專利名稱：一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的方法及其用途的制作方法
一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的方法及其用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的方法。具 體的，所述方法包括將包含力達(dá)霉素輔基蛋白基因與不同腫瘤靶向分子編碼序列組 成之融合基因的表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株，獲得帶有與所述腫 瘤靶向分子對(duì)應(yīng)的靶向性之力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株，其中所述基因阻斷菌株是球孢鏈霉菌 C-1027 (Streptomyces globisporus C-1027)力達(dá)霉素輔基蛋白基因(cagA)阻斷菌株球孢 鏈霉菌AK0(S. globisporus ΑΚ0)，所述腫瘤靶向分子包括但不限于例如腫瘤靶向抗體、腫 瘤靶向肽、細(xì)胞因子等。本發(fā)明還涉及利用所述方法獲得的生產(chǎn)菌株生產(chǎn)靶向性力達(dá)霉素 的用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病之一，目前常用的治療手段主要有手 術(shù)、放療和化療幾種，其中化療是最常采用的治療策略?；熕幬锟梢詺⑺滥[瘤細(xì)胞、抑 制其侵襲轉(zhuǎn)移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分化等，從而治療或治愈腫瘤。其缺點(diǎn)是選擇性差，在殺 死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損傷正常細(xì)胞，出現(xiàn)不同程度的副作用。將化療藥物和腫瘤靶向分 子偶聯(lián)制備靶向藥物用于腫瘤靶向治療具備巨大的應(yīng)用價(jià)值[Dickman S，抗生素回歸癌 癥治療(Antibodies stage a comeback incancer treatment)，禾斗學(xué)(Science)，1998， 280 :1196-1197]。靶向藥物一般由兩部分構(gòu)成，一是對(duì)腫瘤細(xì)胞有殺傷能力的“彈頭”；二 是有一定特異性的載體，把“彈頭”藥物特異性地靶向靶部位[Scallon BJ, Anyder LA, Anderson GM等人，應(yīng)用于腫瘤學(xué)的抗體治療學(xué)和與抗體相關(guān)的技術(shù)的回顧(A review of antibody therapeutics and antibody-related technologies for oncology)，免疫治療 雜志(J. Immunother)，2006，29 (4) :351-364.]。力達(dá)霉素(又名C-1027)是由我國(guó)湖北潛江土壤中發(fā)現(xiàn)的球孢鏈霉菌 C-1027 (Streptomyces globisporus C-1027)所產(chǎn)生[Hu JL, XueYC, Xie MY 等人， 一種新的大分子抗腫瘤抗生素C-1027. I發(fā)現(xiàn)、生產(chǎn)菌的分類、發(fā)酵和生物學(xué)活性 (A new macromoIecuIar antitumorantibiotic，C-1027. I. Discovery, taxonomy of producingorganism, fermentation and biological activity)，抗生素雜志(J Antibiot) 東京，1988,41(11) :1575-1579] 0力達(dá)霉素是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的物質(zhì)，比 臨床上常用的阿霉素強(qiáng)10000倍以上[Zhen YS, Ming XY, Yu B等人，一種新的大分子抗腫 瘤抗生素 C-1027. III 抗月中瘤生物學(xué)活性(A new macromolecular antitumorantibiotic, C-1027. III. Antitumor activity),抗生素雜志(JAntibiot)東京，1989,42(8) 1294-1298]。經(jīng)過(guò)十余年的新藥研究和開發(fā)，目前力達(dá)霉素已經(jīng)進(jìn)入臨床I I期研究[Shao RG, Zhen YS，烯二炔類抗腫瘤抗生素力達(dá)霉素化學(xué)，生物學(xué)和藥理學(xué)(Enediyne anticancer antibiotic lidamycin :chemistry, biology and pharmacology)，Jjt 癌藥物藥物 U 學(xué) (Anticancer Agents Med Chem)，2008，8 (2) : 123-131]，有望發(fā)展成為具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型高效的抗腫瘤藥物。力達(dá)霉素屬于烯二炔類抗生素，由小分子發(fā)色團(tuán)和力達(dá)霉素輔基蛋白組成，發(fā)色 團(tuán)具有環(huán)狀烯二炔結(jié)構(gòu)，是其對(duì)腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)殺傷作用的活性中心。烯二炔類抗生素 對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的殺傷作用，將其作為新型抗癌藥物的高效“彈頭”頗具發(fā)展?jié)摿Α?001 年烯二炔類化合物卡利奇霉素(CaliCheamiCin)-CD33抗體偶聯(lián)物(商品名Mylotarg)成 為第一個(gè)被FDA批準(zhǔn)用于腫瘤治療的單抗靶向藥物[Bross PF, Beitz J，Chen G等人， 批準(zhǔn)摘要骨髓白血病復(fù)發(fā)中的吉妥單抗(Approval summary :gemtuzumab ozogamicin in relapsedacute myeloid leukemia),臨床月中瘤石if 究(Clin Cancer Res), 2001, 71490-1496]。力達(dá)霉素由于其強(qiáng)烈的生物活性，更適于作為抗腫瘤靶向藥物的“彈頭”，使 靶向藥物高效化，其研究和應(yīng)用展示了廣闊的前景。目前常用的抗腫瘤靶向藥物大多數(shù)以單克隆抗體為靶向載體，這些單克隆抗體針 對(duì)的靶標(biāo)通常為腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤相關(guān)抗原或特定的受體，“彈頭”藥物與不同的單克隆 抗體偶聯(lián)可以制備差異化的單克隆抗體靶向藥物。但完整單克隆抗體分子量大，應(yīng)用于人 體時(shí)易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)；穿透力低，龐大的抗體藥物分子難以通過(guò)毛細(xì)管內(nèi)皮 層和細(xì)胞外間隙到達(dá)實(shí)體瘤深部的腫瘤細(xì)胞。因此，研制小型化抗體藥物對(duì)提高療效有重 要意義。抗體小型化原則是在能結(jié)合抗原的前提下最小化抗體片段。研究表明，傳統(tǒng)抗體 的結(jié)合親和性和特異性僅在于抗體分子的前端，即重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域。隨著 基因工程技術(shù)的興起，構(gòu)建小分子抗體如單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)及單域抗體(single domain antibody)等成為現(xiàn)實(shí)。單鏈抗體和單域抗體分子質(zhì)量 僅分別為完整抗體的1/6和1/12，不僅能較好地保持抗原結(jié)合能力和特異性，并且具有分 子質(zhì)量小、穿透力強(qiáng)、半衰期短、免疫原性低、制備流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在腫瘤組織中具有更加 一致的生物分布，更有利于體內(nèi)應(yīng)用[Kasuya K, Boyer JL, Tan Y等人，腺病毒表達(dá)抗保護(hù) 的抗原單鏈抗體介導(dǎo)的炭疽毒素的被動(dòng)免疫治療(Passive immunotherapy for anthrax toxin mediated by anadenovirus expressing an antiprotective antigen single chainantibody)，分子治療(Mol Ther)，2005，11 (2) :237-244]。因此，這些小型化的基因 工程抗體在抗腫瘤靶向藥物的研發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景。!^engqiangJ等人先后成功的以抗IV型膠原酶單克隆抗體3G11、單鏈抗體scFv、 單域抗體Vh及單域抗體Vd乍為靶向藥物的載體，以力達(dá)霉素為彈頭，制備抗體靶向性力 達(dá)霉素，不僅可以提供腫瘤靶向性，而且抗體自身就具有抑制腫瘤的效果Pengqiang W, Boyang S, Yongsu Z，力達(dá)霉素和抗IV型膠原酶單克隆抗體的分子小型化免疫偶聯(lián)劑的 抗癌作用(Antitumor effects of the molecule-downsizedimmunoconjugate composed of lidamycin and Fab' fragment ofmonoclonal antibody directed against type IV collagenase)，中國(guó)科學(xué)系列 C 生命科學(xué)(Sci China C Life Sci)，2004，47 (1) :66-73.]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同的抗體靶向性力達(dá)霉素均保留了其抗原結(jié)合能力，并能抑制高轉(zhuǎn)移性 PG細(xì)胞分泌的I V型膠原酶活性，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，在體外和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中均 獲得很好的抗腫瘤效果[王風(fēng)強(qiáng)，尚伯楊，甄永蘇，抗IV型膠原酶單抗3G11與力達(dá)霉素 偶聯(lián)物的抗腫瘤作用，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003,38(7) =515-519 ；封云，甄永蘇，戴垚等，不同力達(dá) 霉素與抗IV型膠原酶單抗偶聯(lián)物的抗腫瘤作用，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007,42(7) :704-709;唐勇，甄永蘇，抗IV型膠原酶單鏈抗體的表達(dá)及其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的抑制作用，癌癥，2001,20 801-805 ；Miao Q,Shang B等人，由單域抗體片段和力達(dá)霉素構(gòu)成的基因工程強(qiáng)化融合蛋白 Vl-LDP-AE 的產(chǎn)生禾口抗月中瘤作用(Generation and antitumor effects of an engineered andenergized fusion protein Vl-LDP-AE composed of single-domainantibody and lidamycin)，中國(guó)科學(xué)系列 C 生命科學(xué)(Sci China SerC-Iife Sci)，2007，4 (50) 447-456]。對(duì)小型化的基因工程抗體其采取的策略是將抗體基因與力達(dá)霉素輔基蛋白基因 融合后在E. coli中表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白scFv-LDP、Vh-LDP, Vl-LDP在體外裝配力達(dá)霉素 的發(fā)色團(tuán)。然而大腸桿菌所表達(dá)的融合蛋白集中在包涵體內(nèi)，需在體外變性、復(fù)性后與力達(dá) 霉素拆分出的不含力達(dá)霉素輔基蛋白的發(fā)色團(tuán)進(jìn)行裝配，工藝較復(fù)雜。李保衛(wèi)等人利用基因置換技術(shù)改造力達(dá)霉素產(chǎn)生菌中的力達(dá)霉素生物合成基因 簇，以抗IV型膠原酶單鏈抗體SCFv與力達(dá)霉素輔基蛋白融合基因替代力達(dá)霉素生物合 成基因簇中的力達(dá)霉素輔基蛋白基因，構(gòu)建靶向性力達(dá)霉素產(chǎn)生菌[李保衛(wèi)，胡云峰，王麗 非等人，單鏈抗體與力達(dá)霉素融合蛋白在鏈霉菌中的表達(dá)，中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2007，5 346-350]。但是，由于采用基因置換技術(shù)操作比較復(fù)雜，基因同源雙交換機(jī)率較低，重組菌株 篩選工作量大，所以需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能得到基因正確置換的菌株，難以快速獲得具有多 種不同靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株。為解決不同靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的快速構(gòu)建，有利 于利用所得生產(chǎn)菌株對(duì)相關(guān)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行生物活性分析進(jìn)而用于藥物研發(fā)，迫切需要一種 更簡(jiǎn)便、快速的方法用于構(gòu)建可直接得到靶向性力達(dá)霉素的生產(chǎn)菌株。本發(fā)明人通過(guò)構(gòu)建特定基因阻斷菌株，將涉及復(fù)雜基因工程操作基因置換技術(shù)的 靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的制備過(guò)程簡(jiǎn)化為利用含有特定融合基因表達(dá)質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移至 基因阻斷菌株的過(guò)程，大大方便了特定靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的 方法。具體的，本發(fā)明所述方法包括將包含力達(dá)霉素輔基蛋白基因與不同腫瘤靶向分 子編碼序列組成之融合基因的表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株，獲得產(chǎn)生 帶有與所述腫瘤靶向分子對(duì)應(yīng)的靶向性之力達(dá)霉素重組菌株，其中所述基因阻斷菌株是球 孢鏈霉菌C-1027 (Sti^ptomyces globisporus C-1027)力達(dá)霉素輔基蛋白基因(cagA)阻 斷菌株球孢鏈霉菌AKO (S. globisporus ΑΚ0)，所述腫瘤靶向性分子包括但不限于例如腫瘤 靶向抗體、腫瘤靶向肽、細(xì)胞因子等。力達(dá)霉素輔基蛋白基因(cagA)阻斷菌株的構(gòu)建在本發(fā)明中，通過(guò)本領(lǐng)域公知的基因阻斷方法，將力達(dá)霉素產(chǎn)生菌中所述力達(dá)霉 素輔基蛋白基因(cagA)阻斷，得到力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株球孢鏈霉菌ΑΚ0。力達(dá)霉素的生物合成基因簇已被克隆(GenBank登錄號(hào)AY048670)，為構(gòu)建力達(dá)霉 素輔基蛋白基因的阻斷菌株，以及力達(dá)霉素輔基蛋白基因與腫瘤靶向分子編碼序列融合基 因的遺傳操作提供了有利條件。其中，力達(dá)霉素輔基蛋白基因cagA位于結(jié)構(gòu)基因SgcAl和 sgcA4之間(如

圖1)，cagA基因編碼區(qū)全長(zhǎng)432bp，N端編碼一個(gè)33個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，引導(dǎo)力達(dá)霉素輔基蛋白分泌至胞外，成熟力達(dá)霉素輔基蛋白CagA由110個(gè)氨基酸構(gòu)成。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株采用同源 重組雙交換的方法，對(duì)基因簇中cagA基因進(jìn)行阻斷。其中，根據(jù)cagA基因上下游基因的 序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增分別包含基因上游和下游的兩個(gè)片段作為交換兩臂，將阿普霉素抗性 基因aac (3) IV插入兩臂之間，并克隆到自殺性質(zhì)粒PBS03的多克隆位點(diǎn)，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移 導(dǎo)入球孢鏈霉菌C-1027中，通過(guò)抗性篩選獲得發(fā)生雙交換的接合子，然后經(jīng)PCR驗(yàn)證和 Southern blot驗(yàn)證正確(如圖1)，命名為球孢鏈霉菌ΑΚ0。力達(dá)霉素輔基蛋白基因(cagA)阻斷菌株的確證分別采用如下方法對(duì)本發(fā)明所述力達(dá)霉素輔基蛋基因阻斷菌株球孢鏈霉菌AKO 的性質(zhì)加以確證
1) RT-PCR法檢測(cè)球孢鏈霉菌AKO中cagA的表達(dá)(圖2A)；2) Western blot分析檢測(cè)球孢鏈霉菌AKO中CagA蛋白的表達(dá)(圖2B)。上述兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，所得cagA阻斷菌株球孢鏈霉菌AKO不再產(chǎn)生力達(dá)霉素 輔基蛋白。進(jìn)一步的，對(duì)球孢鏈霉菌AKO進(jìn)行發(fā)酵研究，分別在發(fā)酵不同時(shí)間檢測(cè)發(fā)酵液的 抑菌活性，球孢鏈霉菌AKO的發(fā)酵液在不同時(shí)間均喪失抑菌活性(如圖3)。以針對(duì)力達(dá)霉 素的蛋白沉淀抽提法進(jìn)行力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)的粗提取，HPLC分析表明球孢鏈霉菌AKO發(fā)酵液 中檢測(cè)不到力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)(如圖4)。蛋白沉淀抽提法提取力達(dá)霉素的主要原理是通過(guò)沉淀力達(dá)霉素輔基蛋白從而將 以蛋白-發(fā)色團(tuán)復(fù)合物形式存在的力達(dá)霉素抽提出來(lái)，但在力達(dá)霉素輔基蛋白阻斷株中已 經(jīng)不再表達(dá)力達(dá)霉素輔基蛋白，蛋白沉淀法可能不能有效抽提以小分子化合物形式存在的 力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)。因此又進(jìn)一步利用發(fā)酵液直接抽提分離方法，抽提發(fā)酵液中小分子化合 物，進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)球孢鏈霉菌AKO仍可以產(chǎn)生發(fā)色團(tuán)(如圖5)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明所構(gòu)建的力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷株球孢鏈霉 菌ΑΚ0，失去了產(chǎn)生力達(dá)霉素輔基蛋白的能力，不能產(chǎn)生完整的力達(dá)霉素，但不影響發(fā)色團(tuán) 的產(chǎn)生，為重新導(dǎo)入力達(dá)霉素輔基蛋白與靶向分子融合表達(dá)質(zhì)粒，產(chǎn)生新型靶向性力達(dá)霉 素奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證力達(dá)霉素輔基蛋白基因的阻斷沒(méi)有極性效應(yīng)，并且確定利用質(zhì)粒 載體導(dǎo)入融合蛋白基因的策略可行，本發(fā)明人進(jìn)一步將力達(dá)霉素輔基蛋白基因克隆到鏈霉 菌表達(dá)載體上，再導(dǎo)入本發(fā)明所述力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷株球孢鏈霉菌AKO中進(jìn)行回 復(fù)，檢測(cè)回復(fù)菌株中力達(dá)霉素的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明人分別采用了質(zhì)粒pKC1139、pSET152 [Kieser Τ, Bibb MJ, Buttner MJ 等人，鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)(Practical Streptomyces Genetics)諾威治(Norwich), The John Innes Foundation ;2000禾口 pL64Hong B, Phornphisutthimas S，Tilley E等人，灰色鏈霉菌產(chǎn)生鏈霉素可被與A-因子級(jí)聯(lián)調(diào)控中 的 adpA 無(wú)關(guān)的機(jī)制所調(diào)控(Streptomycinproduction by Streptomyces griseus can be modulated by amechanism not associated with change in the adpA component ofthe Α-factor cascade)，生物技術(shù)通訊(Biotechnol Lett) 2007，29 :57-64作為載體(圖 6A)。 質(zhì)粒PKC1139為多拷貝質(zhì)粒；質(zhì)粒pSET152為整合型質(zhì)粒，不含鏈霉菌質(zhì)粒復(fù)制子，含有Φ031 attP位點(diǎn)，可整合到鏈霉菌的attB位點(diǎn)；質(zhì)粒pL646來(lái)自pSET152，在其多克隆位 點(diǎn)上游引入了強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*p和tufl基因的SD序列。將cagA基因片段與選擇性抗性標(biāo)記——硫鏈絲菌素抗性基因片段連入質(zhì)粒載體 pKC1139、pSET152 和 pL646，構(gòu)建了不同的 cagA 表達(dá)質(zhì)粒 pKCTA900、pSETTA900、pLTA900 和 PLTA400。將不同的cagA表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入cagA阻斷菌株中，發(fā)酵活性檢測(cè)表明，cagA基因的 重新導(dǎo)入，除PLTA400外，均可使得cagA阻斷菌株球孢鏈霉菌AKO恢復(fù)產(chǎn)生力達(dá)霉素的能 力，并且PKCTA900導(dǎo)入多拷貝的基因使產(chǎn)量略有提高，具有劑量效應(yīng)(如圖6B)，表明球孢 鏈霉菌AKO不產(chǎn)力達(dá)霉素的確是由于cagA基因阻斷的結(jié)果。對(duì)導(dǎo)入pKCTA900的球孢鏈霉菌AKO進(jìn)行RT-PCR和Western blot分析(如圖2)， 結(jié)果均表明，cagA阻斷菌株重新產(chǎn)生力達(dá)霉素輔基蛋白。另外，以基于力達(dá)霉素的蛋白沉 淀抽提法進(jìn)行力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)的粗提取，HPLC分析表明，在cagA阻斷菌株中導(dǎo)入力達(dá)霉素 輔基蛋白基因，重新形成了完整的力達(dá)霉素(如圖4)。以上結(jié)果表明，在力達(dá)霉素輔基蛋白阻斷菌株中利用cagA表達(dá)質(zhì)粒pKCTA900、 PSETTA900和pLTA900表達(dá)力達(dá)霉素輔基蛋白，可以成功實(shí)現(xiàn)與其合成的發(fā)色團(tuán)組裝成為 完整的力達(dá)霉素。這說(shuō)明將具有腫瘤靶向分子(單鏈抗體、單域抗體、腫瘤靶向肽、細(xì)胞因 子等)編碼序列與力達(dá)霉素輔基蛋白基因融合，利用上述載體導(dǎo)入cagA阻斷株球孢鏈霉菌 AKO中，構(gòu)建新型靶向性力達(dá)霉素產(chǎn)生菌株是可行的。力達(dá)霉素輔基蛋白基因與腫瘤靶向性分子融合基因的構(gòu)建在本發(fā)明中，分別將力達(dá)霉素輔基蛋白基因與腫瘤靶向性分子的編碼序列構(gòu)建融 合基因。本發(fā)明中，所述腫瘤靶向性分子包括但不限于腫瘤靶向抗體、腫瘤靶向肽、細(xì)胞因 子，其中所述腫瘤靶向抗體可以是例如抗IV型膠原酶單域抗體Vh，所述腫瘤靶向肽可以是 例如RGD靶向肽，所述細(xì)胞因子可以是白細(xì)胞介素2 (IL-2)，以得到可在力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株 中表達(dá)融合蛋白的載體。在本發(fā)明中，腫瘤靶向分子編碼序列與力達(dá)霉素輔基蛋白基因融合的策略，可采 用融合于力達(dá)霉素輔基蛋白基因的C端終止密碼子之前，也可融合于力達(dá)霉素輔基蛋白基 因N端信號(hào)肽編碼序列之后成熟力達(dá)霉素輔基蛋白編碼序列之前。在兩部分之間可以直接 相融合，也可以導(dǎo)入連接肽，使表達(dá)的融合蛋白兩部分能夠保持各自的構(gòu)象，力達(dá)霉素輔基 蛋白可和發(fā)色團(tuán)正確結(jié)合，靶向分子可與其靶標(biāo)正確結(jié)合。本發(fā)明所涉及的與力達(dá)霉素輔基蛋白融合的靶向分子的選擇可有多種來(lái)源，包括 但不限于腫瘤特異性抗原的單鏈抗體、單域抗體、具有腫瘤特異性結(jié)合活性的小肽、細(xì)胞因 子、生長(zhǎng)因子等?？捎糜诒景l(fā)明所述方法的單鏈抗體是抗體重鏈可變區(qū)(Vh)與輕鏈可變區(qū)通 過(guò)一段連接肽(linker)連接而成的一種小分子抗體，單域抗體是僅具有抗體重鏈可變區(qū) (Vh)或輕鏈可變區(qū)單域結(jié)構(gòu)的小分子抗體。此外，能夠結(jié)合腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的腫瘤靶向肽也可用于構(gòu)建抗腫瘤 靶向藥物(詳見(jiàn)表1)。例如，含RGD(即Arg-Gly-Asp)的小肽能夠特異性地與ανβ3整合 素結(jié)合，而α νβ3整合素在很多腫瘤組織中呈高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。噬菌 體肽庫(kù)技術(shù)的發(fā)展為尋找親和力高、特異性強(qiáng)的腫瘤靶向肽提供了一種便捷的途徑。表1.用于腫瘤靶向治療的腫瘤靶向肽
權(quán)利要求
1.一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的方法，所述方法包括將包 含力達(dá)霉素輔基蛋白基因與不同腫瘤靶向分子編碼序列組成之融合基因的表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入 力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株，獲得帶有與所述腫瘤靶向分子對(duì)應(yīng)的靶向性之力達(dá)霉素 生產(chǎn)菌株。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述基因阻斷菌株是力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌 株，例如力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株球孢鏈霉菌ΑΚ0，保藏號(hào)CGMCC No. 3315。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腫瘤靶向分子選自腫瘤靶向抗體、腫瘤靶向肽和/ 或細(xì)胞因子。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述腫瘤靶向抗體選自單鏈抗體和/或單域抗體，例如 抗IV型膠原酶單域抗體VH。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述腫瘤靶向肽選自GX1、GFE-1、NGR和/或RGD靶向肽。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素3、白細(xì)胞 介素4、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素13、表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞集落刺激因子和/或Y干擾素誘導(dǎo)蛋白10。
7.一種力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株，其為球孢鏈霉菌ΑΚ0，保藏號(hào)為CGMCC No.3315。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用基因阻斷菌株制備靶向性力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株的方法。具體的，所述方法包括將包含力達(dá)霉素輔基蛋白基因與不同腫瘤靶向分子編碼序列組成之融合基因的表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入力達(dá)霉素輔基蛋白基因阻斷菌株，獲得帶有與所述腫瘤靶向分子對(duì)應(yīng)的靶向性之力達(dá)霉素生產(chǎn)菌株，其中所述基因阻斷菌株是球孢鏈霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)力達(dá)霉素輔基蛋白基因(cagA)阻斷菌株球孢鏈霉菌AKO(S.globisporus AKO)，所述腫瘤靶向分子包括但不限于例如腫瘤靶向抗體、腫瘤靶向肽、細(xì)胞因子等。本發(fā)明還涉及利用所述方法獲得的生產(chǎn)菌株生產(chǎn)靶向性力達(dá)霉素的用途。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102041268SQ200910235669
公開日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月10日
發(fā)明者余騰斐, 崔智慧, 朱元軍, 李保衛(wèi), 洪斌, 王麗非, 邵榮光 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所