專利名稱：以家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)、桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)、蛋白質(zhì)的純化與活性 分析，尤其涉及一種利用家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法。
背景技術(shù)：
蝎毒素蛋白BmK是一種由蝎合成、分泌的小分子量蛋白質(zhì)，基因長(zhǎng)度為198 個(gè)核苷酸，編碼65個(gè)氨基酸，pl為6.3，預(yù)測(cè)分子量大小8KDa左右，具有較 強(qiáng)的毒性。蝎毒素具有抗病毒、抗菌、抗腫瘤、消炎、通絡(luò)、祛風(fēng)濕、鎮(zhèn)痙安 神、止痛等功能。因此，蝎毒素具有較好的應(yīng)用價(jià)值，顯示出很好的應(yīng)用前景。 但是目前市場(chǎng)上蝎毒素蛋白的價(jià)格較貴，雖然用基因工程的方法在大腸桿菌中 可以生產(chǎn)，但在大腸桿菌中蝎毒素以包含體的形式表達(dá)，需要對(duì)其重新折疊恢 復(fù)其生物活性。額外的處理使得該過程效率很低且不經(jīng)濟(jì)。為了克服這個(gè)問題， 其他曾試著用酵母和腺病毒感染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)生產(chǎn)。然而，酵母的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定，哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本又太高。因此有必要建立一 種高效經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)蝎毒素的方法。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是當(dāng)今最有效的真核基因表達(dá)系統(tǒng)之一，目前該系統(tǒng)主要 包括歐美國(guó)家正在廣泛應(yīng)用的苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒G4wtogra;^a ca/z/om/ca nuclear polyhedrosis virus，簡(jiǎn)稱AcNPV)和以中國(guó)、日本為代表的家 蠶核型多角體病毒(5ow6>x won' nuclear polyhedrosis virus, 簡(jiǎn)禾爾BmNPV)表 達(dá)系統(tǒng)兩大類，兩者各有優(yōu)點(diǎn)，但病毒寄主范圍不同，AcNPV寄主范圍較廣。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種利用家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法。 本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是利用BmNPV構(gòu)建含有蝎毒素基因的重組病毒，并利用家蠶作為宿主，使用"家蠶-重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)"表達(dá)生產(chǎn)具有生物活性的重組蝎毒素。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是該以家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法主要包括如下步驟
(1) 以蝎cDNA為模板、以含有5g/II酶切位點(diǎn)的 5'-ACGTAQ^ECJATGGATGGATATATAAG-3'為正向引物、以含有酶切位 點(diǎn)的5'-ACGTAGATCT TTACTTTTTTCCAC-3'為反向引物進(jìn)行三十二個(gè)循環(huán)的 PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)獲得蝎毒素基因，所述PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)是在 94。C模板變性50秒；第二個(gè)至第三十一個(gè)循環(huán)是先在55。C退火30秒，后在 70。C延伸30秒；第三十二個(gè)循環(huán)是在70。C延伸7分鐘；
對(duì)PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)獲得的蝎毒素基因進(jìn)行純化，并將該蝎毒素基因克隆 入3.9kb載體pCR2.1得到pCR2.1-蝎毒素，在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)pCR2.1-蝎毒素基因順序的正確性；
(2) 用限制性內(nèi)切酶Sgm消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后 將蝎毒素基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b獲得重組體pAcGP67b-蝎毒素基因；
通過共轉(zhuǎn)染在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)與家蠶桿狀病毒BmNPV DNA同源重組產(chǎn)生 重組病毒,所述共轉(zhuǎn)染的方法為先將1嗎pAcGP67b-蝎毒素基因DNA和15嗎 BmNPV DNA混合,接著加入14 pl脂質(zhì)體lipofectin，后又加入滅菌蒸餾水至終 體積40 ^d，最后將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf 21培 養(yǎng)細(xì)胞；
將上述通過共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組病毒先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小 時(shí)，再換成含有10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基于27。C培養(yǎng)5天后，收集培養(yǎng)基上 清液作為病毒原液以用來篩選所述重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最 終獲得高濃度純化的重組BmNPV-蝎毒素病毒溶液，該BmNPV-蝎毒素病毒溶液 的濃度為108pfo/ml;
(3) 先將5齡家蠶幼蟲浸在冰水浴中進(jìn)行麻醉，然后采用皮下注射的方法 將濃度為106pfli/ml的重組BmNPV-蝎毒素病毒懸浮液注射入家蠶幼蟲進(jìn)行感染 表達(dá)，每條家蠶注射2(V1;注射1小時(shí)后對(duì)家蠶幼蟲喂桑，并在23-25"C下飼養(yǎng)；
在感染后72—96小時(shí)內(nèi)收集家蠶幼蟲，解剖感染后家蠶的脂肪體，并用該 脂肪體作為純化重組蝎毒素的起始材料；將所述脂肪體勻漿后溶解在預(yù)冷的pH 為7.6的20mM Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)高速離心后將上清液直接上Ni-NAT親和 層析柱而使重組蝎毒素蛋白結(jié)合到層析柱上；然后用pH為7.6的20mM Tris-HCl緩沖液洗脫去掉雜蛋白，最后用250mM咪唑緩沖液一步洗脫出結(jié)合的重組蝎毒素蛋白。
本發(fā)明與背景技術(shù)相比，具有的有益效果是
(1) 本發(fā)明的家蠶幼蟲表達(dá)重組蝎毒素具有成本低、產(chǎn)量高、生物活性強(qiáng) 的優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中蝎毒素在大腸桿菌中表達(dá)需要復(fù)雜的復(fù)性操作、酵 母表達(dá)中質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體不穩(wěn)定和在哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)的成本太高的缺點(diǎn)；
(2) 本發(fā)明的家蠶幼蟲表達(dá)的重組蝎毒素蛋白大部分留在家蠶脂肪體內(nèi)， 利用親和層析從脂肪體中純化蝎毒素，每頭家蠶的產(chǎn)量高達(dá)600-700 且活性 分析表明，本發(fā)明得到的重組蝎毒素具有明顯的生物學(xué)毒性；
(3) 本發(fā)明的"家蠶-重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)"由于可以利用我國(guó)飼養(yǎng)量最大 的特色經(jīng)濟(jì)昆蟲一家蠶作表達(dá)載體，且家蠶具有個(gè)體大、易飼養(yǎng)等特點(diǎn)，因此 具有生產(chǎn)成本低、可規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，適合于生物制藥產(chǎn)業(yè)化水平的要求， 在未來的醫(yī)學(xué)和臨床治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是本發(fā)明使用的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b的圖譜；
圖2是本發(fā)明中家蠶幼蟲感染重組蝎毒素病毒前后的照片圖2的左上方為 家蠶感染前的照片，左下方為家蠶感染后的照片；右邊為重組蝎毒素蛋白純化照 片，其中，1為作為參照的分子量(自上而下分子量分別為14.3KDa和6.0KDa)， 2為作為對(duì)照的樣品，3為從感染幼蟲中純化的樣品。
具體實(shí)施例方式
1.研究材料基因工程操作工具酶和PCR擴(kuò)增試劑盒購于我國(guó)上海生工 生物工程技術(shù)服務(wù)公司。蝎cDNA購自Clotech公司，TA克隆試劑盒、圖譜如 圖1所示的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b、 脂質(zhì)體lipofectin均為/"v浙oge"公 司產(chǎn)品。Ni-NTA親和層析用產(chǎn)品購自日本和光化學(xué)公司。DNA測(cè)序試劑盒購 于尸￡ ^^//ec/ 5/oy^to7w 。胎牛血清FCS、昆蟲細(xì)胞系Sf21的培養(yǎng)基TC-100 和用于培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)基199均為C7^o說 I的產(chǎn)品。秋粘 蟲細(xì)胞系Tn-5的培養(yǎng)基ESF921購于ExpmM/ow ^stem"臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 HUVEC、 SCS和ECGS均為7fec/moc/oMe GmWf的產(chǎn)品。草地貪夜蛾細(xì)胞SG1 用添加10 %(v/v) FCS和0.26 %細(xì)菌用胰蛋白胨的TC-100培養(yǎng)基在27。C培養(yǎng)。 Tn-5利用無血清的ESF921培養(yǎng)基于27。C瓶中培養(yǎng)。本試驗(yàn)使用家蠶雜交種，
6家蠶幼蟲桑葉詞養(yǎng)，溫度為23 25'C。 2.生產(chǎn)步驟
利用家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素的方法主要包括以下步驟
(1)蝎毒素基因的克隆以東亞鉗蝎(8t/f/7(ys ma#e/7s/7 /〈arsc/ )cDNA為模板，
PCR基因擴(kuò)增技術(shù)獲得蝎毒素基因，引物設(shè)計(jì)如下正向引物 5'-ACGTAO^EQIATGGATGGATATATAAG-3'含有5^m酶切位點(diǎn)；反向引物 5'-ACGTAGATCT TTACTTTTTTCCAC-3',含有石g/H酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)的循環(huán) 數(shù)、溫度和時(shí)間的設(shè)計(jì)如下第一個(gè)循環(huán)，94。C模板變性50秒；第二個(gè)至第三
i"一個(gè)循環(huán)，55。C退火30秒，70。C延伸30秒；最后1個(gè)循環(huán)，70。C延伸7 分鐘；利用1X瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行PCR產(chǎn)物分析，并用^V^ewe的PCR純化 試劑盒純化，隨后將目的PCR產(chǎn)物克隆入3.9kb載體pCR2.1得到pCR2.1-蝎毒 素，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)克隆蝎毒素基因，即得到 pCR2.1-蝎毒素基因順序的正確性；
(2) 含有蝎毒素基因的重組桿狀病毒的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶5gm消化 pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b 獲得重組體pAcGP67b-蝎毒素基因；通過共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與家蠶桿狀病毒 BmNPVDNA同源重組產(chǎn)生重組病毒，共轉(zhuǎn)染的方法為l嗎pAcGP67b-蝎毒素 基因DNA和15嗎BmNPVDNA混合，并加入14jxl脂質(zhì)體lipofectin，最后加 入滅菌蒸餾水至終體積40jal;將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞。先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，換成含有 10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基，27。C培養(yǎng)5天，收集培養(yǎng)基上清作為病毒原液， 用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的重組病 毒溶液，該重組病毒溶液的濃度為10Spfii/ml，本發(fā)明將此重組病毒命名為 BmNPV-蝎毒素；
(3) 家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組蝎毒素純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重 組病毒進(jìn)行感染表達(dá)；接種前將幼蟲浸在冰水浴中進(jìn)行短時(shí)間麻醉，然后采用 皮下注射的方法注射重組病毒懸浮液，濃度為106pfo/ml，每條家蠶注射20pl， 注射l小時(shí)后喂桑，并在23-25'C下飼養(yǎng)；感染后72—96小時(shí)內(nèi)收集家蠶幼蟲， 解剖感染家蠶的脂肪體，并用此作為純化重組蝎毒素的起始材料，以感染前的 家蠶作為對(duì)照；將脂肪體勻漿后溶解在預(yù)冷的pH 7.6， 20mM Tris-HCl緩沖液中， 經(jīng)高速離心后將上清液直接上Ni-NAT親和層析柱，由于蝎毒素蛋白與Ni-NAT具有強(qiáng)烈的親和性而使蝎毒素蛋白結(jié)合到層析柱上，然后用含有上述同樣緩沖
液洗脫去掉雜蛋白，最后用250mM咪唑緩沖液一步洗脫出結(jié)合的重組蝎毒素蛋 白。通過SDS-PAGE電泳分析鑒定重組蝎毒素蛋白。圖2示出了本發(fā)明中家蠶 幼蟲感染重組蝎毒素病毒前后的照片圖2的左上方為家蠶感染前的照片，左 下方為家蠶感染后的照片；圖2的右邊為重組蝎毒素蛋白純化照片，其中，l為 作為參照的分子量，自上而下的分子量分別為14.3KDa和6.0KDa， 2為作為對(duì) 照的樣品，3為從感染幼蟲中純化的樣品。由圖2可知，本發(fā)明所獲得的重組蝎 毒素純度很高。
關(guān)于重組蝎毒素蛋白生物學(xué)活性分析鑒定采用經(jīng)口添食的方法，將純化 獲得的重組蝎毒素蛋白溶解于磷酸緩沖液，配制成濃度分別為50pg/ml、 100|ig/ml、 200pg/ml、 500 ng/ml的添食液，將此四種添食液噴于桑葉，按每種添 食液添食一組4齡家蠶幼蟲，每組有30只幼蟲。72小時(shí)后觀察幼蟲的中毒和死 亡情況。結(jié)果表明，不同濃度的重組蝎毒素蛋白溶液添食的幼蟲與圖2所示的 對(duì)照樣品相比，都表現(xiàn)出一定程度的中毒癥狀，隨著濃度增大，中毒程度加深， 在200 pg/ml和500pg/ml兩個(gè)濃度的試驗(yàn)區(qū),分別有12%和38%的幼蟲因中毒死 亡，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明家蠶幼蟲中表達(dá)的重組蝎毒素蛋白具有生物學(xué)毒性。蝎毒素基因BmK核苷酸序列表
<110>浙江大學(xué)
<120>以家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法 〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3.1 〈210> 1 〈211〉 198 〈212> DNA
<213〉 東亞鉗蝎(Buthus martensii Karsch) <400〉 1
atggatggat atataagagg aagtaacgga tgcaaggttt catgcttatg gggaaatgaa 60 ggttgcaata aagaatgcgg agcgtacggt gcctcttatg gttattgctg gacctgggga 120 cttgcatgct ggtgtgaagg ccttcctgat gataagacat ggaaatctga aagtaataca 180 tgcggtggaa aaaagtaa 198
9
權(quán)利要求
1.一種以家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法，其特征在于包括如下步驟(1)以蝎cDNA為模板、以含有BglII酶切位點(diǎn)的5′-ACGTAGATCTATGGATGGATATATAAG-3′為正向引物、以含有BglII酶切位點(diǎn)的5′-ACGTAGATCTTTACTTTTTTCCAC-3′為反向引物進(jìn)行三十二個(gè)循環(huán)的PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)獲得蝎毒素基因，所述PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)的第一個(gè)循環(huán)是在94℃模板變性50秒；第二個(gè)至第三十一個(gè)循環(huán)是先在55℃退火30秒，后在70℃延伸30秒；第三十二個(gè)循環(huán)是在70℃延伸7分鐘；對(duì)PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)獲得的蝎毒素基因進(jìn)行純化，并將該蝎毒素基因克隆入3.9kb載體pCR2.1得到pCR2.1-蝎毒素，在核苷酸測(cè)序儀上測(cè)序確認(rèn)pCR2.1-蝎毒素基因順序的正確性；(2)用限制性內(nèi)切酶BglII消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后將蝎毒素基因片段克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b獲得重組體pAcGP67b-蝎毒素基因；通過共轉(zhuǎn)染在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)與家蠶桿狀病毒BmNPV DNA同源重組產(chǎn)生重組病毒，所述共轉(zhuǎn)染的方法為先將1μg pAcGP67b-蝎毒素基因DNA和15μgBmNPV DNA混合，接著加入14μl脂質(zhì)體lipofectin，后又加入滅菌蒸餾水至終體積40μl，最后將該混合液在室溫培育15分鐘后共轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf21培養(yǎng)細(xì)胞；將上述通過共轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的重組病毒先用無血清的TC-100培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，再換成含有10％胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基于27℃培養(yǎng)5天后，收集培養(yǎng)基上清液作為病毒原液以用來篩選所述重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的重組BmNPV-蝎毒素病毒溶液，該BmNPV-蝎毒素病毒溶液的濃度為108pfu/ml；(3)先將5齡家蠶幼蟲浸在冰水浴中進(jìn)行麻醉，然后采用皮下注射的方法將濃度為106pfu/ml的重組BmNPV-蝎毒素病毒懸浮液注射入家蠶幼蟲進(jìn)行感染表達(dá)，每條家蠶注射20μl；注射1小時(shí)后對(duì)家蠶幼蟲喂桑，并在23-25℃下飼養(yǎng)；在感染后72-96小時(shí)內(nèi)收集家蠶幼蟲，解剖感染后家蠶的脂肪體，并用該脂肪體作為純化重組蝎毒素的起始材料；將所述脂肪體勻漿后溶解在預(yù)冷的pH為7.6的20mM Tris-HCl緩沖液中，經(jīng)高速離心后將上清液直接上Ni-NAT親和層析柱而使重組蝎毒素蛋白結(jié)合到層析柱上；然后用pH為7.6的20mMTris-HCl緩沖液洗脫去掉雜蛋白，最后用250mM咪唑緩沖液一步洗脫出結(jié)合的重組蝎毒素蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以家蠶作為宿主生產(chǎn)重組蝎毒素蛋白的方法，主要包括以下步驟以蝎cDNA為模板、以含有BglII酶切位點(diǎn)的5′-ACGTAGATCTATGGATGGATATATAAG-3′為正向引物、以含有BglII酶切位點(diǎn)的5′-ACGTAGATCT TTACTTTTTTCCAC-3′為反向引物進(jìn)行三十二個(gè)循環(huán)的PCR基因擴(kuò)增反應(yīng)獲得蝎毒素基因；用限制性內(nèi)切酶BglII消化pCR2.1-蝎毒素得到蝎毒素基因片段，然后克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcGP67b獲得重組體pAcGP67b-蝎毒素基因，通過共轉(zhuǎn)染在昆蟲細(xì)胞內(nèi)與家蠶桿狀病毒BmNPV DNA同源重組產(chǎn)生重組病毒；家蠶體內(nèi)表達(dá)和重組蝎毒素純化。本發(fā)明用家蠶幼蟲表達(dá)的重組蝎毒素蛋白大部分留在家蠶脂肪體內(nèi)，利用親和層析從脂肪體中純化蝎毒素，重組蝎毒素具有明顯的生物學(xué)毒性，適合于生物制藥產(chǎn)業(yè)化水平的要求，在未來的醫(yī)學(xué)和臨床治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/866GK101629186SQ20091010213
公開日2010年1月20日 申請(qǐng)日期2009年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日
發(fā)明者于少芳, 吳小鋒, 相興偉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)