專利名稱：一種寬pH適用性的木聚糖酶XYNA4及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種寬pH適應性木聚糖酶XYNA4 及其基因和應用。
背景技術：
木聚糖(xylan)是植物半纖維素的主要成分，廣泛存在于自然界中，其含量僅次 于纖維素是第二豐富的多聚糖(Collins et a 1. FEMS Microbiology Reviews. 2005， 29 : 3-23.)。木聚糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱。目前木聚糖酶在 飼料，面包，啤酒、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領域得到了日益廣泛的應用。在造紙工業(yè)中， 木聚糖酶可以應用于生物制漿、紙漿漂白、廢紙脫墨處理處理等，特別是其在紙漿生物漂 白中，木聚糖酶與傳統(tǒng)的氯漂白配合，促使紙漿中殘余木質素的降解和溶解性木質素的抽 除，不但可以提高紙漿的白度和白度穩(wěn)定性，改善纖維的濾水性和造紙性能，而且可以降 低后續(xù)漂序化學物質的用量，減少富含氯化物的工業(yè)廢水的排放，從而降低紙漿漂白對環(huán) 境產生的污染(Polizeli et al. AppliedMicrobiology and Biotechnology. 2005， 67 : 577-591.)。 脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus)是一類嗜熱耐酸菌。由于脂環(huán)酸芽孢桿菌 (A. acidocaldarius)等可以引起巴氏滅菌果汁的腐敗，產生難以接受的氣味，加上其獨特 的生存能力。目前已引起全球食品工業(yè)和學術界的極大關注。目前關于來源于脂環(huán)酸芽孢 桿菌來源的木聚糖酶基因及其克隆與表達還沒有相關的報導。 由于在飼料和造紙工業(yè)中，動物胃腸道和漂白紙漿的pH值出現(xiàn)較大的波動。因 此，獲得新型具有優(yōu)良pH穩(wěn)定性和適用性的木聚糖酶的研究具有重大意義?？寺『头蛛x具 有高pH穩(wěn)定性和適應性的的木聚糖酶可以更好的應用于飼料和造紙工業(yè)，而且可以降低 生產成本，都是木聚糖酶應用于工業(yè)化生產所必需的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應用的寬pH適應性木聚糖酶。
本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述寬pH適應性木聚糖酶的基因。
本發(fā)明的另一 目的是提供包含上述基因的重組載體。
本發(fā)明的另一 目的是提供包含上述基因的重組菌株。 本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述寬pH適應性性木聚糖酶的基因工程方 法。 本發(fā)明的另一 目的提供上述寬pH適應性木聚糖酶的應用。
本發(fā)明的另一 目的是提供一種脂環(huán)酸芽孢桿菌。 本發(fā)明從脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4，(保存于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究 所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 3147，保藏日期2009年6月29號)中分離得到一種新的寬pH適用性木聚糖酶XYNA4。本發(fā)明提供了一種寬pH適應性木聚糖酶XYNA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所不。 SEQ ID NO. 1 :
MTDTYRNIPSLS:
ADDDTWRDNFPVRGRKDWPLLFDVNHGPKQAFWSVVEF 該酶基因編碼338個氨基酸，因此成熟的木聚糖酶XYNA4的理論分子量為 38.6kDa。 本發(fā)明的木聚糖酶XYNA4在中性及酸堿性范圍內均具有較高活性。本發(fā)明篩選到 一種脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCCNo. 3147)所產生的木聚糖 酶，其在大腸桿菌的重組酶最適pH值為7. O，在pH3. 8 9. 4的范圍內維持40%以上的酶 活性；在P朋.2 9. 4的范圍內維持60%以上的酶活性；在pH2. 6 12. 0的范圍內37。C保 溫60分鐘，能夠保持90%以上的酶活性。最適溫度為55°C ，在45°C _65°C間均具有60%以 上的酶活力；在6(TC保溫60分鐘，剩余酶活達到90^以上。這種性質的木聚糖酶還未曾有 過報道。 本發(fā)明提供了編碼上述寬pH適應性木聚糖酶XYNA4的基因。具體地，該基因的基 因序列如SEQ ID NO. 2所示
SEQ ID NO. 2 :
TTTTGGAGCGTGGTTGAATTTTGA 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因XYNA4， DNA全序列分析結果表 明，木聚糖酶XYNA4結構基因XYNA4全長1017bp，含有一個終止子TGA。木聚糖酶XYNA4 的成熟蛋白理論分子量為38. 6kDa。將木聚糖酶基因XYNA4序列及推導出的氨基酸序列在 GenBank中進行BLAST比對。該基因與來源于Alicyclobacillusacidocaldarius的木聚糖酶(ACV59335. 1)氨基酸序列一致性為62% 。與來源于Geobacillus stearothermophilus 的已知活性木聚糖酶(ABI49937. 2)氨基酸序列一致性為53% ，說明XYNA4是一種新的木聚 糖酶。 本發(fā)明還提供了包含上述木聚糖酶基因XYNA4的重組載體，優(yōu)選為載體 pET-22b(+)。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使 其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案， 優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質粒pET-22b(+)上的EcoR I和Hind III限制 性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于啟動子的下游并受其調控，得到重組大腸表達質粒 pET-22b(+)-XYNA4。 本發(fā)明還提供了包含上述寬pH適應性的木聚糖酶基因XYNA4的重組菌株，優(yōu)選所 述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株大腸桿菌BL21 (DE3)。
本發(fā)明還提供了一種制備寬pH適應性的木聚糖酶XYNA4的方法，包括以下步驟
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及
3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYNA4。 其中，優(yōu)選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞、啤酒酵母細胞、畢赤酵母細胞或多型遜 酵母細胞，優(yōu)選將重組表達質粒轉化大腸桿菌細胞(Escherichia coli)BL21 (DE3)，得到重 組菌株BL21 (DE3) /XYNA4。 本發(fā)明還提供了上述寬pH適應性的木聚糖酶XYNA4的應用。
本發(fā)明首先所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種性質優(yōu)良的、 適合于在飼料，食品和造紙工業(yè)中應用新的木聚糖酶。本發(fā)明的木聚糖酶最適pH為7. 0，在 pH 6. 2 9. 4都有較高的酶活性(60%以上);pH穩(wěn)定性好；比活力為420. 2U/mg ;具有較 好的耐熱的能力。其較高耐熱性能，可以有效降低在飼料加工過程中酶活力的損失，降低木 聚糖酶的應用成本。較高PH適應范圍提高飼料中非淀粉性多糖的轉化率，降低配方成本， 減少環(huán)境污染；改善面包加工過程的外觀品質；可應用于啤酒工業(yè)，降低麥芽汁的粘度，提 高過濾效率，增加麥芽汁產率；還可以用于生物能源中，如將造紙工業(yè)廢料及農業(yè)廢棄物中 的木聚糖轉化為D-木糖單體，進而被大多數(shù)微生物代謝，轉化成有價值的燃料。水解產物 (木糖和低聚木糖)可應用在保健食品行業(yè)；在制藥工業(yè)中木聚糖與其它物質結合使用，可 以延緩藥物成分的釋放。


圖1在大腸桿菌中表達的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1 :低分子量蛋白
質Marker ;2 :純化的重組木聚糖酶。 圖2重組木聚糖酶的最適pH。 圖3重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。 圖4重組木聚糖酶的最適溫度。 圖5重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。 脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147，保存于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，100101)，其保藏號為:CGMCC No. 3147，保藏日期:2009年06月29號。
具體實施例方式
試驗材料和試劑 1、菌株及載體脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147，保 存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院 微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 3147。大腸桿菌表達載體pET-22b (+)及菌 株BL21 (DE3)購自于Merch公司。 2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養(yǎng)基 (1)脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4CGMCC3147培養(yǎng)基組成 為 生長培養(yǎng)基0. 2%蛋白胨、0. 1%酵母提取物、0. 2%葡萄糖，pH3. 0. 產酶培養(yǎng)基0. 2%蛋白胨、0. 1%酵母提取物、0. 5%木聚糖，pH3. 0. (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1X蛋白胨、0. 5%酵母提取物、1% NaCl，pH7.0)。 說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗
指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。 實施例l脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No. 3147)的 分離純化及其產酶特性 采自云南高溫泉流淌物土樣轉接到富集培養(yǎng)基(酵母提取物1. 0g、胰蛋白胨2. 0g 用鹽酸調pH2. 0) ，6(TC培養(yǎng)72小時后，稀釋涂板至分離培養(yǎng)基(酵母提取物1. 0g、胰蛋白 胨2. 0g、燕麥木聚糖5. Og，瓊脂30，剛果紅0. 5g，用鹽酸調pH3. 0)6(TC培養(yǎng)72小時后，根 據透明圈的有無和大小挑取到一株產酶菌株，編號為A4，根據16SRNA和菌株特性鑒定為脂 環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4。將脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4然后轉接生長培養(yǎng)基(酵母提取物1. Og、胰蛋白胨2. 0g用鹽酸調pH3. 0)， 測試其最適生長溫度和pH值。結果表明其最適生長溫度為6(TC和pH3.5。將脂環(huán)酸芽孢 桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4經產酶培養(yǎng)基(酵母提取物1. Og、胰蛋白胨2. 0g 燕麥木聚糖5. Og，用鹽酸調pH3. 0)6(TC培養(yǎng)48小時后，測定上清液的木聚糖酶活性。證明 其具有木聚糖酶活性。 實施例2脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No. 3147)木 聚糖酶編碼基因XYNA4的克隆 提取脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No. 3147)基因組 DNA : 將液體培養(yǎng)2天的菌液離心取菌體，加入lmL溶菌酶，37t:處理60min，再加入裂 解液，65t:水浴鍋裂解30min，每隔10min混勻一次，在4t:下10000rpm離心5min。取上 清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4t:下 10000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-2(TC備用。 根據第十家族木聚糖酶基因的保守(YDWDV和HGIGM)序列設計合成了簡并引物 XYN10F， XYN10R如表1 以脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No. 3147)總DNA 為模板進行PCR擴增。PCR反應參數(shù)為94t:變性5min ;前10個循環(huán)，94t:變性30sec， 48°C-53°C touchdown (0. 5°C/循環(huán))退火30sec， 72。C延伸lmin，然后25個循環(huán)條件為后 94。C變性30sec，53。C退火30sec，72。C延伸lmin。最后72。C保溫10min。得到一約258bp 片段，將該片段回收后與pEASY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。
根據測序得到的核甘酸序列，設計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性嵌套引物 設計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，并將它們分別命名為uspl， usp2， usp3(上游特異性 引物)，dspl， dsp2， dsp3(下游特異性引物)見表1。
表l.木聚糖酶XYNA4TAIL-PCR特異性引物
PrimerSequence (5"3f
XYNWFTAYGAYTGGGAYATNGCT
XYN10RYTGCATNCCDATNCCRTG
xynA4FliliGAAi lCiiAi(iAUCjALAU 1A1 CXjCjAAJ A復
xynA4RGGGAAGCTTAAATTCAACCACGCTCCAAAACGC
，1nr* a ATmTpn a Tnmrwrr a r1 a fin a
sp2
sp3rGATOAAdOTdTfTrrATfTArGG
uspl
usp2
usp3N代表A， G， C或T ;M代表A或C ;S代表C或G ;W代表A或T ;D代表A， G或T ;Y
代表C或T 通過TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收后測序。通過 比較木聚糖酶的基因組序列后發(fā)現(xiàn)該基因全長1017bp，編碼338個氨基酸和一個終止密 碼子，N端沒有預測的信號肽序列。所測出的基因XYNA4的核苷酸序列與GeneBank上的 木聚糖酶基因序列進行同源比較，最高一致性為65%，氨基酸序列最高一致性為62%。與 已知活性木聚糖酶氨基酸序列一致性為53X，說明XYNA4是一種新的木聚糖酶，表明從Alicyclobacillus hesperidumA4(CGMCC No. 3147)中分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基 因為新基因。 實施例3重組木聚糖酶的制備。 將表達載體PET-22B(+)進行雙酶切(EcoRI+Hind III)，同時將編碼木聚糖酶 的基因XYNA4雙酶切(EcoRI+Hind III)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達載體 pPET-22B(+)連接，獲得含有Alicyclobacillus hesperidum A4(CGMCC No. 3147)木聚糖酶 基因XYNA4的重組質粒PET-22b (+) -XYNA4并轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌 菌株BL21(DE3)/XYNA4。 取含有重組質粒的BL21 (DE3)菌株，接種于200mL LB培養(yǎng)液中(1000ml三角瓶)， 37°C 250rpm振蕩培養(yǎng)3 4h后，添加IPTG誘導。30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)10 12h后，離 心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達量為0. 38U/mL。所表達的木聚糖 酶經過鎳柱純化之后，經過SDS-PAGE電泳分析，結果(圖1)表明，重組木聚糖酶在大腸桿 菌中得到了表達。 實施例4重組木聚糖酶的活性分析 DNS法具體方法如下在pH7. 0 (0. 1M磷酸二氫鈉-檸檬酸)，55"條件下，lmL的 反應體系包括100iiL適當?shù)南♂屆敢汉?00iiL(l%， w/v)底物，反應10min，加入1. 5mL DNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm測定0D值。1個酶活單位(U)定義為在給定的 條件下每分鐘釋放出1 P mol還原糖的酶量。
實施例5重組木聚糖酶XYNA4的性質測定 1、重組木聚糖酶XYNA4的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下 將實施例3純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進行酶促反應以測定其最適pH。
底物木聚糖用不同PH的緩沖液(0. 1M甘氨酸-鹽酸pH2. 2-5. 4 ;0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫
二鈉pH5. 4-7. 8 ;0. 1M Tris-HCl pH7. 4-8. 6 ;0. 1M甘氨酸-氫氧化鈉pH8. 6-12. 0)、在55。C
下進行木聚糖酶活力測定。結果(圖2)表明，XYNA4的最適pH為7. 0，在p朋.2 9. 4的
范圍內，酶活性均維持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中
37t:處理60min，再在pH7. 0緩沖液體系中55。C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結果
(圖3)表明木聚糖酶在pH2. 6-12. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內處理60min后剩余酶活
性在90%以上，這說明此酶具有較好的pH穩(wěn)定性。 2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下 木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液(pH7. 0)緩沖液體 系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在 55t:下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖4)表明其最適溫度為55t:。酶的 熱穩(wěn)定性性試驗表明(圖5)，重組酶在6(TC時穩(wěn)定性非常好。65t:下保溫60min，剩余酶活 性為31.6%。 3、木聚糖酶的Km值測定方法如下 用不同濃度的木聚糖(4_0_Me_D_glucurono_D_xylan， Sigma From birchwood)為 底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH7. 0)緩沖液體系中，55t:下測定酶活性，計算出其 在5(TC下的km值。經測定，此木聚糖酶在55t:下以木聚糖為底物的km值為1.90mg/mL，最 大反應速度V隨為417. 93 ii mol/min mg。
4、不同金屬離子化學試劑對XYLA4酶活的影響測定如下 在酶促反應體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質終濃度為1和10mmol/L。在55°C 、pH7. 0條件下測定酶活性。結果(表2) 表明，大多數(shù)離子和化學試劑在濃度為lmmol時重組木聚糖酶的活力沒有明顯變化。Zn2+， Ci^，Ni^Ag+可以部分抑制其活力，但是Hg"和SDS幾乎強烈抑制其活力。當濃度為10mmo 時Zn2+， Cu2+， Ni2+， Ag+， Hg2+，和SDS均強烈抑制其活力。P _巰基乙醇在lmmol和lOmmol時 能分別使重組酶活力增加到原來的1. 13和1. 32倍。
表2.各種化學試劑對木聚糖酶XYNA4活力的影響<formula>formula see original document page 10</formula>12000rpm離心后用3k的超濾膜高速離心后，用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜_脈 沖安培(HPAEC-PAD)檢測方法，進行產物中糖種類的分析。分析結果表明木聚糖酶XYNA4 降解燕麥木聚糖的產物主要是木糖，木二糖和少量木三糖和木四糖。產物中木糖含量為
51. 50%，木二糖含量為34. 30%，木三糖的含量為7. 53%，木四糖含量為6. 65%。序列表〈110〉中國農業(yè)科學院飼料研究所〈120〉 一種寬pH適應性木聚糖酶XYNA4及其基因和應用〈160>2〈210>1〈211>338〈212>PRT〈213〉脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus hesperidum A4)〈400>1MTDTYRNIPSLSERYRPYFRIGAAVNAKSL NTHRDLLVTH FNSVTAENEMKWEEIHPEQD60RYEFAKADALVNFAREHGMFVRGHTLVWHN QTPAAVFLDD LGQTATAAVVERRLEEHVAT120VLGRYHNDIYDWDVANEAVVDAGTGFLRDS RWLQTLGDDY IAKAFRIAHQAAPDALLFYN180DYNETKPDKSERIYKLVAGLLDEGVPIHGI GMQGHWMLDD PALDEIERAIDRYASLGVHL240HITELDVCVYG匪GTGGQSQEVLPYDDEL AKRLAERYRS LFSSLRARKDVIESVTFWGV300ADDDTWRDNFPVRGRKDWPLLFDVNHGPKQ AFWSVVEF 338〈210>2〈211>1017〈212>DNA〈213〉脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus hesperidum A4)〈400>23tg3Ctg3C3cttetcggaatettccttcc ttgagtgagc gcteccgcccgtectttcgc60attggtgctgccgtcaatgccaagtccctg aatecccacc gtgacttgttggtcacgcat120ttteacagcgtg3CCgC3g3g朋cga朋tg朋gtggg朋g 3g3ttC3tCC3g朋C3gg3t180cgatecgagttcgca朋ggcggatgcactc gtgaattttg cccgcgagcacggtetgttt240gtccgcggccacacgttggtctggcacaat caaacgccag ccgcagtgtttctggacgat300ctcggtcaaaC3gCg3C3gCggccgttgtc gagcgtcgac tcgaagagcatgtggc朋ca360gtgcttggtcgateccac朋cgacatctec gactgggatg ttgcc朋cgaggcagtcgtc420gatgcgggtecaggatttttacgggacagt cgctggctgc agacccttggcgatgattec■3ttgCg朋ggcttttcgcatcgcacatcaa gcggcaccag acgcactgctcttctecaac540gactec朋tgcgate朋tcg gagcgcattt 3ca朋cttgttgcaggtctg600
ctcgatgaag gtgtccccat ccatgggatt ccggcgctgg acgaaattga acgagctetc cacatcacag aactcgacgt gtgtgtttet caagaagttc teccctecga cgatgaactt ctgttttcat cgttgcgcgc tcgcaaggat gctgatgatg atecctggcg ggacaacttc ctgtttgacg tgaaccacgg gccgaaacag
ggtetgcagg ggcactggat gttggacgat 660
gaccgctecg cgtcactcgg tgtgcacctt 720
ggcaatgtcc acggaacggg cggccaatcc 780
gccaaacgtt tggccgagcg ttetcgttct 840
gtcatcgaaa gcgtcacgtt ctggggggtt 900
cctgttcgcg gacgcaaaga ctggccactt 960
gcgttttgga gcgtggttga attttga 101權利要求
一種寬pH適應性的木聚糖酶XYNA4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2. —種寬pH適應性的木聚糖酶基因xynA4，其特征在于，編碼權利要求1所述的寬pH 穩(wěn)定性和適應性的木聚糖酶XYNA4。
3. 如權利要求2所述的寬pH適應性的木聚糖酶基因xynA4，其特征在于，其堿基序列 如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含權利要求3所述寬pH適應性的木聚糖酶基因xynA4的重組載體。
5. 包含權利要求3所述寬pH適應性的木聚糖酶基因xynA4的重組載體 PET-22b-XYNA4。
6. 包含權利要求3所述寬pH適應性的木聚糖酶基因xynA4的重組菌株。
7. 如權利要求6的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或 乳酸桿菌。
8. —種制備木聚糖酶XYNA4的方法，其特征在于，包括以下步驟1) 用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導重組木聚糖酶表達；以及3) 回收并純化所表達的木聚糖酶XYNA4。
9. 權利要求1所述寬pH適應性的木聚糖酶XYNA4的應用。
10. 脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidum A4，其保藏編號為CGMCCNo. 3147。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種寬pH適應性木聚糖酶XYNA4及其基因和應用。本發(fā)明提供了一種來源于脂環(huán)酸芽孢桿菌Alicyclobacillus hesperidumA4(CGMCC No.3147)的木聚糖酶XYNA4，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因xynA4。本發(fā)明的木聚糖酶具有以下性質最適pH7.0，最適溫度55℃，比活為420.2U/mg；極寬范圍的pH穩(wěn)定性，較高的pH適應性和較好的熱穩(wěn)定性。作為一種新型的酶制劑，可廣泛用于動物飼料、食品、造紙、能源工業(yè)等。
文檔編號C12N9/42GK101701214SQ20091023594
公開日2010年5月5日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者史秀云, 姚斌, 孟昆, 楊培龍, 柏映國, 王亞茹, 石鵬君, 羅會穎, 袁鐵錚, 趙珩, 黃火清 申請人:中國農業(yè)科學院飼料研究所