專利名稱：一株具有高效分泌生長素能力和固氮能力的自生固氮菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種固氮菌的分離及其應(yīng)用，特別涉及一種具有高效分泌生長素能力的自生固氮菌及其在羊草一紫花苜蓿草地建植過程中提高羊草對紫花苜蓿的競爭力中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物促生菌可以定殖于一些植物根部并提供一系列有益影響，主要促生途徑有分泌一些特殊的化合物，促進(jìn)植物對營養(yǎng)物質(zhì)的攝入；分泌有機(jī)酸，使土壤中的難溶性元素溶解后促進(jìn)植物的吸收，如解磷菌；固定空氣中的氮，為植物提供氮素，這樣的植物促生菌統(tǒng)稱為“固氮菌”，其中包含有自生固氮菌，聯(lián)合固氮菌與共生固氮的根瘤菌。
目前對于植物根際促生菌的研究利用常規(guī)方法為1.大田取樣選取四個具有代表性的點(diǎn)即距根系較遠(yuǎn)的土壤(NRS)、根表土壤(Rs)、根系表面(RP)、根內(nèi)(HP)，利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行促生菌的分離，選擇性培養(yǎng)基包括無氮培養(yǎng)基(Ashby培養(yǎng)基、Burk, s培養(yǎng)基)，溶磷培養(yǎng)基(孟金娜培養(yǎng)基，PKO培養(yǎng)基)。2.理化性質(zhì)及促生能力測試對獲得的菌株進(jìn)行一系列理化性質(zhì)及促生能力的測試，進(jìn)行篩選后留下表現(xiàn)優(yōu)秀的菌株。3.生產(chǎn)測試表現(xiàn)優(yōu)異的菌株進(jìn)入實(shí)際生產(chǎn)促生能力階段。菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，進(jìn)行接種，接種方式為菌液浸泡種子和固體菌劑拌種兩種方式。大田測試后促生效果良好的菌株就可認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)促生菌株?，F(xiàn)有分離得到的植物根際促生菌其理化性質(zhì)及促生能力差別較大，且在與土著菌的競爭中處在劣勢，很多菌種存在抗逆性較差的缺陷。而東北地區(qū)極端天氣較多，因此對抗逆性高的菌株很少，特別是在東北等地理環(huán)境下滿足豆-禾混播草地建植需要的禾草自生固氮菌菌株就顯得特別重要。羊草與紫花苜?；觳ゲ莸乜娠@著提高了干物質(zhì)和粗蛋白產(chǎn)量。增加的草地生產(chǎn)力主要源自紫花苜蓿種群，原因是豆科牧草(紫花苜蓿)在生長初期階段具有較強(qiáng)的生長速率，其對禾本科牧草的抑制作用表現(xiàn)較強(qiáng)。因此在建植羊草-紫花苜?；觳サ貢r，由于存在種間競爭，羊草的生長因占據(jù)較少的光資源而受到抑制(多立安，趙樹蘭.幾種豆禾牧草混播初期生長互作效應(yīng)的研究[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2001，10(2) :72-77)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中問題，本發(fā)明發(fā)明人于2009年9月從黑龍江省蘭西縣遠(yuǎn)大鄉(xiāng)勝利村草原鹽堿化草地上進(jìn)行羊草取樣，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行分離純化，通過對分離純化后的菌株進(jìn)行生長素分泌能力、溶磷能力、固氮能力的測定，最終得到了一株具有高效分泌生長素能力的自生固氮菌，命名為ZLXTR6,分類命名為褐球固氮菌(Azotobacterchroococcum),該菌種已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 6572，保藏日期為2012年9月18日。對本發(fā)明的保藏編號為=CGMCC No. 6572的菌株進(jìn)行促生能力測試，結(jié)果表明該菌株有極強(qiáng)的生長素(3—吲哚乙酸)分泌能力，菌株培養(yǎng)14天后菌液生長素含量可達(dá)52. 16mg/L以上,而普通固氮菌生長素分泌能力多為10mg/L—50mg/L之間(劉小龍,蘆云，羅明等.3個旱生禾草內(nèi)固氮菌的分離及促生性能測定[J]，草地學(xué)報(bào)，2012，20 (4);李劍峰，張淑卿，師尚禮.微波誘變選育高產(chǎn)生長素及耐藥性根瘤菌株研究[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2009, 23 (6))。將接種該菌后的羊草種子與紫花苜蓿進(jìn)行混播后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法有效提高了羊草的成株速度與再生能力，同時抑制了紫花苜蓿對羊草的種間競爭作用，提高了混播草地的羊草的產(chǎn)量達(dá)到干重O. 45噸/畝以上，并且接種該菌后的人工羊草草地蛋白質(zhì)含量也顯著高于未接種對照。因此，進(jìn)一步的，本發(fā)明提出了以上所述的自生固氮菌在提高羊草對紫花苜蓿的
競爭力、提高羊草產(chǎn)量及產(chǎn)氮量中的應(yīng)用。
更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種在羊草-紫花苜蓿草地種植羊草的方法，其特征在于將本發(fā)明所述的菌株接種到羊草種子上后，與紫花苜蓿種子進(jìn)行混播后，按照常規(guī)管理措施進(jìn)行管理。優(yōu)選的，所述紫花苜蓿與羊草的種子重量之比為2:3。本發(fā)明的有益效果在于提供了一種滿足豆-禾混播草地建植需要的禾草自生固氮菌菌株,命名為ZLXTR6,分類命名為褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)。該菌接種的羊草與紫花苜蓿的混播草地試驗(yàn)證明，接種的羊草的草產(chǎn)量和產(chǎn)氮量比不接種的對照分別增加72. 73%和115. 91%。上述試驗(yàn)證明自生固氮菌(ZLXTR6)與紫花苜蓿的混播草地中提高了羊草在混播草地中的競爭能力具有增產(chǎn)效果，產(chǎn)量提高可達(dá)72. 73%，且具有較高的實(shí)用性和可推廣性。本發(fā)明在東北地理?xiàng)l件下，退化草地建植中具有廣闊的應(yīng)用效果。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I自生固氮菌的分離、保藏本發(fā)明發(fā)明人于2009年9月從黑龍江省蘭西縣遠(yuǎn)大鄉(xiāng)勝利村草原鹽堿化草地上進(jìn)行羊草取樣，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行分離純化，分離方法如下根際土壤按照距根系較遠(yuǎn)的土壤(NRS)、根表土壤(Rs)進(jìn)行區(qū)分，分別稱取NRS與Rs各O. I克，在無菌條件下用
O.85%生理鹽水配成不同濃度梯度的懸浮液，取稀釋度為10_2 10_7的懸浮液各O. 1ML，用玻璃刮刀均勻涂布于阿須貝(Asbhy)平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)三天，選取菌落分布均勻分散的菌斑，按菌落大小、顏色、形狀進(jìn)行多次分離，直至菌落的大小、顏色、形狀一致，經(jīng)菌落形態(tài)、菌體形態(tài)檢查后，接入試管斜面保存。對分離純化后的菌株進(jìn)行生長素分泌能力、溶磷能力，固氮能力的測定，最終得到了一株具有高效分泌生長素能力的自生固氮菌，命名為ZLXTR6,分類命名為褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum),該菌種已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 6572，保藏日期為2012年9月18日。羊草自生固氮菌CGMCC No. 6572采用阿須貝(Asbhy)平板培養(yǎng)基配方為葡萄糖10. Og, K2HPO4O. 2g，K2SO4O. 2g，NaCl0. 2g，CaC035g，MgSO4 · 7H20 0. 2g,瓊脂 18. Og,蒸餾水1000ml, pH 值在 7. 0 7· 2。實(shí)施例2本發(fā)明的菌株(保藏編號為=CGMCC No. 6572)分泌IAA和其他能力測定I、供試菌株來源及編號供試菌株為分離純化后的所有菌株進(jìn)行生長素分泌能力、溶磷能力，固氮酶活性的測定，菌株編號及來源見表I。表I供試菌株
權(quán)利要求
1.一株具有高效分泌生長素能力和固氮能力的自生固氮菌，命名為ZLXTR6，分類命名為褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 6572。
2.權(quán)利要求I所述的一株具有高效分泌生長素能力的自生固氮菌在提高羊草對紫花苜蓿的競爭力、提高羊草產(chǎn)量及產(chǎn)氮量中的應(yīng)用。
3.一種在羊草一紫花苜蓿草地種植羊草的方法，其特征在于將權(quán)利要求I所述的自生固氮菌接種到羊草種子上后，與紫花苜蓿種子進(jìn)行混播，按照常規(guī)管理措施進(jìn)行管理即可。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于紫花苜蓿與羊草的種子重量之比為2:3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株具有高效分泌生長素能力和固氮能力的自生固氮菌及其應(yīng)用，屬于微生物領(lǐng)域。本發(fā)明發(fā)明人從黑龍江省蘭西縣遠(yuǎn)大鄉(xiāng)勝利村草原鹽堿化草地上進(jìn)行羊草取樣，通過對分離純化后的菌株進(jìn)行生長素分泌能力、溶磷能力、固氮能力的測定，最終得到了一株具有高效分泌生長素能力和固氮能力的自生固氮菌，命名為ZLXTR6，其菌種保藏編號為CGMCC No.6572。將接種該菌后的羊草種子與紫花苜蓿進(jìn)行混播后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法有效提高了羊草的成株速度與再生能力，同時抑制了紫花苜蓿對羊草的種間競爭作用，提高了混播草地的羊草的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的固氮菌在羊草的種植方面將會具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/065GK102925389SQ20121042752
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者朱瑞芬, 唐鳳蘭, 張?jiān)聦W(xué), 陳積山, 劉杰淋, 劉鳳歧 申請人:黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所