技術領域

本發(fā)明涉及生物繁殖培育技術領域，特別是一種拮抗葡萄霜霉病菌的植物內生生防菌株Zyx-3的生產方法。

背景技術：

葡萄霜霉病(Plasmopara viticola)是葡萄生產上最重要的病害之一，在我國各葡萄產區(qū)幾乎都有發(fā)生。據調查，2010 年我國葡萄栽培面積達 55.2 萬公頃，嚴重發(fā)病地塊的葡萄霜霉病發(fā)生率高達 70% 以上。近年來，我省葡萄栽培面積迅速擴大，葡萄霜霉病已成為甘肅省葡萄種植最嚴重的病害之一。給農業(yè)生產造成了巨大的經濟損失。目前，常見的預防及控制葡萄霜霉病的方法主要有種植抗病品種、準確預警、避雨栽培和化學農藥的使用。生產中，由于葡萄高效益的特點，促使果農在防治病害的過程中不斷增加化學農藥的施藥量，不但增加了對環(huán)境的污染，也降低了果品品質和其在國際市場上的競爭能力?；瘜W農藥的大量使用也導致果品中農藥殘留超標，對食品安全產生一定的影響，同時，也誘發(fā)了葡萄霜霉病抗藥性的產生，進而增大了該病害的防治難度。

隨著綠色農業(yè)的蓬勃發(fā)展，微生物源農藥以其資源豐富、生物安全性高和環(huán)境友好等特點，成為近年來研究的熱點。有研究表明，田間小區(qū)試驗中，利用鏈霉菌 A02 發(fā)酵上清液對葡萄霜霉病的防治效果可達 95.7%，枯草芽孢桿菌 B-FS01 對葡萄霜霉病的防效達 88.25%。經葉盤法檢測，磚紅微桿菌N6 對葡萄霜霉病防治效果好并且穩(wěn)定，其防效達到 74.20%。田間試驗顯示，蒼白桿菌株 SY286 發(fā)酵原液對葡萄霜霉病防效可達80% 以上。因此，利用拮抗生防菌來進行果蔬生物防治越來越引起各國研究者的重視。

而在生防細菌中研究較多的是芽孢桿菌，此外還有放射性農桿菌、熒光假單胞桿菌和某些病原細菌的無毒性突變體等。假單孢菌屬細菌大量存在于植物的根圍．許多菌株對植物有抑制病害、促進生長的作用，其中熒光假單孢桿菌是報道最多、在防治土傳病害方面應用效果較好的一類生防菌，對馬鈴薯、黃瓜、甜菜、豌豆、胡蘿卜、小麥等常見土傳病害如猝倒。假單胞桿菌及其轉基因菌株的開發(fā)與應用目前拮抗細菌對病原真菌的作用已成為研究熱點，但絕大多數是有關假單胞菌的研究。因為易于實驗室培養(yǎng)和繁殖，且該菌能利用一些簡單的新陳代謝有機物，便于檢測。假單胞菌能最大程度地適應根圍生活，具有較強的根際生態(tài)競爭力，這是其能成功用于生物防治的主要原因。但由于假單胞菌在高于45℃的情況下很快失活，所以在各國氣溫偏低的地區(qū)使用較多。在夏季室外常有50℃高溫的一些地區(qū)，不利于假單胞菌的存活，而芽孢桿菌較耐高溫，從而能正常地發(fā)揮生防效果。

芽孢桿菌的抑菌范圍很廣，包括根部病害，枝干病害、葉花部病害和收獲后果品病害 。如棉花枯萎病、黃萎病、立枯病 、小麥赤霉病、番茄青枯病、蘋果紅腐病及其他一些土傳和地上部病害。由于其具內生芽孢，抗逆性強，營養(yǎng)要求簡單。繁殖速度快并在植物根圈易于定殖，所以被廣泛應用于植物病害的生物防治中。目前應用于生防的芽孢桿菌種類主要有枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌和短小芽孢桿菌等。國外利用枯草芽孢桿菌防治絲核菌、腐霉菌、鐮刀霉等引起的病害，均取得較好的效果。

本發(fā)明解決現有技術的不足,提供一種安全便捷、拮抗效果顯著、可產業(yè)化生產的拮抗葡萄霜霉病菌的植物內生生防菌株Zyx-3的生產方法。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：

一種拮抗葡萄霜霉病菌的植物內生生防菌株Zyx-3的生產方法，包括如下步驟：

A、清洗修剪

采集葡萄葉片及葉柄，葉片及葉柄用自來水沖洗后展開晾干表面水分，葉柄剪成0.5㎝的小段，葉片剪成0.5㎝的小塊，將葉片和葉柄分別混合均勻；

B、消毒處理

將上述葉片及葉柄進行表面消毒，先將葉片及葉柄浸泡在質量濃度75%的乙醇溶液中2 min，無菌水清洗3～5次，再將葉片及葉柄浸泡在質量濃度20%次氯酸鈉溶液中5min，無菌水清洗3～5次；

C、研磨處理

將表面消毒后的葉片及葉柄在滅菌的研缽中加無菌水中研磨至糊狀，用無菌紗布過濾留取濾液；

D、增殖培養(yǎng)

濾液稀釋為10倍液和100倍液，分別取濾液、10倍液和100倍液各200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)一周；

E、純化培養(yǎng)

挑選出生防菌株Zyx-3，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA中純化培養(yǎng)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA配方為牛肉膏3 g、酵母浸膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂12g和自來水1000 mL。

所述步驟B中收集最后一次沖洗用過的無菌水，取200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，培養(yǎng)并檢測表面消毒是否徹底。

所述步驟A中葉片及葉柄分別選取不同地區(qū)、不同季節(jié)、不同品種進行采摘。

所述無菌紗布為4層，紗布目數100-500目。

本發(fā)明的有益效果在于：

內生生防菌株Zyx-3對病菌的抑菌機理主要表現為能使得病菌分生孢子及孢子囊萌發(fā)受阻，少量分生孢子雖可萌發(fā)，但萌發(fā)的芽管發(fā)生扭曲，而且芽管長度明顯縮短；且能使多種植物病原菌菌絲頂端膨大、畸形、形成膨脹泡；中間菌絲斷裂、消融，原生質外泄等。通過對Zyx-3內生生防菌株產酶能力的研究發(fā)現，其能產生水解淀粉酶、過氧化氫酶等，這也是可能是其能夠抑菌的因素之一。

經測序獲得菌株Zyx-3的16S rDNA基因有1428個堿基，GenBank 序列登錄號為：KT265261，經過Blast相似性分析，菌株Zyx-3與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens同源性最高，相似值均在99%以上。用DNAStar 軟件將菌株Zyx-3與來自GenBank的10株細菌一起構建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株Zyx-3與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(CP009684)聚在一個分支。其它菌株分別聚在另外的一支，沒有與菌株Zyx-3聚在同一支上，說明菌株Zyx-3與Bacillus subtilis (CP009684)枯草芽孢桿菌遺傳距離更近，結合形態(tài)學和生理生化特性等初步將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

本發(fā)明提供一種能夠防治葡萄霜霉病的植物內生生防菌資源。以期為開發(fā)經濟環(huán)保的生物源農藥提供菌種資源，為其開發(fā)和利用提供理論依據。該菌株的開發(fā)利用將會豐富葡萄及其它農作物病害綠色防控的技術手段，通過產業(yè)化將會增加我國生物農藥的種類，為確保糧食生產安全、農產品質量安全和生態(tài)安全保駕護航，具有廣闊的開發(fā)應用前景。

附圖說明

圖1 內生拮抗細菌Zyx-3對多種植物病原真菌菌絲的抑制作用示意圖；

圖2 PDA培養(yǎng)基上Zyx-3菌落形態(tài)；

圖3 內生拮抗細菌Zyx-3革蘭氏染色反應；

圖4 內生生防菌株Zyx-3 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹。

具體實施方式

一種拮抗葡萄霜霉病菌的植物內生生防菌株Zyx-3的生產方法，其特征在于包括如下步驟：

A、清洗修剪

葉片及葉柄分別選取不同地區(qū)、不同季節(jié)、不同品種進行采摘，采集葡萄葉片及葉柄，葉片及葉柄用自來水沖洗后展開晾干表面水分，葉柄剪成0.5㎝的小段，葉片剪成0.5㎝的小塊，將葉片和葉柄分別混合均勻；

B、消毒處理

將上述葉片及葉柄進行表面消毒，先將葉片及葉柄浸泡在質量濃度75%的乙醇溶液中2 min，無菌水清洗3～5次，再將葉片及葉柄浸泡在質量濃度20%次氯酸鈉溶液中5min，無菌水清洗3～5次；

C、研磨處理

將表面消毒后的葉片及葉柄在滅菌的研缽中加無菌水中研磨至糊狀，用無菌紗布過濾留取濾液，無菌紗布為4層，紗布目數100-500目；

D、增殖培養(yǎng)

濾液稀釋為10倍液和100倍液，分別取濾液、10倍液和100倍液各200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)一周；

E、純化培養(yǎng)

挑選出生防菌株Zyx-3，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA中純化培養(yǎng)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA配方為牛肉膏3 g、酵母浸膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂12g和自來水1000 mL。

所述步驟B中收集最后一次沖洗用過的無菌水，取200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，培養(yǎng)并檢測表面消毒是否徹底。

實施例1

A、清洗修剪

葉片及葉柄分別選取河西走廊、夏秋三季、當地種植的不同品種進行采摘，采集葡萄葉片及葉柄，葉片及葉柄用自來水沖洗后展開晾干表面水分，葉柄剪成0.5㎝的小段，葉片剪成0.5㎝的小塊，將葉片和葉柄分別混合均勻；

B、消毒處理

將上述葉片及葉柄進行表面消毒，先將葉片及葉柄浸泡在質量濃度75%的乙醇溶液中2 min，無菌水清洗3-5次，再將葉片及葉柄浸泡在質量濃度20%次氯酸鈉溶液中5min，無菌水清洗3-5次；

收集最后一次沖洗用過的無菌水，取200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，培養(yǎng)并檢測表面菌種殘留情況，消毒徹底進行下一步；

C、研磨處理

將表面消毒后的葉片及葉柄在滅菌的研缽中加無菌水中研磨至糊狀，用無菌紗布過濾留取濾液，無菌紗布為4層，紗布目數100目；

D、增殖培養(yǎng)

濾液稀釋為10倍液和100倍液，分別取濾液、10倍液和100倍液各200μL涂在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖15g、瓊脂糖12g和水1000mL，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)一周；

E、純化培養(yǎng)

挑選出生防菌株Zyx-3，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA中純化培養(yǎng)，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA配方為牛肉膏3 g、酵母浸膏1g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂12g和自來水1000 mL。

具體對比測試實驗如下：

拮抗內生細菌Zyx-3菌株對多種植物病原真菌的抑制作用

供試植物病原真菌共15種，分別是1、葡萄霜霉病菌（Plasmopara viticola）；2、葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)；3、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cucumerinum）；4、西瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）；5、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs）；6、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）；7、蘋果腐爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）；8、番瓜綿腐病菌（Pythiun aphanidermatum (Eds.) Fitzp）；9、馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani Kühn）；10、半夏早疫病菌（Alternaria sonali）；11、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola Nose）；12、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f .sp.vesinfectum(Atk ．) Snyder et Hansen）；13、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）；14、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici Leonian）；15、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) De Bary）。均保存于甘肅省農業(yè)科學院植物保護研究所植物病理實驗室。

對葡萄霜霉病菌的測定采用離體葉盤法：分別取供試品種成熟的健康葉片，用消毒的打孔器取直徑為1.5cm的葉盤，將葉盤放到倒好的質量濃度8%水瓊脂培養(yǎng)基上，每皿放置10個葉盤，每個葉盤接種10uL孢子囊懸浮液，孢子囊懸浮液濃度為1×10⁵~1×10⁶個/mL，將接種后的培養(yǎng)皿放到22℃人工氣候箱內，先黑暗處理12小時，后光照處理16h 再黑暗處理8h的條件下培養(yǎng)，以噴清水為對照，試驗設置3次重復。逐天觀察病害發(fā)生情況，7 d后觀察其發(fā)病情況并計算發(fā)病率和病情指數。病情調查：按葉片感病面積采用6級記載法。0級：無病斑；1級：病斑面積占葉面積5％以下；3級：病斑面積占葉面積5％ ～25％；5級：病斑面積占葉面積25％ ～50％；7級：病斑面積占葉面積50％～75％；9級：病斑面積占葉面積75％ ～100％。

對其它14種植物病原真菌測定采用平板對峙法：將植物病原真菌2-15作為指示菌，分別取培養(yǎng)好的各植物病原真菌菌落邊緣的菌絲塊(d=5mm)放在倒好的PDA平板中央，在培養(yǎng)皿背面距指示菌約2.5 cm十字交叉法標記4點，分別在這4點點接在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)36h的葡萄內生細菌，以不點接內生細菌為對照，置于28℃下培養(yǎng)，待到植物病原真菌長滿皿時測量抑菌帶的寬度（即內生細菌落邊緣到供試病原真菌菌落邊緣的距離），該試驗重復3 次，取平均值。

菌落生長抑制率(%)=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

將菌株Zyx-3與供試植物病原真菌對峙培養(yǎng)5d后，挑取抑菌帶中央和邊緣的病菌，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲變化情況。

表1 內生拮抗細菌Zyx-3對葡萄霜霉病菌的抑制作用

采用離體葉盤法測定其對葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)的抑菌效果，由試驗結果可知：該菌發(fā)酵液原液對葡萄霜霉病菌的抑制效果達93.34%，稀釋十倍后發(fā)酵液的抑菌效果仍可達到73.34%。

表2 內生拮抗細菌Zyx-3對14種植物病原真菌的抑菌作用

采用平板對峙法測定了其對其它植物病原真菌的抑菌能力，發(fā)現該菌對葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用也在60%以上（表2）；菌株Zyx-3對玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum（Pass.）Leonard et Suggs）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola Nose）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali Miyabe et Yamada）、茄子菌核（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) De Bary）半夏早疫病菌（Alternaria sonali）等13種供試的植物病原真菌也均有不同程度的抑制作用，抑制率在58.17%-74.12%之間，抑菌譜廣，具有很強的生防潛力。

在光學顯微鏡下鏡檢對峙培養(yǎng)中抑菌帶中央和邊緣的病菌菌絲變化狀況，發(fā)現植物病原菌受到內生拮抗細菌Zyx-3菌株抑制后主要表現出，菌落邊緣明顯停止生長，菌絲頂端膨大、畸形、形成膨脹泡、分支增多；菌絲短粗、膨大、叢枝聚集增多；中間菌絲形成致密的串狀泡囊，菌絲斷裂、消融、 原生質外泄等現象（圖1:a-2 - h-2）。而正常菌絲細長，光滑而均勻，有分支（圖1:a-1 - h-1）。圖1中標記：-1表示對照正常菌絲;-2表示處理后變形菌絲；a-葡萄灰霉病菌;b-黃瓜枯萎病菌;c-辣椒炭疽病菌;d-辣椒疫霉病菌;e-馬鈴薯立枯絲核病菌;f-葡萄白腐病菌;g-茄子菌核病菌;h-玉米大斑病菌。

在光學顯微鏡下鏡檢對峙培養(yǎng)中抑菌帶中央和邊緣的病菌菌絲變化狀況，發(fā)現植物病原菌受到內生拮抗細菌Zyx-3菌株抑制后，菌落邊緣明顯停止生長，菌絲頂端膨大、畸形、形成膨脹泡、分支增多；菌絲短粗、膨大、叢枝聚集增多；中間菌絲形成致密的串狀泡囊，菌絲斷裂、消融、 原生質外泄等現象。而正常菌絲細長，光滑而均勻，有分支。因此可以得出拮抗內生細菌Zyx-3菌株具有潛在的生防價值。

小范圍活體生測

供試葡萄品種為紅地球，試驗共設4個處理，處理1：菌株Zyx-3發(fā)酵液濃度為10⁴-10⁵cfu/mL；處理2：菌株Zyx-3發(fā)酵液濃度為10⁷-10⁸cfu/mL；處理3：菌株Zyx-3發(fā)酵液濃度為10¹⁰-10¹¹cfu/mL，；處理4：噴清水（空白對照）。每處理選5株葡萄苗，分別對葉片正反面噴霧處理，整個生育期噴霧4次。待到空白對照葉片充分發(fā)病時進行調查中間連續(xù)的3株，每株調查全部葉片。

病害分級方法：0級：無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積的5%以下；3級：病斑面積占整個葉面積的6%～25%；5級：病斑面積占整個葉面積的26%～50%；7級：病斑面積占整個葉面積的51%～75%；9級：病斑面積占整個葉面積的76%以上。

表3 Zyx-3不同濃度發(fā)酵液處理對葡萄霜霉病防治效果

調查結果（見表3）表明，菌株Zyx-3發(fā)酵液濃度分別為10⁴-10⁵cfu/mL、10⁷-10⁸cfu/mL和10¹⁰-10¹¹cfu/mL時，對葡萄霜霉病的防效分別為34.45%~42.25%、50.12%~57.45%和60.03%~70.47%之間。

拮抗內生細菌Zyx-3菌株產酶能力的研究

蛋白酶測定： 培養(yǎng)基為酪蛋白10.0g，牛肉膏3.0g，Nacl5.0g，K₂HPO₄2.0g，瓊脂粉15.0g，水1000ml，PH7.4。

纖維素酶：培養(yǎng)基為 (NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄0.5g，KH₂PO₄1.0g， NaCL0.5g ，纖維素粉2.0g，剛果紅0.4g，瓊脂15.0g，水1000ml，接種新鮮的Zyx-3菌株，觀察透明圈。②采用肉汁胨液體培養(yǎng)基，接種新鮮的Zyx-3菌株，同時浸泡一條滅菌的優(yōu)質濾紙，觀察濾紙條1-4周的分解情況。

過氧化氫酶：移一環(huán)新鮮培養(yǎng)的菌株Zyx-3放在潔凈的載波片上，加一滴過氧化氫，觀察氣泡的產生情況。

膦酸酯酶：培養(yǎng)基為酵母提取物0.5g，葡萄糖10.0g，Ca₃(PO₄)25.0g，(NH₄)₂SO₄0.5g，Kcl0.2g，Mgcl20.1g ，MnSO₄ ．H₂O 0.1mg，Fe SO₄ 0.1mg，瓊脂15.0g，水1000ml，接種新鮮的Zyx-3菌株，觀察透明圈。

油脂酶：培養(yǎng)基為蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，Nacl5.0g，花生油10.0g，瓊脂粉15.0g，質量濃度1.6%中性紅水溶液1 ml，水1000ml，PH7.2左右，接種新鮮的Zyx-3菌株，觀察透明圈。

淀粉酶：培養(yǎng)基為在上述NA培養(yǎng)基中加入質量濃度2%的可溶性淀粉倒成平板，倒置過夜后，接種新鮮菌種，28℃條件下培養(yǎng)，待形成明顯均落后滴加碘液，觀察菌落四周顏色變化。

從內生細菌Zyx-3產酶能力測定結果可以看出：能水解淀粉，不能水解纖維素；能產生過氧化氫酶；不能產生蛋白酶、油脂酶和磷酸酯酶 。

內生拮抗細菌Zyx-3發(fā)酵液對葡萄苗生長的影響

將不同濃度（10⁴-10⁵cfu/ml；10⁷-10⁸cfu/ml；10¹⁰-10¹¹cuf/ml）的Zyx-3發(fā)酵液（NA培養(yǎng)液）噴霧到溫室種植的紅地球苗木上，觀察有無藥害產生。

通過觀察內生拮抗細菌Zyx-3不同濃度菌懸液對葡萄苗木安全，未出現藥害現象，可以在葡萄上使用。

內生拮抗細菌Zyx-3發(fā)酵液對種子萌發(fā)率和出苗的影響結果

將小麥、玉米種子分別置于不同濃度（10⁴-10⁵cfu/ml；10⁷-10⁸cfu/ml；10¹⁰-10¹¹cfu/ml）的Zyx-3發(fā)酵液（將內生細菌Zyx-3在NA培養(yǎng)基上活化后，接種到NA培養(yǎng)液（牛肉膏3 g，酵母浸膏1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，自來水1000 mL，pH自然。）中，28℃條件下，180r/min，搖培2d。）中浸泡30min后，放在鋪有兩層無菌水浸濕的滅菌紙的直徑為90mm的培養(yǎng)皿內，每皿分別放10粒種子，3次重復，并設對照處理，28℃條件下保濕培養(yǎng)。每24h觀察一次，統(tǒng)計種子發(fā)芽粒數，計算發(fā)芽率。

發(fā)芽率（%）=（發(fā)芽的種子粒數/供試種子總粒數）×100

表4 內生拮抗細菌Zyx-3對不同作物種子發(fā)芽速率的影響

將試驗結果經Duncan新復極差法分析可知（表4），不同濃度(10⁴ cfu/ml -10¹¹ cfu/ml)的內生拮抗細菌Zyx-3發(fā)酵液浸種處理的小麥和玉米種子，種子的發(fā)芽率均與未處理的對照沒有明顯的差異，說明內生拮抗細菌Zyx-3對這2種作物種子萌發(fā)是安全的，沒有抑制作用，也沒有明顯的促生作用。

內生拮抗細菌Zyx-3的鑒定

形態(tài)學及生理生化特性研究：

參考東秀珠《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和方中達《植病研究方法》的研究方法，進行形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特性及生理生化特性測定。

16S rDNA鑒定：

細菌基因組DNA的提?。焊鶕?6S rDNA兩端的保守序列，采用一對細菌的通用引物27F ：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3。引物由上海桑尼生物工程有限公司合成。PCR反應體系為：10×Buffer(含 2.5mMMg2+) 5.0ul，Taq 聚合酶(5u/μL) 1.0ul，dNTP（10mM）1.0ul，27F 引物 (10uM) 1.5ul，1492R引物 (10uM) 1.5ul，基因組DNA1.0ul，ddH2O39.0ul。擴增程序為：95℃預變性5min；95℃變性 30s；55℃退火45s；72℃延伸1min30s；循環(huán)數45后，再72℃終延伸7min。反應完成后，取3ul PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。確認PCR擴增片段。將特異性條帶亮度好、純度高且無非特異性條帶的PCR產物冷凍條件下，送上海桑尼生物科技有限公司進行DNA測序。用BLAST軟件將所得序列與GenBank(http://www.ncbi.nln.nih.gov)中已知的16S rDNA進行同源性比較，而后用DNAstar軟件進行多序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

內生細菌Zyx-3在PDA上生長，菌落呈現圓形，表面凸起，后產生皺褶，表面無光澤，不光滑（圖2）。在PDA斜面上劃線培養(yǎng)生長良好，邊緣整齊。在澄清的牛肉膏培養(yǎng)液中生長良好，在培養(yǎng)液表面形成褶皺的膜層，液體不渾濁。內生細菌Zyx-3需氧，能運動；能夠使明膠液化；可以水解淀粉；過氧化氫酶反應為陽性；可以在質量濃度10% NaCL培養(yǎng)液中生長；不能利用檸檬酸鹽；不能水解纖維素；不產生H₂S。在光學顯微鏡觀察下，菌體呈桿狀，革蘭氏染色為陽性，芽孢著生于菌體的中間，柱形或者橢圓形（圖3）。根據形態(tài)特征可以初步確定Zyx-3為芽孢桿菌屬(Bacillus spp．)。

經質量濃度1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，提取的細菌基因組DNA條帶清楚、 亮度高，且無非特異性條帶，說明獲得的基因組DNA純度高，可用作為16S rDNA PCR擴增的模板。16S rDNA PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，菌株Zyx-3在1500bp處有一條明亮的PCR目的條帶，且無其他非特異性條帶。表明16S rDNA PCR擴增得到的目的DNA片段產量高、純度好。經測序獲得菌株Zyx-3的16S rDNA基因有1428個堿基，GenBank 序列登錄號為：KT265261，經過Blast相似性分析，菌株Zyx-3與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis同源性最高，相似值均在99%以上。用DNAStar 軟件將菌株Zyx-3與來自GenBank的10株細菌一起構建基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，Zyx-3與枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis(CP009684)聚在一個分支。其它菌株分別聚在另外的一支，沒有與菌株Zyx-3聚在同一支上(圖4)，說明菌株Zyx-3與Bacillus subtilis (CP009684)枯草芽孢桿菌遺傳距離更近，結合形態(tài)學和生理生化特性等將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。