專利名稱：檢測葡萄苦腐病菌的引物和探針及其檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術，具體地說涉及葡萄苦腐病菌檢測用引物和探針及其檢測方法。
背景技術：
葡萄苦腐病(bitter rot)是美國和澳大利亞等國葡萄(Wm/eraL.)上重要的果實腐爛病害，其病原菌葡萄苦腐病菌(O^^n'aMV/CO/。)主要分布在美國、澳大利亞、新西蘭、巴西、南非、希臘、印度、日本和中國臺灣，我國大陸沒有明確記錄，是我國重要的檢疫性有害生物。G m^o/a病菌可侵染葡萄的果實和技葉，對鮮食葡萄和酒用葡萄等都有嚴重影響，使葡萄的產量和果實的質量、風味下降。G m^o/a病菌可隨水果(葡萄)貿易進行傳播，為保護我國經濟發(fā)展，我國已對多個國家的鮮食葡萄實行了巿場準入，密切防范該危險性有害生物的進入。
本發(fā)明選擇葡萄苦腐病菌ITS序列設計一條熒光標記探針和一對引物，建立了葡萄苦腐病菌的熒光PCR檢測方法，反應結束即可根據擴增曲線判定是否有葡萄苦腐病菌。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種葡萄苦腐病菌檢測用引物及一種葡萄苦腐病菌檢測用探針。
本發(fā)明另一目的在于提供一種葡萄苦腐病菌的檢測方法。
根據發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種葡萄苦腐病菌檢測用引物，其核苷酸序列為
FP: 5'-TCGCGGCTGGAGAAGG-3'
RP: 5 ， - TCGATGCCAGAACCAAGAGAT -3 ，。
3本發(fā)明還提供一種含有前述引物的試劑盒。
本發(fā)明還提供 一種與前述引物配合使用的探針，其核苷酸序列
為5，- TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT -3，，該探針 一端標記有報告熒光染料，另一端采用了熒光性的淬滅基團。
前述的探針，其5，端標記有FAM熒光染料，3'端釆用了熒光性的淬滅基團TAMRA?？梢愿鶕景l(fā)明給出的引物對或者其擴增產物序列設計其他類型的探針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。
本發(fā)明還提供一種含有前述引物及探針的試劑盒。
本發(fā)明另外提供 一種檢測葡萄苦腐病菌的方法，其是以樣品總DNA為模板，利用前述的引物及探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結束釆集數據，反應結東后根據擴增曲線判定結果。
前述的方法，其中實時熒光PCR的反應過程中的退火和延伸溫度為60°C。
本發(fā)明通過分析已報道葡萄苦腐病菌ITS序列的基礎上，分別設計引物和熒光探針。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo. 1和2所示；所述探針核苷酸序列如序列表SEQIDNo. 3所示，該探針為普通的Taqman探針。
普通Taqman探針技術，即將報告熒光染料標記在探針的5，端，而3'端釆用了熒光性的淬滅基因，當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基因吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，由于Taq酶具有5'端到3，端的外切酶活性，在擴增延伸階段將與模板結合的探針切斷，淬滅基團的抑制作用消失，報告熒光染料產生熒光信號，從而實現對葡萄苦腐病菌的檢測。
本發(fā)明還進一步給出了應用上述引物和探針的熒光PCR檢測方法，具體地說本發(fā)明以樣品總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應體系為8 超純水，12.5 (iL 2xMaster Mix， 1 |iL引物FP ( 10pmol/L ), 1 |xL引物RP( 10 |imol/L ), 1.5 jiL TaqMan探針(10 pmol/L )，1 jxL( lng )總DNA,總體積為25|xL。 TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents購自Applied Biosystems公司。
反應條件第一個循環(huán)為95'C10min;隨后40個循環(huán)，94°C 15 s, 60 °C 1 min。
本發(fā)明根據葡萄苦腐病菌ITS序列設計的引物及探針，該探針特 異性好，用于熒光PCR檢測靈敏性高。此外，本發(fā)明檢測方法準確 性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有葡萄苦腐病菌， 為進出口安全提供了保證。


圖1是本發(fā)明實施例4釆用實時熒光PCR技術檢測葡萄苦腐病 菌的結果示意圖，1: G. w/co/a ; 2:感染G. wWco/a的紅提葡萄；3: ddH20; 4:空白對照；5:紅提葡萄；6:
dz)9/0(^e〃"； 10: A/o ///"/a々Mc//<ge a; 11: 戶e"/c/〃/wm ex/ awsMm; 12:
圖2是本發(fā)明實施例5檢測方法的靈敏度檢測實驗結果示意圖， 1: DNA濃度50 ng/pL; 2: DNA濃度5 ng/pL; 3: DNA濃度0.5 ng L; 4: DNA濃度0.05 ng L; 5: DNA濃度0.005 ng/pL; 6: DNA濃度 0.0005 ng/jiL; 7: DNA濃度0.00005 ng/|iL; 8: ddH20; 9:空白對
昭
具體實施例方式
以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 實施例l引物及探針的設計和合成
根據葡萄苦腐病菌ITS序列，釆用探針設計軟件Express 3.0設 計引物及探針，引物序列為
FP (正向)5,- TCGCGGCTGGAGAAGG -3,
RP (反向)5，- TCGATGCCAGAACCAAGAGAT -3，探針的序列為5，- TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT -3'， 該探針的5，端用FAM熒光染料標記，3'端釆用了熒光性的淬滅
基團TAMRA。
實施例2總DNA的提取
1) 釆集適量真菌菌絲體或染病果實、葉片，用液氮研成粉末， 取0.4g裝入1.5mL離心管中。
2) 預熱CTAB提取液到65°C,加600pL到裝有粉末的1.5mL離 心管中，混勻。
3) 立即置于65。C水浴lh，后加入(500iiL)氯仿/異戊醇(24:1), 上下顛倒數次，13200g離心IO分鐘。
4) 吸取上清液約400|iL于一新2.0ml離心管，加入(500|il) 氯仿/異戊醇(24:l), 500!iLCTAB提取液，輕輕混勻，13200g離心10 分鐘。
5) 取800[il上清于一新1.5mL離心管，加入500iiL異丙醇，輕 輕混勻，室溫放置20min。
6) 13200g離心20min，去上清，用70%乙醇洗沉淀，室溫干燥。 7 )加入50[aL 1 xTE Buffer ( 10mM Tris陽HCl ; lmM EDTA;含
20嗎Rnase; PH=8.0),置于4。C過夜，待DNA溶解后，檢測DNA 濃度及質量。
實施例3實時PCR擴增方法的建立
1、 實時熒光PCR反應體系
以總DNA為模板，進行實時熒光PCR反應，反應體系為8 )iL 超純水，12.5 2xMaster Mix, 1 pL引物FP ( 10 pmol/L ), 1 pL引 物RP ( 10 )imol/L ), 1.5 TaqMan探針(10 (imol/L ), 1 pL ( lng ) 總DNA，總體積為25pL。
2、 實時熒光PCR反應條件
將樣品管放入ABI公司ABI7700熒光PCR儀后，設置如下條件進行反應第一個循環(huán)為95'Cl0min;隨后40個循環(huán)，94°C 15 s, 60 'Clmin。每個循環(huán)結東后釆集數據。反應結東后根據擴增曲線判定 結果。
實施例4葡萄苦腐病菌實時PCR方法的特異性確定
以真菌菌絲體或染病葡萄果實、葉片的總DNA為模板，以葡萄上 其他常見真菌以及健康的葡萄為對照，通過實時熒光PCR檢測熒光強 度變化。
試驗結果
以真菌菌絲體或染病葡萄果實、葉片總DNA為模板，通過實時熒 光PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度(ARn)變化，而葡萄上其他常 見真菌以及健康的葡萄樣本的熒光強度沒有變化，結果如圖l所示。 實施例5檢測方法的靈敏度實驗
用超純水分別稀釋G.t/Wco/a的DNA,進行相對靈敏度檢測，在 25|uL反應體系中，DNA分別為50ng/jLiL 、 5.0ng小L 、 0.5ng/|iL 、 0.05ng/nL、 0.005ng爾L、 0.0005ng/iaL和0.00005ng/jiL。檢測結果如圖 2所示，最低檢測限是0.0005 ng L。序 列 表
<110>中國檢驗檢疫科學研究院
<120>檢測葡萄苦腐病菌的引物和探針及其檢測方法
<130> KHP09113177.9
<160> 3
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgcggctggagaagg 21
<210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400〉 2
tcgatgccagaaccaagagat 24
<210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3
tgccggtggccctgtaaactcttgt 23
8
權利要求
1、一種葡萄苦腐病菌檢測用引物，其特征在于其核苷酸序列為FP5’-TCGCGGCTGGAGAAGG-3’RP5’-TCGATGCCAGAACCAAGAGAT-3’。
2、 含有權利要求l所述引物的試劑盒。
3、 一種與權利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于其核苷酸序列為5，- FAM- TGCCGGTGGCCCTGTAAACTCTTGT-TAMRA-3',該探針一端標記有報告熒光染料，另一端釆用了熒光性的灃滅基團。
4、 如權利要求3所述的探針，其特征在于，該探針5，端標記有FAM熒光染料，3'端釆用了熒光性的淬滅基團TAMRA。
5、 含有權利要求2所述引物以及權利要求3或4所述探針的試
6、 一種檢測葡萄苦腐病菌的方法，其特征在于，以樣品總DNA為模板，利用權利要求1所述的引物以及權利要求3或4所述的探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結束釆集數據，反應結東后根據擴增曲線判定結果。
7、 如權利要求6所述的方法，其特征在于，實時熒光PCR的反應過程中的退火溫度為6(TC。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種葡萄苦腐病菌檢測用引物及探針，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1&2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。本發(fā)明還進一步提供了檢測葡萄苦腐病菌的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用上述引物和探針進行實時熒光PCR擴增，每個循環(huán)結束采集數據，反應結束后根據擴增曲線判定結果。本發(fā)明探針特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，靈敏度高，為進出口安全提供了保證。
文檔編號C12R1/645GK101671742SQ20091023611
公開日2010年3月17日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權日2009年10月20日
發(fā)明者吳品珊, 杜洪忠 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院