本發(fā)明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆[Glycinemax(L.)Merr.]起源于中國(guó)，具有悠久的栽培歷史，作為我國(guó)重要的糧食作物和油料作物，其在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活中都占有極其重要的地位。近年來(lái)，我國(guó)大豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展遇到諸多瓶頸，種植面積和產(chǎn)量均呈逐年減少趨勢(shì)，其原因除了受到國(guó)際市場(chǎng)沖擊外，土傳病害的猖獗也是造成品質(zhì)差、單產(chǎn)低、持續(xù)生產(chǎn)力不穩(wěn)定等問(wèn)題的一個(gè)關(guān)鍵因素。大豆立枯病，俗稱黑根病，是由立枯絲核菌引起的一種重要的大豆土傳病害。該病主要在幼苗和幼株主根及近地面莖基部侵染發(fā)病，引起紅褐色稍凹陷病斑，皮層開裂呈潰瘍狀，植株表現(xiàn)為外形矮小、生育遲緩，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，2-3天即可死苗。據(jù)調(diào)查，大豆立枯病在我國(guó)各大豆產(chǎn)區(qū)均有分布，病害嚴(yán)重年份，死亡率可達(dá)30％以上，生產(chǎn)上防控極為困難。昆蟲病原線蟲共生菌是存在于昆蟲病原線蟲腸道內(nèi)的一類革蘭氏陰性細(xì)菌，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，包括致病桿菌屬(XeNorhabdus)、光桿狀菌屬(Photorhabdus)和沙氏菌屬(Serratia)，其分別與斯氏線蟲屬(Steinernema)、異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)及擬異小桿線蟲屬(Heterorhabditidoides)的線蟲共生。在自然界，此類細(xì)菌存在于3齡侵染期線蟲的腸道內(nèi)，隨著線蟲的侵染，而被攜帶到寄主體內(nèi)并釋放到血腔中，經(jīng)大量繁殖，產(chǎn)生毒素，在48之內(nèi)就能殺死寄主。研究表明，昆蟲病原線蟲共生菌在離體人工培養(yǎng)時(shí)，也能夠產(chǎn)生多種物質(zhì)。隨著對(duì)昆蟲病原線蟲共生菌研究的不斷深入，這些產(chǎn)物的功能亦不斷被發(fā)現(xiàn)，如對(duì)多種動(dòng)植物加人類病原菌有廣泛的抑菌活性等。目前，昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的能夠殺蟲防病的生物資源。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種昆蟲病原線蟲共生菌及其應(yīng)用。本發(fā)明的一種昆蟲病原線蟲共生菌，它為致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年4月11日，保藏號(hào)CGMCCNo.12352。它用于防治大豆立枯病。本發(fā)明昆蟲病原線蟲共生菌為革蘭氏陰性菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上為乳黃色菌落，圓形，微凸，邊緣不整齊，隨著時(shí)間延長(zhǎng)顏色加深；在NBTA培養(yǎng)基上，初生型可吸收溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)，形成藍(lán)色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果表明：昆蟲病原線蟲共生菌不能還原硝酸鹽，過(guò)氧化氫酶、氧化酶陰性，淀粉水解、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，葡萄糖、纖維二糖、麥芽糖、甘油等產(chǎn)酸為陽(yáng)性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等為陰性。本發(fā)明昆蟲病原線蟲共生菌可在NBTA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度為28℃，最適pH為7.2～7.4，轉(zhuǎn)速180r/min。NBTA培養(yǎng)基由牛肉膏5g、蛋白胨10g、營(yíng)養(yǎng)瓊脂20g、氯化鈉5g、溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)0.025g、氯化三苯基四氮唑(TCC)0.04g和蒸餾水1000mL組成。本發(fā)明昆蟲病原線蟲共生菌通過(guò)16SrDNA序列比對(duì)分析，與致病桿菌屬有極高的同源性，同源性為99％以上。通過(guò)結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定昆蟲病原線蟲共生菌屬于致病桿菌屬(XeNorhabdus)，為致病桿菌XeNorhabdusbudapestensis。平板抑菌實(shí)驗(yàn)表明，在固體培養(yǎng)條件下，本發(fā)明致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02具有較強(qiáng)的抑制大豆立枯病原菌絲生長(zhǎng)的能力，且隨著體積濃度的增加而增大，抑菌效果越明顯。附圖說(shuō)明圖1表示為致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02在PDA培養(yǎng)基上的抑菌照片(對(duì)照，CK)。具體實(shí)施方式具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種昆蟲病原線蟲共生菌，它為致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2016年4月11日，保藏號(hào)CGMCCNo.12352。本實(shí)施方式的致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02是按照如下方式獲取的：利用大臘螟誘集法從采自哈爾濱市的土樣中分離出昆蟲病原線蟲；按下列方法分離初生型共生細(xì)菌：用分離得到的昆蟲病原線蟲感染大臘螟5齡幼蟲，蟲體死亡后，用體積百分含量為75％的酒精浸泡3s后，用質(zhì)量百分含量為1％的NaClO溶液擦拭蟲體表面，并用滅菌濾紙吸干蟲體上的水分；用滅菌剪子剪掉大臘螟前足，將從傷口流出的血淋巴涂布于NBTA培養(yǎng)基上，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3天，挑取藍(lán)色單菌落為初生型共生單菌落并接種于NA培養(yǎng)液(由牛肉膏5g、蛋白胨10g和蒸餾水1000mL組成)中，于28℃下180r/min振蕩培養(yǎng)24h后，按體積比1％轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)液中振蕩發(fā)酵36-48h后，離心管中冷凍離心，取上清液，以獲得無(wú)菌體發(fā)酵液。所篩選的昆蟲病原線蟲共生菌為革蘭氏陰性菌，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上為乳黃色菌落，圓形，微凸，邊緣不整齊，隨著時(shí)間延長(zhǎng)顏色加深；在NBTA培養(yǎng)基上，初生型可吸收溴麝香百里酚藍(lán)(BTB)，形成藍(lán)色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果表明：昆蟲病原線蟲共生菌不能還原硝酸鹽，過(guò)氧化氫酶、氧化酶陰性，淀粉水解、吲哚實(shí)驗(yàn)陰性，葡萄糖、纖維二糖、麥芽糖、甘油等產(chǎn)酸為陽(yáng)性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等為陰性。對(duì)分離篩選得到的致病桿菌進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行：提取菌株的總DNA，根據(jù)共生菌16SrDNA設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，之后，進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性達(dá)到99％以上。通過(guò)結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定昆蟲病原線蟲共生菌HEB02屬于致病桿菌屬(XeNorhabdus)，為致病桿菌XeNorhabdusbudapestensis。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式的一種昆蟲病原線蟲共生菌的應(yīng)用，它用于防治大豆立枯病。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是：它是采用昆蟲病原線蟲共生菌的菌液防治大豆立枯病。其它與具體實(shí)施方式二相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二或三不同的是：所述的昆蟲病原線蟲共生菌的菌液制備方法是按照以下步驟進(jìn)行的：將致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02接種于液體培養(yǎng)基中，在28℃，180r/min的條件下，振蕩發(fā)酵培養(yǎng)36～48h，倒入離心管中冷凍離心后，取上清液，獲到無(wú)菌體發(fā)酵液。其它與具體實(shí)施方式二或三相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式四不同的是：所述的液體培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)液；1L的NA培養(yǎng)液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸餾水組成。其它與具體實(shí)施方式四相同。本
發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。通過(guò)以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果：應(yīng)用梯度稀釋法測(cè)定無(wú)菌體發(fā)酵液對(duì)大豆立枯病病原菌立枯絲核菌的拮抗作用。具體步驟為：1.前期準(zhǔn)備：采集大豆立枯病樣品，按照常規(guī)方法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、純化后，接種于PDA培養(yǎng)基上置于24℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)至菌絲剛剛長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，備用；2.帶藥培養(yǎng)基的制備：在無(wú)菌條件下，將致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02發(fā)酵液加入到PDA培養(yǎng)基中混勻，以制備5個(gè)濃度梯度，以加無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理3次重復(fù)；3.拮抗作用測(cè)定：將5mm靶標(biāo)菌(即大豆立枯病病原菌)餅分別接于上述不同濃度PDA培養(yǎng)基及對(duì)照培養(yǎng)基中心，24℃恒溫培養(yǎng)3天，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，測(cè)定抑菌圈率；4.數(shù)據(jù)處理：抑菌率公式如下，幾率值法求毒力回歸方程，算出各藥劑對(duì)病原菌的EC50。抑菌率(％)＝(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100％；為驗(yàn)證本實(shí)施例致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02的抑菌效果，現(xiàn)將結(jié)果列出如下：通過(guò)上述抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在PDA平板培養(yǎng)條件下，HEB02對(duì)絲核菌菌絲的生長(zhǎng)具有較好的抑制作用，且隨著體積濃度的增加而增大，抑菌效果越明顯(見圖1和表1)，抑菌中濃度及線性回歸方程見表2。表1PDA平板培養(yǎng)條件下致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02的拮抗效果體積比濃度0.20.10.050.0250.0125抑菌率(％)80.2773.7857.6834.2413.42注：表中數(shù)據(jù)為接菌第三天時(shí)不同濃度的抑菌率，數(shù)值為3次重復(fù)平均值。表2平板培養(yǎng)條件下致病桿菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02對(duì)大豆立枯病的毒力分析當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3