本公開涉及一種新型人松馳素類似物，包含其的藥物組合物及其用途。

背景技術(shù)：
松弛素(Relaxin簡稱RLX)是一種多肽激素，其由哺乳動物的卵巢黃體分泌。松弛素在體內(nèi)具有多種生理功能，包括松弛恥骨韌帶、抑制子宮收縮、軟化子宮頸、刺激乳腺發(fā)育、影響乳汁分泌。1926年，在研究妊娠期間骨盆帶變化時，松弛素由FrederickHisaw首次發(fā)現(xiàn)。20世紀70至80年代，松弛素被認為是一種雙鏈蛋白質(zhì)。松弛素的結(jié)構(gòu)與胰島素相似。已經(jīng)證實松弛素是肽類激素家族的成員之一。在人類當中，松弛素家族由7個基因所編碼：RLN1、RLN2、RLN3(也作INSL7)、INSL3/RLF、INSL4/EPIL、INSL5/RIF2和INSL6/RIF1。人體循環(huán)中的大多數(shù)人類松弛素是基因RLN2編碼的產(chǎn)物。RLN2的翻譯產(chǎn)物是松弛素前體，該松弛素前體包括(從N端至C端)：24個氨基酸殘基的信號肽序列、29個氨基酸殘基的B鏈、104-107個氨基酸殘基的連接序列，以及約24個氨基酸殘基的A鏈。目前已明確，松弛素不僅在妊娠過程中發(fā)揮重要作用，而且對非妊娠動物的血管結(jié)構(gòu)和功能也產(chǎn)生影響。松弛素具有廣泛的生物學(xué)作用，包括在哺乳動物妊娠和機體老化過程中維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、抗炎、心肌保護、擴張血管、促進傷口愈合，尤為重要的作用是抗纖維化。各種原因引起的心臟、腎臟病變最終均導(dǎo)致纖維化、結(jié)構(gòu)改變、功能喪失的發(fā)生。因此，纖維化過程的有效抑制，是挽救臟器功能的重要措施。鑒于此，松弛素的抗纖維化作用可能成為未來抗纖維化治療的有效措施。更為重要的是，松弛素可由心臟產(chǎn)生，并通過局部受體來保護心臟和調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)。松弛素已成功地用于改善多種動物模型的心臟纖維化。因而，松弛素有望用于人類心臟纖維化性疾病的治療(杜曉軍，周娟，Baker心臟研究所)?，F(xiàn)有技術(shù)中，在大腸桿菌中表達人松弛素(hRelaxin，野生型)前體；經(jīng)過純化后前體折疊復(fù)性；兩步酶切(分別用CPB和胰蛋白酶)；再純化得到有活性的產(chǎn)物松弛素?，F(xiàn)有技術(shù)中的缺陷是：生產(chǎn)過程中需要蛋白復(fù)性、兩步酶切和再純化。繁多的步驟導(dǎo)致產(chǎn)量大大降低以及成本的提高，因為每一步都會涉及蛋白的損失。而且，外源酶(CPB、胰蛋白酶等)本身的成本高，酶的質(zhì)量也會影響終產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。另一缺陷是，所表達的野生型松弛素活性低。這使得治療劑量所需的重組蛋白的量增多，成本增加；而且所表達的野生型松弛素的低活性，給進一步開發(fā)蛋白修飾產(chǎn)品帶來困難，因為修飾會損失蛋白的活性。針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，通過對野生型松弛素的特定位點氨基酸改變，本公開進行了新型分子的設(shè)計，并發(fā)現(xiàn)了新型的人松弛素類似物，從而能非常好的解決上述問題。新的技術(shù)方案顯示以下優(yōu)點：1.松弛素特定位點的氨基酸改變，使所得的類似物能夠在酵母細胞內(nèi)完成正確的折疊，在這一過程中細胞自身的酶系統(tǒng)除去A和B鏈中的c-肽段。得到的完整有功能的活性分子被分泌到細胞外。通過一步純化得到活性分子。省去現(xiàn)有技術(shù)所需的表達后復(fù)性、酶切、純化等多個步驟。2.松弛素特定位點的氨基酸改變，使結(jié)構(gòu)更加適應(yīng)細胞內(nèi)折疊、酶切和分泌，而且提高了生物學(xué)活性。這樣可以減少單位劑量所需的重組蛋白質(zhì)的量，從而降低成本。同時，因為活性提高，使得這樣的類似物更加容易分子修飾物的開發(fā)。通過設(shè)計(松弛素序列中特定氨基酸的替換、缺失等)，本公開得到特定序列的人松馳素類似物。這種類似物能在真核表達系統(tǒng)(細胞)里完成松弛素前體的蛋白折疊、酶切；并且分泌到發(fā)酵液中時，本公開的人松馳素類似物是成熟的、完整、有功能的松弛素類似物。不僅如此，通過這些特定的設(shè)計所得到的松弛素類似物，其生物學(xué)活性比野生型松弛素高2倍以上。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本公開提供一種人松弛素類似物，其包含A鏈和B鏈，所述A鏈和B鏈的氨基酸序列分別如下式所示：A鏈：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24個氨基酸殘基)B鏈：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29個氨基酸殘基)其中A1選自：Q、D、E和W；其中B14選自：E、D和N；任選地，B1和B2同時缺失；當A1為Q時，B14不為E或D。在本公開的一個實施方案中，提供一種如上所述的人松弛素類似物，其包含A鏈和B鏈，所述A鏈和B鏈的氨基酸序列分別如下式所示：A鏈：A1LYSALANKCCHVGCTKRSLARFC(24個氨基酸殘基)B鏈：DSWMEEVIKLCGRB14LVRAQIAICGMSTWS(29個氨基酸殘基)其中A1選自：Q、D、E和W；其中B14選自：E、D和N；當A1為Q時，B14不為E或D。在本公開一個實施方案中，所述的A1為D、E或W，優(yōu)選為D。在本公開一個實施方案中，所述的A1為D，B14為D。具體地，實例為SEQIDNO：134(A鏈)和SEQIDNO：135(B鏈)，通過二硫鍵連接而形成的人松弛素類似物。在本公開一個實施方案中，所述的B14為D。在本公開一個實施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述的A鏈和B鏈的氨基酸序列選自如下組合：在本公開一個實施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述B鏈通過連接序列(本公開中簡稱L)與所述A鏈連接，所述連接序列的長度為1至15個氨基酸殘基，優(yōu)選為2至8個氨基酸殘基，所述的連接序列的氨基酸序列選自：在本公開一個實施方案中，一種如上所述的人松弛素類似物，其中所述的人松弛素類似物的N端連接有信號肽序列(本公開中簡稱S)，所述信號肽序列的長度為4至15個氨基酸殘基，優(yōu)選6至11個氨基酸殘基；更優(yōu)選的，所述的信號肽序列的氨基酸序列選自：S1：EEGEPK，SEQIDNO：33，S2：EEGEPKR，SEQIDNO：34，和S3：MKKNIAFLLKRSEQIDNO：35。在本公開一個實施方案中，一種用于制備如上所述的人松弛素類似物的表達前體，表達前體的氨基酸序列選自SEQIDNO：1至SEQIDNO：26的一種或多種。表1.人松弛素類似物表達前體匯總本公開進一步提供一種人松弛素類似物的衍生物，其是如上所述的人松弛素類似物經(jīng)PEG化修飾所得，換言之其中如上所述的人松弛素類似物被PEG分子所修飾。在一些實施方案中，所述的PEG分子的分子量為5-100KDa；在一些實施方案中，是10-80KDa；在一些實施方案中，15-45KDa；在一些實施方案中，20-40KDa；在一些實施方案中，所述的PEG分子為支鏈型或直鏈型。本公開進一步提供一種多核苷酸，其編碼如上所述的人松弛素類似物的表達前體。多核苷酸選自DNA或RNA。技術(shù)人員理解，多核苷酸的互補序列也涵蓋在本公開的范圍內(nèi)。本公開進一步提供一種含有如上所述多核苷酸的表達載體。本公開進一步提供一種轉(zhuǎn)化有如上所述的表達載體的宿主細胞。在一些實施方案中，所述的宿主細胞為細菌，在一些具體實施方案中為大腸桿菌；在另一些實施方案中，宿主細胞為酵母菌，在一些具體實施方案中為畢赤酵母。本公開進一步提供一種藥物組合物，其含有或由如下組成：a)一種或多種如上所述的人松弛素類似物、和/或一種或多種如上所述的人松弛素類似物衍生物，和b)一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本公開進一步提供一種人松弛素類似物或其衍生物的可注射溶液，其含有溶解形式或可溶解形式的如上所述的藥物組合物。應(yīng)當理解，可注射溶液的干粉或凍干粉形式也涵蓋在本公開的范圍內(nèi)。本公開進一步提供如上所述的人松弛素類似物、如上所述的人松弛素類似物衍生物、或如上所述的藥物組合物、或如上所述的可注射溶液，在制備用于治療或預(yù)防纖維化疾病或心血管疾病的藥物中的用途，參見Cardiovasculareffectsofrelaxin；frombasicsciencetoclinicaltherapy，Nat.Rev.Cardiol.7，48-58(2010)；Relaxindecreasesrenalinterstitialfibrosisandslowsprogressionofrenaldisease，KindneyInternational，Vol.59(2001)，pp.876-882。本公開進一步提供一種治療或預(yù)防纖維化疾病或心血管疾病的方法，該方法包括向所需的受試者施用治療有效量的如上所述的人松弛素類似物或其衍生物，或如上所述的藥物組合物。發(fā)明詳述一、術(shù)語為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術(shù)和科學(xué)術(shù)語。除非另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本公開所屬領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的含義。本公開所用氨基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。當應(yīng)用于動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，“給予”、“施用”、“治療”和“處理”是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸?！敖o予”、“施用”、“治療”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學(xué)、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中所述流體與細胞接觸?！敖o予”、“施用”、“治療”和“處理”還意指通過試劑、診斷、結(jié)合組合物或通過另一種細胞，在體外和離體處理細胞。當應(yīng)用于人、獸醫(yī)學(xué)或研究受試者時，“處理”是指治療處理、預(yù)防或預(yù)防性措施、研究和診斷應(yīng)用?！爸委煛币庵附o予患者內(nèi)用或外用治療劑，諸如給予患者包含本公開的任一種結(jié)合化合物的組合物，所述患者具有一種或多種疾病癥狀，而已知所述治療劑對這些癥狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病癥狀的量給予治療劑。所述的有效緩解的量包括無論是通過誘導(dǎo)這類癥狀退化還是抑制這類癥狀發(fā)展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病癥狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據(jù)多種因素變化，例如患者的疾病狀態(tài)、年齡和體重，以及藥物在患者產(chǎn)生需要療效的能力。通過醫(yī)生或其它專業(yè)衛(wèi)生保健人士通常用于評價該癥狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病癥狀是否已被減輕。盡管本公開的實施方案(例如治療方法或制品)在緩解每個患者都有的目標疾病癥狀方面，可能效果不同，但是根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何統(tǒng)計學(xué)檢驗方法，如Studentt檢驗、卡方檢驗、Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗，確定其在患者中應(yīng)當統(tǒng)計學(xué)意義上顯著減輕目標疾病癥狀。除非另有說明，否則在本公開中所述的松弛素或人松馳素為人松馳素RLN2，其包含具有生物活性的全長序列或部分序列。人松馳素包含A鏈和B鏈，兩者之間通過二硫鍵結(jié)合。本公開中所用人松馳素的序列描述參見GenBank序列號：EAW58770。本公開中用于作為陽性對照的人松馳素800828為野生型。本公開中所述的人松馳素類似物前體按照從氨基端至羧基端的順序包含：信號肽序列、B鏈或其突變體、連接序列、A鏈或其突變體。其中信號肽序列的長度是4-15個氨基酸殘基，優(yōu)選6-11個氨基酸殘基；B鏈或其變體的長度是29個氨基酸殘基；連接序列的長度是1-15個氨基酸殘基，優(yōu)選2-8個氨基酸殘基；以及A鏈或其變體的長度是約24個氨基酸殘基。本公開中所述的突變體指在序列上進行氨基酸的修飾、替換、置換或取代。本公開的B鏈優(yōu)選的突變?yōu)樵贐鏈第14位(簡稱B14)上將E替換為D，且A鏈第1位(簡稱A1)Q替換為D。本公開的序列縮寫中，Ln表示本公開中的某種連接序列(如L1至L6)，Sn表示本公開中的某種信號肽序列(如S1、S2、S3)；DA1表示在A鏈第1個氨基酸突變?yōu)镈，DB14表示在B鏈第14個氨基酸突變?yōu)镈，DelB1，B2表示B鏈第1和2個氨基酸缺失；A(wt)，表示野生型無突變的A鏈，B(wt)，表示野生型無突變的B鏈?！氨Ｊ匦揎棥被颉氨Ｊ刂脫Q或取代”是指：蛋白中的氨基酸殘基被具有類似特征(例如電荷、側(cè)鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構(gòu)象和剛性等)的其它氨基酸殘基所置換；即使蛋白中的這種氨基酸殘基被頻繁改變，也不改變蛋白的生物學(xué)活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，一般而言，多肽的非必需區(qū)域中的單個氨基酸置換不改變生物學(xué)活性(參見例如Watson等(1987)MolecularBiologyoftheGene，TheBenjamin/CummingsPub.Co.，第224頁，第4版)。另外，結(jié)構(gòu)或功能類似的氨基酸殘基的置換不大可能破環(huán)生物學(xué)活性?！坝行Я俊卑阋愿纳苹蝾A(yù)防醫(yī)學(xué)病癥的癥狀或病癥的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用于特定患者或獸醫(yī)學(xué)受試者的有效量可依據(jù)以下因素而變化：如待治療的病癥、患者的總體健康情況、給藥的方法、途徑、和劑量、以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案?！巴庠葱浴敝竵碓丛谏?、細胞或人體外產(chǎn)生的物質(zhì)?！皟?nèi)源性”來源在細胞、生物或人體內(nèi)產(chǎn)生的物質(zhì)。本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”可互換使用，并且所有這類名稱都包括后代。因此，表述“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移數(shù)目。還應(yīng)當理解的是，由于故意或非有意的突變，所有后代在DNA含量方面不可能精確相同。以上表述還包括與最初轉(zhuǎn)化細胞具有相同功能或生物學(xué)活性的突變后代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。本文使用的“聚合酶鏈式反應(yīng)”或“PCR”是指，例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術(shù)。一般來說，需要獲得來自目標區(qū)域末端或之外的序列信息，從而能夠設(shè)計寡核苷酸引物；這些引物的序列與待擴增模板的對應(yīng)鏈相同或相似。2個引物的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用于擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列、以及由總細胞RNA轉(zhuǎn)錄而來的cDNA、噬菌體或質(zhì)粒序列等。一般，參見Mullis等(1987)ColdSpringHarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCRTECHNOLOGY(StocktonPress，N.Y.)。本文使用的PCR被視為用于擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應(yīng)法的一個實例，但不是唯一的實例；所述方法包括使用作為引物的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產(chǎn)生核酸的特定部分?！叭芜x”或“任選地”意味著隨后所描述的事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生?！八幬锝M合物”表示含有一種或多種本文所述類似物或前體以及其他化學(xué)組分的混合物，其中其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。其他化學(xué)組分的目的是促進對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進而發(fā)揮生物活性。本公開中所述的用轉(zhuǎn)化宿主細胞的步驟可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。獲得的轉(zhuǎn)化體可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，其表達本公開的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。從表達前體產(chǎn)物中釋放所述人松弛素類似物的化學(xué)和/或酶方法可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行，比如胰蛋白酶、羧肽酶B、賴氨酸內(nèi)肽酶C等。具體實施方式實施例1、重組人松弛素800800的分子克隆和表達1、重組人松弛素800800表達載體的構(gòu)建經(jīng)過密碼子優(yōu)化的人松弛素800800的DNA序列通過OverlapPCR方法合成。由Invitrogen公司合成6條單鏈DNA片段作為合成引物，序列如下：800-引物1CTCGAGGATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTSEQIDNO：36800-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAATTCTCTACCACACAACTTAATAACTTCTTCCATCCAAGAASEQIDNO：37800-引物3AGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACASEQIDNO：38800-引物4ATGACAACACTTGTTAGCCAAAGCAGAGTACAATTGTCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：39800-引物5CTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTSEQIDNO：40800-引物6GAATTCTTAACAAAATCTAGCCAAAGATCTCTTASEQIDNO：41松弛素的合成采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)，采用兩步PCR完成。第一步PCR，25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KOD緩沖液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2，3，4，5，6(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，12.5μLddH2O。反應(yīng)程序為94℃5分鐘；94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃30秒鐘，擴增30個循環(huán)后；再68℃30分鐘以結(jié)束PCR擴增程序。第二步PCR，25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1和6(10μM)各1μL，1μL第一輪PCR產(chǎn)物，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，15.5uLddH2O。反應(yīng)程序為94℃5分鐘；94℃30秒鐘，68℃60秒鐘，擴增30個循環(huán)后；再68℃10分鐘以結(jié)束PCR擴增程序。將PCR合成的DNA序列和pPIC9K表達載體(Invitrogen，Cat.K1750-01)分別進行EcoRI/XhoI(NewEnglandBiolabs，Cat.R0101S/R0146V)雙酶切，得到的目的片段經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠回收，用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs，Cat.M0202V)連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽性克隆由Invitrogen公司作測序分析。800前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：42上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：1。2、重組人松弛素800800表達載體的轉(zhuǎn)化將5-10μg的上述步驟中得到的松弛素800800表達載體用SalI(Takata，Cat.D1080a)進行線性化。再加入1/10體積的3M醋酸鈉，2倍體積的無水乙醇，充分混合后，放置于-20℃，2hr?；旌衔锔咚匐x心(13,000rpm)5min，去處上清，用75％乙醇清洗沉淀2次，將沉淀倒置晾干后，用10μLddH2O溶解。將線性化的質(zhì)粒與80μL電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(畢赤酵母GS115，Invitrogen，Cat.K1750-01)混合轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯(BioRad，Cat.1652086)中，并置冰浴5min。將電轉(zhuǎn)儀(BioRadMicropulser)參數(shù)設(shè)至2kV，25Ω，200uF，進行電轉(zhuǎn)化。結(jié)束后迅速加入1ml冰浴的D-山梨醇(生工生物工程有限公司)混合，將100-300μl混合物涂布于MD培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)3d至形成菌落。3、重組人松弛素800800表達克隆的G418篩選用3mlYPD培養(yǎng)基洗脫MD培養(yǎng)板上的菌落，重懸，并用分光光度計(Beckman，DU800)測定重懸的細胞濃度(1OD600＝5×107cell/ml)。將1×105細胞涂在4mg/ml濃度G418(GIBCO，Cat.11811-031)的YPD培養(yǎng)板上，30℃培養(yǎng)5d至形成菌落。4、重組人松弛素800800的誘導(dǎo)表達從YPD培養(yǎng)板上挑取單菌落置于4mLBMGY培養(yǎng)基，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜。第二天檢測OD600值，應(yīng)處于2-6之間。離心機(BeckmanCoulter)室溫低速(1,500g)離心5min收集細胞，并用BMMY培養(yǎng)基重懸至OD600為1.0。在培養(yǎng)基中加入1/200總體積的100％甲醇(終濃度為0.5％)，并于28℃，250rpm培養(yǎng)72hr，其中每24hr補加1/200總體積的100％甲醇。誘導(dǎo)結(jié)束后，離心機低速(1,500g)離心并收集上清。SDS-PAGE(Invitrogen，Cat.No.456-1083)電泳檢測蛋白表達，挑選表達較好克隆進行下一步發(fā)酵。得到的重組人松弛素800800序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實施例2、重組人松弛素800801的分子克隆和表達1、重組人松弛素800801表達載體的構(gòu)建松弛素800801用PCR的方法進行定點突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點突變引物，序列如下：801-引物1GTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCSEQIDNO：43801-引物2GAGTACAATTGTCTCTTCAAAGATCTCTTAGACCAAGTAGACATACSEQIDNO：44PCR定點突變以松弛素800800載體為模板，采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KOD緩沖液，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反應(yīng)程序為94℃5分鐘，94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃12分鐘，擴增30個循環(huán)后，再68℃12分鐘以結(jié)束PCR擴增程序。在PCR產(chǎn)物中直接加入內(nèi)切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小時后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽性克隆由Invitrogen公司作測序分析。801前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGATCTTTGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：45上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRSLKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：22、重組人松弛素800801的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達重組人松弛素800801的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達同實施例1。得到的重組人松弛素800801序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實施例3、重組人松弛素800802的分子克隆和表達1、重組人松弛素800802表達載體的構(gòu)建松弛素800802用PCR的方法進行定點突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點突變引物，序列如下：802-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：46802-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：47PCR定點突變以松弛素800801載體為模板，采用KODplus試劑盒(TOYOBO，Cat.KOD-201)25μL反應(yīng)體系：2.5μL10×KODbuffer，2.5μL2mMdNTPs，引物1，2(10μM)各1μL，0.5μLKODplus，1μL25mMMgSO4，16.5μLddH2O。反應(yīng)程序為94℃5分鐘，94℃30秒鐘，60℃30秒鐘，68℃12分鐘，擴增30個循環(huán)后，再68℃12分鐘以結(jié)束PCR擴增程序。在PCR產(chǎn)物中直接加入內(nèi)切酶DpnI(NEBCat.R0176L)1μL消化5小時后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞(天根生化，Cat.CB101-02)，挑選陽性克隆由Invitrogen公司作測序分析。802前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：48上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：3。2、重組人松弛素800802的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達重組人松弛素800802的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達同實施例1。得到的重組人松弛素800802序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實施例4、重組人松弛素800802-1的分子克隆和表達1、重組人松弛素800802-1表達載體的構(gòu)建松弛素800802-1用PCR的方法進行定點突變完成，由Invitrogen公司合成4條單鏈DNA片段作為定點突變引物，序列如下：802-1-引物1GTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGSEQIDNO：49802-1-引物2CAATTTGAGCTCTAACCAAATCTCTACCACACAACTTAATAACSEQIDNO：50802-1-引物3GTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGSEQIDNO：51802-1-引物4CCAAAGCAGAGTACAAATCTCTCTTCTTTCTAGAACSEQIDNO：52PCR定點突變以松弛素800802載體為模板，突變過程同實施例2。800802-1前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGATTTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAAGAGAGATTTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：53上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKKRDLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：4。2、重組人松弛素800802-1的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達重組人松弛素800802-1的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達同實施例1。得到的重組人松弛素類似物800802-1序列如下：B鏈(DB14)DSWMEEVIKLCGRDLVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：137A鏈(DA1)DLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：138。實施例5、重組人松弛素800803的分子克隆和表達1、重組人松弛素800803表達載體的構(gòu)建松弛素800803用PCR的方法進行定點突變完成，由Invitrogen公司合成2條單鏈DNA片段作為定點突變引物，序列如下：803-引物1GTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCSEQIDNO：54803-引物2GCAGAGTACAATTGTCTCTTTCTAGAACCGTAACCAGTTGGCTTTCTCTTAGACCAAGTAGACSEQIDNO：55PCR定點突變以松弛素800801載體為模板，突變過程同實施例2。800803前體DNA序列如下：GATTCTTGGATGGAAGAAGTTATTAAGTTGTGTGGTAGAGAATTGGTTAGAGCTCAAATTGCTATTTGTGGTATGTCTACTTGGTCTAAGAGAAAGCCAACTGGTTACGGTTCTAGAAAGAGACAATTGTACTCTGCTTTGGCTAACAAGTGTTGTCATGTTGGTTGTACTAAGAGATCTTTGGCTAGATTTTGTTAASEQIDNO：56上述DNA序列編碼氨基酸序列如下：DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSKRKPTGYGSRKRQLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：5。2、重組人松弛素800803的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達重組人松弛素800803的轉(zhuǎn)化、篩選、誘導(dǎo)表達同實施例1。得到的重組人松弛素800803序列(WT，野生型)如下：B鏈(WT)DSWMEEVIKLCGRELVRAQIAICGMSTWSSEQIDNO：134A鏈(WT)QLYSALANKCCHVGCTKRSLARFCSEQIDNO：135。實施例6、重組人松弛素800803-1的分子克隆和表達1、重組人松弛素80...