專利名稱：內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法和內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶載體的制備方法和酶的固定方法，特別是內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法和 內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法。
背景技術(shù)：
殼聚糖需要溶解在溶液中后，再經(jīng)過殼聚糖酶的處理得到小分子的殼寡糖，殼寡糖因分 子量小和其他優(yōu)良性質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和食品等行業(yè)。傳統(tǒng)的從殼聚糖出發(fā)制備殼寡糖的 過程中，通常采用液體狀態(tài)的酶技術(shù)，液體狀態(tài)的酶的效率雖然能滿足生產(chǎn)要求，但有下列 弊端酶的穩(wěn)定性較差。因為酶是具有一定空間構(gòu)象的蛋白質(zhì)，在受到熱、pH值、無機離子、 有機溶劑等外界因素的影響下，容易變性失活，反應(yīng)完畢后的殼聚糖酶和殼寡糖產(chǎn)物都依然 存在液體體系中，二者分離困難，給進一步分離純化帶來了一定的困難。特別是殼寡糖產(chǎn)物 需要滅酶活再做成固體產(chǎn)品，這樣一來液體酶也被滅活，因而殼聚糖酶只使用了一次。
內(nèi)切殼聚糖酶，簡稱eCSN酶在工業(yè)上可用于殼寡糖(Chitooligosaccharides)的生產(chǎn)， 由于殼寡糖有較好的水溶性，更利于人體吸收，特別是聚合度在5、 6的殼寡糖更是具有較強 的抗感染、抑制腫瘤的活性。但是利用化學(xué)合成方法生產(chǎn)殼寡糖，尤其是具有較強生理活性 的寡五糖和六糖，非常困難，產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本較高且易污染環(huán)境，而使用內(nèi)切殼聚糖酶通 過降解生產(chǎn)殼寡糖卻有著高效、環(huán)保等優(yōu)點，因此利用內(nèi)切殼聚糖酶生產(chǎn)殼寡糖已經(jīng)成為目 前研究應(yīng)用的熱點。從湖泊淤泥中采集、誘變并分離得到的菌種可產(chǎn)生胞外分泌型內(nèi)切殼聚 糖酶，對其發(fā)酵后的粗酶液進行分離純化，可獲得一種較高活性、專一性的內(nèi)切殼聚糖酶 (endo-Chitosanase， eCSN)純品。由于eCSN酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，游離酶在使用過程中穩(wěn) 定性較差，且酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，給產(chǎn)物的分離純化帶來了一定的困 難，酶也不能重復(fù)使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法和內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法。 本發(fā)明的技術(shù)方案為
內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法，其中經(jīng)過NaOH、冰乙酸、對甲苯磺酰氯、吡啶處理得
到棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。
內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法，其中棉質(zhì)的纖維條浸入200ml質(zhì)量百分濃度為15M的NaOH 溶液中處理10min后，用蒸餾水洗滌數(shù)次，再在質(zhì)量百分濃度為l(^的冰乙酸中浸泡30min，最后用去離子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉質(zhì)的纖維條的比例加入吡啶，在25X:， 250r/min恒 溫水浴振蕩器中作用0.5h;按15g對甲苯磺酰氯/g棉質(zhì)的纖維條的比例，向吡啶處理過的棉質(zhì) 的纖維條中加入用丙酮溶解的對甲苯磺酰氯，每lg對甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶解；在25'C， 250r/min恒溫水浴振蕩器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗，HC1可以洗去 多余的對甲苯磺酰氯及吡啶，取出的棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。該載體放于 0. 05mol/L的HCl中4。C保存。
本發(fā)明涉及的棉質(zhì)的纖維條，可以是醫(yī)藥企業(yè)生產(chǎn)的醫(yī)用棉質(zhì)的纖維條。也可以是其他 的纖維條。
內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法，其中去離子水洗滌載體3次，以250 U /g載體比例，將O. 2mol/L PH5. 5 NatyU—Na2HP04緩沖液稀釋的內(nèi)切殼聚糖酶加入載體中，于250r/min的恒溫水浴振蕩 器中固定12h，去離子水洗滌，固定化酶4t)緩沖液中保存。
本發(fā)明涉及的"U"是酶活力的單位。
游離酶活力測定取100叱1%殼聚糖醋酸溶液，加入內(nèi)切殼聚糖酶(溶于95化水中)， 在45°C 300r/niin回轉(zhuǎn)式水浴恒溫振蕩器(SHZ-88型)內(nèi)連續(xù)振蕩10min。降解反應(yīng)結(jié)束后， 參照3， 5-二硝基水楊酸法(DNS)比色定糖法測定還原糖量，計算游離酶的活力。
固定化酶活測定取2(KHxL 1%殼聚糖醋酸溶液，加入本發(fā)明方法固定化的內(nèi)切殼聚糖酶 O.Olg，在45。C 300r/min回轉(zhuǎn)式水浴恒溫振蕩器(SHZ-88型)內(nèi)反應(yīng)10min。降解反應(yīng)結(jié)束后， 取100HL還原糖參照3, 5-二硝基水楊酸法(DNS)比色定糖法測定還原糖濃度，計算固定化酶 活力。
l個酶活單位定義1個酶活力(U)單位定義在(45±1) 'C、 pH值為7.0條件下， 一分鐘水 解殼聚糖所釋放出相當于llimol還原糖所需要的酶量。3,5-二硝基水楊酸法(DNS)比色定糖 法測定還原糖含量。
固定化殼聚糖酶活力回收率=棉質(zhì)的纖維條上所固定的酶活力(U)/固定前最初加入的酶
活力00
單位固定化酶活(U/g):每克干基棉質(zhì)的纖維條上所固定的酶活力。 殼聚糖水解率的計算殼聚糖水解率(％)=還原糖含量/起始殼聚糖含量100% 固定化內(nèi)切殼聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)研究 固定化殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度
純化的酶液經(jīng)固定后，在PH5.5, 0.2mol/LNaH2P04—Na2HP04緩沖液中，分別在30'C、 40°C、 45°C、 5CTC、 55°C、 6(TC下，測定固定化酶活力，以最高酶活力為100%計，該酶經(jīng)固定化后， 最適反應(yīng)溫度仍為45。C。固定化殼聚糖酶最適反應(yīng)PH:
純化的酶液經(jīng)固定后，分別在(PH4.5-6.5) 0.2mol/L船仏？04—化2^04緩沖液中，45°C 測定固定化酶活力。實驗測得游離酶反應(yīng)最適PH為6.5。酶經(jīng)固定化后，最適反應(yīng)PH向酸性方 向偏移l個單位。因此，殼聚糖酶固定化之后，可以用于處理中性偏酸性物質(zhì)。
固定化eCSN酶的儲存穩(wěn)定性
游離酶及固定化內(nèi)切殼聚糖酶分別置于0. 2mol/L NaH2P04 —化^04緩沖溶液(pH 6. 5)中， 在4'C下儲存，30天后在酶的最適水解條件下測定儲存后酶的殘余活力。結(jié)果表明，儲存30 天后固定化內(nèi)切殼聚糖酶保持較高的酶活力。
固定化eCSN酶的操作穩(wěn)定性
操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶實用價值的主要指標，以固定化酶的重復(fù)水解實驗表征其操 作穩(wěn)定性。將固定化酶濕法裝柱，床層加入1%殼聚糖溶液，以每24hr為一個酶水解過程。 一次水解反應(yīng)完成后，用去離子水洗漆固定化酶，除去固定化酶上殘余的降解底物及降解產(chǎn) 物。然后重新進行水解反應(yīng)，在酶的最適水解條件下參照DNS比色定糖法測定還原糖濃度， 計算固定化酶的剩余活力。結(jié)果表明，固定化酶重復(fù)水解殼聚糖10次后，酶活仍保持40%。
填充床反應(yīng)器固定化內(nèi)切殼聚糖酶酶解殼聚糖
在PH為5.5, 45°C， 20 ml， 1%的殼聚糖溶液與固定化酶連續(xù)循環(huán)反應(yīng)，不同時間間隔(6h、 12h、 18h、 24h)取樣，通過薄層色譜或HPLC檢測酶解液成分中殼寡糖的變化。
內(nèi)切殼聚糖酶eCSN是水解殼聚糖制備低分子量殼聚糖和殼寡糖的有效商品酶制劑。在本 研究中，將內(nèi)切殼聚糖酶固定于對甲苯磺酰氯活化的棉纖維載體上，得出制備固定化eCSN酶 的最適條件是pH6.5，離子濃度為0.2mol/L NaH2P04—化2^04緩沖液，加酶量為250U/g載 體，固定化反應(yīng)時間為12hr，活力回收率可達到60%。固定化酶的最適反應(yīng)溫度沒有改變，最 適反應(yīng)PH向酸性方向偏移1個單位，固定化酶的儲存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性表明，應(yīng)用固定化 內(nèi)切殼聚糖酶可以連續(xù)降解殼聚糖制備低分子量殼聚糖和殼寡糖。
采用本發(fā)明的技術(shù)方案有下列優(yōu)點
固化酶便于與反應(yīng)后的液體體系中的產(chǎn)物分離，而且固化酶取出后可反復(fù)使用。與游離 酶相比，酶固定化后，極易與底物、產(chǎn)物分開，可以在較長時間內(nèi)進行裝柱連續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)物 殼寡糖溶液中沒有酶的殘留，提高了殼寡糖的質(zhì)量；酶有較高的穩(wěn)定性、較長的操作壽命和 保存期，且酶可重復(fù)使用，成本顯著降低。本發(fā)明以NaOH和吡啶為引發(fā)劑，對甲苯磺酰氯作 為中間物，與棉質(zhì)的纖維條表面的羥基發(fā)生反應(yīng)形成共價鍵，內(nèi)切殼聚糖酶在固定過程中， 氨基酸殘基上游離的氨基水端通過取代對甲苯磺酰基而共價連接在棉質(zhì)的纖維條上；研究了固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)；并且在填充床柱反應(yīng)器中探討了固定化酶連續(xù)降解殼聚糖的操作條件，
這對固定化酶的實際生產(chǎn)應(yīng)用具有比較高的參考價值。
具體實施例方式
實施例l、內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法，其中棉質(zhì)的纖維條浸入200ml質(zhì)量百分濃度 為15M的NaOH溶液中處理10min后，用蒸餾水洗滌數(shù)次，再在質(zhì)量百分濃度為10%的冰乙酸中浸 泡30min,最后用去離子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉質(zhì)的纖維條的比例加入吡啶，在25。C， 250r/min恒溫水浴振蕩器中作用0.5h;按15g對甲苯磺酰氯/g棉質(zhì)的纖維條的比例，向吡啶 處理過的棉質(zhì)的纖維條中加入用丙酮溶解的對甲苯磺酰氯，每lg對甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶 解；在25'C， 250r/min恒溫水浴振蕩器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗， HC1可以洗去多余的對甲苯磺酰氯及吡啶，取出的棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。 該載體放于O. 05mol/L的HCl中4'C保存。
本發(fā)明涉及的棉質(zhì)的纖維條，可以是醫(yī)藥企業(yè)生產(chǎn)的醫(yī)用棉質(zhì)的纖維條。也可以是其他 的纖維條。
實施例2、內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法，其中去離子水洗滌載體3次，以250U/g載體比例， 將O. 2mol/L PH6. 5 %}^04—化2^04緩沖液稀釋的內(nèi)切殼聚糖酶加入載體中，于250r/min的恒 溫水浴振蕩器中固定12h，去離子水洗滌，固定化酶4'C緩沖液中保存。其中的載體通過實施 例1方法獲得。
權(quán)利要求
1、內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法，其特征在于經(jīng)過NaOH、冰乙酸、對甲苯磺酰氯、吡啶處理得到棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。
2、 內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法，其特征在于棉質(zhì)的纖維條浸入200ml質(zhì)量百分濃度 為15M的NaOH溶液中處理10min后，用蒸餾水洗滌數(shù)次，再在質(zhì)量百分濃度為10%的冰乙酸中浸 泡30min，最后用去離子水洗至中性；按15ml吡啶/g棉質(zhì)的纖維條的比例加入吡啶，在25'C， 250r/min恒溫水浴振蕩器中作用0.5h;按15g對甲苯磺酰氯/g棉質(zhì)的纖維條的比例，向吡啶 處理過的棉質(zhì)的纖維條中加入用丙酮溶解的對甲苯磺酰氯，每lg對甲苯磺酰氯采用2ml丙酮溶 解；在25。C， 250r/min恒溫水浴振蕩器中作用4h，再加丙酮清洗，再用O. 05mol/L HC1清洗， 取出的棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。
3、 如權(quán)利要求2所述的內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法得到的內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方 法應(yīng)用于內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法，其特征在于:'去離子水洗滌載體3次，以250U/g載體比例， 將O. 2mol/L PH6. 5 NaH2P04—Na2HP04緩沖液稀釋的內(nèi)切殼聚糖酶加入載體中，于250r/min的恒 溫水浴振蕩器中固定12h，去離子水洗滌，固定化酶4'C緩沖液中保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及內(nèi)切殼聚糖酶載體的制備方法和內(nèi)切殼聚糖酶的固定方法。經(jīng)過NaOH、冰乙酸、對甲苯磺酰氯、吡啶處理得到棉質(zhì)的纖維條可以作為內(nèi)切殼聚糖酶載體。采用本發(fā)明的技術(shù)方案有下列優(yōu)點固化酶便于與反應(yīng)后的液體體系中的產(chǎn)物分離，而且固化酶取出后可反復(fù)使用。與游離酶相比，酶固定化后，極易與底物、產(chǎn)物分開，可以在較長時間內(nèi)進行裝柱連續(xù)反應(yīng)，產(chǎn)物殼寡糖溶液中沒有酶的殘留，提高了殼寡糖的質(zhì)量；酶有較高的穩(wěn)定性、較長的操作壽命和保存期，且酶可重復(fù)使用，成本顯著降低。
文檔編號C12N11/12GK101508985SQ20091011511
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者王曼瑩, 王超莉 申請人:江西師范大學(xué)