專利名稱：高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株，本發(fā)明還涉及該高效泌銨聯(lián)合固氮菌 株的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
生物固氮的研究有助于增產(chǎn)糧食且不污染環(huán)境。聯(lián)合固氮菌是固氮生物中重要的 類群，但由于聯(lián)合固氮菌與植物之間是一種松散的結(jié)合，未能形成穩(wěn)定的共生結(jié)構(gòu)，因而其 為植物提供的氮素很有限。而泌銨菌向胞外環(huán)境分泌銨，為宿主植物提供一定量的氮素，因 此成為國內(nèi)外研究者的研究熱點(diǎn)。目前泌銨菌對于植物的促生作用的研究多局限于實(shí)驗(yàn)室 環(huán)境下，要想真正的應(yīng)用于大田環(huán)境還要從以下幾個(gè)因素對其進(jìn)行改良1)提高泌銨菌的 根際定殖能力；2)結(jié)合態(tài)氮是抑制固定大氣氮的主要因素，高銨條件下提高泌銨菌的固氮 能力和耐銨能力；幻在土壤微生物菌群中使泌銨菌成為優(yōu)勢菌群；4)提高固氮能源的供給 及優(yōu)化其組成。斯氏假單胞菌A1501 (Pseudomonas stutzeri A1501)是一株聯(lián)合固氮菌，于 1980 年分離于我國南方水稻田，該菌在微好氧條件下具有很強(qiáng)的固氮能力，而且固氮產(chǎn)物能夠 迅速的被水稻直接吸收利用。此外，斯氏假單胞菌A1501除了具有明顯的固氮活性以外，在 厭氧條件下該菌還可以以乳酸為碳源，NH4+為唯一氮源進(jìn)行反硝化作用，NO3-為最終電子受 體，接受無氧呼吸鏈傳遞的末端電子，經(jīng)N02_等氮氧化物最終還原為N2。反硝化作用產(chǎn)生的 N2可被斯氏假單胞菌A1501在微好氧條件下重新固定形成NH4+(Lin M et al. 1987)。斯氏假單胞菌A1501的全基因組已測序完成(Yan Y et al. 2008 fenBank號為。該菌株雖然具有明顯的固氮能力，但它們固定的氮素主要用來滿足自身的生長 需要，而提供給植物的氮素有限。特別是在外界有銨的情況下，所固定的氮就更少，甚至停 止固氮及泌銨。這就限制了聯(lián)合固氮菌的開發(fā)及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此，提高斯氏假單胞菌A1501菌株的固氮和泌銨能力，獲得高效固氮的泌銨菌 具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用基因重組的手段對斯氏假單胞菌A1501菌進(jìn)行改造，開發(fā)一株 新的高效泌銨的聯(lián)合固氮菌，并提供一種高效泌銨聯(lián)合固氮菌株的構(gòu)建方法，以提供具有 應(yīng)用潛力的微生物菌肥。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在斯氏假單胞菌A1501的全基因組中，其中amtB基因如果被缺失， 對于泌銨有著重要意義，所述amtB基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株，特征是在斯氏假單胞菌A1501的全基因組中缺失了具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序 列；或者，在斯氏假單胞菌A1501的全基因組中缺失了具有SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，并轉(zhuǎn)入具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的基因，以質(zhì)粒形式存在。本發(fā)明還提供了一種高效泌銨聯(lián)合固氮菌株的構(gòu)建的方法，包括整套表達(dá)載體 的構(gòu)建、三親接合、重組字的篩選及鑒定方法。使用菌株為斯氏假單胞菌O^eudomonas stutzeri)A1501o菌株構(gòu)建具體方法如下1.基因克隆從斯氏假單胞菌G^seudomonas stutzeri) A1501的基因組中利用PCR技術(shù)對amtB 基因的兩邊旁側(cè)序列分別進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的片段插入載體，通過三親接合導(dǎo)入受體菌 P. stuteri A1501，使質(zhì)粒在目標(biāo)基因上發(fā)生同源單交換，從而缺失amtB基因，構(gòu)建好突變株。2.載體構(gòu)建按常規(guī)方法克隆(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)?？?隆了固氮酶正調(diào)節(jié)基因(nifA)，將含有完整的nifA的DNA片段連接到pVKlOO，構(gòu)建了 nifA 組成型表達(dá)質(zhì)粒PVA3。3.三親接合通過三親本接合將不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌中。4.重組子的篩選及鑒定挑出部分長出的菌落連續(xù)轉(zhuǎn)三次平板后，進(jìn)行菌落PCR鑒定。之后，對泌銨情況進(jìn) 行鑒定。經(jīng)采用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測銨試驗(yàn)，并與野生型菌株(A1501)相比較(見實(shí)施例 3)，證實(shí)用本發(fā)明構(gòu)建的聯(lián)合固氮菌株可高效泌銨，進(jìn)而可為農(nóng)作物提供氮肥，是一種潛在 的微生物肥料。


圖1為amtBl基因同源片段的擴(kuò)增，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為目的片段的泳 道；圖2為大腸桿菌重組載體pK18mob的物理圖譜；圖3為大腸桿菌重組載體pVA3的物理圖譜；圖4為酶切驗(yàn)證載體pVA3電泳圖，圖中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為為EcoRI酶切結(jié) 果，2為pVA3 PCR結(jié)果；3為Hind III酶切結(jié)果；；圖5為工程菌1561/pVA3和野生型泌銨比較。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)為銨濃度。序列表說明USEQ ID NO 1 amtB 的基因序列；2、SEQ ID NO 2是斯氏假單胞菌A1501的固氮酶基因的正調(diào)控因子nifA的核苷 酸；3、SEQ ID NO 3是從SEQ ID NO 2推導(dǎo)出的NifA編碼的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)驗(yàn)中所用的實(shí)驗(yàn)材料來源如下菌株與載體大腸桿菌菌株E. coli JM109購自Novagen公司，斯氏假單胞菌A1501 和載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶，連接酶，Taq酶為NEB公司產(chǎn)品。基因組提取試劑盒 為天根生化公司產(chǎn)品。生化試劑DNA合成試劑為Millipore公司產(chǎn)品。引物合成為ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-GaUSDS等試劑為Sigma公司產(chǎn)品。培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、l%NaCl，pH7. 0)。 A15限制性培養(yǎng)基磷酸二氫鉀0. 4g，磷酸氫二鉀0. Ig,氯化鈉0. Ig,七水硫酸鎂0. 2g，一 水硫酸錳0. Olg，一水硫酸鐵0. Olg，鉬酸鈉0. Olg，乳酸鈉6ml，硫酸銨0. 4g定容至1000ml, 調(diào)pH6. 8。用于液體培養(yǎng)，28°C搖床，180-200rpm，培養(yǎng)16 18h。A15無氮培養(yǎng)基A15限 制性培養(yǎng)基中除去硫酸銨。實(shí)施例中其它未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，如Sambrook等人 的方法，分子克隆按(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)實(shí)驗(yàn)室手冊 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例IamtB突變株構(gòu)建DamtBl基因同源片段的擴(kuò)增以A1501總DNA為模板，分別以5 ‘ -ACAGGATCCTCTGTTAAGCCCAGGCTT-3‘5' -GGGAGGCTTATTGAAGTTGGTGACGCC-3為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增用于構(gòu)建amtB基因突變株的DNA片段，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳驗(yàn)證(圖1)。2)amtBl基因整合突變體的構(gòu)建將PCR獲得的同源片段酶切后，分別連接到經(jīng)酶切的質(zhì)粒pKlSmob多克隆位點(diǎn)上， 得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后，通過三親接合導(dǎo)入受體菌P. stuteri A1501，使質(zhì) 粒在目標(biāo)基因上發(fā)生同源單交換，整合到染色體上，經(jīng)適當(dāng)抗生素篩選獲得三親接合子。3)三親接合實(shí)驗(yàn)分別將供體菌，幫助菌PRK2013在LB中培養(yǎng)過夜，受體菌在A15培養(yǎng)基中培養(yǎng) 15 20小時(shí)至OD6J). 6 1. O。離心收集Iml受體菌，用生理鹽水洗兩次，然后，于同一 EP 管中分別離心收集Iml供體菌、0. 5ml幫助菌后，再用生理鹽水洗1 2次，最后用移液器 將已充分混勻的菌泥轉(zhuǎn)移到放有硝酸纖維素膜的A15培養(yǎng)基(不含任何抗生素)上。晾干 后，倒置于32°C培養(yǎng)Mh。將接合完成的菌體用400 μ 1 ddH20從濾膜上洗脫，分別以200 μ 1的用量涂布在含適當(dāng)抗生素的Α15培養(yǎng)基平板上，篩選三親接合子。培養(yǎng)3-4天后，對接合子進(jìn)行酶切或 PCR驗(yàn)證。固體三親接合是將供體菌，幫助菌與受體菌在不含任何抗生素的Α15培養(yǎng)基上充 分混勻，倒置于30°C培養(yǎng)兩天。三親接合子的篩選及驗(yàn)證與液體三親接合相同。突變株命 名為1561。
實(shí)施例2 1561/pVA3菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證l、nifA基因分子的克隆提取斯氏假單胞菌A1501的基因組。以所提取的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所 使用的引物根據(jù)nifA基因的5’和3’端序列合成，2個(gè)引物序列分別為5' CCGAAGCTTTCAGATCTTGCGCATATGA 3'禾口5’ CCGAAGCTTACGGTGCATATCGATAGC 3，，電泳回收植酸酶phyc基因約IlMbp片段。通過PCR方法獲得完整的nifA基 因，并包含nifA基因編碼區(qū)上游約70bp的一段核苷酸序列，長為1. 64kb的目的片段。用 HindIII酶切并回收目的片段，與同樣酶切的穿梭載體PVKlOO連接。TcsKnf抗性篩選，提取 質(zhì)粒，HindIII及EcoRI酶切鑒定，重組質(zhì)粒pVA3圖譜見圖3。2、pVA3的三親接合實(shí)驗(yàn)分別將供體菌pVA3，受體菌1561，幫助菌pRK2013按著1 1 1的比例混合，通 過三親結(jié)合的方法，將重組質(zhì)粒PVA3轉(zhuǎn)入A1501和1561中，然后進(jìn)行卡那霉素(Km)，四環(huán)素 (Tc)抗性篩選。隨機(jī)選取3個(gè)三親結(jié)合子，提取質(zhì)粒驗(yàn)證pVA3是否轉(zhuǎn)入A1501或1561中。提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到1. 6Kb的片段，以提取1561 的空質(zhì)粒為陰性對照；同時(shí)將質(zhì)粒通過EcoR I和Hind III酶切驗(yàn)證，分別切出兩條帶(見 圖4)，從而得到了重組的工程菌，命名為1561/pVA3。由于pVA3中nifA的表達(dá)受Km抗性 盒啟動子的啟動，PVA3轉(zhuǎn)入1561后，重組的工程菌1561/pVA3中的nifA的轉(zhuǎn)錄將不受銨 的抑制，以組成型表達(dá)。實(shí)施例3工程菌1561/pVA3和野生型菌株的泌銨比較1)菌株泌銨測定方法NH4+濃度的測定按照靛酚藍(lán)比色法(Bender et al. 1977) :A溶液(100ml) :5g苯 酚；0.025g Na-nitroprusside (Na2Fe [CN] 5N02H20) ；B 溶液(100ml) :62. 5mllM NaOH ；3. 3ml NaOCl (有效氯5. 25%)。取100 μ 1細(xì)菌培養(yǎng)上清液，加入100 μ 1 A溶液后再加入100 μ 1 B溶液，20min后觀察反應(yīng)液顏色的深淺可判斷是否存有NH4+。適當(dāng)擴(kuò)大體積，可繪制NH4+的 標(biāo)準(zhǔn)曲線(系列稀釋IM的NH4+為0. 1，0· 2,0. 4,0. 6,0. 8，1. 0，1. 5,2. OmM ；加入A、B溶液反 應(yīng)20min后，在OD625比色)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知上清液中的NH4+濃度。2)結(jié)果在固氮條件下，1561/pVA3的固氮酶活(14. 24U/mg · protein)約為野生型菌株 (A1501)的1. 95倍。將1561/pVA3，A1501接種于半固體無氮限制性培養(yǎng)基中，在充滿N2, 0.5% O2, 30°C條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)15天，測其固氮酶活，培養(yǎng)基中的泌銨量和PH值。培養(yǎng)15 天后，野生型，A1501/pVA3及1561通過靛酚藍(lán)法檢測培養(yǎng)基中銨的濃度，發(fā)現(xiàn)均未顯藍(lán)色， 即沒有分泌銨；而在1561/pVA3的培養(yǎng)基顯藍(lán)色，且泌銨量達(dá)到5. 15mM，其培養(yǎng)基呈弱堿性 (pH值=7. 42，而野生型培養(yǎng)15天之中沒有檢測到泌銨，胺濃度為0，結(jié)果如圖5所示。研 究結(jié)果表明1561/pVA3具有較強(qiáng)的固氮活力，并且能向細(xì)胞外分泌銨。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株<160>3
<170>PatentIn versior3. 1
<210>1
<211>1317
<212>DNA
<213> 固氮斯氏假單胞菌 A1501 (Pseudomonas stutzeri)
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100105110IleAspAlaGluProArgPheLeuAspArgLeuAlaLeuTyrAspMET115120125AspLeuProPhelieAlaValProlieLysAlaValAspGlyThrThr130135140IleGlyValLeuAlaAlaGlnProAspArgArgAlaAspGluLeuMET145150155160ProGluArgThrArgLeuMETGlulieValAlaArgLeuLeuAlaGln165170175ThrValArgLeuValValAsnLeuGluAspGlyGlnGluValValAsp180185190GluArgAspGluLeuArgArgGluValArgAlaLysTyrGlyPheGlu195200205AsnMETValValGlyHisThrAlaSerMETArgArgValPheAspGln210215220ValArgArgValAlaLysTrpAsnSerThrValLeulieLeuGlyGlu225230235240SerGlyThrGlyLysGluLeulieAlaSerAlalieHisTyrAsnSer245250255ProArgAlaHisGlnProLeuValArgLeuAsnCysAlaAlaLeuPro260265270GluThrLeuLeuGluSerGluLeuPheGlyHisGluLysGlyAlaPhe275280285ThrGlyAlaValLysGlnArgLysGlyArgPheGluGlnAlaAspGly290295300GlyThrLeuPheLeuAspGlulieGlyGlulieSerProMETPheGln305310315320AlaLysLeuLeuArgValLeuGlnGluGlyGluLeuGluArgValGly325330335GlySerGlnThrValLysValAsnValArglieValAlaAlaThrAsn340345350ArgAspLeuGluHisGluValGluGlnGlyLysPheArgGluAspLeu355360365TyrTyrArgLeuAsnValMETAlalieArgValProProLeuArgGlu370375380ArgSerAlaAsplieProGluLeuAlaGluPheLeuLeuAspLyslie385390395400AlaArgGlnGlnGlyArgLysLeuLysLeuThrAspSerAlaLeuArg401405410415
LeuLeuMETSer420CysLeuGlu Arg435AspValValSer450ProValProGlu465ArgVallieAlaAlaArgLeuLeu500ThrLeuAsnlie515His Arg Trp Pro Gly Asn 425Ser Ala lie MET Ser Glu 440Leu Thr Gly Leu Asp His 455Val Asp Leu Ala Asp Asp 470Ala Leu Glu Gln Ala Gly 485490Gly MET Thr Pro Arg Gln 505His MET Arg Lys lie 520Val Arg Glu Leu Glu Asn 430Asp Gly Thr lie Ser Arg 445Asp Ala Thr Pro Leu Ala 460Ser Leu Asp Asp Arg Glu 475480Trp Val Gln Ala Lys Ala 495lie Ala Tyr Arg Val Gln 510
權(quán)利要求
1.高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株，特征是在斯氏假單胞菌A1501的全基因組中缺失了具有 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列。
2.高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株，特征是在斯氏假單胞菌A1501的全基因組中缺失了具有 SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，并轉(zhuǎn)入具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列的基因。
3.構(gòu)建權(quán)利要求1或2所述菌株的方法，包括表達(dá)載體的構(gòu)建、三親接合實(shí)驗(yàn)、重組子 的篩選及鑒定方法，其特征在于將SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列在固氮斯氏假單胞菌中 使用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新的高效泌銨的聯(lián)合固氮菌株，其特征為斯氏假單胞菌A1501的全基因組中缺失了amt B基因，同時(shí)轉(zhuǎn)入nif A基因。經(jīng)測銨試驗(yàn)證實(shí)，用本發(fā)明構(gòu)建的聯(lián)合固氮菌株可高效泌銨，是一種潛在的微生物肥料。本發(fā)明還提供了構(gòu)建該高效泌銨聯(lián)合固氮菌株的方法，包括整套表達(dá)載體的構(gòu)建、三親接合、重組字的篩選及鑒定方法。
文檔編號C12N1/21GK102041241SQ20091023613
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者何升, 平淑珍, 張維, 李燕, 林敏 , 樊穎, 燕永亮, 陸偉, 陳明 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所