專利名稱：一種肝癌靶向性基因表達元件ae及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)，涉及基因表達調(diào)控，具體地說，涉及一種特異性針對 甲胎蛋白陽性肝癌的靶向性基因表達元件AE的設(shè)計、制備及其在甲胎蛋白陽 性的肝癌細胞內(nèi)特異表達、其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)細胞內(nèi)加工后可以有效地抑制肝癌細 胞內(nèi)真核細胞翻譯起始因子4E的表達，使細胞內(nèi)新的蛋白質(zhì)合成因完整的真 核細胞翻譯起始復合物缺乏而無法進行，從而達到抑制肝癌細胞生長及增殖的 作用。本發(fā)明可用于制備靶向性腫瘤基因治療藥物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是目前人類主要"殺手"之一，近年來隨著人們生活方式及環(huán)境的 改變，其發(fā)病率呈上升趨勢，在許多城市已成為第一位死亡原因，在農(nóng)村位列 第二位。肝癌在我國是最常見的危害極大的惡性腫瘤之一，和肺癌、胃腸道腫 瘤、乳癌等其它常見惡性腫瘤相比，目前的手術(shù)和化療等常規(guī)方式的療效和預 后均不理想。
被稱為腫瘤治療新模式的生物治療目前正顯示出越來越良好的應用前景。 在各種腫瘤生物治療手段中，基因治療始終是一個主要方向，我國研制的世界 上第一個正式進入臨床使用的基因藥物、針對許多腫瘤細胞中發(fā)生突變的抑癌 基因p53的、可表達野生型p53的腺病毒注射液"今又生"即是其代表。隨著醫(yī) 學分子生物學技術(shù)和知識的飛速發(fā)展，各種先進的分子生物學手段都運用到腫 瘤的基因治療研究中。但是由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及眾多基因，而目前的研究 大都僅針對個別靶基因，因此，這些研究雖然都顯示出較好的細胞水平的體外 抑瘤效果甚至荷瘤動物模型的體內(nèi)抑瘤效應，但實際效果并不理想。因此，探 索、嘗試新的腫瘤基因治療手段具有十分重要的意義。
正常細胞在各種致癌因素的作用下逐漸發(fā)生變化直至最后發(fā)生癌變，有相 當多的基因表現(xiàn)出過度表達的現(xiàn)象，尤其是一些促進細胞生長、侵襲等惡性表 型的基因的過量表達。針對腫瘤中異常表達的基因，人們設(shè)計了許多耙向性基 因治療的方法，其中以封閉促進腫瘤生長、侵襲等相關(guān)基因的表達的研究是一 個相當熱門的領(lǐng)域。在以往大量的研究中，人們利用反義RNA(antisense RNA) 對腫瘤細胞高表達基因進行封閉，但由于反義RNA本身存在的限制，這類研 究在抑制腫瘤細胞生長、控制細胞侵襲遷移等方面雖然取得了較大的成績，其封閉基因表達的效果仍不理想。
小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA)的發(fā)現(xiàn)為人為干預細胞中基 因的表達提供了一個有力的工具。利用化學合成的雙鏈形式的siRNA，或是由 III型啟動子帶動轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)類似的小發(fā)卡樣RNA (small hairpin RNA, shRNA)，可以通過序列特異性匹配原則降解靶基因，從而對靶基因的表達進 行有效的抑制，因此也被嘗試應用于基因治療。但是由于化學合成的siRNA代 價太高，而shRNA的表達又不利于調(diào)控，這些因素大大地限制了這一技術(shù)的 應用。
微小RNA (microRNA)是細胞內(nèi)天然存在的一種小分子RNA，是在基因 轉(zhuǎn)錄后水平進行表達調(diào)控的一種重要方式，能在序列完全匹配的情況下降解靶 基因mRNA，也可以在序列非完全匹配的情況下抑制靶基因的翻譯，是目前生 命科學領(lǐng)域中的一個研究熱點，在腫瘤相關(guān)microRNA方面也有大量研究，而 且大都集中在正常細胞和腫瘤細胞之間表達有差異的各種天然microRNA的發(fā) 現(xiàn)以及功能鑒定。
由于天然microRNA是由II型啟動子帶動轉(zhuǎn)錄，因此如果人工設(shè)計類似的 microRNA分子，也應該可以由II型啟動子引導轉(zhuǎn)錄，而II型啟動子的特點是 其轉(zhuǎn)錄啟動功能可以調(diào)控，所以其下游的人工miRNA的表達應該可以受到人 為控制，而microRNA的作用方式最近的一些文獻報道已證實這一設(shè)想。
在本發(fā)明中我們選擇細胞的蛋白質(zhì)合成這一重要環(huán)節(jié)為靶點，設(shè)計人工 microRNA的序列，抑制蛋白質(zhì)合成過程中的重要蛋白質(zhì)的表達，通過阻斷蛋 白質(zhì)合成而使細胞生長及增殖停止。由于蛋白質(zhì)的合成是一個復雜而又精密調(diào) 控的過程，需要由十幾個真核細胞翻譯起始因子組成的起始復合物引導mRNA 結(jié)合于核糖體、啟動蛋白質(zhì)的翻譯，其中真核細胞翻譯起始因子4E負責結(jié)合 mRNA的5，帽結(jié)構(gòu)，具有重要的作用，因此對真核細胞翻譯起始因子4E的抑 制將有效阻斷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的啟動，從而使細胞因缺少完整的翻譯起始復 合物而停止新的蛋白質(zhì)合成，進而抑制細胞的生長和增殖。
為了達到對腫瘤細胞的靶向性作用，針對我國高發(fā)的、惡性程度高、療效 及預后均較差的肝癌這一瘤種，利用在正常細胞中不表達但在肝癌細胞中高表 達的肝癌細胞特異性甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的特點，重組了 AFP 基因上游的表達調(diào)控序列，用來調(diào)控人工設(shè)計的microRNA的表達。這一基因 表達元件在導入正常細胞后不會有任何表達，而在導入AFP陽性的肝癌細胞 后，可以表達出相應的microRNA并有效地阻斷肝癌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，從而達到靶向性抑制肝癌細胞的生長。
基于本發(fā)明的思路，還可以以真核細胞翻譯起始因子4E基因的其它位點 做為靶序列進行人工microRNA的設(shè)計，或是以細胞蛋白質(zhì)合成途徑中其它重 要基因作為耙基因來進行細胞蛋白質(zhì)合成的阻斷，進而抑制細胞生長和增殖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供的一種肝癌靶向性基因表達元件AE，為一種DNA分 子，具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。其中第7位至第827位為人甲胎 蛋白(AFP)基因轉(zhuǎn)錄起始點上游第-4113位至第-3292位，該區(qū)域含有多個轉(zhuǎn) 錄增強因子和肝細胞核因子結(jié)合位點；第831位至第1012位為人甲胎蛋白
(AFP)基因轉(zhuǎn)錄起始點上游第-182位至第-l位，該區(qū)域含有AFP的基本啟 動子功能；從第1位至第1012位的1012 bp片段組成重組的AFP陽性細胞表 達調(diào)控序列；第1019位至第1828位為6個串聯(lián)連的針對人真核細胞翻譯起始 因子4E基因的人工設(shè)計的microRNA;第1829位至第2177位為牛生長激素基 因多聚腺苷酸信號區(qū)，為基因表達提供轉(zhuǎn)錄終止信號。
本發(fā)明的另一個目的是提供該表達元件AE在制備甲胎蛋白(AFP)陽性 的肝癌的靶向基因治療藥物中的應用。該表達元件AE在導入AFP陽性的腫瘤 細胞后，可以在細胞中表達針對真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA， 并有效抑制細胞內(nèi)真核細胞翻譯起始因子4E的表達，進而影響到細胞中完整 的翻譯起始復合物的形成，最終阻斷蛋白質(zhì)合成，抑制細胞生長和增殖。
該表達元件AE可構(gòu)建靶向性基因治療藥物載體，用于AFP陽性的肝癌的 靶向基因治療。該表達元件中的重組AFP表達調(diào)控元件可用于調(diào)控其它基因 的表達、針對人真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列可以用于其 它表達載體達到抑制相應細胞中真核細胞翻譯起始因子4E的表達目的。
本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點及效果利用本發(fā)明提供的表達元件 可以制備的基因治療藥物，其特點在于以肝癌細胞特異性表達的胚胎性抗原 AFP為腫瘤細胞特異性表達調(diào)控手段、以腫瘤細胞快速生長所需的蛋白質(zhì)合成 中所需的翻譯起始復合物中關(guān)鍵蛋白真核細胞翻譯起始因子4E為作用靶點進 行表達抑制，有效地阻斷細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，特異性地抑制AFP陽性的肝癌 細胞的生長和增殖。


圖1為重組AFP陽性細胞表達調(diào)控序列構(gòu)建PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖2為針對真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA構(gòu)建PCR產(chǎn)物電泳圖。
圖3為pDC312-AE酶切鑒定電泳圖。
圖4為Western blot法檢測AE對真核細胞翻譯起始因子4E表達的抑制。 圖5為MTT法檢測結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例作進一步說明。這些實施例僅用于說明，但 不限制本發(fā)明。
實施例1:
重組AFP陽性細胞表達調(diào)控序列的克隆
首先從GenBank檢索得到人AFP基因的mRNA序列(GenBank登錄號 NM—001134)，然后再經(jīng)網(wǎng)上基因組比對分析方法從GenBank中得到人包括 AFP基因在內(nèi)的第4號染色體的基因組序列(GenBank登錄號:NTJ)06216.14)， 并以AFP基因mRNA序列為基準，將其5'端作為AFP基因轉(zhuǎn)錄起始點，根據(jù) 其上游的基因組序列設(shè)計合成 引物1: 5'-AGA TCT CAG ATT GAA TTA TTT GCCTGTCA國3'、弓l物2: 5，國GGA TCC TAG GAA GTT TTC GCA ATA ATA C國3 ，、引物3:5 ，國AGA TCT GCC CCA AAG AGC TCT GTG T-3 ，和引物4:5 ，國GGA TCC AAA TCA TGC TGA AAT TCT TTT ATA CTC-3 ，，利用聚合酶鏈反應技術(shù)
(Polymerase Chain Reaction, PCR)以人肝癌細胞SMMC7721的基因組DNA 為模板，用上述引物進行核酸擴增(引物1與引物2、引物3與引物4)，獲得 擴增產(chǎn)物A(821 bp)和B(180bp)，參見圖1，其中泳道1，4為lkbDNALadder， 泳道2為擴增產(chǎn)物A (821bp)，泳道3為擴增產(chǎn)物B (180bp)。
將擴增產(chǎn)物A、 B以T-A克隆的方式分別克隆至pGEM T-easy載體
(Promega公司，美國)，經(jīng)DNA序列測定并與基因組序列(NT_006216.14) 核對驗證其正確性。然后將A經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后連至 B的5，端的BglII位點，成為重組的AFP陽性細胞表達調(diào)控序列。
實施例2:
針對人真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA的克隆
從GenBank檢索得到人真核細胞翻譯起始因子4E基因的mRNA序列 (GenBank登錄號NM_001968)，利用網(wǎng)上軟件分析該mRNA序列上合適的 位點，確定人工microRNA的作用靶點，設(shè)計合成引物1:5'-TGC TGT TGA CAGTA畫3，、引物2: 5，- TCC GAG GCA GTA GGC ATG GAG CAC TAG TTT GAT TAT TAT ACA TCT GTG GCT TCA CTA TA -3 ，、引物3: 5 ，-AGA TCT GAT CCA AGA AGG TAT ATT GCT GTT GAC AGT GAG CG-3，和引物4: 5'國GGA TCC ATC GTA GCC CTT GAA GTC CGA GGC AGT AGG CA-3 ，。先將引物1和引物 2進行重疊延伸PCR，得到97 bp的擴增產(chǎn)物C，再以此擴增產(chǎn)物C為模板， 用引物3和引物4進行PCR擴增，得到142 bp的擴增產(chǎn)物D，參見圖2，其 中泳道1為DL2000 DNALadder，泳道2為擴增產(chǎn)物D (142bp)。
以T-A克隆的方式克隆至pGEM T-easy載體，經(jīng)DNA測序驗證其正確性。 此即針對人真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列。為了加強其作 用效果，用限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后回收該人工microRNA序 列并重新插入同一載體的BamH I位點，獲得6個串聯(lián)連接的人工microRNA 序列。
實施例3:
肝癌靶向性基因表達元件AE的構(gòu)建及腺病毒載體的制備
首先構(gòu)建pDC312-BGHpA載體將腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312載體(Microbix 公司，美國)用限制性內(nèi)切酶XbaI單酶切開，用Klenow酶補平，再用限制 性內(nèi)切酶HindIII單酶切，去掉Xba I到HindIII之間的部分(從HindIII、 Sac I 、 Ecll36H、 Accl、 Sal I到Xba I )，回收部分一端為平端，另一端為HindIII 粘性末端。pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司，美國)用限制性內(nèi)切酶PvuII 和HindIII雙酶切，回收包括HindIII、 Asp718、 Kpn I 、 BamH I 、 BstXI、 EcoR I 、 EcoRV、 BstXI、 Not I 、 Xho I 、 Xba I 、 DraII 、 Apa I和Pme I多克隆位點 和牛生長因子基因多聚腺苷酸信號(BGHpA)的片段， 一端為HindIII粘性末 端，另一端為PvuII的平端。將上述兩個片段連接起來，即成pDC312-BGHpA 載體，可在多克隆位點上插入啟動子和目的基因編碼區(qū)。
再將實施例1中的重組AFP陽性細胞表達調(diào)控序列從載體上用限制性內(nèi) 切酶BamH I和Bgl II雙酶切后回收，并插入pDC312-BGHpA的BamH I位點， 得到帶有重組AFP陽性細胞表達調(diào)控序列和BGHpA的腺病毒穿梭質(zhì)粒。最后 將6個串聯(lián)連接的針對人真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA序列從 載體上用限制性內(nèi)切酶BamH I和BglII雙酶切后回收，插入此穿梭質(zhì)粒的 BamHl位點，得到帶有完整肝癌靶向性表達元件AE的腺病毒穿梭質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果與預期完全相符，參見圖3，其中泳道l為1Kb Plus DNAMarker; 泳道2為pDC312-AE經(jīng)BamH I 、 Bgl I 、 EcoR I酶切。
將上述帶有完整肝癌靶向性表達元件AE的腺病毒穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架 質(zhì)粒pBHGlox(ddta)El,3cre (Microbix公司，美國)共轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細胞293 細胞，得到帶有表達元件AE的腺病毒載體。
實施例4:
基因表達元件AE對AFP陽性肝癌細胞的靶向性抑制
A、 Western blot法檢測AE對真核細胞翻譯起始因子4E表達的抑制 取對數(shù)生長期的AFP陽性的肝癌細胞Hep3B細胞，按3xl()S細胞/孔的密
度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時使其貼壁并達到80%的匯合度。用培養(yǎng)基稀 釋上述帶有表達元件AE的腺病毒，以感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI) 為100pfli/cell和10pfu/cell感染細胞，48hr后中止作用，提取細胞總蛋白，進 行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10X分離膠，5X濃縮膠)，然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后與l : 1000稀釋抗真核細胞翻譯起始因子4E的單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.，美國，elF4E (P隱2): sc-9976)結(jié)合，室溫2hr后，用 TBST洗膜3次，再結(jié)合HRP標記抗小鼠IgG抗體(北京中杉金橋生物技術(shù) 有限公司)，再次洗膜，然后用化學發(fā)光試劑盒(Roche公司，美國)顯影，X 光片暴光。以GAPDH為內(nèi)參照，用HRP標記的GAPDH抗體(上?？党缮?物技術(shù)有限公司)同樣結(jié)合、顯影及暴光。實驗設(shè)帶綠熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的腺病毒感染和無腺病毒感染的細胞作對照。結(jié)果參 見圖4，顯示感染帶有表達元件AE的腺病毒的AFP陽性肝癌細胞Hep3B中的 真核細胞翻譯起始因子4E表達明顯受到抑制。圖中G:帶AE腺病毒MOI分 別為100和10感染Hep3B肝癌細胞后真核細胞翻譯起始因子4E表達；GFP: 帶GFP腺病毒MOI分別為100和10感染Hep3B肝癌細胞后真核細胞翻譯起 始因子4E表達；N:未感染腺病毒的Hep3B肝癌細胞中真核細胞翻譯起始因 子4E表達。
B、 體外細胞生長抑制試驗(MTT法)
取對數(shù)生長期的肝癌細胞Hep3B、 HepG2、 SMMC7721和乳癌細胞Bcap37 (非肝癌細胞)，按2><103細胞/孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時使其 貼壁。將帶AE的腺病毒以MOI為200pfii/ce11、 100pfU/cell、 50pfli/ce11、 10 pfu/cel1、 lpfo/cell和OpfU/cell感染細胞。在病毒感染4天后，每孔加入MTT 8溶液(5mg/ml) 20ul， 37。C繼續(xù)培養(yǎng)4hr，中止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)上清液，每孔 加入DMSO200ul，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測 定各孔570nm波長OD值。細胞存活率=(病毒作用組OD值/病毒未作用組 OD值)xl00%。每組設(shè)立5復孔，重復3遍。從圖5可以看出，不同MOI 的帶AE的腺病毒對不同的肝癌細胞Hep3B、 HepG2和SMMC7721的生長均 有不同程度的抑制，而對乳癌細胞(非肝癌細胞)Bcap37則無明顯抑制。本發(fā)明涉及的序列
<120>—種肝癌靶向性基因表達元件AE及其應用 <160>9
<210> 1 <211>2177 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>甲胎蛋白陽性肝癌細胞特異性表達元件AE序列
<400> 1
DNASIS
SEQ
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtcat acagctaata attgaccata agacaattag 60 atttaaatta gttttgaatc tttctaatac caaagttcag tttactgttc catgttgctt 120 ctgagtggct tcacagactt atgaaaaagt aaacggaatc agaattacat caatgcaaaa 180 gcattgctgt gaactctgta cttaggacta aactttgagc aataacacat atagattgag 240 gattgtttgc tgttagtata caaactctgg ttcaaagctc ctctttattg cttgtcttgg 300 aaaatttgct gttcttcatg gtttctcttt tcactgctat ctatttttct caaccactca 360 catggctaca ataactgtct gcaagcttat gattcccaaa tatctatctc tagcctcaat 420 cttgttccag aagataaaaa gtagtattca aatgcacatc aacgtctcca cttggagggc 480 ttaaagacgt ttcaacatac aaaccgggga gttttgcctg gaatgtttcc taaaatgtgt 540 cctgtagcac atagggtcct cttgttcctt aaaatctaat tacttttagc ccagtgctca 600 tcccacctat ggggagatga gagtgaaaag ggagcctgat taataattac actaagtcaa 660 taggcataga gccaggactg tttgggtaaa ctggtcactt tatcttaaac taaatatatc 720 caaaactgaa catgtactta gttactaagt ctttgacttt atctcattca taccactcag 780 ctttatccag gccacttatt tgacagtatt attgcgaaaa cttcctagga tctgccccaa 840 agagetctgt gtccttgaac ataaaataca aataaccgct atgctgttaa ttattggcaa 900 atgtcccatt ttcaacctaa ggaaatacca taaagtaaca gatataccaa caaaaggtta 960 ctagttaaca ggcattgcct gaaaagagta taaaagaatt tcagcatgat ttggatctga 1020 tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca ctagtttgat tattatagtg 1080 aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc tactgcctcg gacttcaagg 1140 gctacgatgg atctgatcca agaaggtata ttgctgttga cagtgagcgc ggagcactag 1200 tttgattatt atagtgaagc cacagatgta taataatcaa actagtgctc catgcctact 1260 gcctcggact tcaagggcta cgatggatct gatccaagaa ggtatattgc tgttgacagt 1320 gagcgcggag cactagtttg attattatag tgaagccaea gatgtataat aatcaaacta 1380 gtgctccatg cctactgcct cggacttcaa gggctacgat ggatctgatc caagaaggta 1440 tattgctgtt gacagtgagc gcggagcact agtttgatta ttatagtgaa gccacagatg 1500 tataataatc aaactagtgc tccatgccta ctgcctcgga cttcaagggc tacgatggat 1560 ctgatccaag aaggtatatt gctgttgaca gtgagcgcgg agcactagtt tgattattat 1620 agtgaagcca cagatgtata ataatcaaac tagtgctcca tgcctactgc ctcggacttc 1680 aagggctacg atggatctga tccaagaagg tatattgctg ttgacagtga gcgcggagca 1740 ctagtttgat tattatagtg aagccacaga tgtataataa tcaaactagt gctccatgcc 1800 tactgcctcg gacttcaagg gctacgatgg atccactagt ccagtgtggt ggaattctgc 1860 agatatccag cacagtggcg gccgctcgag tctagagggc ccgtttaaac ccgctgatca 1920
10gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1980 ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 2040 cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 2100 gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag 2160 gcggaaagaa ccagctg 2177
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計的AFP上游表達調(diào)控序列擴增用引物1 <400> 2
agatctcaga ttgaattatt tgcctgtca 29
<210> 3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計的AFP上游表達調(diào)控序列擴增用引物2 <400> 3
ggatcctagg aagttttcgc aataatac 28
<210> 4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計的AFP上游表達調(diào)控序列擴增用引物3 <400> 4
agatctgccc caaagagctc tgtgt 25
<210> 5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根據(jù)AFP基因組序列設(shè)計的AFP上游表達調(diào)控序列擴增用引物4 <400> 5
ggatccaaat catgctgaaa ttcttttata etc 33
<210> 6 <211>59<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>針對真核細胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計的人工microRNA擴增用引物1 <400> 6
tgctgttgac agtgagcgcg gagcactagt ttgattatta tagtgaagcc acagatgta 59
<210> 7 <211>59 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>針對真核細胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計的人工microRNA擴增用引物2 <400> 7
tccgaggcag taggcatgga gcactagttt gattattata catctgtggc ttcactata 59
<210> 8 <211>41 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>針對真核細胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計的人工microRNA擴增用引物3 <400> 8
agatctgatc caagaaggta tattgctgtt gacagtgagc g 41
<210>9
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>針對真核細胞翻譯起始因子4E基因設(shè)計的人工microRNA擴增用引物4 <400> 9
ggatccatcg tagcccttga agtccgaggc agtaggca 38
權(quán)利要求
1.一種肝癌靶向性基因表達元件AE，為一種DNA分子，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，其中第7位至第827位為人甲胎蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點上游第-4113位至第-3292位，該區(qū)域含有多個轉(zhuǎn)錄增強因子和肝細胞核因子結(jié)合位點，第831位至第1012位為人甲胎蛋白基因轉(zhuǎn)錄起始點上游第-182位至第-1位，該區(qū)域含有甲胎蛋白的基本啟動子功能，從第1位至第1012位的1012bp片段組成重組的甲胎蛋白陽性細胞表達調(diào)控序列，第1019位至第1828位為6個串聯(lián)連的針對人真核細胞翻譯起始因子4E基因的人工設(shè)計的microRNA，第1829位至第2177位為牛生長激素基因多聚腺苷酸信號區(qū)，為基因表達提供轉(zhuǎn)錄終止信號。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌靶向性基因表達元件AE在制備甲胎蛋白陽性的肝癌的靶向基因治療藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種肝癌靶向性基因表達元件AE，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。該表達元件AE在導入甲胎蛋白陽性的腫瘤細胞后，可以在細胞中表達針對真核細胞翻譯起始因子4E的人工microRNA，并有效抑制細胞內(nèi)真核細胞翻譯起始因子4E的表達，進而影響到細胞中完整的翻譯起始復合物的形成，最終阻斷蛋白質(zhì)合成，特異性地抑制AFP陽性的肝癌細胞的生長和增殖，可在制備甲胎蛋白(AFP)陽性的肝癌的靶向基因治療藥物中的應用。
文檔編號C12N15/11GK101671669SQ20091010181
公開日2010年3月17日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者江 曹, 毛晨宇, 賈振宇, 萍 陳 申請人:浙江大學