專利名稱：通過檢測感染后宿主的差別性基因表達進行微陣列介導的皰疹病毒感染診斷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明總體上涉及診斷、檢測宿主應答，監(jiān)測、治療與處理哺乳動物中皰疹病毒感染的方法與系統(tǒng)。本發(fā)明可實際應用于早期診斷感染、檢測對皰疹病毒感染的特異性免疫應答(具有或不具有臨床癥狀)，能對受臨床和亞臨床影響的哺乳動物作出更好的治療和處理決定。本發(fā)明也可實際應用于監(jiān)測有發(fā)生皰疹相關后遺癥風險或因潛伏病毒引起的臨床體征復發(fā)的哺乳動物。這種哺乳動物包括但不限于因患其它疾病或給予治療藥物所致、患有慢性疲勞綜合征、遭應激或運動訓練而免疫減弱的動物。
背景技術：
皰疹病毒代表了廣泛導致人與家養(yǎng)和野生動物各種疾病的一個病毒大家族。已知的皰疹病毒類型超過80種，但只有8種已知能引起人類致病。這8種分為下表所示的三個亞科。
皰疹病毒感染分布廣泛，導致的疾病具有嚴重經(jīng)濟重要性。事實上，大多數(shù)種類的哺乳動物在生命的早期曾受到皰疹病毒的至少一種毒株感染。感染是持久性的，并且沒有已知的治療方法?？墒褂每共《舅幬飦碇委煟窃诎Y狀發(fā)生后應用和/或服用(當它們至少有用時)，由于副作用和費用而不能用作預防給藥。因此，它們的應用一般限于人類。
目前基于抗體檢測的診斷方法只能檢測臨床體征出現(xiàn)后與患者從其它動物感染后產(chǎn)生的抗體。其它檢測方法包括聚合酶鏈式反應擴增病毒轉錄物或病毒DNA，組織培養(yǎng)分離病毒和/或病毒中和試驗。
所有皰疹病毒感染是持久的。初始感染后，病毒進入潛伏期。當患者免疫力減弱或受應激或強烈運動訓練時，疾病可重新激活。病毒的重新激活可導致癥狀復發(fā)，或全身不適，或對鍛煉的耐受性或表現(xiàn)降低，或者可以無癥狀。
病毒抗體、抗原或轉錄物的測定(值)不一定與疾病或臨床體征相關聯(lián)。
可用的有效疫苗幾乎沒有。
可用藥物來治療，但它們昂貴，為獲得最大療效需要在主要臨床體征出現(xiàn)前給予。
流行病學與臨床表現(xiàn)皰疹病毒在正常與免疫力減弱的宿主中可導致幾種臨床表現(xiàn)。大多數(shù)皰疹病毒感染時無癥狀，皰疹傳播的大多數(shù)病例是爆發(fā)時尚未意識到或依舊未診斷出的人。
50-90％的成人具有對HHV-1或1型人單純皰疹病毒(HSV-1)的抗體；20-30％成人具有對HHV-2或2型人單純皰疹病毒(HSV-2)的抗體。(病毒)在社會經(jīng)濟地位較低群體與性濫交個體中傳播更普遍。HSV-1通常與口面部(orofacial)區(qū)域初始感染有關，潛伏感染三叉神經(jīng)節(jié)，而HSV-2通常與生殖器感染有關，潛伏感染骶骨神經(jīng)節(jié)。雖然初始與復發(fā)感染通常是自我限制的(self-limited)，但HSV能導致嚴重疾病，例如新生兒播散性皰疹，病毒性腦炎與致盲性角膜炎(blinding keratitis)。
在急性初始感染期間，HSV持久潛伏在與進入的皮膚或粘膜部位相對應的神經(jīng)根節(jié)(nerve root ganglia)中。在口唇(orolabial)感染中，HSV潛伏在三叉神經(jīng)節(jié)中，而在生殖器或肛門直腸感染時潛伏在骶骨神經(jīng)節(jié)中。各種刺激，例如紫外光與感覺神經(jīng)損傷可重新激活潛伏的HSV。復發(fā)性病損發(fā)生在或接近初始感染部位。復發(fā)似乎與某些方式降低個體對疾病抵抗力的因素有關，例如感冒或上呼吸道感染，高強度體力運動，日曬，應激，婦女月經(jīng)與一些個體因食物而觸發(fā)，特別是大量巧克力或花生。
在重激活期間，HSV在神經(jīng)節(jié)內復制，后代病毒顆粒沿感覺神經(jīng)向外周轉移至其重激活神經(jīng)節(jié)支配的粘膜或上皮表面。然后病毒在皮膚表面活躍復制產(chǎn)生了HSV感染復發(fā)的典型臨床體征與病損(如同受HSV感染的人復發(fā)感冒的情況一樣)。
“EB病毒”(EBV)或HHV-4與也稱為“腺熱”的傳染性單核細胞增多以及腫瘤形成(例如，伯基特淋巴瘤與鼻咽癌(nasopharyngeocarcinoma))有關。此外，在免疫抑制與患何杰金病的患者中發(fā)現(xiàn)有EBV。EBV在全世界都有，大多數(shù)人在其一生中曾受其感染。在美國，多達95％的成人在35-40歲時受感染。一旦母體抗體保護作用(出生時存在)消失，嬰兒即對EBV易感。
傳染性單核細胞增多的EBV癥狀包括發(fā)熱、咽喉痛、淋巴腺腫脹。有時可發(fā)生脾臟或肝臟腫脹。很少發(fā)生心臟問題或涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，傳染性單核細胞增多幾乎從不致命。與患傳染性單核細胞增多的人接觸的大多數(shù)個體以前受過EBV感染，不會有患傳染性單核細胞增多的風險。此外，EBV傳播需要與受感染者的唾液(在口中發(fā)現(xiàn)病毒)密切接觸。此病毒一般不通過空氣或血液傳播。潛伏時期，或從感染到癥狀出現(xiàn)的時間為4-6周。傳染性單核細胞增多患者能在數(shù)周內中將此感染性疾病傳播給他人。然而，不推薦專門的預防措施或隔離方法，因為在健康人的唾液中也經(jīng)常能發(fā)現(xiàn)此病毒。事實上，許多健康者可終身攜帶并間歇傳播此病毒。這些人通常是人與人傳播的主要來源(primary reservoir)。有鑒于此，幾乎不可能防止該病毒傳播。
雖然傳染性單核細胞增多的癥狀通常會在1或2個月中消退，EB病毒在此人一生的其余時間可維持休眠或潛伏在咽喉與血液的少數(shù)細胞中。該病毒可以周期性地重新激活，常見于受感染者的唾液中。此重激活發(fā)生時往往沒有明顯疾病癥狀，但可以有非特異性癥狀，例如不適或運動表現(xiàn)不佳。EBV也能在機體免疫系統(tǒng)的一些細胞中建立終身的休眠感染。此病毒極少的攜帶者后來可出現(xiàn)伯基特淋巴瘤與鼻咽癌，兩種在美國不常發(fā)現(xiàn)的罕見癌癥。EBV似乎在這些惡性腫瘤發(fā)生中起著重要作用，但可能不是這些疾病的唯一原因。
巨細胞病毒(CMV)或HHV-5普遍見于所有地理區(qū)域與社會經(jīng)濟群體中，在美國，50％-85％的40歲成人受感染。CMV可導致免疫抑制者肺部感染。此外，據(jù)信CMV與EBV與慢性疲勞綜合征有關，每100,000人中有6人受該病影響。任何以前感染者的體液中可排出感染性CMV，因而可在尿、唾液、血液、眼淚、精液與母乳中發(fā)現(xiàn)。病毒的排出可間歇發(fā)生，而沒有可檢測的體征，也不導致癥狀。CMC在人與人之間傳播。CMV可經(jīng)性傳播，也可經(jīng)母乳、移植的器官傳播，很少經(jīng)輸血傳播。雖然該病毒不是高度傳染性的，但其顯示能在家庭內與年輕兒童中傳播。常能阻止該病毒的傳播，因為它最常見的傳播方式是通過受感染體液與手接觸，然后該病毒被易感者的鼻或口吸收。因此，當處理兒童的物品如尿布時應當心。用肥皂與水簡單洗手能有效地將該病毒從手上除去。
CMV引起的癥狀少于EBV，往往發(fā)生長期不明顯的感染，在此期間病毒寄居在細胞中而不導致可檢測的損傷或臨床疾病。因服藥或疾病導致機體免疫系統(tǒng)嚴重受損時常使該病毒從潛伏或休眠狀態(tài)重新激活。CMV感染在嬰兒與幼兒中常見但沒有癥狀；因此，將已知受感染的兒童停學或停學不合理也不必要。類似地，住院患者不需要單獨或精心的隔離預防措施。對兒童或患者進行CMV篩檢的價值可疑。該方法的成本與操作不切實際。不應將已知感染了CMV的兒童單獨排除、隔離或特別對待。反而，建議對照料兒童的人員給予教育與建立有效的衛(wèi)生措施。CMV可能導致問題的情況是妊娠，嬰兒和兒童護理工作的人與免疫力減弱的人。
水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)或HHV-3通常導致兒童水痘，其(感染)需要吸入感染者鼻部或咽喉排放入空氣的含病毒顆粒的小液滴。該病毒通過感染呼吸道的細胞進入人體，從而擴散至身體的大多數(shù)其它部位，包括皮膚而導致特征性皮疹。各病損(斑點)在約一周內經(jīng)歷了一系列特征性階段。丘疹和小泡發(fā)展為膿皰，然后結痂，愈合。水痘的顯著特征是長出幾個連串的斑點，達到疾病的高峰期(首次出現(xiàn)皮疹的3-4天后)，從新的水泡發(fā)展為結痂的所有階段均有病損。
VZV以此方式傳播的能力顯示水痘極具傳染性。病毒從氣道排出始于潛伏后期，持續(xù)至所有斑點結痂。雖然皮膚水泡含有病毒顆粒，但它們不是主要傳染源。疤無傳染性。由來已久的干預方法是盡可能降低發(fā)熱與不適(即，退熱藥物、冷水浴和安慰性洗液(soothing lotion))。
水痘是VZV初始感染的臨床表現(xiàn)。從初始感染恢復后，VZV并不從體內消失，而是在脊髓中感覺神經(jīng)的根部處于休眠狀態(tài)(通?？蓴?shù)十年)。當感染重新激活后，引起受感染感覺神經(jīng)所分布區(qū)域疼痛與皮疹。潛伏感染可導致帶狀皰疹發(fā)作。這通常在老年人中發(fā)生，可能是因為隨著年齡增長，免疫系統(tǒng)不能控制該病毒。帶狀皰疹的皮疹含有VZV顆粒，像水痘的皮疹一樣。因此，帶狀皰疹將水痘傳染給以前未患水痘的人的風險不大。嬰兒通?？赏ㄟ^與患帶狀皰疹的祖父母親密接觸而染上水痘，但這種傳播風險低，因為帶狀皰疹期間VZV不通過喉部排出。
玫瑰疹病毒或HHV-6與兒童和免疫力減弱患者的“玫瑰疹”和“嬰兒疹(infantum)”感染有關。例如，AIDS患者顯示有HHV-6感染，雖然HHV-6感染的意義尚不清楚。HHV-6對抗病毒藥物敏感。然而，抗病毒藥物如何抵御HHV-6或該病毒對這種藥物的抗性如何產(chǎn)生尚不清楚。HHV-6的有意義方面是其推測其分別與多發(fā)性硬化癥和慢性疲勞綜合征有關。
對HHV-7與HHV-8(細長病毒)了解更少。HHV-7直接參與任何人類疾病的明確證據(jù)還未見報導。然而，研究顯示HHV-7可能與HHV-6相關感染有關。一有關觀點是，據(jù)信HHV-8感染與卡波西肉瘤有關。
此外，認為皰疹病毒是養(yǎng)馬業(yè)損耗的重要原因與嚴重損害馬的運動能力的原因。獸醫(yī)、訓馬員與馬主人傾向于只憑經(jīng)驗治療患呼吸道疾病的馬，因為缺乏臨床指南和實驗室方法，也因為不了解病毒和繼發(fā)性細菌感染與疾病持續(xù)時間之間的關系。其它診斷或評估方法往往是復雜、侵入性、不方便、昂貴、耗時、動物可能因該方法而受傷的危險并且往往需要將動物轉運至診斷中心。
在西澳大利亞進行的研究中，從48％具有呼吸道問題或(運動)表現(xiàn)不佳的馬的血液中分離到皰疹病毒。然而，也可從54％不具有臨床體征的馬中分離到皰疹病毒，從而得出結論血細胞中存在該病毒不是疾病的決定因素。從鼻部拭子中分離病毒更能表明呼吸道感染，但只在50％的臨床病例中分離到。據(jù)報導在英國多達75％的馬攜帶有該病毒。
馬鼻肺炎與馬流產(chǎn)公認由兩種不同但抗原性相關的病毒(稱為4型馬皰疹病毒(EHV-4)與1型馬皰疹病毒(EHV-1))導致的馬疾病。EHV-1是馬流行性流產(chǎn)、產(chǎn)期死亡、呼吸道疾病與神經(jīng)體征(偶爾)的病因。流產(chǎn)是EHV感染的最驚人與可怕的結果，它是飼養(yǎng)者的經(jīng)濟災難，造成客戶流失與大量的保險賠付。EHV-1或極其相關的EHV-4造成的呼吸道疾病可不良地影響馬的競技表現(xiàn)。
在澳大利亞的Hunter Valley進行的研究顯示養(yǎng)馬業(yè)中EHV-1感染流行，該地方60日齡前幼駒常受EHV-1感染。在美國進行的獨立研究顯示85％的幼駒在斷奶后6-8個月血清陽轉。據(jù)信，幼駒是通過與母馬或同群幼駒的呼吸道液滴接觸而感染。
EHV-1是一種偏愛呼吸道上皮細胞的DNAα皰疹病毒。該病毒通過免疫系統(tǒng)細胞在全身傳播至其它器官。因為此兩種病毒在抗原性上相關，目前無法通過血清學檢驗(血液檢驗)來確定馬是否受EHV-4或EHV-1中一種或兩種的感染。例如，如果作為幼駒的馬受EHV-4感染，其血清中產(chǎn)生的抗體不僅能與EHV-4也能與EHV-1反應，因此，無法知道這種幼駒是否只受EHV-4感染。EHV-4只證實可導致呼吸道疾病，而EHV-1還能導致神經(jīng)與生殖疾病(Wilcox和Raidal，2000，“病毒在呼吸道疾病中的作用”(Role of viruses inrespiratory disease)，RIRDC出版號00/146，RIRDC項目號UMU-22A；Dunowska等，2002，New Zealand Veterinary Journal 50(4)132-139；Dunowska等，2002，New Zealand Veterinary Journal 50(4)140-147)。
已證明EHV-1是持久、終身潛伏性感染，其重新激活導致馬呼吸道疾病再次發(fā)作。然而，當與第一匹馬(索引病例(index case))接觸而感染的其它馬匹是牧場中的妊娠母馬時，該病毒重新激活并將其傳播給其它與之接觸的妊娠母馬，其后果對飼養(yǎng)農場更嚴重。索引病例母馬自己可能流產(chǎn)或導致一匹或多匹與之接觸的母馬流產(chǎn)。流產(chǎn)的胎兒、胎膜和液體受到EHV-1嚴重感染，污染了發(fā)生流產(chǎn)的場所。該牧場中天生好奇的其它母馬來到流產(chǎn)場所，嗅該胎兒與肽膜。這樣，該牧場中幾乎100％的母馬受到感染，在10或20天內流產(chǎn)，從而導致通常稱為的“流產(chǎn)風暴”。EHV-1流產(chǎn)的這種爆發(fā)對全球養(yǎng)馬業(yè)，特別是純種馬(Thoroughbred)和標準馬(Standardbred)極具經(jīng)濟重要性。
免疫力與診斷皰疹病毒能誘導強的體液抗體反應，雖然此反應保護宿主的有效性值得懷疑。最終是通過細胞介導的機理，例如細胞毒性淋巴細胞或天然殺傷細胞賦予保護作用。皰疹病毒感染的關鍵特征之一是終身持久感染與潛伏。該病毒維持在細胞核中，在臨床癥狀消退后很久仍可從許多器官分離到。因此，當患者(馬)具有難以名狀的臨床體征，例如(運動)表現(xiàn)不佳或不適，可從組織分離到病毒，但是病毒的激活是否是這些癥狀的原因尚不清楚。應激或其它因素可導致休眠病毒激活與伴隨的臨床體征(Walker等，1999，Veterinary Microbiology，683-13)。
HSV-1或HSV-2感染能誘導細胞介導的免疫力，產(chǎn)生常規(guī)類型與特定類型的抗體。雖然這些免疫機理看來不影響HSV潛伏的發(fā)生或復發(fā)頻率，但是一旦發(fā)生(病毒)重新激活，它們可調節(jié)臨床復發(fā)的嚴重性并減少HSV復制。
HSV-1或HSV-2感染引發(fā)的宿主免疫反應顯示提供了抵御隨后HSV感染的部分保護作用，因為在HSV感染的個體中常見對自體感染的抵抗力。此外，與以前未感染過HSV的人相比，當感染過HSV的患者受另一HSV類型感染時，臨床體征常更緩和。
在診斷實驗室中HSV是最頻繁檢測到的病毒?？赏ㄟ^病毒分離、聚合酶鏈式反應(PCR)(Espy等，2000，J Clin Microbiol.，38(2)795-799)與組織病理學(方法)作出診斷。這些方法均不能用于控制與監(jiān)測疾病?？捎糜谠\斷的其它實驗室檢驗包括用顯微鏡檢查專門處理的刮屑(scrapings)與血液抗體檢驗。一些檢測只在早期有效，為證實皰疹存在可能需要多種這些檢驗。生殖器皰疹可能會誤診為其它疾病，包括梅毒。血清抗體水平高也是近期感染的指標。如果某人確實具有可見癥狀，推薦在癥狀出現(xiàn)后的前48小時內進行培養(yǎng)檢驗。48小時后，有得到假陰性檢驗結果的風險，因為癥狀可能開始痊愈并且皮膚上沒有足夠的病毒來培養(yǎng)。
當某人沒有可見癥狀，但擔心有皰疹感染時，可采用血液檢驗。血液檢驗實際上不是檢測病毒；而是找尋抗體(機體的免疫反應)，但50-90％的人血液有陽性抗體。目前可用兩次血液檢驗得到皰疹的精確結果。與任何血液檢驗一樣，這些檢驗不能測定感染部位是口腔還是生殖道。然而，由于生殖器皰疹大多數(shù)病例是HSV-2造成，2型抗體結果陽性最可能表明是生殖器皰疹。就最精確的結果而言，推薦從與皰疹(病毒)可能的最后接觸時間等到至少12-16周后有足夠時間產(chǎn)生抗體。
根據(jù)發(fā)熱、咽喉疼痛、淋巴腺腫脹癥狀與患者的年齡提出EBV與傳染性單核細胞增多的臨床診斷。通常需要實驗室檢驗來確認。傳染性單核細胞增多患者的血清學結果包括白細胞計數(shù)升高、某些非典型白細胞百分比升高與“單斑點”檢驗呈陽性反應。
通過酶聯(lián)免疫吸附測定(或ELISA)，一種檢測抗體的血清學檢驗進行CMV臨床診斷?？衫闷浣Y果確定嬰兒是否有急性感染、以前感染或被動獲得的母體抗體。其它檢驗包括各種熒光試驗、間接血細胞凝集試驗與乳汁凝集試驗。
根據(jù)呼吸道癥狀，即咳嗽或鼻涕進行EHV診斷。然而，區(qū)分呼吸道細菌性感染或病毒性感染、鍛煉誘導的肺部出血與過敏至關重要。誤診的代價很大。馬主兒診斷病癥的成本包括運輸、獸醫(yī)費用和病理檢驗。呼吸道疾病可快速殺死(馬匹)、產(chǎn)生終身殘疾、阻礙(運動)表現(xiàn)或需要長期休息。處于活性病毒攜帶狀況的馬匹可再感染其它動物。
以養(yǎng)馬業(yè)為例，需要對馬匹是否存在EHV-4和/或EHV-1抗體進行精確、類型特異的血清學監(jiān)測來幫助我們了解這些病毒，特別是EHV-1的流行病學(特點)。EHV-1感染難以診斷和治療，該行業(yè)歡迎如何治療患病馬匹的任何有用信息。然而，目前不能區(qū)分多克隆血清中的EHV-1或EHV-4抗體，因為該兩種病毒之間有廣泛的抗原性交叉反應。采用這種特異性血清學檢驗對控制(或許根除)EHV-1與選擇疫苗接種的候選馬匹也具有深遠意義。雖然感染后馬匹受到短時期保護抵抗EHV-1，但通常沒有足夠高水平的長期免疫力來始終如一地抵御EHV-1疾病。因此，馬匹在其一生中可反復感染數(shù)次，而皰疹病毒能在宿主動物中建立終身潛伏感染使疫苗接種方案復雜化。
尚沒有能預防HSV疾病發(fā)生的疫苗。雖然以HSV-2包膜糖蛋白為基礎的幾種蛋白質亞單位疫苗已進而后期臨床試驗。選擇這些抗原是因為它們是中和抗體反應的靶標并能引發(fā)細胞免疫力。
已開發(fā)了口服抗病毒藥物，例如阿昔洛韋、泛昔洛韋(famcyclovir)或伐昔洛韋(valacyclovir)來有效治療皰疹(病毒)感染。這些藥物可用于治療皰疹爆發(fā)或可用于抑制皰疹復發(fā)。較低的劑量有助于減少頻繁爆發(fā)人群中皰疹發(fā)作的次數(shù)。更昔洛韋、噴昔洛韋(penciclovir)和阿昔洛韋是1型(HSV-1)和2型(HSV-2)單純皰疹病毒的有效抑制劑。此抗病毒療法昂貴，需要在最早臨床體征發(fā)作時給予。這些抗病毒療法是基于采用自殺基因，例如胸腺嘧啶激酶基因。比較了更昔洛韋、噴昔洛韋和阿昔洛韋誘導單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSVTK)系統(tǒng)導致細胞死亡的效果(Shaw等，2001，Antivir Chem Chemother.，12(3)175-86)。所有化合物延緩了HSVTK轉化細胞的生長或降低了其存活。
除了治療這些癥狀外，對EBV和傳染性單核細胞增多沒有專門的治療方法。沒有抗病毒藥物或疫苗可用。一些內科醫(yī)生開了5天類固醇療程來控制咽喉與扁桃體腫脹。有報導說使用固醇能降低疾病的總時間和嚴重性，但這些報導未發(fā)表。最后，即使檢測EBV抗體，例如早期抗原試驗提示存在重激活感染時，此結果不一定表明患者目前的醫(yī)學病癥是EBV感染所致。許多沒有癥狀的健康者在首次感染EBV后可多年具有EBV早期抗原的抗體。
目前，健康個體中存在的CMV感染不必治療。現(xiàn)正在嬰兒中評估抗病毒藥物療法。更昔洛韋用于治療免疫抑制與患視覺相關或威脅生命疾病的患者。疫苗仍處于研究和開發(fā)階段。
通常不用專門的抗病毒化合物治療水痘，因為它持續(xù)時間短以及通常溫和性質不復雜。一些醫(yī)生相信抗病毒藥物適合于疾病可能更嚴重的老年人。水痘疫苗(水痘病毒(varicella)疫苗)從1995年開始使用。研究顯示水痘病毒疫苗預防疾病的有效性為85％。該疫苗有益于無免疫力的成年人，特別是處于高風險的成年人，例如兒童護理與保健人員。因為大多數(shù)成年人有免疫力，推薦在疫苗接種前檢查血清學狀態(tài)。
治療帶狀皰疹的主要難點是快速緩解疼痛。四種因素獨立地增加了持久疼痛的風險年齡增長、皮疹出現(xiàn)時嚴重或中等嚴重的疼痛(稱為急性疼痛)、皮疹出現(xiàn)前的疼痛(稱為前驅疼痛)與皮疹出現(xiàn)3日內沒能獲得足夠的抗病毒治療。認為疼痛，特別是持久疼痛在很大程度上是病毒誘導的受感染神經(jīng)損傷所致。應用抗病毒藥物的原理很簡單通過盡可能快的停止病毒復制來盡可能減少神經(jīng)損傷。帶狀皰疹對口服抗病毒藥物，即阿昔洛韋、泛昔洛韋和伐昔洛韋確有反應。
早期鑒定EHV-1感染，特別是病毒性流產(chǎn)對于治療馬匹至關重要，從而使易感馬匹不會發(fā)生周期性反復感染與復發(fā)。由于造成訓練天數(shù)喪失、反復感染和疾病復發(fā)、流產(chǎn)和(運動)表現(xiàn)不佳，EHV感染對養(yǎng)馬業(yè)造成的代價很大。治療主要依賴于精確診斷。可利用疫苗引發(fā)強體液免疫反應，但這些疫苗不具完全保護力。突發(fā)性感染(breakthrough infection)通常發(fā)生于疫苗接種動物。雖然可采用疫苗，但一般知道它們提供的保護作用寥寥無幾，并且在疫苗接種動物中往往發(fā)生突發(fā)性感染?？贵w治療只能預防繼發(fā)性細菌感染。
目前，診斷血液中的皰疹病毒以及相關疾病的方法是依據(jù)抗體-抗原定量測定或檢測病毒遺傳信息(例如，通過聚合酶鏈式反應)。例如，美國專利6,506,553描述了通過檢測血液樣品中的抗原抗體來診斷EBV以及相關疾病的試驗。該試驗檢測血液中，更具體地說血清中EBV早期抗原的彌散性(EA-D)和限制性(EA-R)組分的IgG和IgM抗體?？刹捎么嗽囼瀬碓\斷EBV-相關疾病，例如傳染性單核細胞增多(IM)；也可用于區(qū)分該疾病的急性期和康復期的個體。然而，此專利描述的方法是檢測早期抗原抗體，而不是檢測病毒或對該病毒的免疫反應。
美國專利6,537,555描述了根據(jù)HSV抗原的檢測(結果)來診斷和治療HSV感染的組合物與方法。然而，此專利沒有描述檢測病毒或對該病毒的免疫反應的方法。
國際公布WO 99/45155描述的基因表達和分子診斷方法用于擴增和檢測EBV核酸，特別是RNA特異性序列。此方法特別適用于檢測循環(huán)外周血細胞中、人(腫瘤)組織樣品及其薄切片中(利用“溶液中”擴增或“原位”擴增技術)、與可能含有EBV感染細胞的其它生物學樣品中EBV基因表達的晚期感染。然而，此方法只檢測病毒轉錄物，最適合于晚期疾病診斷。此方法也不檢測對導致不適、發(fā)熱與淋巴結腫脹等最早癥狀的病毒感染的免疫反應。
美國專利申請公布20040072147公開了利用探針寡核苷酸與至少兩種引物寡核苷酸來選擇性擴增以下特定類型皰疹病毒或毒株的靶區(qū)段包括HSV-1、耐藥性HSV-1、HSV-2、耐藥性HSV-2、VZV、EBV(HHV-4a和HHV-4b)、CMV、淋巴潛隱病毒(HHV-6a、HHV-6b)、HHV-7和細長病毒(HHV-8)。然而，此方法不能提供疾病階段或動物何時受感染或疾病是否為活動的任何信息。
美國專利6,193,983描述了檢測EVH-4和EVH-1型特異性糖蛋白的方法用于臨床上與這種糖蛋白的特征相關的領域。此方法檢測抗EHV-1和EHV-4特異性抗體，但熟知大多數(shù)馬匹在幼年與這些病毒接觸過，抗體滴度可持續(xù)一定時間。所以，此方法不能提供疾病階段或動物何時受感染或疾病是否為活動的任何信息。
總之，皰疹病毒的各種毒株感染是社區(qū)中普遍的現(xiàn)象，導致具有嚴重經(jīng)濟影響的疾病。大多數(shù)人和家養(yǎng)動物在幼年時都受到皰疹病毒的至少一種毒株的感染，且該感染是終身的。皰疹病毒進入潛伏期，可重新激活而導致癥狀復發(fā)。病毒的重激活常往往無癥狀，但可表現(xiàn)為不適或非特異性癥狀，例如低燒、嗜睡、慢性疲勞、運動耐力不佳或運動表現(xiàn)不佳。生理應激(例如，繁重的鍛煉、并發(fā)的疾病、精神壓力)，或免疫系統(tǒng)減弱(例如HIV感染、免疫抑制治療)可導致皰疹病毒重激活而產(chǎn)生慢性感染癥狀。鑒于這些原因，監(jiān)測皰疹病毒感染往往重要，特別是免疫力減弱的患者或杰出的運動員。目前的抗體診斷方法本身不監(jiān)測皰疹病毒感染，因為這些方法檢測的血清抗體在感染后7-14天才升高并因病毒潛伏而持續(xù)升高。目前的其它診斷方法，例如病毒分離和PCR本身不監(jiān)測(病毒感染)，因為這些方法費力或者病毒基因組不是時刻存在于血液細胞中。目前診斷方法獲得的結果不與臨床體征發(fā)作的時間相關聯(lián)。例如，首先在最初感染后10-14天可檢測到抗體并可長期存在。單靠抗體檢測不能表明感染發(fā)生的時間或者疾病活動水平，檢測病毒轉錄物或病毒蛋白也不表明疾病活動水平。宿主的免疫系統(tǒng)最終負責抵抗病毒侵入的保護作用。是免疫反應，而不是病毒本身導致可該疾病的臨床體征。更合適于皰疹病毒感染的監(jiān)測方法是檢測宿主對感染的特異性免疫反應。
同樣，目前需要更有效的方法來診斷皰疹病毒感染，通過宿主免疫反應測定活動皰疹病毒感染與鑒定適合用抗病毒藥物治療性或預防療法的動物。在所有病例中，初始感染導致潛伏感染，免疫力減弱的患者也往往有復發(fā)危險。在這種病例中，癥狀可能明顯或不明顯，可檢測或可傳播。因此，目前需要更好的方法與試劑來評估與監(jiān)測處于皰疹病毒感染和/或復發(fā)危險中的哺乳動物。
發(fā)明簡述本發(fā)明公開了檢測皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染的方法與系統(tǒng)。鑒定與描述了用于(檢測)皰疹病毒感染的免疫系統(tǒng)細胞的一組預測性的基因。這些基因及其產(chǎn)物可用于基因表達試驗、蛋白質表達試驗、全細胞試驗與設計和制備治療劑。它們也可用于測定具有或不具有疾病臨床體征的動物。有人提出，當這些試驗頻繁用作對病毒活動的反應指標時，可獲得更好的應對決定與治療方案，包括杰出運動員或免疫力減弱患者所用的方案。
本發(fā)明代表了目前處理受感染動物治療技術的顯著進步。在某些優(yōu)選實施方案中，依賴于檢測宿主細胞中某些標記，特別是循環(huán)白細胞的水平，而不是檢測病毒產(chǎn)物或抗病毒抗體。同樣，這些方法適用于廣泛篩選有癥狀與無癥狀動物。在以循環(huán)白細胞為分析對象的某些實施方案中，可在檢測血清皰疹病毒特異性抗體之前，宜在該病毒進展的非常早期階段檢測宿主對皰疹病毒感染，特別是EHV感染的反應。
因此，本發(fā)明通過檢測宿主對皰疹病毒的反應來解決診斷皰疹病毒感染的問題。優(yōu)選的實施方案包括監(jiān)測免疫系統(tǒng)的外周白細胞中某些基因的表達，所述基因表達反映于存在皰疹病毒感染相關的RNA水平或蛋白質產(chǎn)生模式的改變。
因此，在一方面，本發(fā)明提供診斷測試對象，特別是馬匹測試對象中存在皰疹病毒感染，特別是活動皰疹病毒感染的方法。這些方法一般包括檢測該測試對象中至少一種選自以下的基因(本文也稱為“皰疹病毒感染標記基因”或“HVI標記基因”)的異常表達(a)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有與以下任一序列有至少50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113(參見表1)，或其互補序列；(b)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114(參見表1)；(c)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼與以下任一序列的至少一部分有至少50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的這些HVI標記基因在皰疹病毒感染或患皰疹病毒感染相關病癥的動物中表達異常，所述病癥的示范性例子包括免疫抑制、應激、高強度的田徑訓練、并發(fā)感染與特發(fā)性病癥。
本文將所用的HVI標記基因的多核苷酸表達產(chǎn)物稱為“皰疹病毒感染標記多核苷酸”或“HVI標記多核苷酸”。本文將HVI標記基因的多肽表達稱為“皰疹病毒感染標記”或“HVI標記多肽”。
因此，在一些實施方案中，所述方法包括檢測選自以下的HVI標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性核苷酸序列的多核苷酸SEQ IDNO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少可在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在其它實施方案中，所述方法包括檢測選自以下HVI標記多肽的異常表達(i)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少5個毗連氨基酸殘基；(iii)所含氨基酸序列與以下任一序列的至少15個毗連氨基酸殘基至少有30％相似性的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；和(iv)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少5個毗連氨基酸殘基，并且與能和(i)、(ii)或(iii)所述某序列發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子發(fā)生免疫相互作用。
這種異常表達一般通過以下步驟檢測(1)檢測得自測試對象的生物學樣品中至少一種HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性，和(2)將所檢測到的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性與得自一位或多位正常對象或一位或多位未患此疾病(例如，無活動感染)的對象的參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該生物學樣品中此表達產(chǎn)物的水平或功能活性有差異，表明該測試對象中存在皰疹病毒感染或相關病癥。在一些實施方案中，當該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性與相應的該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性不同時，所述方法還包括診斷該測試對象中皰疹病毒感染的存在、階段或程度或相關病癥。在這些實施方案中，與各相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性相比，所述差異通常表示各表達產(chǎn)物的水平或功能活性至少提高約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或者甚至至少提高約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％；或者至少降低約10％、20％、30％ 40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或者甚至至少降低約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，即下文所稱的“異常表達”。在此類型的示范性例子中，通過檢測至少一種選自以下的HVI標記多核苷酸的水平或功能活性降低來測定皰疹病毒感染的存在或相關病癥(a)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO6、10、19、24、25、29、33、34、35、37、38、41、53、57、61、63、65、66、73、77、83、89、93、94、96、100、101、102、104、106、107或108，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105；(c)含有編碼與以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在其它示范性例子中，通過檢測至少一種選自以下HVI標記多核苷酸的水平或功能活性的提高來確定皰疹病毒感染的存在或相關病癥(a)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、2、4、8、12、13、15、17、21、23、26、27、31、39、43、45、47、49、51、55、59、67、69、71、75、76、79、81、85、87、91、98、99109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在一些實施方案中，當該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性與相應的該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物的所檢測水平或功能活性相同或相似時，所述方法還包括診斷不存在皰疹病毒感染或相關病癥。在這些實施方案中，各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性與各相應表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性的差異不超過約20％、18％、16％、14％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％時，下文稱為“正常表達”。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77或78種HVI標記多核苷酸各表達產(chǎn)物的水平或功能活性。例如，所述方法可包括單獨檢測一種HVI標記多核苷酸或聯(lián)合檢測多至77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1種其它HVI標記多核苷酸的水平或功能活性。在另一實施例中，所述方法可包括單獨檢測一種HVI標記多肽或聯(lián)合檢測多至77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1種其它HVI標記多肽的水平或功能活性。在此類型的示范性例子中，所述方法包括檢測與存在皰疹病毒感染或相關病癥或其風險高度相關(p＜0.00001)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17種HVI標記基因(下文稱為“一級相關HVI標記基因”)各表達產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25或26，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20或22；(c)含有編碼與以下序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20或22，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在其它示范性例子中，所述方法包括檢測與存在皰疹病毒感染或相關病癥或其風險高度相關(p＜0.0001)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21種HVI標記基因(下文稱為“二級相關HVI標記基因”)各表達產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在其它示范性例子中，所述方法包括檢測與存在皰疹病毒感染或相關病癥或其風險中等相關(p＜0.0003)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種HVI標記基因(下文稱為“三級相關HVI標記基因”)各表達產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85或87，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO68、70、72、74、78、80、82、86或88；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO68、70、72、74、78、80、82、86或88，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在其它示范性例子中，所述方法包括檢測與存在皰疹病毒感染或相關病癥或其風險適度相關(p＜0.06)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16或17種HVI標記基因(下文稱為“四級相關HVI標記基因”)各表達產(chǎn)物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限于(a)含有與以下任一序列具有至少50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少含有該序列的15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種一級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種二級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種五級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少2種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少3種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少4種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少1種三級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性和至少5種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
在一些實施方案中，所述方法包括檢測至少1種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少2種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在其它實施方案中，所述方法包括檢測至少3種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少3種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少4種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少5種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，所述方法包括檢測至少6種四級相關HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
生物學樣品優(yōu)選包括宜含有白細胞的血液，特別是外周血。所述表達產(chǎn)物宜選自RNA分子或多肽。在一些實施方案中，所述表達產(chǎn)物與相應的表達產(chǎn)物相同。在其它實施方案中，所述表達產(chǎn)物是相應表達產(chǎn)物的變體(例如，等位基因變體)。
在某些實施方案中，所述表達產(chǎn)物或相應的表達產(chǎn)物是靶RNA(例如，mRNA)或該靶RNA的DNA拷貝，其水平可用能在低嚴謹性條件下與該靶RNA或該DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測，該核酸探針至少含有某HVI標記多核苷酸的15個毗連核苷酸。在這些實施方案中，將該靶RNA或其DNA拷貝所檢測到的水平或豐度按同一樣品中存在的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標準化。核酸探針宜固定在固體或半固體支持物上。在此類型的示范性例子中，該核酸探針形成核酸探針空間陣列的一部分。在一些實施方案中，通過雜交(例如采用核酸陣列)檢測與該靶RNA或該DNA拷貝結合的核酸探針的水平。在其它實施方案中，通過核酸擴增(例如，采用聚合酶鏈式反應(PCR))檢測與該靶RNA或該DNA拷貝結合的核酸探針的水平。在還有其它實施方案中，通過核酸酶保護試驗檢測與該靶RNA或該DNA拷貝結合的核酸探針的水平。
在其它實施方案中，所述表達產(chǎn)物或相應的表達產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽發(fā)生免疫相互作用的至少一種抗原結合分子來檢測。在這些實施方案中，將該靶多肽檢測到的水平或豐度按同一樣品中存在的參比多肽水平標準化。抗原結合分子宜固定于固體或半固體支持物上。在此類型的示范性例子中，該抗原結合分子形成抗原結合分子空間陣列的一部分。在一些實施方案中，用免疫測定(例如利用ELISA)檢測與該靶多肽結合的抗原結合分子的水平。
在還有其它實施方案中，所述表達產(chǎn)物或相應的表達產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽反應形成反應產(chǎn)物的至少一種底物來檢測。在這些實施方案中，將該靶多肽檢測到的功能活性按同一樣品中存在的參比多肽的功能活性標準化。
在一些實施方案中，可用適當包括至少一個與基站(base station)相耦聯(lián)的終端站(end station)的一種系統(tǒng)來執(zhí)行該診斷方法。該基站宜(a)通過通信網(wǎng)絡從終端站接受數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)代表的參數(shù)值對應于生物學樣品中至少一種表達產(chǎn)物所檢測到的或標準化的水平或功能活性，和(b)將所述數(shù)據(jù)與代表參比樣品中至少一種相應表達產(chǎn)物的所檢測到的或標準化水平或功能活性的預定數(shù)據(jù)作比較，從而測定與參比樣品中相應表達產(chǎn)物水平或功能活性相比，該生物學樣品中此表達產(chǎn)物的水平或功能活性的任何差異?；咀詈眠€能診斷是否存在皰疹病毒感染相關病癥或其程度。在這些實施方案中，基站還可通過通信網(wǎng)絡將診斷指征傳遞至終端站。
在另一方面，本發(fā)明考慮了采用以上廣泛描述的方法來監(jiān)測、治療與控制具有可能導致皰疹病毒感染的病況的動物，所述病況的示范性例子包括免疫抑制、新出生、應激或高強度的運動訓練方案。在這些實施方案中，使用本發(fā)明診斷方法常能有效監(jiān)測皰疹病毒感染的早期發(fā)生或相關病癥，從而能早期治療性干預與治療該病癥。
在另一方面，本發(fā)明提供治療、預防或抑制對象中皰疹病毒感染或相關病癥的方法。這些方法一般包括檢測對象中至少一種HVI標記基因的異常表達，給予該對象有效量的藥物以治療或緩解癥狀，或者逆轉或抑制該對象發(fā)生皰疹病毒感染或相關病癥。這種治療或藥物的代表性例子包括但不限于抗生素、類固醇與抗炎藥物、靜脈內(注射)液、血管活性(藥物)、損傷或損壞器官的姑息劑支持療法(例如，呼吸窘迫的供氧，血容量不足輸液)與密切監(jiān)測生命器官。
在另一方面，本發(fā)明提供本文稱為“HVI標記多核苷酸”的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列，其中所述部分至少含有該序列或互補序列的15個毗連核苷酸；(c)至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)或(b)所述序列或其互補序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列，其中所述部分至少含有該序列或互補序列的15個毗連核苷酸并至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)或(c)所述序列或其互補序列雜交。
在還有另一方面，本發(fā)明提供含有操作性連接于調節(jié)元件的以上廣泛描述的多核苷酸的核酸構建物，該構建物可在宿主細胞中操作。在某些實施方案中，所述構建物是載體形式，特別是表達載體。
在還有另一方面，本發(fā)明提供含有以上廣泛描述的核酸構建物或載體的分離的宿主細胞。在某些優(yōu)選實施方案中，所述宿主細胞選自細菌細胞、酵母菌細胞和昆蟲細胞。
在還有另一方面，本發(fā)明提供用于探查核酸中是否存在以上廣泛描述的多核苷酸的探針。這些探針一般包含至少能在低嚴謹性條件下與以上廣泛描述的多核苷酸雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述探針基本上由對應于編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分或與其互補的核酸序列構成SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少長15個核苷酸。在其它實施方案中，所述探針含有至少能在低嚴謹性條件下與編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列至少一部分雜交的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少長15個核苷酸。在還有其它實施方案中，所述探針含有至少能在低嚴謹性條件下與以下序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，其中所述部分至少長15個核苷酸。用于檢測本發(fā)明HVI標記多核苷酸的代表性探針如SEQID NO145-2150(見表2)所示。
在一相關方面，本發(fā)明提供在其上固定了至少一種以上廣泛描述的核酸探針的固體或半固體支持物。在一些實施方案中，該固體或半固體支持物包含固定于其上的核酸探針空間陣列。
在其它方面，本發(fā)明提供本文稱為“HVI標記多肽”的分離的多肽，所述多肽一般選自(i)含有與以上廣泛描述的HVI標記基因的多肽表達產(chǎn)物至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相似性的氨基酸序列的多肽，例如，特別是含有與以下任一序列至少有50％(和至少51％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)序列相同性的核苷酸序列的HVI標記基因SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113；(ii)如(i)所述多肽的一部分，其中該部分至少含有該多肽的5個毗連氨基酸殘基；(iii)含有與(i)所述多肽的至少15個毗連氨基酸殘基至少有30％相似性(和至少31％-至少99％及其之間所有整數(shù)百分比)的氨基酸序列的多肽；和(iv)含有能與(i)、(ii)或(iii)所述序列發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子發(fā)生免疫相互作用的氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明還有一方面提供能與以上廣泛描述的HVI標記多肽發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子。
在一相關方面，本發(fā)明提供在其上固定了至少一種上述抗原結合分子的固體或半固體支持物。在一些實施方案中，該固體或半固體支持物包含固定于其上的抗原結合分子空間陣列。
本發(fā)明還有另一方面提供一種或多種以上廣泛描述的HVI標記多核苷酸、一種或多種以上廣泛描述的探針、一種或多種以上廣泛描述的HVI標記多肽或一種或多種以上廣泛描述的抗原結合分子在制備診斷對象皰疹病毒感染相關病癥存在的試劑盒中的應用。
本發(fā)明的各方面涉及以上廣泛描述的診斷方法、一種或多種以上廣泛描述的HVI標記多核苷酸、一種或多種以上廣泛描述的探針、一種或多種以上廣泛描述的HVI標記多肽或一種或多種以上廣泛描述的抗原結合分子用于診斷患皰疹病毒感染相關病癥。動物(脊椎動物)、哺乳動物、非人哺乳動物，例如涉及負重或運動(例如競技)的馬與寵物(例如，狗與貓)。
本發(fā)明的各方面涉及動物(脊椎動物)、哺乳動物、非人哺乳動物，例如涉及負重或運動(例如競技)的馬與寵物(例如，狗與貓)。
附圖簡述

圖1是組1病毒接種動物的接收器操作曲線(Receiver Operator Curve)，比較了第2、4和6天與其它天數(shù)的基因表達。利用基因表達標記(signature)的此檢驗靈敏度和特異性優(yōu)秀，曲線下面積超過0.9。
圖2是利用臨床感染動物的選擇基因時，接收器操作曲線的圖示。利用基因表達標記的檢驗靈敏度和特異性優(yōu)秀。
圖3是利用視作具有活動性病毒感染的動物的選擇基因時，接收器操作曲線的圖示。利用基因表達標記的此檢驗靈敏度和特異性優(yōu)秀。
圖4是利用臨床感染動物的所有基因時，接收器操作曲線的圖示。利用基因表達特征的此檢驗靈敏度和特異性良好。
圖5是利用視作具有活性病毒感染的動物的選擇基因時，接收器操作曲線的圖示。利用基因表達特征的此檢驗靈敏度和特異性良好。
圖6是顯示EHV-1組1幼駒的基因表達指數(shù)(Log強度單位)、血清EHVAb水平(450nm吸光度)、日期、天數(shù)(D＝天)和臨床體征的示意圖。幼駒在2003年3月18日接種(病毒)?；虮磉_指數(shù)的變化對應于存在的臨床體征，這種變化發(fā)生在特異性血清抗-EHV-1抗體產(chǎn)生的10-14天前。
圖7是組1幼駒的主要組分分析示意圖。這些組分按照接種(病毒)后的天數(shù)作圖。
發(fā)明詳述1.定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價的任何方法和材料來實施或檢驗本發(fā)明，但優(yōu)選本文所述的方法和材料。為本發(fā)明的目的定義了以下術語。
本文所用的冠詞“一”和“一個”指一個或多個(即至少一個)該冠詞在語法上的賓語。例如，“一個元件”指一個元件或多個元件。
本文用于描述HVI標記基因表達的術語“異常表達”，指與取自健康對象或未受皰疹病毒感染對象的細胞中某HVI標記基因或其變體的表達水平，和/或與取自健康對象或無皰疹病毒的對象的組織樣品或體液中某HVI標記基因產(chǎn)物(例如，轉錄物或多肽)的較高或較低水平相比，該HVI標記基因過度表達或表達不足。具體地說，如果與取自健康對象或無皰疹病毒的對象的細胞、組織或體液樣品中某HVI標記基因的表達水平相比，該HVI標記基因至少高約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或甚至至少高約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者低至少約10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少低約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，則該HVI標記基因異常表達。
本文用于描述HVI標記多核苷酸表達的術語“異常表達”，指與取自健康對象或無皰疹病毒感染相關疾病(例如，無活動性皰疹病毒感染)的對象的細胞中某HVI標記多核苷酸或其變體的表達水平，和/或取自健康對象或無皰疹病毒感染疾病的對象的組織樣品或體液中某HVI標記多核苷酸產(chǎn)物(例如，轉錄物或多肽)的較高或較低的水平相比，該HVI標記多核苷酸過度表達或表達不足。具體地說，如果與取自健康對象或無皰疹病毒疾病的對象的細胞、組織或體液樣品中某HVI標記基因的表達水平，和/或與取自健康對象或無皰疹病毒疾病的對象的組織樣品或體液中某HVI標記多核苷酸的表達水平相比，該HVI標記多核苷酸的表達水平至少高約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，或甚至至少高約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％，或者至少低約10％、20％、30％40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少低約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，則該HVI標記多核苷酸異常表達。本發(fā)明的免疫系統(tǒng)細胞，特別是循環(huán)白細胞中的異常基因表達可從以下兩個連續(xù)步驟推導(1)發(fā)現(xiàn)異常表達的基因進行診斷、預后與病癥評估；和(2)臨床確認異常表達的基因。
在按照以下步驟比較多組細胞或組織樣品(例如，免疫系統(tǒng)的細胞，例如但不限于白細胞)中受到顯著上調或下調(p＜0.06)的那些基因而確定發(fā)現(xiàn)異?；虮磉_(a)按照在正常與患病狀態(tài)下表達維持恒定的不變基因來標準化，和(b)采用可防止假陽性的統(tǒng)計學方法(例如，Holm和FDR判斷)來解釋多變量數(shù)據(jù)，例如微陣列數(shù)據(jù)所固有的假陽性發(fā)現(xiàn)?；虮磉_數(shù)據(jù)分析領域的技術人員知道可采納數(shù)據(jù)標準化的其它形式而不會實質改變本發(fā)明性質(例如MAS5，穩(wěn)定的多芯片平均化(Robust multi chip averaging)、GC穩(wěn)定的多芯片平均化(GC Robust multi chip averaging)或Li Wong算法)。就診斷而言，細胞或組織樣品通常得自一組代表感興趣病癥的真陰性細胞或組織樣品與一組代表該病癥的真陽性細胞或組織樣品。這些組中所有其它參數(shù)或變量通常需要適當利用相同的動物與誘導該動物發(fā)生感興趣病癥來控制，例如年齡、地理位置、性別、運動健康與其它正常的生物學變化。實驗設計領域的技術人員知道可采用其它方法來控制其它參數(shù)和變量而不會實質性改變本發(fā)明性質。這種方法包括但不限于隨機化、阻斷(blocking)與利用所分析的共變量(covariates)。就預后而言，細胞或組織樣品通常得自一組代表感興趣病癥的真陰性細胞或組織樣品與隨后(一定時間后)代表該病癥的真陽性細胞或組織樣品的同一組。這些組中所有其它參數(shù)或變量通常需要利用相同的動物，誘導那些動物發(fā)生感興趣病癥與隨時間變化取自同一動物的樣品來控制，例如年齡、地理位置、性別、運動健康與其它正常的生物學變化。就評估而言，細胞或組織樣品通常得自與代表感興趣病癥相關的可檢測臨床參數(shù)圖譜的一端的一組與代表沿可檢測臨床參數(shù)圖譜各點的數(shù)組。類似地，這些組中所有其它參數(shù)或變量通常需要適當利用相同的動物與誘導該動物發(fā)生感興趣病癥來控制，例如年齡、地理位置、性別、運動健康與其它正常的生物學變化。
在發(fā)現(xiàn)清單中按照細胞或組織中的不變基因標準化后，證明顯著上調或下調的那些基因，并且分析在發(fā)現(xiàn)方法中所用的臨床細胞或組織樣品中感興趣的情況是能使異常表達的基因在至少75％的時間正確診斷或評估病癥的那些基因，從而確定臨床確認的異?；虮磉_。接收器操作曲線(ROC)一般是執(zhí)行這種診斷的有用檢測工具?；虮磉_數(shù)據(jù)分析領域的技術人員知道可用其它標準化方法(例如MAS5，穩(wěn)定的多芯片平均化、GC穩(wěn)定的多芯片平均化或LiWong算法)代替不變基因標準化方法而不會實質性改變本發(fā)明性質。此外，基因表達數(shù)據(jù)分析領域的技術人員知道可采用許多方法來測定那些基因受到“顯著上調或下調”。
“約”指與參比品的量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、維度、大小、用量、重量或長度相比，最多有30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％不同的量、水平、數(shù)值、數(shù)字、頻率、百分比、維度、大小、用量、重量或長度變化。
術語“活動性感染”在本文以最廣泛的意義使用，包括病毒對宿主的侵入、寄居和/或繁殖，通常伴有一種或多種臨床上可能明顯或可能不明顯的病理學癥狀?；顒有愿腥景ň植?、亞臨床或暫時性感染。局部感染可持久存在和通過傳播擴展為急性、亞急性或慢性臨床感染或疾病狀態(tài)。當病毒進入淋巴或血管系統(tǒng)時，局部感染也可以變?yōu)槿硇?。“活動性感染”通常指宿主的免疫系統(tǒng)被感染因子激活的感染狀態(tài)。
術語“擴增子”指擴增的靶序列和/或擴增的靶序列的擴增產(chǎn)物。在某些其它實施方案中，“擴增子”可包含用于擴增的探針或引物序列。
“抗原結合分子”指對靶抗原具有結合親和力的分子。應該知道該術語可擴展至顯示具有抗原結合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白質框架。
當本文所用的術語“特異性結合”、“特異性免疫相互作用”等指某抗原結合分子時，此術語指能確定在蛋白質和其它生物制品的異質群體中存在該抗原的結合反應。因此，在所指定的免疫測定條件下，所述抗原結合分子能與其特定抗原相結合而不以明顯量與樣品中存在的其它蛋白質或抗原相結合。在這種條件下與某抗原的特異性結合可能需要選擇對該特定抗原有特異性的抗原結合分子。例如，可制備針對所選蛋白質抗原的抗原結合分子，該分子能與該抗原而非樣品中其它蛋白質抗原相結合?？刹捎酶鞣N形式的免疫測定來選擇能與某特定蛋白質發(fā)生特異性免疫相互作用的抗原結合分子。例如，常規(guī)采用固相ELISA免疫測定來選擇能與某蛋白質發(fā)生特異性免疫相互作用的單克隆抗體。可用于測定特異性免疫反應性的免疫測定方式和條件可參見Harlow和Lane，(1988)，“抗體，實驗室手冊”(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港出版物，紐約。
“生物學活性部分”指保留了親代分子活性的全長親代肽或多肽的一部分。本文所用的術語“生物學活性部分”包括具有親代分子活性的缺失突變體和具有例如至少約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000個連續(xù)氨基酸殘基的肽?？捎脴藴实闹亟M核酸技術來獲得或采用常規(guī)液相或固相合成技術來合成此類部分。例如，可參考如Blackwell Scientific Publications出版，Nicholson所編的名為《合成疫苗》(Synthetic Vaccines)的出版物中Atherton和Shephard所著名為“肽合成”(Peptide Synthesis)第9章中所述的液相合成或固相合成?；蛘?，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發(fā)明的肽或多肽來制備這類肽?？赏ㄟ^例如高效液相層析(HPLC)技術純化所消化的片段。也可采用重組核酸技術來制備這種蛋白質。
本文所用的術語“生物學樣品”指從動物提取的、未處理、處理、稀釋或濃縮的樣品。生物學樣品可包括生物學液體，例如全血、血清、血漿、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、腦脊液、組織活檢(樣品)等。在某些實施方案中，生物學樣品是血液、特別是外周血。
應理解本文所用的術語“順式作用序列”、“順式作用元件”、“順式調節(jié)區(qū)”或“調節(jié)區(qū)”或類似的術語指當置于某可表達遺傳序列的適當位置時能調節(jié)，至少部分調節(jié)該遺傳序列表達的任何核苷酸序列。本領域技術人員知道順式調節(jié)區(qū)能在轉錄或翻譯后水平上活化、沉默、增強、抑制或者改變基因序列的表達水平和/或細胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。在本發(fā)明的某些實施方案中，順式作用序列是能增強或刺激某可表達遺傳序列表達的激活序列。
除非文中另有需要，本說明書中的詞語“包含”和“含有”應理解為指包括某所述步驟或元件或者一組步驟或元件，但不排除任何其它步驟或元件或者一組步驟或元件。
“對應”或“對應于”指以下的多核苷酸(a)其含有的核苷酸序列與某參比多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互補，或(b)其編碼的氨基酸序列與某肽或蛋白質的氨基酸序列相同。該短語的范圍也包括含有的氨基酸序列與參比肽或蛋白質的氨基酸序列基本上相同的肽或多肽。
在本文治療或預防某疾病的章節(jié)中，“有效量”指將該用量的活性(化合物)以單次劑量或連續(xù)劑量的一部分給予需要這種治療或預防的個體，該用量可有效防止該病癥的癥狀發(fā)生、抑制這種癥狀和/或治療已有癥狀。有效量依待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的分類學組別、組合物的劑型、醫(yī)學狀況的評估和其它相關因素而不同。希望該用量可用常規(guī)試驗確定具有較寬范圍。
術語“表達”或“基因表達”指產(chǎn)生RNA信息或將RNA信息翻譯為蛋白質或多肽。采用本文所述方法檢測各類型基因表達是本發(fā)明的一部分。
“表達載體”指能指導該載體所含的多核苷酸轉錄和適當?shù)睾铣稍摱嗪塑账崴幋a的肽或多肽的任何自主遺傳元件。本領域技術人員知道這種表達載體。
本文所用的術語“基因”指細胞基因組的任何與所有的不連續(xù)編碼區(qū)及其相關的非編碼和調節(jié)區(qū)?；蛞仓妇幋a具體多肽的開放讀框、內含子、參與表達調節(jié)的毗鄰的5’和3’非編碼核苷酸序列。在這點上，基因還可含有與某給定基因天然相關的調控信號，例如啟動子、增強子、終止和/或聚腺苷酸化信號，或異源調控信號。DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或其片段?？蓪⒒蛞牒线m的載體中而維持于染色體外或整合入宿主。
“高密度多核苷酸陣列”等指每cm2至少含有400個不同元件(feature)的那些陣列。
短語“高度鑒別性雜交條件”指可測定出一個堿基錯配的雜交條件。
本文用“雜交”表示互補核苷酸序列配對產(chǎn)生雜交DNA-DNA或雜交DNA-RNA?；パa堿基序列是通過堿基配對原則相互關聯(lián)的那些序列。在DNA中，A與T配對，C與G配對。在RNA中，U與A配對，C與G配對。在這點上，本文所用術語“匹配”和“錯配”指互補核酸鏈中配對核苷酸的雜交可能性。匹配的核苷酸能有效雜交，例如上述典型的A-T和C-G堿基配對。錯配是不能有效雜交核苷酸的其它組合。
短語“特異性雜交”等指在嚴謹性條件下，當某特定核苷酸序列存在于復雜的DNA或RNA混合物(例如，總細胞的)中時，某分子只與該序列結合、形成雙螺旋或雜交。
本文提及“免疫相互作用”包括分子之間(特別是在所述分子之一是或模擬免疫系統(tǒng)某組分時)的任何相互作用、反應或其它結合形式。
“免疫功能”或“免疫反應性”指通過本領域熟知的標準試驗檢測免疫系統(tǒng)對外來抗原的反應能力。
“分離的”表示所述物質實質上或基本上不含其在天然狀態(tài)下正常伴有的組分。例如，本文所用的“分離的多核苷酸”指去除了天然狀態(tài)下其側接序列的多核苷酸，例如去除了與其正常毗鄰序列的DNA片段。或者，本文所用的“分離的肽”或“分離的多肽”等指在體外將肽或多肽分子與其天然細胞環(huán)境和與之結合的其它細胞組分相分離和/或純化。分離的多核苷酸、肽或多肽可以指(不限于)通過分離而純化的天然序列或通過重組或合成方法產(chǎn)生的序列。
“標記基因”表示能賦予表達該標記基因的細胞獨特表型從而使這種轉化細胞與不含有該標記的細胞相區(qū)別的基因?？蛇x擇標記基因賦予等于特性能根據(jù)對選擇性因子(例如，除草劑、抗生素、輻射、熱或其它破壞未轉化細胞的處理方法)的抗性進行選擇。可篩選標記基因(或報道基因)賦予的性狀可通過觀察或檢驗，即通過“篩選”來鑒定(例如，非轉化細胞中不存在的β-葡糖醛酸酶、螢光素酶或其它酶活性)。
本文所用的“天然產(chǎn)生的”核酸分子指具有天然產(chǎn)生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能編碼天然產(chǎn)生的蛋白質。
“獲自”表示某樣品，例如細胞提取物或核酸或多肽提取物是分離自或衍生自特定來源。例如，可直接從對象的生物學液體或組織中分離得到提取物。
本文所用的術語“寡核苷酸”指經(jīng)磷酸二酯鍵相連的多個核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相關的結構變體或合成類似物，包括含有修飾或取代糖基團等的核苷酸)構成的聚合物(或其相關的結構變體或合成的同類物)。因此，盡管術語“寡核苷酸”通常指其中的核苷酸殘基與殘基間的連接鍵是天然存在的核苷酸聚合物，但應知道該術語的范圍也包括各種同類物，包括但不限于肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亞磷酰胺、膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核酸等。該分子的確切大小視具體應用而不同。寡核苷酸是長200個或以下堿基的多核苷酸亞組。寡核苷酸優(yōu)選長10-60個堿基，最優(yōu)選長12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個堿基。雖然寡核苷酸可以是雙鏈，例如用于構建變體核酸序列，但寡核苷酸通常是單鏈的，例如探針。本發(fā)明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。
術語“寡核苷酸陣列”指含有寡核苷酸探針的基板，在該基板表面的已知不連續(xù)位置沉積了不同的已知序列。例如，該基板可以是如美國專利號5,424,186所述的兩維基板形式。這種基板可用于合成兩維空間尋址的寡核苷酸(矩陣)陣列?；蛘?，該基板的特征在于通過將兩維平面的薄片卷成三維管狀構型而形成管狀陣列。該基板也可采取與光纖表面相連的微球或珠形式，例如Chee等在WO 00/39587中所述的那樣。這些寡核苷酸陣列至少具有兩種不同的元件，其密度為每cm2至少400個元件。在某些實施方案中，這些陣列的密度可以是每cm2約500、至少一千、至少一萬、至少十萬、至少一百萬或至少一千萬個元件。例如，該基板可以是硅或玻璃，具有載玻片或蓋玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物構成。當在該基板上進行試驗的方法包括光檢測時，可用透光的基板。該術語也指探針陣列和與其相連形成晶片一部分的基板。
本文所用的術語“操作性連接”或“操作性相連”表示將結構基因置于啟動子的調控下，從而可控制該基因的轉錄和任選的翻譯。在構建異源啟動子/結構基因組合時，通常優(yōu)選將遺傳序列或啟動子安置在與基因轉錄起始位點的距離與其天然設置中該遺傳序列或啟動子與其所調控的基因，即衍生該遺傳序列或啟動子的基因的距離大體相同。本領域已知可允許對此距離作一些變動而不喪失功能。類似地，調控序列元件與置于其控制下的異源基因的優(yōu)選定位可利用該元件在其天然設置，即衍生其的基因中的定位來確定。
術語“病原體”在本文以其最廣泛的含義使用，指可感染動物活組織的細胞引發(fā)疾病反應的生物或感染因子。
本文所用的術語“多核苷酸”或“核酸”指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該術語通常指至少長10個堿基的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二類核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA的單鏈或雙鏈形式。
術語“多核苷酸變體”和“變體”指顯示與參比多核苷酸序列具有基本序列相同性的多核苷酸，或能在下述嚴謹性條件下與參比序列雜交的多核苷酸。這些術語也包括其中有一個或多個核苷酸添加或刪除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在這點上，本領域熟知可按照參比多核苷酸對所述多核苷酸作出某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，從而使改變的多核苷酸仍保留該參比多核苷酸的生物學功能或活性。術語“多核苷酸變體”和“變體”也包括天然產(chǎn)生的等位基因變體。
“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物及其變體與合成的同類物。因此，這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是合成的非天然氨基酸(例如，相應的天然氨基酸的化學類似物)的氨基酸聚合物以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。
術語“多肽變體”指通過至少一個氨基酸殘基的添加、缺失或取代而與參比多肽相區(qū)別的多肽。在某些實施方案中，參比多肽的一個或多個氨基酸殘基可用不同的氨基酸所取代。如下所述，本領域熟知一些氨基酸可以更換成具有大致相似性質的其它氨基酸而不會改變多肽的活性(保守取代)。
“引物”表示當與DNA的一條鏈配對時在合適的聚合試劑存在下能啟動引物延伸產(chǎn)物合成的寡核苷酸。為使擴增效率最大，引物優(yōu)選單鏈，但或者可以是雙鏈。引物應足夠長從而能在聚合試劑存在時引發(fā)合成延伸產(chǎn)物。引物的長度取決于許多因素，包括應用、所采用的溫度、模板反應條件、其它試劑和引物來源。例如，取決于靶序列的復雜性，引物的3’末端可比模板序列長度短至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1個堿基而能延伸核酸鏈，雖然引物5’末端長度可延伸超出模板序列的3’末端。在某些實施方案中，引物可以是大的多核苷酸，例如約35個核苷酸到數(shù)千堿基以上?？蛇x出與模板序列“基本上互補”的引物，設計的這些引物能與模板雜交并用作合成的起點?！盎旧匣パa”表示該引物的互補性足夠與靶多核苷酸雜交。引物和設計與之雜交的模板最好不含錯配，但這不是必需的。例如，可將非互補核苷酸殘基連接在引物的5’末端，而該引物序列的其余部分與模板互補。或者，可將非互補核苷酸殘基或非互補核苷酸殘基的延伸段間插入引物中，前提是該引物序列與和其雜交的模板序列的互補性足夠而形成合成該引物的延伸產(chǎn)物所需的模板。
“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有說明，術語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結合的多核苷酸探針。取決于雜交條件的嚴謹性，探針能結合與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸。探針可直接或間接標記，其范圍包括引物。
本文所用的術語“重組多核苷酸”指通過操作核酸使其成為自然界中正常未發(fā)現(xiàn)形式而在體外形成的多核苷酸。例如，重組多核苷酸可以采取表達載體形式。這種表達載體一般包括操作性連接于該核苷酸序列的轉錄和翻譯調節(jié)核酸。
“重組多肽”表示采用重組技術，即通過重組子或合成的多核苷酸表達而制備的多肽。
“調節(jié)元件”或“調節(jié)序列”表示在具體宿主細胞中表達操作性相連的編碼序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，適用于原核細胞的調節(jié)序列包括啟動子和任選的順式作用序列，如操縱子序列與核糖體結合位點。適用于真核細胞的調控序列包括啟動子、聚腺苷酸化信號、轉錄增強子、翻譯增強子、調節(jié)mRNA穩(wěn)定性的前導和尾隨序列，以及使轉錄的多核苷酸編碼產(chǎn)物靶向細胞內區(qū)室或靶向胞外環(huán)境的導向序列。
本文所用的術語“序列相同性”指二序列在比較窗口上核苷酸對核苷酸或氨基酸對氨基酸的相同性程度。因此，“序列相同性百分比”可通過以下步驟計算在比較窗口上比較兩條最佳比對的序列，測定兩條序列中相同的核苷酸堿基(例如，A、T、C、G、I)或相同的氨基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)位置數(shù)目產(chǎn)生匹配的位置數(shù)目，將匹配位置數(shù)目除以比較窗口的總位置數(shù)(即，窗口大小)，再將結果乘以100得到序列相同性百分比。為本發(fā)明的目的，應將“序列相同性”理解為用DNASIS計算機程序(已有windows的2.5版；購自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，加利福尼亞，美國)，采用該軟件所附參考手冊中使用的標準默認(參數(shù))計算的“匹配百分比”。
如下表3所定義，“相似性”指相同或構成保守取代的氨基酸百分數(shù)?？衫眯蛄斜容^程序，例如GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research，12，387-395)測定相似性。長度與本文所述序列相似或基本上不同的序列可以此方式在排列中插入空位來比較，這種空位可通過例如GAP所用的比較算法確定。
用于描述兩條或以上多核苷酸或多肽之間的序列相關性的術語包括“參比序列”、“比較窗口”、“序列相同性”、“序列相同性百分比”和“基本上相同”?！皡⒈刃蛄小钡拈L度至少12個，但更常見15-18個，往往至少25個單體單元，包括核苷酸和氨基酸殘基。由于兩條多核苷酸各含有(1)兩條多核苷酸之間相似的一條序列(即，只是整個多核苷酸序列的一部分)，和(2)兩條多核苷酸序列之間有差別的一條序列，則一般通過在“比較窗口”上比較這兩條多核苷酸的序列來鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性從而在兩條(以上)多核苷酸之間進行序列比較。“比較窗口”是含有至少6個，通常約50-約100個，更常見約100-約150個連續(xù)位置的概念上的片段，其中某序列與參比序列最佳比對后，該序列與含有相同數(shù)目連續(xù)位置的參比序列作比較。為(進行)兩條序列的最佳比對，與參比序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口可包含約20％或以下的添加或缺失(即，空位)。為比對比較窗口，可通過計算機執(zhí)行算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0，GeneticsComputer Group，575 Science Drive Madison，WI，美國)，或通過目測和所選擇的各種方法之一產(chǎn)生的最佳比對(即導致比較窗口上最高同源性百分比)來對諸序列進行最佳比對。也可如Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.，253389所述，通過BLAST家族程序進行比對。序列分析詳述可見Ausubel等，《最新分子生物學方法》(Current Protocols in Molecular Biology)的第15章，第19.3單元，John Wiley & Sons Inc，1994-1998。
在本文可互換使用的術語“對象”、“個體”或“患者”指需要治療或預防的任何對象，特別是脊椎動物對象，甚至更特別指哺乳動物對象。本發(fā)明范圍內合適脊椎動物包括但不限于靈長類動物、鳥類、家畜(例如，綿羊、母牛、馬、驢、豬)、實驗室檢驗動物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、陪伴動物(例如，貓、狗)和捕獲的野生動物(例如，狐、鹿、野狗)。優(yōu)選的對象是需要治療或預防皰疹病毒感染或其相關癥狀的動物，特別是馬類動物。然而，應該知道以上術語并未暗示有癥狀存在。
本文的短語“基本上相似的親和力”指靶序列在所選擇的一組嚴謹性條件下與它們的互補或基本上互補的寡核苷酸探針雜交強度相似并可檢測。
本文所用的術語“模板”指用于產(chǎn)生與該“模板”鏈互補的核酸鏈的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互補鏈也可以是RNA和/或DNA。在某些實施方案中，互補鏈可包括該“模板”的全部或部分互補序列，和/或可包含突變，因而其不是該“模板”的完全互補鏈。在本文所述的檢測試驗以及本領域已知的其它試驗中，不與模板鏈完全互補的鏈也可以與模板鏈特異性雜交，這種可用于檢測試驗的互補鏈是本發(fā)明的一部分。
術語“轉化”表示通過引入外源或內源性核酸而改變某生物體，例如細菌、酵母菌、哺乳動物、鳥類、爬行動物、魚或植物的基因型。
術語“治療”表示治療性與預防性治療。
“載體”表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，合適的載體可以是衍生自，例如質粒、細菌噬菌體、酵母菌、病毒、哺乳動物、鳥類、爬行動物或魚的DNA分子。載體優(yōu)選含有一個或多個獨特的限制性位點并能在確定的宿主細胞，包括靶細胞或組織或其子代細胞或組織中自主復制，或能與確定的宿主細胞基因組整合從而可復制所克隆的序列。因此，載體可以是自主復制的載體，即以染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體的復制，例如線形或閉環(huán)質粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可含有確保自身復制的元件?；蛘?，當將載體引入宿主細胞后它能整合入基因組中與所整合入的染色體一起復制。載體系統(tǒng)可包含一種載體或質粒，一起含有引入宿主細胞基因組的總DNA的兩種以上載體或質粒，或轉座子。選擇載體一般取決于該載體與待引入該載體的宿主細胞的相容性。載體也可包含選擇標記，例如可用于選擇合適轉化子的抗生素抗性基因。本領域技術人員已知這種抗性基因的例子。
術語“野生型”和“正常的”可互換使用，指大多數(shù)天然產(chǎn)生的物種的特征性表型，其相反的例子是突變體表型。
2.縮寫說明書中使用以下縮寫nt＝核苷酸nts＝多個核苷酸aa＝氨基酸kb＝千堿基或千堿基對kDa＝千道爾頓d＝日h＝小時s＝秒3.皰疹病毒感染的標記及其應用本發(fā)明涉及皰疹病毒感染，特別是EHV感染或其相關病癥的早期檢測、診斷、監(jiān)測或預后。本發(fā)明公開了感染了皰疹病毒的對象的細胞，特別是血細胞，更具體是外周血細胞中的皰疹病毒感染替代(surrogate)標記，所述標記的形式為特定序列的RNA分子或這些RNA分子表達的多肽。這些標記是皰疹病毒感染的指標，與在正常對象或無皰疹病毒感染對象中的表達相比，當它們差異性表達時可診斷該測試對象發(fā)生皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染，或存在風險。與此領域的現(xiàn)有技術相比，這種標記有許多優(yōu)點。在某些利用外周血進行分析的優(yōu)選實施方案中，可能在檢測到血清抗體前即診斷皰疹病毒感染。
看來本文所述的核酸序列可用于皰疹病毒檢測、診斷、預后與治療各種應用領域。本文范圍內這些應用的例子包括利用特異性引物擴增HVI標記、通過與寡核苷酸探針雜交、將分離的核酸摻入載體、使摻入載體的核酸表達為RNA和蛋白質與使對應于該標記所編碼產(chǎn)物的免疫學試劑顯色來檢測HVI標記。
所鑒定的HVI標記進而可用于設計特異性寡核苷酸探針和引物。這種探針和引物可以是能與所鑒定的標記基因序列特異性雜交的任何長度，其至少長約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500個核苷酸，而探針可長達本文所鑒定的標記基因序列的全長。探針也可在其5’和/或3’末端包含其它序列從而能延伸超出與其雜交的靶序列。
當聯(lián)用核酸擴增方法時，這些探針和引物能快速分析生物學樣品(例如，外周血樣品)檢測標記基因或檢測或定量測定標記基因的轉錄物。這種方法包括本領域已知或本文所述用于復制或增加靶核酸或其互補序列的拷貝數(shù)或含量的任何方法或技術。
所鑒定的標記也可用于鑒定和分離基因組DNA文庫的全長基因序列，包括基因表達的調節(jié)元件，宜為(但不限于)馬來源的元件。本文鑒定的cDNA序列可用作雜交探針以常規(guī)技術來篩檢基因組DNA文庫。一旦鑒定到部分基因組克隆，可通過“染色體行走”(也稱為“重疊雜交”)，采用，例如Chinault和Carbon(1979，Gene，5111-126)所述的方法來分離全長基因。一旦利用cDNA雜交探針分離得到部分基因組克隆，位于該部分基因組克隆兩末端或其附近的非復制型區(qū)段可用作雜交探針作進一步基因組文庫篩檢，最終分離得到感興趣HVI標記的整個基因序列。應知道可用本文所述的全長或部分cDNA序列或短的表達序列標簽(ETS)，采用例如Sambrook等，(《分子克隆.實驗室手冊》(MOLECULAR CLONING.A LABORATORY MANUAL)，(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物學方法》(CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，John Wiley & Sons，Inc.，1994)所述的標準技術獲得全長基因。此外，可采用公開的，例如以上參考教材中所述的標準技術，利用所述序列來鑒定和分離得到全長cDNA序列?？衫眠@些技術鑒定和分離的序列，采用本文所述檢測方法來檢測HVI標記基因，這些序列是本發(fā)明的一部分。
本領域普通技術人員能從所鑒定的標記基因中選擇一些區(qū)段用于作為本發(fā)明一部分的各種檢測、診斷或預后方法，載體構建物，制備抗原結合分子，試劑盒和/或本文所述任何實施方案。本發(fā)明優(yōu)選使用的標記基因序列是SEQID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113所示的序列。
3.1本發(fā)明的核酸分子如實施例和表1所述，本文提供了通過GeneChipTM分析從正常馬匹和具有EHV臨床證據(jù)的馬匹的血液中鑒定到的63種皰疹病毒標記(即，63種皰疹病毒標記基因)。在這63種標記基因中，44種具有全長或基本上全長的編碼序列，其余21種在它們的5’和3’末端的一端或兩端具有部分序列信息。所鑒定的HVI標記基因包括21種以前未特征鑒定的馬基因。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)本文所述分離的核酸序列本身可用作雜交探針或擴增引物。這些核酸可用于，例如診斷性評估生物學樣品或用于克隆全長cDNA或其相應的基因組克隆。在某些實施方案中，這些探針和引物提供了長度足以和提起自生物學樣品的RNA或DNA樣品特異性雜交的寡核苷酸。這些序列通常約10-20個核苷酸長，但可以更長。某些實施方案需要較長的序列，例如約30、40、50、100、500個核苷酸和甚至多達全長。
本發(fā)明考慮了具有以下SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113所示任一序列的約10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500個核苷酸的毗連延伸段的核酸分子。本發(fā)明也考慮了與上述序列互補，能在高嚴謹性條件下與之結合的分子。這些探針可用于各種雜交實施方案，例如Southern和Northern印跡。在一些例子中，本發(fā)明考慮可使用能與多種靶序列雜交而不損傷它們有效診斷皰疹病毒感染能力的探針?？傊?，本發(fā)明認為本文所述雜交探針既可用作溶液雜交(如PCR中)的試劑來檢測相應基因的表達也可用于固相實施方案中。
設計了圍繞所述核苷酸序列的各種探針和引物。例如，在某些實施方案中，用于設計探針和引物的序列可包含通常連接于所鑒定標記基因的RNA兩末端的腺嘌呤核苷酸的重復延伸段(poly-A尾)。在其它實施方案中，本領域普通技術人員可能認為某些區(qū)段更適用于所述檢測方法，故可將探針和引物專門設計為不包含所鑒定標記基因的這些或其它區(qū)段。在任何情況中，普通技術人員均能為所選擇的應用領域選擇引物或探針序列。用于檢測HVI標記基因的示范性探針序列見表2。
引物可以是雙鏈或單鏈形式，雖然單鏈形式更可取。可將探針設計為能與靶DNA或RNA結合(盡管可能引發(fā))而無需用于擴增方法中。在某些實施方案中，可用放射性物質(32P、14C、35S、3H或其它標記物)、熒光團(例如羅丹明、熒光素)或化學發(fā)光標記物(例如，螢光素酶)標記這些探針或引物。
本發(fā)明提供可用作EHV標記的基本上全長的cDNA序列以及EST或部分cDNA序列。然而，應該知道本文內容不限于這些公開的序列，特別是至少要包括能與含有所公開序列的核酸或這些核酸的變體雜交的分離的核酸。例如，可用核酸的部分序列來鑒定結構相關的基因或其衍生的全長基因組或cDNA克隆。本領域已知可用作上述探針的靶序列的cDNA和基因組文庫的制備方法(參見，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有這種核酸以及本文所述的特異性核酸分子統(tǒng)稱為“皰疹病毒標記多核苷酸”或“HVI標記多核苷酸”。此外，本發(fā)明的范圍包括HVI標記多核苷酸的分離或純化的表達產(chǎn)物(即，RNA轉錄物和多肽)。
因此，本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白質組合物。“分離的”或“純化的”核酸分子或蛋白質，或其生物學活性部分是基本上或在本質上不含有該核酸分子或蛋白質天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的與其正常相伴或相互作用的組分。因此，當分離或純化的多核苷酸或多肽通過重組技術產(chǎn)生時其基本上不含其它細胞物質或培養(yǎng)基成分，或者當它們用化學合成時基本上不含化學前體或其它化學物質。“分離的”多核苷酸宜不含產(chǎn)生該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的序列(即，位于該多核苷酸的5’和3’末端的序列)，特別是蛋白質的編碼序列。例如，在各種實施方案中，分離的HVI標記多核苷酸可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的產(chǎn)生該多核苷酸的細胞的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的核苷酸序列?；旧喜缓毎镔|的多肽包括含有少于約30％、20％、10％、5％(以干重計)的污染蛋白質的蛋白質制品。當本發(fā)明的蛋白質或其生物學活性部分用重組方法制備時，培養(yǎng)基宜含有少于約30％、20％、10％或5％(以干重計)的化學前體或非感興趣蛋白質化學物質。
本發(fā)明也包括HVI標記多核苷酸的全長或基本上全長核苷酸序列的各部分，或者它們的轉錄物或這些轉錄物的DNA拷貝。HVI標記核苷酸序列的各部分可編碼多肽部分或保留該天然多肽生物學活性的區(qū)段?；蛘撸捎米麟s交探針的HVI標記核苷酸序列的各部分通常不編碼保留這種生物學活性的氨基酸序列。因此，HVI標記核苷酸序列的各部分至少含有編碼本發(fā)明HVI標記多肽的核苷酸序列的約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100個核苷酸，或者幾乎多達其全長。
編碼本發(fā)明HVI標記多肽的生物學活性部分的HVI標記核苷酸序列的一部分至少可編碼全長HVI標記多肽中的約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個連續(xù)氨基酸殘基，或者幾乎高達其氨基酸總數(shù)。可用作雜交探針或PCR引物的HVI標記核苷酸序列的各部分一般無需編碼HVI標記多肽的生物學活性部分。
因此，HVI標記核苷酸序列的一部分可編碼HVI標記多肽的生物學活性部分，或者它可以是在本領域已知標準方法中用作雜交探針或PCR引物的片段?？赏ㄟ^分離一條本發(fā)明HVI標記核苷酸序列的一部分，表達其所編碼的HVI標記多肽的一部分(例如通過體外重組表達)并評估所編碼的該HVI標記多肽的一部分(的活性)來制備該HVI標記多肽的生物學活性部分。作為HVI標記核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全長HVI標記核苷酸序列中的約15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650個核苷酸，或者幾乎高達其核苷酸總數(shù)。
本發(fā)明也考慮了HVI標記核苷酸序列的變體。核酸變體可以是天然產(chǎn)生的，例如等位基因變體(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物體)或者可以是非天然產(chǎn)生的?？刹捎檬熘姆肿由飳W技術，例如本領域已知的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術鑒定天然產(chǎn)生的變體，例如所述這些變體?？赏ㄟ^誘變技術，包括適用于多核苷酸、細胞或生物體的技術來制備非天然產(chǎn)生的變體。這些變體可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。編碼與非編碼區(qū)可發(fā)生變異。變異既可導致保守性也可導致非保守性氨基酸取代(與編碼產(chǎn)物相比)。就核苷酸序列而言，保守性變體包括因遺傳密碼子簡并性仍能編碼本發(fā)明HVI標記多肽之一的氨基酸序列的那些(核酸)序列。變體核苷酸序列也包括合成產(chǎn)生但仍能編碼本發(fā)明HVI標記多肽的核苷酸序列，例如通過定點誘變產(chǎn)生的那些序列。總體上，通過本文所述的序列比對程序利用默認參數(shù)測定到本發(fā)明某特定核苷酸序列的變體與該特定核苷酸序列至少具有約30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％，一般至少約75％、80％、85％，優(yōu)選約90％-95％以上，更優(yōu)選約98％以上的序列相同性。
本發(fā)明的HVI標記核苷酸序列可用于分離其它生物體，特別是其它哺乳動物，尤其是其它品種的馬的相應序列與等位變體序列。核酸序列的雜交方法在本領域不難獲得?？赏ㄟ^熟知技術根據(jù)其與本文所述編碼序列的序列相同性分離得到其它生物體的編碼序列。在這些技術中，可將所有或部分的已知編碼序列用作探針，與所選生物體的克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它HVI標記編碼序列選擇性雜交。因此，本發(fā)明也考慮在下述嚴謹性條件下能與所述HVI標記基因核苷酸序列或其互補序列雜交的多核苷酸。本文所用的術語“在低嚴謹性、中等嚴謹性、高嚴謹性或極高嚴謹性條件下雜交”描述了雜交和洗滌的條件。進行雜交反應的指南可見Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。該參考文獻中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文提及的低嚴謹性條件包括至少約1％-至少約15％v/v的甲酰胺和至少約1-至少約2M的鹽，42℃雜交，與至少約1-至少約2M的鹽，42℃洗滌。低嚴謹性條件也可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS，65℃雜交，與(i)用2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS，室溫洗滌。低嚴謹性條件的一個實施方案包括約45℃在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中雜交，然后至少在50℃(低嚴謹性條件的洗滌溫度可升高至55℃)用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌兩次。中等嚴謹性條件包括至少約16-至少約30％v/v的甲酰胺和至少約0.5-至少約0.9M的鹽，42℃雜交，與至少約0.1-至少約0.2M的鹽，55℃洗滌。中等嚴謹性條件也可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS，65℃雜交，與(i)用2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS，60-65℃洗滌。中等嚴謹性條件的一個實施方案包括約45℃在6×SSC中雜交，然后60℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌一次以上。高嚴謹性條件包括至少約31-至少約50％v/v的甲酰胺和約0.01-約0.15M的鹽，42℃雜交，與用約0.01-約0.02M的鹽，55℃洗滌。高等嚴謹性條件也可包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS，65℃雜交，與(i)用0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)用0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS，65℃以上溫度洗滌。高嚴謹性條件的一個實施方案包括約45℃在6×SSC中雜交，然后65℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗滌一次以上。
在某些實施方案中，HVI標記多肽由能在極高嚴謹性條件下與所述核苷酸序列雜交的多核苷酸編碼。極高嚴謹性條件的一個實施方案包括65℃在0.5M磷酸鈉、7％SDS中雜交，然后65℃用0.2×SSC，1％SDS洗滌一次以上。
本領域熟知其它嚴謹性條件，技術人員知道可操控各種因素來優(yōu)化雜交的特異性?？蓛?yōu)化最終洗滌步驟的嚴謹性以確保高度雜交。詳細例子可參見Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16頁和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。
雖然一般在約42℃-68℃的溫度下進行嚴謹性洗滌，但本領域技術人員知道其它溫度也適合于嚴謹性條件。為形成DNA-DNA雜交，最大雜交率一般發(fā)生在比Tm低約20℃-25℃的溫度。本領域熟知Tm是解鏈溫度，或者是兩條互補多核苷酸序列解離的溫度。本領域熟知估計Tm的方法(參見Ausubel等，同上，第2.10.8頁)。總體上，可利用以下公式預測DNA的最佳匹配雙螺旋的Tm近似值Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/長度)其中M是Na+的濃度，優(yōu)選0.01-0.4摩爾；％G+C是鳥苷和胞苷堿基之和占堿基總數(shù)的百分比，其范圍在30％和75％G+C之間；％甲酰胺是以體積計的甲酰胺濃度百分比；長度是DNA雙螺旋中堿基對的數(shù)目。隨機錯配的堿基對數(shù)目每上升1％，雙螺旋DNA的Tm降低約1℃。高嚴謹性洗滌通常在Tm-15℃時進行，或者中等嚴謹性在Tm-30℃進行。
在雜交方法的一個例子中，將含有固定DNA的膜(例如，硝酸纖維素膜或尼龍膜)42℃在含有標記探針的雜交緩沖液(50％去離子甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt溶液(0.1％ficoll、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)、0.1％SDS和200mg/mL變性鮭魚精子DNA)中雜交過夜。然后以中等嚴謹性連續(xù)洗滌該膜兩次(即，45℃用2×SSC、0.1％SDS洗滌15分鐘，然后50℃用2×SSC、0.1％SDS洗滌15分鐘)，再以較高嚴謹性連續(xù)洗滌兩次(即，55℃用0.2×SSC、0.1％SDS洗滌12分鐘，然后65-68℃用0.2×SSC、0.1％SDS溶液洗滌12分鐘)。
3.2本發(fā)明的多肽本發(fā)明也考慮了本發(fā)明HVI標記基因編碼的全長多肽以及那些多肽的生物學活性部分，在本文統(tǒng)稱為“皰疹病毒感染標記多核苷酸”或“HVI標記多肽”。全長HVI標記多肽的生物學活性部分包含至少長約6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60個氨基酸殘基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本發(fā)明所考慮的免疫相互作用片段至少長6個，優(yōu)選至少8個氨基酸殘基，它們能在動物中引發(fā)免疫反應從而產(chǎn)生能與本發(fā)明HVI標記多肽發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子?？捎眠@種抗原結合分子篩檢其它哺乳動物，特別是馬類哺乳動物中結構和/或功能相關的HVI標記多肽。全長HVI標記多肽的各部分一般可能參與某種相互作用，例如分子內或分子間相互作用。分子間相互作用可以是特異性結合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬時性，可形成或打斷某共價鍵)。全長HVI標記多肽的生物學活性部分包括含有與某(假定的)全長HVI標記多肽的氨基酸序列，例如以下所示的氨基酸序列足夠相似或衍生自該氨基酸序列的氨基酸序列的肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，這些序列含有少于全長HVI標記多肽的氨基酸并至少顯示該多肽的一種活性。生物學活性部分通常包含至少具有全長HVI標記多肽一種活性的結構域或基序。全長HVI標記多肽的生物學活性部分可以是長，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000，或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個以上氨基酸殘基的多肽。所述部分宜是含有不低于衍生其的全長多肽的約1％、10％、25％、50％活性的“生物學活性部分”。
本發(fā)明也考慮了變體HVI標記多肽。“變體”多肽包括通過以下方式從天然蛋白質衍生的蛋白質在該天然蛋白質的N-末端和/或C-末端刪除(稱為截短)或添加一個或多個氨基酸；在該天然蛋白質的一個或多個位點處刪除或添加一個或多個氨基酸；或者在該天然蛋白質的一個或多個位點處取代一個或多個氨基酸。本發(fā)明的變體蛋白質具有生物學活性，即它們仍具有該天然蛋白質的所需生物學活性。例如，遺傳多態(tài)性或人為操作可形成這種變體。通過本文所述的序列比對程序利用默認參數(shù)測定到本發(fā)明的天然HVI標記蛋白質的生物學活性變體與該天然蛋白質的氨基酸序列可具有至少40％、50％、60％、70％，一般至少75％、80％、85％，優(yōu)選約90％-95％以上，更優(yōu)選約98％以上的序列相似性。本發(fā)明蛋白質的生物學活性變體與該蛋白質一般可有多達1000、500、400、300、200、100、50或20個氨基酸殘基，或者宜少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個(例如6-10個)、少至5個、少至4、3、2或者甚至1個氨基酸殘基不同。
可以各種方式改變本發(fā)明的HVI標記多肽，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。本領域一般知道這種操作方法。例如，可通過DNA突變制備HVI標記蛋白質的氨基酸序列變體。本領域熟知誘變與核苷酸序列改變的方法。參見，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82488-492)，Kunkel等，(1987，Methods in Enzymol.，154367-382)，美國專利號4,873,192；Watson，J.D.等，(《基因的分子生物學》(Molecular Biology of the Gene)，第四版，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，1987)和它們所引用的參考文獻。適當進行氨基酸取代而不影響感興趣蛋白質的生物學活性的指南見Dayhoff等，(1978)，《蛋白質序列和結構圖》(Atlas of Protein Sequenceand Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)的模型。本領域已知篩選含有所選特性的通過點突變或截短(方法)制備的組合文庫基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫基因產(chǎn)物的方法。這種方法適用于快速篩選通過組合誘變產(chǎn)生的HVI標記多肽的基因文庫。可聯(lián)用能提高該文庫中功能性突變頻率的技術-遞推集團誘變(REM)與篩選試驗來鑒定HVI標記多肽變體(Arkin和Yourvan，(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，897811-7815；Delgrave等，(1993)，Protein Engineering，6327-331)。下文詳述了理想的保守性取代，例如用另一個具有相似特性的氨基酸替換某一氨基酸。
與親代HVI標記氨基酸序列相比，變體HVI標記多肽在沿它們序列的不同位置可含有保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是用具有相似側鏈的氨基酸殘基取代某氨基酸殘基。本領域定義了具有相似側鏈的氨基酸殘基家族，它們一般可再分為酸性該殘基因在生理pH下失去H離子而帶負電荷，該殘基受水溶液吸引，因此當包含它的肽處于生理pH水性介質中時，此殘基處于該肽構型的表面位置。含有酸性側鏈的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
堿性該殘基因在生理pH下或在其一兩個pH單位內結合H離子而帶正電荷(例如，組氨酸)，該殘基受水溶液吸引，因此當包含它的肽處于生理pH水性介質中時，此殘基處于該肽構型的表面位置。含有堿性側鏈的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。
帶電荷的這些殘基在生理pH時帶電荷，因此包括含有酸性或堿性側鏈的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。
疏水性這些殘基在生理pH下不帶電荷并被水溶液所排斥，因此當包含它的肽處于水性介質中時，此殘基處于該肽構型的內部位置。含有疏水側鏈的氨基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
中性/極性這些殘基在生理pH下不帶電荷，但水溶液不足以排斥它們，因此當包含該殘基的肽處于水性介質中時，此殘基吸附于該肽構型的內部位置。含有中性/極性側鏈的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。
本說明書也將某些氨基酸特征鑒定為“小的”氨基酸，因為它們的側鏈不夠大(即使缺乏極性基團)因而不能賦予疏水性。除脯氨酸以外，“小的”氨基酸是當側鏈上有至少一個極性基團時具有4個以下碳，和當側鏈上沒有極性基團時具有3個以下碳的那些氨基酸。具有小側鏈的氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸?；蚓幋a的二級氨基酸--脯氨酸因已知其對肽鏈的二級構型有影響而成為特例。脯氨酸的結構因其側鏈與α-氨基的氮原子以及α-碳原子結合而不同于所有其它天然產(chǎn)生的氨基酸。例如Dayhoff等((1978)，“蛋白質進化改變的模型”(A model of evolutionary change in proteins))公開了幾種氨基酸相似性矩陣(例如，PAM120矩陣和PAM250矩陣)。然而，刊于M.O.Dayhoff編的《蛋白質序列和結構圖》(Atlas of Protein Sequence andStructure)，第5卷，第345-358頁，國家生物醫(yī)學研究基金會(NationalBiomedical Research Foundation)，Washington DC；和Gonnet等，1992，Science，256(5062)144301445中用于測定遠程關系的矩陣將脯氨酸包括在甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸的同一組中。因此，為本發(fā)明的目的將脯氨酸歸類為“小”氨基酸。
將(氨基酸)分為極性或非極性類別所需的吸引或排斥程度是隨意的，因此本發(fā)明專門考慮的氨基酸可分為一類或另一類?？筛鶕?jù)已知的性能對大多數(shù)未專門命名的氨基酸進行分類。
氨基酸殘基還可再分為環(huán)狀或非環(huán)狀，芳香族或非芳香族，根據(jù)殘基的側鏈取代基可自圓其說分類，與分成小的或大的。如果某殘基總共含有4個以下碳原子(包括羧基碳)，認為其是小氨基酸，前提是存在其它極性取代基；如果不存在其它極性取代基，總共含3個以下碳原子的殘基可認為是小氨基酸。小殘基當然總是非芳香族殘基。可根據(jù)氨基酸殘基的結構性能將其分入兩種以上的種類。就天然產(chǎn)生的蛋白質氨基酸而言，根據(jù)此方案的亞分類見表3。
保守性氨基酸取代也包括根據(jù)側鏈分類。例如，含有脂族側鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含有脂族-羥基側鏈的一組氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；具有含酰胺側鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；含有芳香族側鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有堿性側鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和具有含硫側鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地預期用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺、絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結構相關的氨基酸相似地取代某種氨基酸時不會嚴重影響所產(chǎn)生的變體多肽的性能。氨基酸改變是否能產(chǎn)生功能性HVI標記多肽不難通過檢驗其活性來測定。保守性取代見表4的示范性取代的標題。更優(yōu)選的取代見優(yōu)選取代標題。本發(fā)明范圍內的氨基酸取代一般通過所選擇的取代基對維持(a)取代區(qū)域肽骨架結構，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積沒有明顯不同作用的取代來實現(xiàn)。引入取代后，篩選具有生物學活性的變體。
或者，可根據(jù)側鏈的相同性將制備保守性取代的相似氨基酸分為三類。如Zubay，G.，《生物化學》(Biochemistry)，第三版，Wm.C.Brown Publishers，(1993)所述，第一組包括均含有帶電荷側鏈的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸；第二組包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。
因此，通常用相同側鏈家族中的另一氨基酸殘基取代HVI標記多肽中預計的非必需氨基酸殘基。或者，可沿著HVI標記基因編碼序列的全部或部分隨機引入突變，例如通過飽和誘變，然后篩選得到的突變體有無親代多肽的活性來鑒定保留了該活性的突變體。誘變編碼序列后，可重組表達所編碼的肽，測定該肽的活性。
因此，本發(fā)明也考慮天然產(chǎn)生的HVI標記多肽序列的變體或它們的生物學活性片段，其中所述變體可通過添加、缺失或取代一個或多個氨基酸殘基而與天然產(chǎn)生的序列相區(qū)別。總體上，變體可顯示與親代HVI標記多肽序列，例如以下SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。變體優(yōu)選與親代HVI標記多肽序列，例如以下SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列相同性。此外，本發(fā)明考慮通過添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500個以上氨基酸而與天然或親代序列不同但仍保留了該親代HVI標記多肽特性的序列。HVI標記多肽也包括能在本文所定義的嚴謹條件下，特別是高嚴謹條件下與上述本發(fā)明HVI標記多核苷酸序列或其非編碼鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽。
在一個實施方案中，變體多肽與HVI標記序列有至少一個但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個氨基酸殘基不同。在另一實施方案中，變體多肽與以下SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示的相應序列有至少1％但低于20％、15％、10％或5％的殘基不同。(如果此比較(方法)需要比對，則應比對這些序列的最大相似性。因缺失或插入或錯配所產(chǎn)生的“環(huán)”外序列可認為有差別)。這些差別優(yōu)選是位于非必需殘基的差別或改變，或保守性取代。
“非必需”氨基酸殘基是可從某具體多肽的野生型序列中改變而不破壞或基本上不改變其一種或多種活性的殘基。所述改變優(yōu)選基本上不改變這些活性之一，例如野生型活性的20％、40％、60％、70％或80％?！氨匦琛卑被釟埢钱敻淖儽景l(fā)明HVI標記多肽野生型序列的該殘基時會破壞該親代分子的活性從而低于野生型多肽的活性20％。
在其它實施方案中，變體多肽包括與HVI標記多肽的相應序列，例如以下SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示任一序列具有至少約50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或以上相似性并具有該HVI標記多肽活性的氨基酸序列。
可通過本領域技術人員已知的任何合適方法制備本發(fā)明的HVI標記多肽。例如，可通過包括以下步驟的方法制備這些多肽(a)制備含有編碼某HVI標記多核苷酸至少一部分并與調節(jié)元件操作性相連的核苷酸序列的嵌合型構建物；(b)將該嵌合型構建物引入宿主細胞中；(c)培養(yǎng)該宿主細胞表達該HVI標記多肽；和(d)從宿主細胞中分離該HVI標記多肽。在示范性的例子中，所述核苷酸序列編碼以下SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114所示序列，或其變體的至少一部分。
嵌合型構建物通常采取表達載體的形式，宜選自自身復制的染色體外載體(例如質粒)和能整合入宿主基因組中的載體。
調節(jié)元件一般應適合于表達該HVI標記多肽所用的宿主細胞。本領域已知各種宿主細胞的許多類型的表達載體和調節(jié)元件。此類型的示范性元件包括但不限于啟動子序列(例如可以是天然產(chǎn)生的組成型或可誘導啟動子或具有多種啟動子的組合元件)、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列及增強子或激活序列。
在一些實施方案中，表達載體包含可選擇的標記基因以選擇轉化的宿主細胞?？蛇x擇標記基因是本領域熟知的并隨所用的宿主細胞而不同。
所述表達載體也可包含融合伴侶(通常由該表達載體提供)從而可將HVI標記多肽制備為含有融合伴侶的融合多肽。融合伴侶的主要優(yōu)點是它們有助于鑒定和/或純化該融合多肽。為制備融合多肽，需要將HVI標記多核苷酸連接入表達載體中使融合伴侶與HVI標記多核苷酸的翻譯讀框重合。融合伴侶的熟知例子包括但不限于谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結合蛋白(MBP)和六個組氨酸(hexahistidine)(HIS6)，這些伴侶特別可用于通過親和層析分離融合多肽。在一些實施方案中，可利用與融合伴侶結合的基質(例如但不限于谷胱甘肽-、直鏈淀粉-和鎳-或鈷-偶聯(lián)樹脂)通過親和層析純化這些融合多肽。許多這種基質可以“試劑盒”形式購得，例如利用(HIS6)伴侶的QIAexpressTM系統(tǒng)(Qiagen)和Pharmacia GST純化系統(tǒng)。本領域已知的其它融合伴侶是發(fā)光蛋白質，例如可用作熒光“標簽”通過熒光顯微術或流式細胞術來鑒定和/或分離融合多肽的綠色熒光蛋白(GFP)和螢光素酶。流式細胞術方法，例如熒光激活細胞分選(FACS)法在該后一應用中特別有用。
融合伴侶也優(yōu)選含有蛋白酶切割位點，例如因子Xa或凝血酶的切割位點，從而使相關蛋白酶能部分消化該融合多肽而從融合構建物中釋放出HVI標記多肽。隨后可通過層析分離方法分離所釋放的多肽與融合伴侶。
融合伴侶的范圍也包括“表位標簽”，這些標簽通常是可購得其特異性抗體的短肽序列。易于購得特異性單克隆抗體的表位標簽的熟知例子包括c-Myc、流感病毒血凝素和FLAG標簽。
可通過包括“轉導”和“轉染”等適當方法將本發(fā)明的嵌合型構建物引入宿主中，這在技術上意味著通過核酸介導的基因轉移將核酸，例如表達載體引入受者細胞中。然而，“轉化”指宿主的基因型因細胞攝入外源性DNA或RNA而改變的過程，例如轉化細胞含有本發(fā)明的表達系統(tǒng)。將嵌合型構建物引入細胞有許多方法。所用的方法一般取決于宿主細胞的選擇。本領域技術人員熟知將嵌合型構建物引入宿主細胞的技術。已描述了四類將核酸分子遞送入細胞的方法(1)化學方法，例如磷酸鈣沉淀、聚乙二醇(PEG)-介導的沉淀和脂質轉染；(2)物理方法，例如顯微注射、電穿孔、加速方法和真空滲入；(3)載體方法，例如細菌和病毒載體介導的轉化；和(4)受體介導的轉化。本領域技術人員熟知這些和其它類型的轉化技術，而新的技術也不斷涌現(xiàn)。具體選擇轉化技術取決于該技術轉化特定宿主細胞的效率以及采用具體選擇的方法實施本發(fā)明之人的經(jīng)驗和偏好。技術人員明顯可知將嵌合型構建物引入細胞中的轉化系統(tǒng)的具體選擇不是實質性的或對本發(fā)明的限制，只要該系統(tǒng)能實現(xiàn)可接受的核酸轉移水平。
可通過培養(yǎng)經(jīng)嵌合型構建物轉化的宿主細胞來制備重組HVI標記多肽。適合表達HVI標記多肽的條件隨所選表達載體和宿主細胞而不同，技術人員通過常規(guī)實驗不難確定這些條件。適合表達的宿主細胞可以是原核或真核細胞。表達本發(fā)明多肽的示范性宿主細胞是細菌。所用的細菌可以是大腸桿菌(Escherichia coli)?；蛘?，宿主細胞可以是酵母菌細胞或昆蟲細胞，例如利用桿狀病毒表達系統(tǒng)的SF9細胞。
可采用如Sambrook等，(1989，同上)，特別是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特別是第10和16章；和Coligan等，《蛋白質科學的最新方法》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)，(John Wiley& Sons，Inc.，1995-1997)，特別是第1、5和6章中所述的標準方法不難制備重組HVI標記多肽?；蛘?，可通過化學合成，例如采用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，Science，269202)中所述的液相合成或固相合成法來化學合成HVI標記多肽。
4.抗原結合分子本發(fā)明也提供可與本發(fā)明HVI標記多肽發(fā)生特異性免疫相互作用的抗原結合分子。在一個實施方案中，該抗原結合分子包括多克隆全抗體?？赏ㄟ^，例如將本發(fā)明的HVI標記多肽注射入能產(chǎn)生(抗體)的動物(包括小鼠和家兔)以獲得多克隆抗血清來制備這種抗體。本領域技術人員熟知制備多克隆抗體的方法?？刹捎玫氖痉缎苑椒ㄒ?，例如Coligan等，《免疫學最新方法》(CURRENTPROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)，(John Wiley & Sons，Inc，1991)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特別是第11章的第III部分。
可采用，例如K_hler和Milstein(1975，Nature，256，495-497)所述的標準方法或采用，例如Coligan等，(1991，同上)所述的最新改進方法，用得自接種了一種或多種本發(fā)明HVI標記多肽的產(chǎn)生(抗體的)動物的無限增殖脾細胞或其它抗體產(chǎn)生細胞來制備單克隆抗體，替代從產(chǎn)生(抗體的)動物得到的多克隆抗血清。
本發(fā)明也考慮用Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2免疫球蛋白片段作為抗原結合分子?；蛘?，抗原結合分子可包括合成的穩(wěn)定的Fv片段。此類型的示范性片段包括用肽接頭分別橋連VH結構域的N末端或C末端與VL結構域的C末端或N-末端的單鏈Fv片段(sFv，通常稱為scFv)。ScFv缺乏完整抗體的所有恒定區(qū)，因而不能激活補體?？筛鶕?jù)，例如Kreber等(Kreber等，1997，J.Immunol.Methods，201(1)35-55)所概述的方法制備ScFv。或者，可通過美國專利號5,091,513；歐洲專利號239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Nature，349293)和Plückthun等(1996，刊于《抗體工程改造一種實用方法》(AntibodyengineeringA practical approach)，203-252)所述的方法制備它們。在另一實施方案中，合成的穩(wěn)定的Fv片段包括二硫鍵穩(wěn)定的Fv(dsFv)，在該片段中將兩個半胱氨酸殘基引入VH和VL結構域中從而在完全折疊的分子中此二殘基彼此間形成二硫鍵。產(chǎn)生dsFv的合適方法描述于，例如(Glockscuther等，Biochem.，291363-1367；Reiter等，1994，J.Biol.Chem.，26918327-18331；Reiter等，1994，Biochem.，335451-5459；Reiter等，1994，Cancer Res.，542714-2718；Webber等，1995，Mol.Immunol.，32249-258)。
本領域已知制備抗-HVI標記多肽的抗原結合分子的噬菌體展示與組合方法(例如，以下文獻中所述的Ladner等，美國專利號5,223,409；Kang等，國際公布號WO 92/18619；Dower等，國際公布號WO 91/17271；Winter等，國際公布WO 92/20791；Markland等，國際公布號WO 92/15679；Breitling等，國際公布WO 93/01288；McCafferty等，國際公布號WO 92/01047；Garrard等，國際公布號WO 92/09690；Ladner等，國際公布號WO 90/02809；Fuchs等，(1991)，Bio/Technology，91370-1372；Hay等，(1992)，Hum Antibod Hybridomas，381-85；Huse等，(1989)，Science，2461275-1281；Griffths等，(1993)，EMBOJ，12725-734；Hawkins等，(1992)，J Mol Biol，226889-896；Clackson等，(1991)，Nature，352624-628；Gram等，(1992)，PNAS，893576-3580；Garrad等，(1991)，Bio/Technology，91373-1377；Hoogenboom等，(1991)，Nuc AcidRes，194133-4137；和Barbas等，(1991)，PNAS，887978-7982)。這些抗原結合分子可用于篩選表達文庫中的變體HVI標記多肽。它們也可用于檢測和/或分離本發(fā)明的HVI標記多肽。因此，本發(fā)明也考慮利用這些抗原結合分子，采用例如任何合適的免疫親和方法(包括但不限于免疫層析和免疫沉淀)來分離HVI標記多肽。合適的方法利用固相吸附，其中將抗-HVI標記多肽的抗原結合分子與合適的樹脂相連，使該樹脂與懷疑含有HVI標記多肽的樣品接觸，然后從樹脂上洗脫HVI標記多肽(如果存在的話)。示范性樹脂包括SepharoseTM(Pharmacia)、PorosTM樹脂(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis)、ActigelSuperflowTM樹脂(Sterogene Bioseparations Inc.，Carlsbad Calif.)和DynabeadsTM(Dynal Inc.，Lake Success，N.Y.)。
可將抗原結合分子與化合物，例如標記物，如放射性核素，或成像試劑，如放射性、酶活性(試劑)或其它成像試劑，如NMR對比試劑相偶聯(lián)。優(yōu)選能產(chǎn)生可檢測的放射性射線或熒光的標記物。為評估蛋白質表達的豐度和模式，可利用抗-HVI標記多肽的抗原結合分子(例如，單克隆抗體)來檢測HVI標記多肽(例如，在細胞裂解物或細胞上清液中的)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選應用中，可用這種抗原結合分子來監(jiān)測生物學樣品(含有完整的細胞和液體)中的HVI標記多肽水平而診斷是否存在皰疹病毒感染及其程度或皰疹病毒感染所致疾病的風險。將抗體與可檢測物質(即，抗體標記)相偶聯(lián)(即，物理連接)有助于檢測?？蓹z測物質的例子包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復合物的例子包括鏈霉親和素/生物素與親和素/生物素；合適的熒光材料的例子包括傘形酮、熒光素、熒光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三吖嗪胺熒光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的例子包括魯米諾；生物發(fā)光材料的例子包括螢光素酶、熒光素和水母蛋白；合適的放射性材料的例子包括125I、131I、35S或3H。標記物可選自色原、催化劑、酶、熒光基團、化學發(fā)光分子、鑭系離子，如銪(Eu34)、放射性同位素和可直接觀察的標記物。就可直接觀察標記物而言，可用膠體金屬顆?；蚍墙饘兕w粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質體或含有信號產(chǎn)生物質的其它載體等制備標記。
美國專利說明書U.S.4,366,241；U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公開了大量可用作標記物的酶。本發(fā)明可用的酶標記物包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等?？蓡为毷褂妹笜擞浳锶芤夯蚺c第二種酶聯(lián)用。
5.檢測異常HVI標記基因表達或等位基因的方法本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)與未受皰疹病毒感染的馬匹相比，受皰疹病毒(特別是EHV)感染的馬匹，特別是活動性皰疹病毒感染的那些馬匹的某些基因或者這些基因的某些等位基因(本文稱為HVI標記基因)表達異常。本文提出在受皰疹病毒感染的其它動物中發(fā)現(xiàn)這些基因或它們的同源物或直向同源物的表達異常。因此，本發(fā)明的特征在于通過檢測取自對象的生物學樣品中某HVI標記基因的異常表達來評估該對象(優(yōu)選哺乳動物)的皰疹病毒感染或診斷皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染的方法。皰疹病毒感染宜包括受選自α皰疹病毒科、β皰疹病毒科和γ皰疹病毒科的皰疹病毒亞科成員之一感染。α皰疹病毒科亞科的皰疹病毒的示范性例子包括HHV-1(HSV-1)、HHV-2(HSV-2)、HHV-3(VZV)和馬皰疹病毒(如，EHV-1和EHV-4)。β皰疹病毒科亞科的皰疹病毒的非限制性例子包括HHV-5(CMV)、HHV-6(玫瑰疹病毒)和HHV-7。γ皰疹病毒科亞科的皰疹病毒的代表性例子包括但不限于HHV-4(淋巴潛隱病毒，EBV)和HHV-8(細長病毒)。在特定的實施方案中，所述皰疹病毒是EHV，特別是EHV-1，更特別是活動性EHV-1。
為作出評估或診斷，需要定性或定量測定HVI標記基因轉錄物的水平、某HVI標記基因的特定等位基因的存在或水平或HVI標記多肽的水平或功能活性。在一些實施方案中，當生物學樣品中存在的某HVI標記基因產(chǎn)物檢測水平低于取自正常對象或未受皰疹病毒感染，特別是未受皰疹病毒活動性感染對象的參比樣品中該基因的水平時，可診斷存在皰疹病毒感染狀態(tài)、程度或階段，或者存在發(fā)生皰疹病毒后遺癥風險。在其它實施方案中，當生物學樣品中某HVI標記基因產(chǎn)物的可檢測水平高于取自正常對象或未受皰疹病毒感染，特別是未受皰疹病毒活動性感染對象的參比樣品該基因的水平時，則可診斷存在皰疹病毒感染狀態(tài)、程度或階段，或者存在發(fā)生皰疹病毒后遺癥風險。總之，當生物學樣品中的某HVI標記基因產(chǎn)物的水平或功能活性與參比樣品中相應的HVI標記基因產(chǎn)物的水平或功能活性相比至少有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少約99.5％、99.9％、99.95％、99.99％、99.995％或99.999％，或甚至至少約100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％或1000％的差異時，可作出這種診斷。代表性HVI標記基因表達水平的示范性升高或降低見表5-7。
相應的基因產(chǎn)物通常選自生物學樣品中存在的同一基因產(chǎn)物、含有等位基因變體或剪接變體的變體基因(例如，同源或直向同源基因)所表達的基因產(chǎn)物或它們的蛋白質產(chǎn)物。在一些實施方案中，該方法包括檢測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30種HVI標記基因各表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
生物學樣品一般包括血液，特別是外周血，或其組分或提取物。生物學樣品通常含有血細胞，例如成熟、不成熟和發(fā)育的白細胞，包括淋巴細胞、多形核白細胞、嗜中性白細胞、單核細胞、網(wǎng)織紅細胞、嗜堿性粒細胞、腔胞、血細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞，或這些細胞的組分(例如，核酸或蛋白質部分)。在特定的實施方案中，生物學樣品含有白細胞，包括外周血單核細胞(PBMC)。
5.1核酸診斷可按照標準方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)從生物學樣品所含細胞中分離核酸用于多核苷酸試驗。所述核酸一般是分級的(例如，poly A+RNA)或全細胞RNA。當將RNA作為檢測對象時，需要將RNA轉變?yōu)榛パaDNA。在一些實施方案中，采用模板依賴性核酸擴增技術擴增該核酸。已有許多模板依賴性方法來擴增某給定模板樣品中存在的HVI標記序列。示范性核酸擴增技術詳述于美國專利號4,683,195；4,683,202和4,800,159；Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCRProtocols)，Academic Press，Inc.，San Diego Calif.，1990)中的聚合酶鏈式反應(稱為PCR)。簡言之，在PCR中，制備與該標記序列的相對互補鏈上區(qū)域互補的兩條引物序列。向反應混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。如果某樣品中存在同源HVI標記序列，這些引物將與該標記(序列)結合，聚合酶可通過添加核苷酸使該引物沿著標記序列延伸。通過升高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物可與標記(序列)解離形成反應產(chǎn)物，過量的引物可與標記(序列)和反應產(chǎn)物結合，而反復進行該過程。為定量測定所擴增的mRNA含量，可采用逆轉錄酶PCR擴增方法。將RNA逆轉錄為cDNA的方法是熟知的，其描述于Sambrook等，1989，同上。其它逆轉錄方法利用熱穩(wěn)定的RNA依賴性DNA聚合酶。WO90/07641描述了這些方法。本領域熟知聚合酶鏈式反應方法。
在某些優(yōu)選實施方案中，模板依賴性擴增包括實時定量測定轉錄物。例如，可采用實時PCR技術(Higuchi等，1992，Biotechnology，10413-417)定量測定RNA或DNA。通過測定PCR反應中完成相同數(shù)目擴增輪次并處于線性范圍內的靶DNA擴增產(chǎn)物的濃度，可以確定原始DNA混合物中特異性靶序列的相對濃度。如果DNA混合物是從分離自不同組織或細胞的RNA合成的cDNA，則可測定產(chǎn)生該靶序列的各組織或細胞的特異性mRNA的相對豐度。PCR產(chǎn)物的濃度與mRNA相對豐度之間的這種直接正比例關系只在PCR反應的線性范圍內才正確?？赏ㄟ^反應混合物中試劑的利用率測定該曲線平臺部分靶DNA的終濃度，該終濃度不依賴于該靶DNA的初始濃度。
另一擴增方法是EPO No.320 308所公開的連接酶鏈式反應(“LCR”)。在LCR中，制備兩對互補探針，在靶序列存在下每對探針與靶序列的相反互補鏈結合從而使它們毗鄰。在連接酶存在下，此兩對探針可相連形成一個單位。與PCR中一樣，通過溫度循環(huán)，使結合的連接單位從靶序列上解離，然后用作連接過量探針對的“靶序列”。美國專利號4,883,750描述了與LCR相似，使探針對和靶序列結合的方法。
也可使用PCT申請?zhí)朠CT/US87/00880所述的Qβ復制酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下將具有與靶序列某區(qū)域相互補區(qū)域的RNA復制序列加入樣品中。聚合酶可拷貝該復制序列，然后檢測。
利用限制性核酸內切酶和連接酶擴增在一條鏈的限制性位點含有核苷酸5′α-硫代-三磷酸的靶分子的恒溫擴增方法也可用于擴增本發(fā)明的核酸，Walker等，(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，89392-396)。
鏈置換擴增(SDA)是進行核酸恒溫擴增的另一種方法，該方法包括多輪鏈置換與合成，即切口平移。稱為修復鏈式反應(RCR)的相似方法包括使幾種探針在擴增的整個靶區(qū)域上退火，然后只對四種堿基中的兩種進行修復反應。為便于檢測將另兩種堿基作為生物素化衍生物加入。SDA中采用了類似的方法。也可采用循環(huán)探針反應(CPR)檢測特異性靶序列。在CPR中，具有非特異性DNA的3’和5’序列與特異性RNA中段序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交后，用RNA酶H處理反應(混合物)，探針的產(chǎn)物鑒定為消化后釋放的不同產(chǎn)物。使原始模板與另一循環(huán)探針退火，重復進行此反應。
還可采用英國專利申請?zhí)? 202 328和PCT申請?zhí)朠CT/US89/01025所述的另一種擴增方法。在前一申請中，將“修飾的”引物用于PCR-樣的模板和酶依賴性合成中?？捎貌东@部分(例如，生物素)和/或檢測部分(例如，酶)標記修飾這些引物。在后一申請中，將過量的標記探針加入樣品。在靶序列存在下，探針結合并被酶催化切割。切割后，靶序列完整釋放進而與過量探針結合。標記探針的切割是靶序列存在的信號。
其它核酸擴增方法包括轉錄擴增系統(tǒng)(TAS)，包括核酸序列擴增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，861173；Gingeras等，PCT申請WO 88/10315)。在NASBA中，可通過臨床樣品的標準苯酚/氯仿提取、熱變性、裂解緩沖液處理和微量離心(minispin)柱分離DNA和RNA或通過氯化胍提取RNA來制備用于擴增的核酸。這些擴增技術包括使具有靶特異性序列的引物退火。聚合后，用RNA酶H消化雜交的DNA/RNA雜交體，對雙鏈DNA分子再進行熱變性。在兩種情況中，通過加入第二條靶特異性引物然后聚合從而將單鏈DNA制成完全雙鏈。然后用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次轉錄該雙鏈DNA分子。在恒溫循環(huán)反應中，將RNA逆轉錄為單鏈DNA，然后轉變?yōu)殡p鏈DNA，接著用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次轉錄。得到的產(chǎn)物無論是截短的還是完整的均顯示為靶特異性序列。
Davey等，EPO No.329 822公開了一種核酸擴增方法，包括可用于本發(fā)明的循環(huán)合成的單鏈RNA(“ssRNA”)、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。ssRNA是逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然后利用核糖核酸酶H(RNA酶H，對含DNA或RNA的雙螺旋中RNA具有特異性的RNA酶)的作用除去得到的DNA:RNA雙螺旋中的RNA。產(chǎn)生的ssDNA是第二引物的模板，該引物在5’(端)也含有與該模板同源的RNA聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)的啟動子序列。然后用DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNA聚合酶I的大“Klenow”片段)延伸此引物，得到雙鏈DNA(“dsDNA”)分子，其序列與引物之間的原始RNA相同，在一末端還含有啟動子序列。合適的RNA聚合酶可利用此引物序列制備該DNA的多份RNA拷貝。然后這些拷貝可再進入循環(huán)從而快速擴增。適當?shù)剡x擇酶，可恒溫進行此擴增(方法)而無需在每輪加入酶。由于此方法的循環(huán)性質，可選擇DNA或RNA形式的起始序列。
Miller等在PCT申請WO 89/06700中公開的核酸序列擴增方案根據(jù)啟動子/引物序列與單鏈靶DNA(“ssDNA”)雜交，然后轉錄該序列的多份RNA拷貝。此方案不是循環(huán)性的，即得到的RNA轉錄物不產(chǎn)生新模板。其它擴增方法包括“RACE”和“單邊(one-sided)PCR”(Frohman，M.A.，刊于《PCR方法方法與應用指南》(PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications)，科學出版社，N.Y.，1990；Ohara等，1989，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，865673-567)。
也可采用在含有所產(chǎn)生的“二-寡核苷酸”序列的核酸存在下連接兩條(或多條)寡核苷酸從而擴增該“二-寡核苷酸”的方法來擴增靶核酸序列。Wu等，(1989，Genomics，4560)。
取決于所用的方式，可采用例如上述模板依賴性擴增或在擴增后用第二種已知的核酸直接鑒定樣品中感興趣的HVI標記核酸。然后檢測所鑒定的產(chǎn)物。在某些應用中，可通過目測方法進行檢測(例如，凝膠溴化乙錠染色)?；蛘撸瑱z測可包括通過化學發(fā)光、放射性標記的放射性閃爍照相術或熒光標記物或甚至通過利用電或熱脈沖信號的系統(tǒng)來間接鑒定產(chǎn)物(Affymax Technology；Bellus，1994，J Macromol.Sci.Pure，Appl.Chem.，A31(1)1355-1376)。
在一些實施方案中，可觀察擴增產(chǎn)物或“擴增子”以證實HVI標記序列的擴增。一種典型的目測方法包括用溴化乙錠染色凝膠，在UV光下觀察?；蛘?，如果擴增產(chǎn)物整合標記了放射性或熒光標記的核苷酸，可在分離后使這些擴增產(chǎn)物曝光x-射線膠片或在合適的激發(fā)光譜下觀察。在一些實施方案中，可間接進行觀察。擴增產(chǎn)物分離后，使標記的核酸探針與擴增的HVI標記序列接觸。探針優(yōu)選與生色團偶聯(lián)，但也可放射性標記?；蛘撸瑢⑻结樑c結合伴侶，例如抗原結合分子或生物素偶聯(lián)，而結合對的另一成員攜帶可檢測部分或報導分子。所涉及的技術是本領域技術人員熟知的，可在許多分子方法的標準教科書(例如，參見Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，可在擴增期間或其后用生色團或放射性標記的探針或引物鑒定靶(序列)。
在某些實施方案中，采用本領域技術人員熟知的印跡技術定量測定靶核酸。Sourthern印跡利用DNA作為靶子，而Northern印跡利用RNA作為靶子。各方法可提供不同類型的信息，雖然cDNA印跡在許多方面與上述印跡或RNA相似。簡言之，探針用于靶向固定于合適的基質上，通常是硝酸纖維素膜上的DNA或RNA。不同種類核酸在空間上應分開以便分析。這往往通過核酸凝膠電泳，然后“印跡”到膜上來實現(xiàn)。隨后，在促進變性和再雜交(rehybridisation)的條件下共同培育印跡靶(序列)與探針(通常是標記的探針)。因為探針設計為與靶(序列)堿基配對，探針可在復性條件下與靶序列的一部分結合。然后除去未結合的探針，如上所述進行檢測。
檢測/定量測定后，可將某給定對象的所見結果與對照反應(結果)或正常對象或無皰疹病毒感染，特別是無活動性皰疹病毒感染對象的有統(tǒng)計學意義的參比組作比較。以此方式可使所檢測到的HVI標記核酸含量與疾病的進程或嚴重性相關聯(lián)。
本發(fā)明也考慮如Kristensen等，(Biotechniques，30(2)318-322)所述的基因分型方法和等位基因鑒別方法和技術，這些方法和技術包括采用單個核苷酸多態(tài)性分析、高效液相層析、TaqManTM、液相層析和質譜。
本發(fā)明也考慮生物芯片技術，例如Hacia等(1996，Nature Genetics，14441-447)和Shoemaker等(1996，Nature Genetics，14450-456)所述的技術。簡言之，這些技術包括快速精確分析許多基因的定量測定方法。通過用寡核苷酸給基因加標簽或者利用固定的探針陣列，可用生物芯片技術將靶分子分隔成高密度陣列并根據(jù)雜交篩選這些分子。也參見Pease等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，915022-5026)；Fodor等(1991，Science，251767-773)。簡言之，如本文所概述，制備HVI標記多核苷酸的核酸探針，將其與用于篩選和診斷方法的生物芯片相連?？蓪⑦B接生物芯片的核酸探針設計為基本上與特異性表達的HVI標記核酸，即靶序列(無論是樣品的靶序列還是其它探針序列，例如夾心測定中的序列)互補，從而使得靶序列與本發(fā)明的探針雜交。此互補性無需完美；靶序列與本發(fā)明的核酸探針之間可存在一定數(shù)量的干擾雜交的堿基對錯配。然而，如果錯配的數(shù)量太大以致于即使在最低嚴謹性雜交條件下也不發(fā)生雜交，則該序列不是靶序列的互補序列。在某些實施方案中，每條序列可利用多種探針，可利用重疊的探針或針對靶序列不同部分的探針。即，可用兩種、三種、四種以上的探針(優(yōu)選三種)構建具體靶(序列)而具有豐余度。這些探針可以是重疊的(即某些序列相同)或分離的。
本領域普通技術人員應該知道，可以各種方式將核酸連接于或固定于固體支持物。本文的“固定的”或其語法等價詞表示核酸探針與固體支持物之間的連接或結合在下述結合、洗滌、分析和去除條件下足夠穩(wěn)定。結合可以是共價或非共價。本文的“非共價結合”與其語法等價詞表示靜電、親水性和疏水性相互作用的一種或多種。非共價結合包括分子，例如鏈霉親和素與支持物的共價連接與生物素化探針與鏈霉親和素的非共價結合。本文的“共價結合”及其語法等價詞表示兩部分，即固體支持物與探針至少通過一根鍵，包括σ鍵、π鍵和配位鍵相連。探針與固體支持物之間可直接形成共價鍵，或者可通過交聯(lián)接頭或通過固體支持物或探針二者或此兩種分子所含的特異性反應活性基團來形成共價鍵。固定化也可包括聯(lián)合用共價和非共價相互作用。
總之，本領域技術人員知道可以各種方式連接探針與生物芯片。如本文所述，可先合成核酸，然后與生物芯片相連，或者可直接在生物芯片上合成核酸。
生物芯片包含合適的固體或半固體基板或固體支持物?！盎濉被颉肮腆w支持物”表示經(jīng)修飾而含有適合與核酸探針相連或結合的不連續(xù)多個位點并適用于至少一種檢測方法的任何材料。本領域技術人員知道可用的基板很多，包括但不限于玻璃與改性或功能化玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯與苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)，多糖，尼龍或硝酸纖維素，樹脂，二氧化硅或含硅材料(包括修飾的硅)、碳、金屬、無機玻璃、塑料等。總之，這些基板可用光學方法檢測并且不帶熒光。
所述基板一般是平的，雖然本領域技術人員知道也可利用其它構型的基板。例如，為對流過的樣品進行分析而盡可能降低樣品體積，可將探針置于試管的內表面。類似地，所述基板可以是可彎曲的，例如可彎曲的泡沫塑料，包括特定塑料制成的有密封小室的泡沫塑料。
在某些實施方案中，本領域已知可在基板上合成寡核苷酸探針。例如，利用光聚合化合物和技術的光活化技術。在一示范性例子中，采用熟知的光版印刷技術，例如WO 95/25116；WO 95/35505；美國專利號5,700,637和5,445,934及其引用的參考文獻中所述的技術原位合成核酸；這些連接方法構成Affymetrix GeneChipTM技術的基礎。
在一示范性生物芯片分析的例子中，使生物芯片上的寡核苷酸探針在有助于特異性雜交的條件下與懷疑含有一種或多種皰疹病毒多核苷酸的核酸樣品接觸。可從生物材料的懸液中制備樣品的DNA或RNA提取物(無論單鏈或雙鏈)，或者研碎生物材料，或者按照細胞裂解步驟制備，所述步驟包括但不限于用SDS(或其它洗滌劑)、滲透壓沖擊、異硫氰酸胍和溶菌酶處理進行裂解?？捎糜诒景l(fā)明方法的合適DNA包括cDNA。可采用多種常用方法之一制備這種DNA，例如見Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。
可用于本發(fā)明方法的合適RNA包括信使RNA、DNA轉錄的互補RNA(cRNA)或基因組RNA或次基因組RNA?？刹捎脴藴史椒ㄖ苽溥@種RNA，例如Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。
可通過，例如超聲波處理或用限制性核酸內切酶處理使cDNA片段化。優(yōu)選使cDNA片段化從而使產(chǎn)生的DNA片段長于固定的寡核苷酸探針，但足夠小而可在合適的雜交條件下快速接觸固定的探針。或者，可采用例如上述合適的核苷酸擴增技術來選擇并擴增cDNA片段，這涉及利用合適的隨機或特異性引物。
通?？蓹z測性標記靶HVI標記多核苷酸從而可測定它們與各探針的雜交。通常用報導分子可檢測性標記靶多核苷酸，所述報導分子的示范性例子包括色原、催化劑、酶、熒光染料、化學發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、鑭系離子(例如，Eu34)、放射性同位素和可直接觀察的標記物。對于可直接觀察的標記物，可利用膠體金屬顆?；蚍墙饘兕w粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質體或含有信號產(chǎn)生物質的其它載體等。此類的示范性標記物包括大的膠體，例如金屬膠體，如金、硒、銀、錫和鈦氧化物膠體。在一些將酶用作可直接觀察標記物的實施方案中，將生物素化的堿基摻入靶多核苷酸中。通過與鏈霉親和素-報導分子培育來檢測雜交。
合適的熒光染料包括但不限于異硫氰酸熒光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、R-藻紅蛋白(RPE)和得克薩斯紅(Texas Red)。其它示范性熒光染料包括Dower等(國際公布WO 93/06121)中所述的。熒光染料也可參考美國專利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)?；蛘?，熒光染料可參考美國專利號5,227,487；5,274,113；5,405,975；5,433,896；5,442,045；5,451,663；5,453,517；5,459,276；5,516,864；5,648,270和5,723,218中所述?？少彽玫臒晒鈽擞浳锇ǎ鐭晒馑貋喠柞０?，如FluoreprimeTM(Pharmacia)、FluorediteTM(Millipore)和FAM(Applied Biosystems International)。
放射性報導分子包括，例如可通過X-射線或磷酸成像(phosphoimager)技術檢測的32P。
可在適合于寡核苷酸探針與測試核酸(包括DNA或RNA)雜交的條件下進行雜交形成步驟。就此而言，可參考例如《核酸雜交，一種實用方法》(NUCLEICACID HYBRIDIZATION，A PRACTICAL APPROACH)，(Homes和Higgins編)，(IRL press，Washington D.C.，1985)。總之，雜交是否發(fā)生受寡核苷酸探針和所測試多核苷酸序列的長度、pH、溫度、一價和二價陽離子的濃度、雜交形成區(qū)中G和C核苷酸的比例、介質粘度和可能存在的變性劑的影響。這些可變因素也影響雜交所需時間。因此，優(yōu)選的條件取決于具體應用。然而，可用常規(guī)方法確定這些經(jīng)驗性條件而無需過多實驗。
某些優(yōu)選實施方案采用高度鑒別性雜交條件。例如，可參考Wallace等(1979，Nucl.Acids Res.，63543)，他描述了與含有一個內部堿基對錯配的相似寡核苷酸探針相比，可區(qū)別與靶序列完美匹配和完全同源的11-17個堿基長的寡核苷酸探針的雜交條件。也可參考Wood等(1985，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，821585)，他描述了利用3M氯化四甲銨使11-20個堿基長的寡核苷酸雜交的條件，其中雜交體的解鏈溫度只取決于寡核苷酸探針的長度，而無論其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10個核苷酸長的寡聚物的嚴謹雜交條件，利用核苷酸類似物，例如“鎖定核酸”不難獲得相似條件(Christensen等，2001，Biochem J，354481-4)。
雜交反應一般可在雜交緩沖液存在下進行，所述緩沖液任選含有雜交優(yōu)化試劑，例如穩(wěn)定劑(isostabilising agent)、變性劑和/或復性加速劑。穩(wěn)定劑的例子包括但不限于甜菜堿和低級四烷基銨鹽。變性劑是通過干擾雙鏈核酸堿基之間的氫鍵或核酸分子的水合作用來降低雙鏈核酸分子解鏈溫度的組合物。變性劑包括但不限于甲酰胺、甲醛、二甲基亞砜、四乙基乙酸酯(tetraethylacetate)、脲、異硫氰酸胍(guanidium isothiocyanate)、甘油和離液鹽。雜交加速劑包括核內不均一核糖蛋白(hnRP)A1和陽離子洗滌劑，如十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、聚賴氨酸、精胺、亞精胺、單鏈結合蛋白(SSB)、噬菌體T4基因32蛋白與乙酸銨和乙醇的混合物。雜交緩沖液可含有濃度為約0.005-約50nM、優(yōu)選約0.5-5nM、更優(yōu)選約1-2nM的靶多核苷酸。
使含有靶HVI標記多核苷酸的雜交混合物與探針陣列接觸并在室溫培育適當時間以使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補探針雜交?？稍谌魏魏线m的容器中進行接觸，例如設計用于盛放其上連接有探針的固體支持物的碟或小室。培育溫度通常為核酸雜交所用的溫度，例如約20℃-約75℃、如約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃，或約65℃。長度超過14個核苷酸的探針優(yōu)選20-50℃。對較短的探針而言，優(yōu)選較低溫度。將靶多核苷酸樣品與探針培育足夠時間使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補探針之間達到所需雜交水平。例如，可在約45℃+/-10℃在甲酰胺中雜交1-2天。
雜交物形成步驟后，用含有與雜交步驟所用相同濃度的雜交優(yōu)化劑的雜交緩沖液洗滌探針以除去任何未結合的核酸。此洗滌步驟只留下結合的靶多核苷酸。然后可檢測探針以鑒定哪種探針與靶多核苷酸雜交。
然后可檢測雜交反應以確定哪種探針與相應的靶序列雜交。取決于和靶多核苷酸連接的報導分子的性質，可通過以下方式用儀器檢測信號用光照射熒光標記物，用熒光計檢測熒光；提供酶系統(tǒng)以產(chǎn)生可用分光光度計檢測的顏色；或者用光反射儀檢測染料顆?；蛴猩哪z體金屬顆?；蚍墙饘兕w粒；用放射性標記物或化學發(fā)光分子時采用輻射計數(shù)器或放射自顯影術。因此，檢測裝置應適用于檢測或掃描標記物相關的光，所述光可包括熒光、冷光、聚焦光束或激光。此時，可用電荷耦合器件(CCD)或光電池來掃描微陣列中各位置探針靶多核苷酸雜交物發(fā)射的光并直接在數(shù)字計算機上記錄數(shù)據(jù)。在一些情況中，無需電子檢測信號。例如，以酶促產(chǎn)生與核酸陣列模式相關的顏色斑點為例，目測該陣列就可解釋陣列上的模式。在核酸陣列情況中，檢測裝置優(yōu)選與模式識別軟件相連而將陣列的信號模式轉化為普通語言遺傳分布模式。在某些實施方案中，不同HVI應激標記基因產(chǎn)物的特異性寡核苷酸探針采取核酸陣列形式，用“芯片閱讀器”檢測陣列上報導分子所產(chǎn)生的信號?！靶酒喿x器”采用的檢測系統(tǒng)如Pirrung等(美國專利號5,143,854)所述。芯片閱讀器通常也包括一些信號加工過程來確定某具體陣列位置或元件處的信號是真陽性或者可能是假信號。示范性芯片閱讀器例如Fodor等(美國專利號5,925,525)所述?；蛘撸旉嚵惺怯筛鞣N可尋址型標記的微珠混合物制成時，可采用流式細胞術檢測該反應。
5.2蛋白質診斷與本發(fā)明一致的是，存在異常濃度的HVI標記蛋白質表明皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染的存在、程度或階段，或發(fā)生皰疹病毒感染后遺癥的風險?？刹捎帽绢I域已知的任何合適方法檢測生物學樣品中HVI標記蛋白質的水平。例如，當HVI標記蛋白質是酶時，可根據(jù)其催化活性或根據(jù)樣品所含該蛋白質分子數(shù)來定量測定該蛋白質?？刹捎每贵w技術，例如免疫組織學和免疫組織化學方法來檢測組織樣品中感興趣蛋白質的水平。例如，用一抗(多克隆或單克隆)提供特異性識別，用第二檢測系統(tǒng)檢測一抗的存在(或結合)。可將可檢測標記物，例如熒光標記物、放射性標記物或能產(chǎn)生可定量測定(如有色的)產(chǎn)物的酶(如，堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)與二抗相偶聯(lián)。在另一合適的方法中，可檢測性地標記一抗本身。因此可對組織切片作免疫組織學標記。在一些實施方案中，從生物學樣品(例如，組織、細胞)中制備分析用蛋白提取物?？刹捎贸Ｒ?guī)免疫印跡方法(Jalkanen等，1985，J.Cell.Biol.，101976-985；Jalkanen等，1987，J.Cell.Biol.，1053087-3096)經(jīng)western-印跡或斑點/狹線實驗(分析)這種提取物(例如，洗滌劑提取物)中感興趣蛋白質的水平。
其它有用的抗體方法包括免疫測定，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。例如，蛋白質特異性單克隆抗體可用作免疫吸附劑與酶標記探針來檢測和定量測定感興趣的HVI標記蛋白質?？刹捎镁€性回歸計算機算法(參見，Lacobilli等，1988，Breast Cancer Research and Treatment，1119-30)，參考標準制品中的含量來計算樣品中這種蛋白質的含量。其它實施方案可用感興趣蛋白質的兩種不同單克隆抗體，一種作為免疫吸附劑，另一種作為酶標記探針。
此外，蛋白質捕獲陣列領域的最新進展使得能同時檢測和/或定量測定大量蛋白質。例如，濾膜上的低密度蛋白質陣列，如通用蛋白質陣列系統(tǒng)(Ge，2000，Nucleic Acids Res.，28(2)e3)采用標準ELISA技術和掃描電荷耦聯(lián)器件(CCD)檢測器拍攝組成陣列的抗原圖像。也開發(fā)了能同時檢測臨床(多種)分析物的免疫傳感器陣列。目前已能用蛋白質陣列來分析體液中，例如健康或患病對象以及藥物治療前后對象血清中的蛋白質表達分布模式。
蛋白質捕獲陣列一般包含多種蛋白質捕獲劑，它們各自組成了該陣列空間位置不同的元件。蛋白質捕獲劑可以是能結合蛋白質并將其固定在陣列上的蛋白質捕獲劑位點的任何分子或分子復合物。蛋白質捕獲劑可以是一種蛋白質，其在細胞中的天然功能是特異性結合另一種蛋白質，例如抗體或受體。或者，蛋白質捕獲劑可以是能特異性結合某蛋白質的部分合成或全合成或重組的蛋白質?；蛘?，蛋白質捕獲劑可以是在體外根據(jù)對特異性靶蛋白質或肽的結合親和力從誘變、隨機或完全隨機化與合成文庫中選出的蛋白質。所用的選擇方法可以任選是本領域已知的展示方法，例如核糖體展示或噬菌體展示方法?；蛘?，經(jīng)體外選擇得到的蛋白質捕獲劑可以是能特異性結合靶蛋白質的DNA或RNA適體(參見，例如Potyrailo等，1998，Anal.Chem.，703419-3425；Cohen等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9514272-14277；Fukuda等，1997，Nucleic Acids Symp.Ser.，37237-238；得自SomaLogic)。例如，用SelexTM方法從寡核苷酸文庫中選擇適體，可通過共價連接，例如摻入溴化脫氧尿苷和紫外光活化交聯(lián)(光適體)來提高它們與蛋白質的相互作用。適體的優(yōu)點在于易于通過自動寡核苷酸合成來制備，和DNA穩(wěn)定而牢固；可采用通用熒光蛋白質染色技術來檢測結合情況?；蛘?，體外選擇的蛋白質捕獲劑可以是多肽(例如，抗原)(參見，例如Roberts和Szostak，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9412297-12302)。
捕獲分子的另一種陣列是通過“分子印刷”技術制成的陣列，其中的肽(例如蛋白質的C-末端區(qū)域)用作模板在可聚合基質中產(chǎn)生結構互補的序列特異性空隙；然后這些空隙能特異性捕獲具有相應一級氨基酸序列的(變性的)蛋白質(例如，得自ProteinPrintTM和Aspira Biosystems)。
示范性蛋白質捕獲陣列包括通常稱為抗體陣列的含有空間上可尋址的抗原結合分子的陣列，該陣列有助于大規(guī)模地平行分析眾多蛋白質來確定蛋白質組或蛋白質亞組?？贵w陣列顯示具有所需的特異性性質和可接受的背景，一些陣列可購得(例如，BD Biosciences，Clontech，BioRad和Sigma)。制備抗體陣列的各種方法已有報道(參見，例如Lopez等，2003，J.Chromatogr.B，78719-27；Cahill，2000，Trends in Biotechnology，747-51；美國專利申請公布2002/0055186；美國專利申請公布2003/0003599；PCT公布WO03/062444；PCT公布WO 03/077851；PCT公布WO 02/59601；PCT公布WO02/39120；PCT公布WO 01/79849；PCT公布WO 99/39210)。這些陣列的抗原結合分子至少可識別某細胞或細胞群所表達蛋白質亞組，其示范性例子包括生長因子受體、激素受體、神經(jīng)遞質受體、兒茶酚胺受體、氨基酸衍生物受體、細胞因子受體、胞外基質受體、抗體、凝集素、細胞因子、絲抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-樣GTP酶、水解酶、類固醇激素受體、轉錄因子、熱激轉錄因子、DNA-結合蛋白、鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈蛋白、同源域蛋白、胞內信號轉導調節(jié)劑和效應物、凋亡相關因子、DNA合成因子、DNA修復因子、DNA重組因子、細胞表面抗原、丙型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。
在噬菌體展示或核糖體展示文庫(例如，得自Cambridge AntibodyTechnology，BioInvent，Affitech和Biosite)中選擇后可通過常規(guī)免疫方法(例如，多克隆血清和雜交瘤)，或作為通常在大腸桿菌中表達的重組片段制備抗體陣列的抗原結合分子?；蛘?，制備的含非共價締合的VH和VL結構域的“組合抗體(combibody)”形式為產(chǎn)生雙抗體細菌克隆(例如，得自Domantis)組合所形成的矩陣。用作蛋白質捕獲劑的示范性抗原結合分子包括單克隆抗體、多克隆抗體、Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2免疫球蛋白片段、合成的穩(wěn)定Fv片段(如單鏈Fv片段(scFv)、通過二硫鍵穩(wěn)定的Fv片段(dsFv))、單可變區(qū)結構域(dAbs)小抗體(minibody)、組合抗體和多價抗體(如雙抗體和多-scFv)、駱駝(camelids)的單結構域或工程改造的人等價抗體。
空間位置不同的各蛋白質捕獲劑通常連接于一般是平的或有起伏的支持物表面。常用的物理支持物包括載玻片、硅、微孔、硝酸纖維素或PVDF膜與磁性微珠和其它微珠。
雖然廣泛采用將蛋白質微滴遞送到平面上，但也可采用有關的其它構造，包括工具微流體學進展開發(fā)的CD離心裝置(例如，購自Gyros)和專門化的芯片設計，例如平面中工程改造的微通道(例如，The Living ChipTM，購自Biotrove)和硅表面的微小3D柱(例如，得自Zyomyx)。
也可將懸浮液中的顆粒用作陣列的基礎，只要給它們的身份編碼；這些系統(tǒng)包括用顏色編碼的微珠(例如，購自Luminex、Bio-Rad和NanomicsBiosystems)、半導體納米晶體(例如，QdotsTM，購自Quantum Dots)、棒形編碼珠(UltraPlexTM，購自Smartbeads)和多金屬微桿(NanobarcodesTM顆粒，購自Surromed)。也可將這些珠在半導體芯片上組裝成平面陣列(例如，購自LEAPS technology和BioArray Solutions)。當用顆粒時，各蛋白質捕獲劑通常連接于各顆粒以提供空間確定位置或分開的陣列。然后分別(但平行)以隔離方式，例如在微滴定板的孔中或不同試管中檢測這些顆粒。
在操作中，將蛋白質樣品任選片段化以形成肽片段(參見，例如美國專利申請公布2002/0055186)，在適合于蛋白質或肽結合的條件下遞送到蛋白質捕獲陣列；洗滌該陣列將樣品中未結合或非特異性結合的組分從陣列上洗去。然后，利用合適的檢測系統(tǒng)檢測與陣列上各元件結合的蛋白質或肽的存在或含量。將與陣列上某元件結合的蛋白質測定量與該陣列第二元件結合的第二蛋白質的含量作比較。在某些實施方案中，樣品中第二蛋白質的含量是已知或已知不變。
為分析兩種細胞或細胞群之間蛋白質表達的差異，將第一種細胞或細胞群的蛋白質樣品在適合于蛋白質結合的條件下遞送到該陣列。將第二種細胞或細胞群的蛋白質樣品以類似方式遞送到與第一陣列相同的第二陣列。然后洗滌兩陣列將樣品中未結合或非特異性結合的組分從陣列上洗去。最后，將維持與第一陣列元件結合的蛋白質含量和維持與第二陣列的相應元件結合的蛋白質含量作比較。為測定兩種細胞或細胞群之間蛋白質表達模式的差異，將與第一陣列各元件結合的蛋白質含量從與第二陣列的相應元件結合的蛋白質含量中扣除。
在一示范性例子中，可利用熒光標記檢測與陣列結合的蛋白質。將與解讀DNA微陣列所用相同的儀器應用于蛋白質捕獲陣列。為展示差別，可用得自兩種不同狀態(tài)細胞的熒光標記蛋白質檢測捕獲陣列(例如，抗體陣列)，兩種狀態(tài)的細胞裂解物用不同熒光團(例如，Cy-3和Cy-5)標記并混合，從而可將顏色作為靶(分子)豐度變化的讀數(shù)。通過酪酰胺信號擴增(TSA)(例如，購自PerkinElmer Lifesciences)可將熒光讀數(shù)靈敏度提高10-100倍。平面波導技術(例如，購自Zeptosens)能進行超靈敏的熒光檢測，其另一優(yōu)點是無需洗滌。利用藻紅蛋白作標記物(例如，購自Luminex)或利用半導體納米晶體(例如，購自Quantum Dot)性能的懸浮珠和顆粒也能實現(xiàn)高靈敏度。已采納熒光共振能量轉移來檢測可用于陣列的未標記配體的結合(例如，購自Affibody)。已開發(fā)了幾種其它讀數(shù)裝置，包括以下方法的改進裝置表面等離振子共振(例如，購自HTS Biosystems和Intrinsic Bioprobes)、滾動循環(huán)DNA擴增(例如，購自Molecular Staging)、質譜(例如，購自Sense Proteomic，Ciphergen，Intrinsic和Bioprobes)、共振光散射(例如，購自Genicon Sciences)和原子力顯微鏡(例如，購自BioForce Laboratories)。NextGen和PerkinElmer Life Sciences共同開發(fā)了用于樣品與載玻片陣列自動培育和洗滌的微流體系統(tǒng)。
在某些實施方案中，用于檢測HVI標記表達產(chǎn)物的技術包括用內部或外部標準品來定量或半定量測定那些產(chǎn)物，從而能有效地比較生物學樣品中這些表達產(chǎn)物與參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性。技術人員采用標準方法可以確定這種標準品。具體實施例中測定了各表達產(chǎn)物的水平或功能活性的絕對值。
在特定的實施方案中，可利用如國際公布號WO 02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申請?zhí)朠CT/AU03/01517中所述的，包括與基站相耦聯(lián)的至少一個終端站的系統(tǒng)來執(zhí)行此診斷方法。基站通常與一個或多個數(shù)據(jù)庫相耦聯(lián)，這些數(shù)據(jù)庫含有大量個體的代表HVI標記表達產(chǎn)物水平或功能活性的預定數(shù)據(jù)，以及收集這些預定數(shù)據(jù)時這些個體實際狀態(tài)的指征(例如，皰疹病毒感染的存在、不存在、程度、階段或發(fā)生皰疹病毒后遺癥的風險)。在操作中，基站一般通過通信網(wǎng)絡接受終端站的數(shù)據(jù)并將所述數(shù)據(jù)與存儲在數(shù)據(jù)庫中的預定數(shù)據(jù)作比較，所述數(shù)據(jù)代表對應于取自測試對象生物學樣品中至少一種表達產(chǎn)物所檢測到或標準化的水平或功能活性。將該對象的數(shù)據(jù)與預定數(shù)據(jù)作比較使基站能根據(jù)比較結果確定該對象的狀態(tài)。因此，基站試圖鑒定與測試對象具有相似參數(shù)值的個體，一旦根據(jù)該鑒定(結果)確定了狀態(tài)，基站會將顯示的診斷送至終端站。
5.3試劑盒可將檢測與定量測定HVI標記基因表達產(chǎn)物所需的所有必需材料和試劑一起組裝在試劑盒中。這些試劑盒也任選裝有檢測標記物的合適試劑、陽性和陰性對照、洗滌溶液、印跡膜、微滴定板稀釋緩沖液等。例如，核酸檢測試劑盒可裝有(i)HVI標記多核苷酸(可用作陽性對照)，(ii)能與某種HVI標記多核苷酸特異性雜交的引物或探針。也可裝有適用于擴增核酸的酶，包括各種聚合酶(逆轉錄酶，Taq，SequenaseTMDNA連接酶等，取決于所采用的核酸擴增技術)，脫氧核苷酸和緩沖液以提供擴增所需的反應混合物。這種試劑盒一般以合適方式裝有各種試劑和酶以及各種引物或探針的不同容器?；蛘?，蛋白質檢測試劑盒可裝有(i)HVI標記多肽(可用作陽性對照)，(ii)能與某HVI標記多核苷酸發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子。該試劑盒的特征也在于裝有進行本文所述試驗的各種裝置和試劑；和/或用該試劑盒定量測定HVI標記基因表達的印制的使用說明書。
這些試劑盒任選裝有檢測標記物的合適試劑、陽性和陰性對照、洗滌溶液、印跡膜、微滴定板稀釋緩沖液等。例如，核酸檢測試劑盒可裝有(i)HVI標記多核苷酸(可用作陽性對照)，(ii)能與某種HVI標記多核苷酸特異性雜交的引物或探針。也可裝有適用于擴增核酸的酶，包括各種聚合酶(逆轉錄酶，Taq，SequenaseTMDNA連接酶等，取決于所采用的核酸擴增技術)，脫氧核苷酸和緩沖液以提供擴增所需的反應混合物。這種試劑盒一般以合適方式裝有各種試劑和酶以及各種引物或探針的不同容器?；蛘?，蛋白質檢測試劑盒可裝有(i)HVI標記多肽(可用作陽性對照)，(ii)能與某HVI標記多核苷酸發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子。該試劑盒的特征也在于裝有進行本文所述試驗的各種裝置和試劑；和/或用該試劑盒定量測定HVI標記多核苷酸表達的印制的使用說明書。
6.治療或預防方法在作出對象有發(fā)生皰疹病毒感染后遺癥風險陽性診斷后，本發(fā)明也可延伸用于治療或預防對象的皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染?？傮w上，所述治療包括給予診斷陽性的對象有效量的藥物或治療以改善癥狀或逆轉皰疹病毒感染的發(fā)生，或降低對象發(fā)生皰疹病毒感染后遺癥的可能性。目前適用于治療皰疹病毒感染的藥物包括但不限于例如美國專利申請公布號20020147210所述的阿昔洛韋、泛昔洛韋、伐昔洛韋、更昔洛韋、噴昔洛韋、疊氮胸苷、胞苷阿糖苷、利巴韋林、金剛烷胺、碘代脫氧尿苷、poscarnet、trifluoridine、美替沙腙(methizazone)、阿糖腺苷、levanisole 4-氨基-α，α-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑(imidazo)[4，5-c]喹啉-1-乙醇；美國專利申請公布號20020103262所述的羥化二苯乙炔；美國專利號5,840,728所述的環(huán)丙基化(cyclopropanated)碳環(huán)2′-脫氧核苷；美國專利號6,048,843所述的胸腺嘧啶-類似物抗皰疹藥物；美國專利申請公布號20040053891所述的膦甲酸(PFA，產(chǎn)自Astra，Sodertlje，瑞典的FoscavirTM)、5-(E)-溴乙烯基尿嘧啶類似物與相關的嘧啶核苷；美國專利申請公布號20040024209所述的1-芳基-4-氧-1，4-二氫-3-喹啉羧酰胺；與Raymond等，(1984，Biochem.Bioph.Res.Comm.，121(3)848-854)所述的亞精胺兒茶酚酰胺鐵螯合劑。
或者，可利用如美國專利申請公布號20020099426所述的裝置治療對象，所述裝置將電刺激遞送給患者受感染的皮膚或粘膜。以具有不同電特征的一系列電脈沖施加電刺激。
然而，應該知道本發(fā)明包括可用于治療或預防皰疹病毒感染的任何藥物或方法，并不限于上述的示范性化合物和制劑。
皰疹病毒緩解藥物一般與藥學上可接受的載體組成藥物(或獸醫(yī)學)組合物，以有效量給予來實現(xiàn)它們所需的目的。給予對象的活性化合物的劑量應在一段時間內足以在對象中引發(fā)有益反應，例如降低或減輕皰疹病毒感染，特別是活動性皰疹病毒感染的癥狀。給予的藥學活性化合物的用量取決于待治療的對象，包括其年齡、性別、體重和全身健康狀況。就此而言，所給予的活性化合物的精確用量取決于從業(yè)醫(yī)師的判斷。在確定給予治療或預防皰疹病毒感染的活性化合物的有效量時，醫(yī)師或獸醫(yī)應評估與皰疹病毒感染存在相關癥狀的嚴重性，包括上述皰疹病毒感染后遺癥相關癥狀。在任何情況中，本領域技術人員不難確定皰疹病毒感染緩解藥物的合適劑量與合適的治療方案而無需過多實驗。
在特定的實施方案中，在診斷陽性對象存在EHV或其階段后，本發(fā)明可延伸用于治療EHV感染、治療EHV感染復發(fā)或預防對象進一步被EHV感染?？傮w上，治療包括隔離以防進一步感染，姑息劑治療與休息以避免長時期損傷。本發(fā)明在動物是傳染性時可作出更有效的隔離與控制決定，知道這種信息的獸醫(yī)、馬主人與訓練員就能將這些動物隔離直至病毒擴散終止從而防止感染其它馬匹，特別是其它妊娠母馬。相反，現(xiàn)有方法只能在傳染階段經(jīng)過后才能診斷EHV，因此不能用于隔離決定。
為便于理解和實施本發(fā)明，通過以下非限制性實施例描述了特別優(yōu)選的實施方案。
實施例實施例1鑒定皰疹病毒感染的特異性診斷基因實驗性疾病試驗設計在不同時間，在兩組13匹幼駒中誘導馬皰疹病毒1(EHV-1)感染。6匹幼駒跟蹤觀察20天(組1)，在第0天感染(實驗性接種)。7匹幼駒跟蹤觀察42天(組2)，在第21天感染(實驗性接種)。用體外培養(yǎng)的EHV-1鼻咽氣溶膠感染所有幼駒。組1的血液樣品在第0、1、2、4、6、10、13和20天的8個時間點采集。組2的血液樣品在第0、1、2、4、6、10、13、20、21、22、23、25、27、31、34和41天的16個時間點采集。第0天的樣品用作各匹馬的對照。
然后發(fā)現(xiàn)組2的動物已受到EHV的天然且不同步的感染。組2的所有動物血清陽轉，利用血清陽轉時間估算天然感染的時間(約在血清陽轉前10-14天)。由于組2的感染時間不同步，利用這些動物的基因表達數(shù)據(jù)來檢驗利用組1得到的診斷特征。
在所有時間點進行以下檢驗與觀察●體檢，包括體溫、脈搏與呼吸測量●血液學與生物化學(檢驗)●對鼻拭子進行PCR●血清EHV-1抗體(Ab)滴度●對白細胞特異性基因陣列進行基因表達分析。
利用含有馬白細胞所表達的數(shù)千種基因的GeneChipsTM(使用方法詳述于下文“產(chǎn)生基因表達數(shù)據(jù)”)分析取自受感染動物的血液樣品。分析這些數(shù)據(jù)(參見下文“鑒定應答基因與證明診斷潛力”)揭示感染EHV前后與感染后第一天之間動物的許多基因表達有差異?？梢栽O計一種試驗檢測樣品中至少一種，優(yōu)選至少兩種HVI標記基因的RNA水平，所述基因的代表性轉錄序列如下所示1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113。此方法的特異性和靈敏度水平均為94％。或者，至少兩種多核苷酸與表1所列其它61種HVI標記多核苷酸之一的任何組合均具有強有力的診斷能力。
材料與方法采血從馬匹(非激動狀態(tài))采血提取高質量的RNA或蛋白質。收集、保藏、轉運和分離RNA的合適采血試管包括PAXgeneTM試管(PreAnalytix Inc.，Valencia，CA，美國)?；蛘?，可將血液收集入含有設計用于保藏核酸的溶液(購自Roche，Ambion，Invitrogen和ABI)的試管中。為測定蛋白質水平，將50ml血液收集入含有4ml 4％檸檬酸鈉的試管中以防凝結。分離白細胞和血漿，冷凍保藏用于隨后分析與檢測特異性蛋白質。將PAXgene試管保持于室溫，然后提取RNA。以標準格式記錄臨床體征。
Qiagen Inc(Valencia，CA，美國)的試劑盒裝有收集的2.5mL血液的PAXgene血液RNA試管(PAXgene Blood RNA Tube)的和分離總RNA的試劑和使用說明書。分離從離心步驟開始沉淀PAXgene血液RNA試管中的核酸。洗滌沉淀物，重懸，用含有蛋白酶K的優(yōu)化緩沖液培育以消化蛋白質。再次離心除去殘留的細胞碎片，將上清液轉移至新鮮的微離心管中。加入乙醇調節(jié)結合條件，將裂解物施加于PAXgene RNA自旋(spin)柱上。在簡單離心期間，RNA選擇性地與硅膠膜結合，而污染物流出。經(jīng)三次有效洗滌步驟除去殘留的污染物，然后用緩沖液BR5洗脫RNA。
測試前需要用Agilent生物分析儀和分光光度計以吸光度260/280比值定量和定性測定RNA。
DNA提取Qiagen Inc(Valencia，CA，USA)的試劑盒裝有收集的8.5ml血液的PAXgene血液DNA試管(PAXgene Blood DNA Tube)和分離總DNA的試劑和使用說明書。分離開始加入額外的裂解溶液然后離心。洗滌沉淀物、重懸，用含有蛋白酶K的優(yōu)化緩沖液培育以消化蛋白質。乙醇沉淀DNA，再離心一次沉淀核酸。洗滌除去殘留污染物，然后將DNA重懸于緩沖液BG4中。
測試前需要用分光光度計或瓊脂糖凝膠電泳定量和定性測定DNA。
血清抗體測定基本上如Foote等，(Equine Vet J.，36(4)341-345，2004)所述，用重組EHV-1糖蛋白G通過ELISA測定EHV-1的血清抗體水平?？俁NA提取。
產(chǎn)生基因表達數(shù)據(jù)方法選擇可采用各種技術檢測組織樣品中的特異性RNA水平。本領域熟知的兩種常規(guī)且易于使用的技術是采用Affymetrix技術作GeneChipTM分析；實時聚合酶鏈式反應(例如，Applied Biosystems的TaqManTM)。
GeneChipsTM通過檢測與構建在硅基板上的短寡核苷酸雜交的標記cRNA來定量測定RNA。該技術和方法詳見www.affymetrix.com。
實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)利用兩種PCR引物、標記的探針和熱穩(wěn)定DNA聚合酶來定量測定RNA。PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的顏色釋放入溶液，檢測該顏色。常用內部對照，例如18S RNA探針測定樣品中總RNA的起始水平。分別測定各基因與內部對照。該技術和方法詳見www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.com或www.biorad..com。AppliedBiosystems提供以下服務即客戶提供DNA序列信息并負費，作為回饋該公司提供對各基因進行RT-PCR所需的全部試劑。
GeneChipTM分析的優(yōu)點是一次能分析數(shù)千個基因。然而，該分析昂貴且進行一次試驗要3天以上。RT-PCR一般一次只能分析一種基因，但廉價并且能在一天內完成。
如果待分析的具體基因數(shù)目少于20，則RT-PCR是可選的基因表達分析方法。當需要同時分析許多基因時，GeneChipTM或其它基因表達分析技術(例如Illumina珠陣列)是可選的方法。
用于產(chǎn)生和分析GeneChipTM數(shù)據(jù)的方法與實時PCR概述于下文。
產(chǎn)生GeneChipTM數(shù)據(jù)制備cDNA和cRNA從總RNA制備cDNA和cRNA的以下方法采用Affymetrix(www.affymetrix.com)提供和推薦的方法。
步驟是●總共3μg的總RNA用作模板來制備雙鏈cDNA。
●制備cRNA并用生物素化尿嘧啶(dUTP)作標記。
●純化(clean)生物素作標記的cRNA，利用分光光度計和MOPS凝膠分析定量測定。
●將作標記的cRNA片段化為約300bp大小。
●利用Agilent“Lab-on-a-Chip”系統(tǒng)(Agilent Technologies)測定RNA含量。
雜交、洗滌和染色步驟是●制備含有0.05μg/μL作標記和片段化的cRNA、摻雜(spike-in)陽性雜交對照和Affymetrix寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的雜交混合物。
●將終體積(80μL)的雜交混合物加入GeneChipTM藥盒中。
●將該藥盒置于恒定轉速的雜交爐中，16小時。
●去除GeneChipTM中的液體并保存。
●將GeneChipTM置于流體站中。
●將各GeneChipTM的實驗條件記錄為.EXP文件。
●助理人員加入合適的溶液后，Affymetrix流體站執(zhí)行所有的洗滌和染色過程。
●洗滌GeneChipTM，用鏈霉親和素-藻紅蛋白染料染色，然后用低鹽溶液再次洗滌。
●洗滌完成后，用激光“激發(fā)”探針陣列上的染料，用Affymetrix掃描儀(Agilent制造)通過CCD照相機拍攝圖像。
掃描和產(chǎn)生數(shù)據(jù)文件掃描儀和MAS 5軟件產(chǎn)生一個GeneChipTM的圖像文件，稱為.DAT文件(參見背面的圖)。
預處理.DAT文件后進行統(tǒng)計學分析。
數(shù)據(jù)的預處理步驟(在任何統(tǒng)計學分析之前)包括●.DAT文件的質量控制(QC)。
●產(chǎn)生.CEL文件。
●標定(scaling)和標準化。
.DAT文件的質量控制.DAT文件是一種圖像。手工檢查這些圖像的人為因素(artifact)(例如，高/低強度斑點，劃痕，高的局部背景或總背景)。(通過改變產(chǎn)生邊界的強度模式和陣列名稱不難鑒定B2寡核苷酸陣列的雜交性能)。MAS 5軟件利用B2寡核苷酸邊界來比對圖像上的柵格從而可集中和鑒定各方格的寡核苷酸。
利用其它摻雜(spiked)雜交對照(bioB、bioC、bioD和cre)通過讀取隨信號值的增加反映它們相對濃度的“本”基因檢測引入子程序來評估樣品的雜交效率。(如果.DAT文件具有合適的質量，用Affymetrix MAS 5軟件將其轉化為強度數(shù)據(jù)文件(.CEL文件))。
產(chǎn)生.CEL文件用MAS 5軟件從.DAT文件產(chǎn)生的.CEL文件包含該探針組計算的原始強度。從各細胞(測定)值中扣除計算的背景值得到基因表達數(shù)據(jù)。為除去陰性強度值，應用了基于最低2％背景值的標準偏差的局部噪聲值的噪聲校正分式。
將GeneChipTM產(chǎn)生的所有.CEL文件應用于特定的質量度量標準參數(shù)。
一些度量標準由Affymetrix常規(guī)推薦，可用作為GeneChipTM的一部分而提供的Affymetrix內部對照測定。其它度量標準根據(jù)經(jīng)驗和許多GeneChipTM的處理而定。
分析GeneChipTM數(shù)據(jù)可用于數(shù)據(jù)標準化的三種示范性方法是●Affymetrix MAS 5算法。
●Irizarry的可靠多芯片分析(Robust Multi-chip Analysis)(RMA)算法(Irizarray等，2002，Biostatistics(印刷中))。
●可靠多芯片分析保留模型(Robust Multi-chip Analysis Saved model)(RMAS)本領域技術人員應知道可采用許多其它方法而不會對本發(fā)明有實質影響。
Affymetrix MAS 5算法Affymetrix MAS 5軟件利用.CEL文件來標準化或標定數(shù)據(jù)。將一塊芯片的標定數(shù)據(jù)與另一芯片的相似標定數(shù)據(jù)作比較。
對.CEL文件應用MAS 5算法的默認“全球定標(Global Scaling)”選項來實現(xiàn)Affymetrix MAS 5標準化。此法扣除了探針值分布中心的可靠估計值，再除以探針可變性的可靠估計值。這產(chǎn)生了在探針水平具有共同位置和標定的一組芯片。
通過對某給定基因的所有探針對可靠平均化方法得到基因表達指數(shù)。將結果強制為非陰性。
鑒于是在探針水平而不是在基因水平進行標定，故即使標準化后總體基因表達水平在芯片之間也可能存在差異。將標準MAS 5標準化后，根據(jù)芯片強度中值使各基因值去趨勢(de-trend)。即，各基因值根據(jù)芯片強度中值回歸，計算殘差。取這些殘差作為各基因表達去趨勢的估計值。
用Affymetrix MAS5算法計算芯片中值強度，但標定因子固定是一。
RMA分析除了用chip.cel文件的長期文庫建立探針權重和靶分位數(shù)(quantile)，和不對這些特異性芯片再重復計算外，此方法與RMA方法相同。將探針水平再次進行標準化。
產(chǎn)生實時PCR數(shù)據(jù)在例如http//dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html和Bustin SA的綜述(2000，J Mol Endocrinol，25169-193)中可獲得執(zhí)行實時PCR的背景信息。
TaqManTM引物和探針設計指南1.Primer ExpressTM(ABI)軟件設計了解鏈溫度(Tm)為58-60℃的引物和Tm值為10℃以上的探針。兩種引物的Tm應該相同；2.引物應長15-30個堿基；3.G+C含量優(yōu)選30-80％。如果G+C含量較高無法避免，則需要采用高退火和解鏈溫度，用共溶劑，例如甘油、DMSO或7-脫氮雜-dGTP；4.應避免成串的相同核苷酸。這對G而言尤其重要，不可以有4個以上的G串；5.引物3’末端的最后5個核苷酸中G和C的總數(shù)應不超過2個(較新版本的該軟件具有自動執(zhí)行此功能的選項)。這有助于在引物的3’末端引入相對不穩(wěn)定性從而減少非特異性致敏。引物條件與SYBR Green試驗相同；6.最大擴增子的長度不應超過400 bp(優(yōu)選50-150個堿基)。較小的擴增子能得到更一致的結果，因為PCR更有效且對反應條件更耐受要求長度短與5′核酸酶活性的功能無關)；7.該探針不應含有成串的相同核苷酸(特別是4個以上的連續(xù)G)，G+C含量應為30-80％，C應比G多，5′末端不應是G。C的數(shù)量越多，產(chǎn)生的ΔRn越高。應先選擇探針；8.為避免因擴增了cDNA制劑中污染性基因組DNA所致的假陽性，引物宜跨越外顯子-外顯子連接區(qū)。這樣不會擴增基因組DNA(用于人GAPDH擴增的PDAR試劑盒裝有這種引物)；9.如果設計TaqManTM探針來區(qū)別等位基因，錯配的核苷酸(多態(tài)性位點)應在探針中間而不是兩端；10.可利用3’末端附近含有dA核苷酸的引物通過AmpEraseTMUNG有效地降解所產(chǎn)生的任何引物二聚體(見EZ RT-PCR試劑盒手冊的第9頁；P/N 402877)。如果不能選擇在二末端附近含有dA核苷酸的引物，則應考慮利用具有3′末端dU-核苷酸的引物。
(也可參見Invitrogen的《PCR引物設計》(PCR Primer Design)的通用原理)。
通用方法1.用隨機六聚體(不含有寡聚-dT)將總RNA逆轉錄為cDNA。如果不得不用寡聚-dT，則應避免上游有兩千堿基以上的長mRNA轉錄物或擴增子，18S RNA不能用作標準品；2.多重PCR只在對照引物有限時可正確進行(ABI對照試劑不限制它們的引物)；3.靶cDNA用量范圍是10ng-1g。如果用DNA(主要用于等位基因鑒別研究)，最佳用量是100ng-1g；4.最好用不含RNA酶的DNA酶處理各RNA制品以避免基因組DNA污染。即使是最佳的RNA提取方法也會產(chǎn)生一些基因組DNA。當然最好有根本不擴增基因組DNA的引物，但有時這做不到；5.為得到最佳結果，試劑(在制備PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加樣之前)應充分振蕩(vortex)與混合。否則在PCR的早期輪次(0-5)中Rn值可能會有漂移。先將探針加入緩沖液組分使其在室溫下平衡再配制試劑混合物也很重要。
TaqManTM引物和探針定購自ABI的中等規(guī)模(midi-scale)TaqManTM探針收到時是100μM的混懸液。如果制備1/20稀釋液，則得到5μM溶液。此儲備溶液應分為等份、冷凍、閉光保存。在50μL反應體積中其用量為1μL得到推薦的100nM終濃度。
引物收到時是凍干的，含量以pmol標在試管上(例如150.000pmol等于150nmol)。如果將X nmol的引物重懸在XμL水中，得到的溶液是1mM。最好將此儲備液分成等份冷凍。當將1mM儲備液稀釋100倍時，得到的工作溶液是10μM。為使50μL反應體積中的最終引物濃度為推薦的50-900nM，每次反應使用0.25-4.50μL(500nM終濃度用2.5μL)。
PDAR引物和探針以保存于一個試管中的混合物提供。它們在50μL反應體積中用量為2.5μL。
設置一步TaqManTM反應一步實時PCR將RNA(與cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液濃度低則優(yōu)選此方法，但只在進行單重反應時。缺點是RNA遺留物使得酶AmpErase不能用于一步反應。在此方法中，逆轉錄和實時PCR發(fā)生在同一試管中。下游PCR引物也用作逆轉錄酶的引物(隨機六聚體或寡聚-dT不能用于一步RT-PCR中的逆轉錄)。一步反應需要較高的dNTP濃度(大于或等于300mM與200mM)，因為該反應合并了需要dNTP的兩種反應的一種。Gold RT-PCR試劑盒的一步PCR所用的典型反應混合物如下
如果用PDAR，則用2.5μL的引物+探針混合物。
此反應優(yōu)選用10pg-100ng RNA。注意將模板用量從100ng降低至50ng將使CT值增加1。為使CT值降低3，起始的模板用量應增加8倍。ABI宣稱此系統(tǒng)可檢測到2皮克的RNA，RNA的最大用量可以是1微克。為進行常規(guī)分析，可用10pg-100ng的RNA和100pg-1μg基因組DNA。
一步PCR的循環(huán)參數(shù)逆轉錄(MuLV)，48℃30分鐘。
AmpliTaq活化，95℃10分鐘。
PCR95℃變性15秒，60℃退火/延伸1分鐘(重復40次)(在ABI 7700上，最低維持時間是15秒)。
最新介紹的EZ one-stepTMRT-PCR試劑盒可利用UNG，因為利用了熱穩(wěn)定性逆轉錄酶使得逆轉錄的培育時間是60℃。此溫度也是避免在48℃形成引物二聚體和非特異性結合的較好選擇。
操作ABI 7700開始運行前應確認以下事項1.運行的循環(huán)參數(shù)正確；2.光譜補償?shù)倪x擇正確(單重反應選off，多重反應選on)；3.Analysis Options box(分析選項框)(Analysis(分析)/Options(選項))中的“Number of PCR Stages(PCR階段編號)”選擇正確。如果擴增圖中沒有數(shù)據(jù)，但在平面圖中可見，并且擴增(圖)的X-軸顯示范圍0-1輪，則在運行一次后必須手動設定此(參數(shù))。
4.模板對照(Template Control)不如此標記(為精確計算ΔRn)；5.數(shù)據(jù)分析前應正確選擇染料組分；6.你必須在運行開始前給予名稱(不能維持未命名)并保存；7.在運行結束時，先保存數(shù)據(jù)再開始分析；(使用)ABI軟件需要極其謹慎。撳下Run(運行)按鈕后不要試圖停止運行。你有問題并如果需要開關機器時，必須等至少1小時才能重新啟動運行。
當分析數(shù)據(jù)時，記住默認的基線設置是3-15。如果任何CT值＜15，應隨之改變基線(基線停止值應比最小的CT值小1-2)。此問題的有用討論見《ABI基線與閾值設置指南》(ABI Tutorial on Setting Baselines andThresholds)。(令人感興趣的是，此問題的最佳討論見TaqManTM人內源性對照板(Human Endogenous Control Plate)的手冊中)。
如果結果沒有意義，檢查原始光譜看運行期間CDC照相機(是否)可能飽和。利用光學蓋(optical cap)而不是光學粘性罩(optical adhesive cover)可防止CDC照相機飽和。當利用SYBR Green I、多重(反應)和高濃度探針時，更可能發(fā)生(CDC照相機飽和)。
結果解析每次反應結束時，所記錄的熒光強度用于以下計算Rn+是含所有組分時反應的Rn值；Rn-是未反應樣品的Rn值(基線值或NTC中檢測的值)。ΔRn是Rn+與Rn-之間的差異。它是PCR產(chǎn)生的信號數(shù)量級指標。
定量測定模板含量有三種示范性方法1.絕對標準方法在此方法中，用含量已知的標準品，例如體外翻譯的RNA(cRNA)。
2.相對標準方法每次運行的試驗設計中包括已知量的靶核酸；3.比較性CT方法此方法不用含量已知的標準品，而是將靶序列的相對量與選擇的任何參比值作比較，結果相對于參比值(例如靜息淋巴細胞或標準細胞系的表達水平)給出的量。
基因表達相對定量測定的比較性CT方法(ΔΔCT)此方法在觀察相對于活性參比對照物(標準品)的表達水平時無需制作標準曲線即能相對地定量測定模板并提高樣品處理量。為成功實施此方法，應使靶標和參比物的動態(tài)范圍相似。控制此(動態(tài)范圍)的靈敏方法是觀察ΔCT(同一起始模板用量作兩次PCR所得兩個CT值之間的差異)如何隨模板的稀釋度而變化。如果兩種擴增子的效率大致相等，將輸入量的對數(shù)與ΔCT作圖得到接近水平的線(斜率＜0.10)。這表示在起始模板用量范圍內進行的兩次PCR效率相同。如果該圖顯示效率不相等，應采用標準曲線方法來定量測定基因表達。應測定(1)靶標結果的精確最低和最高濃度和(2)兩種基因含量結果的精確最低和最高比例二者的動態(tài)范圍。在常規(guī)競爭性RT-PCR中，該動態(tài)范圍限制在靶標-競爭物比例約為10∶1-1∶10(1∶1的比例可獲得最佳精確性)。實時PCR能實現(xiàn)更廣泛的動態(tài)范圍。
在不同試管中擴增靶標和內源對照物，采用標準曲線方法幾乎不需要優(yōu)化和驗證。采用比較性CT方法的優(yōu)點在于無需制作標準曲線(樣品可利用更多的孔)。該方法也消除了制作標準曲線樣品時可能產(chǎn)生的任何稀釋誤差的負面影響。
只要靶標和標準品具有相似的動態(tài)范圍，比較性CT方法(ΔΔCT方法)是最實用的方法。預計標準品比靶標的表達水平高(因此，CT值較低)。從得到靶標和標準品的CT值間的差異(ΔCT)開始定量計算ΔCT＝CT(靶標)-CT(標準品)計算待定量的各樣品的此值(除非靶標的表達水平高于標準品，此值應為陽性值。如果是陰性也無害)。每次比較應選擇這些樣品之一作為參比品(基線)。比較性ΔΔCT計算包括找到各樣品ΔCT與基線ΔCT之間的差異。如果基線值表示最低表達水平，則預計ΔΔCT值是陰性(因為基線樣品的ΔCT因其具有最大CT值而是最大)。如果一些樣品中表達增加，而另一些中減少，ΔΔCT值將是陰性和陽性數(shù)值的混合值。定量測定的最后一步是將這些數(shù)值轉化為絕對值。此計算公式是比較性表達水平＝2-ΔΔCT就表達而言，與基線水平相比，(樣品)增加約23＝8倍，而降低約為參比品水平的2-3＝1/8。通過簡單地輸入CT值用微軟Excel進行這些計算(ABI在http//www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有關于利用擴展層程序(spread sheet program)來產(chǎn)生擴增圖的在線指南；TaqManTM人內源性對照板(Human Endogenous Control Plate)方法也包括有關用MSExcel進行實時PCR數(shù)據(jù)分析的詳細說明)。
其它(絕對)定量方法概述于ABI用戶公告(http//docs.appliedbiosystems.com/search.taf？_UserReference＝A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5對全面理解實時PCR和定量最有用。
推薦方法1.利用正位置換液管(positive-displacement pipette)以避免移液不精確；2.實時PCR的靈敏度可檢測出2pg總RNA中的靶標。反應所用總RNA的拷貝數(shù)最好應通過25-30輪即足以產(chǎn)生信號(優(yōu)選低于100ng)。為實現(xiàn)此目的應降低或增加用量；3.各試劑的最佳濃度如下；i.氯化鎂的濃度應是4-7mM。對用Primer Express software(引物表達軟件)設計的引物/探針而言最佳是5.5mM；ii.除dUTP外(如果使用的話)，各dNTP的濃度應平衡。用dUTP取代dTTP來控制PCR產(chǎn)物殘留需要dUTP濃度是其它dNTP的兩倍。雖然dNTP濃度的最佳范圍是500μM-1mM(一步RT-PCR)，但典型的TaqMan反應(只是PCR)的各種dNTP采用200μM(400μM的dUTP)；iii.通常向每50μL反應物中加入0.25μL(1.25 U)AmpliTaq DNA聚合酶(5.0U/μL)。這是最低要求。如果需要，可將此量增加0.25U達到最優(yōu)；iv.最佳探針濃度是50-200nM，引物濃度是100-900nM，應對三種不同溫度(TaqMan引物的58、60和62℃)和三種濃度(50、300、900nM)的各種組合優(yōu)化各對引物。這意味著設置了不同的三組(三種溫度)，每組利用固定量的靶模板有九種反應(50/50mM、50/300mM、50/900、300/50、300/300、300/900、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(進行)第二輪優(yōu)化來改善結果。選擇可提供最低CT和最高ΔRn的引物濃度來實現(xiàn)最佳性能。類似地，應將探針濃度優(yōu)化為25-225nM；4.如果用AmpliTaq Gold DNA聚合酶，為實現(xiàn)此目的需要在PCR前于92-95℃加熱9-12分鐘。如果用AmpliTaq Gold DNA聚合酶，不需要在冰上反應。典型的TaqMan反應包括50℃UNG(參見下文)培育2分鐘；95℃活化聚合酶10分鐘；和95℃15秒(變性)40輪與60℃1分鐘(退火與延伸)。如果起始材料是總RNA，在TaqMan反應之前通常應進行逆轉錄循環(huán)，該循環(huán)(cDNA合成)由25℃10分鐘(引物培育)，48℃30分鐘(用常規(guī)逆轉錄酶進行逆轉錄)和95℃5分鐘(滅活逆轉錄酶)；5.向該反應中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)來除去摻入擴增子中的任何尿嘧啶以防殘留PCR產(chǎn)物再擴增。這是PCR反應中為何用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55℃以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的單鏈DNA。除非逆轉錄和PCR采用rTth DNA聚合酶，一步RT-PCR不應使用含UNG的主混合物(TaqMan EZ RT-PCR試劑盒)；6.每塊反應平板中必需包含至少三份非擴增對照(NAC)以及三份非模板對照(NTC)(為在確定的靶標擴增的+/-閾值中達到99.7％可信度水平，必須進行一式六份NTC)。NAC樣板含有樣品，不含酶。需要排除樣品中或熱循環(huán)儀的加熱塊(heating block)中熒光污染物的存在(這些污染物可導致假陽性)。如果PCR后NAC的絕對熒光大于NTC，樣品中或熱循環(huán)儀的加熱塊中可能存在熒光污染物。
7.如果要將ΔΔCT方法用于相對定量測定，應核查引物/探針系統(tǒng)及其標準品的動態(tài)范圍。通過以5種RNA濃度(例如，0.80pg/μL、400pg/μL、2ng/μL和50ng/μL)進行(一式三份)反應來實現(xiàn)此核查。對于相同的總RNA濃度范圍，進行靶標和標準品的實時RT-PCR得到的起始含量的對數(shù)與CT值作圖(標準曲線)應該是(接近)直線；8.被動參比物是加入反應中的染料(ROX)(存在于TaqMan通用PCR主混合物中)。它不參與5’核酸酶反應。它提供了背景發(fā)射熒光的內部參比物?？捎闷鋪順藴驶荏w-染料信號。對孔與孔之間(濃度或體積差異)或隨時間變化發(fā)生的非PCR相關熒光波動進行此標準化，不同于對cDNA用量或PCR效率進行的標準化。將報導染料的發(fā)射光強度除以被動參比物的發(fā)射光強度進行標準化。得到的比值定義為Rn；9.如果進行多重(反應)，更豐富的靶標將在其它靶標得以擴增之前耗盡所有的反應成分。為避免此種情況，對更豐富的靶物質應限制其引物的濃度；10.TaqMan通用PCR主混合物應保存于2-8℃(不是-20℃)；11.用JOE報導染料標記TaqMan Gold RT-PCR試劑盒提供的GAPDH探針，用VIC標記Pre-Developed TaqManTMAssay Reagents(PDAR)試劑盒提供的同一探針。設計的這些人GAPDH試驗的引物不會擴增基因組DNA；12.為防止酶殘留，需要48℃培育的一步RT-PCR法不能利用AmpErase UNG，但EZ RT-PCR試劑盒中可用；13.單重反應只能用一步RT-PCR法，逆轉錄法只能選擇下游引物(不是隨機六聚體或寡聚-dT)；14.優(yōu)選進行一式兩份(反應)來控制移液誤差，但這不可避免會增加成本；15.如果進行多重(反應)，在運行前應核查光譜補償選項(在AdvancedOptions(高級選項)中)；16.利用反應中的被動參比物(ROX)將熒光波動(值)標準化，和用內源性對照物(例如GAPDH，活性參比物)將cDNA/PCR用量的效率標準化是不同的方法；17.ABI 7700不僅可用于定量RT-PCR也可用于終點PCR。后者包括存在/不存在試驗或等位基因鑒別試驗(例如SNP分型)；18.PCR的前幾輪(0-5輪)中Rn值漂移表示反應諸組分最初不平衡，但不影響最終結果，只要重新設置基線范圍的下限值；19.如果注意到擴增圖異常(CT值＜15，在前幾輪中檢測到有擴增信號的輪次)，應降低基線范圍的上限值，應稀釋樣品以提高CT值(污染也可能提高CT值)；20.ΔRn值低(或高于預計的CT值)表明PCR效率不佳或者靶標的拷貝數(shù)低；21.CT值的標準偏差＞0.16表明移液不精確；22.純色彩設置(Pure Dye Setup)中的SYBR綠色條目(SYBR Greenentry)以大寫字母縮寫為“SYBR”。任何其它縮寫或小寫字母會產(chǎn)生問題；23.ABI 7700的SDS軟件與8.1版的Macintosh操作系統(tǒng)有沖突。不應在這種計算機上分析數(shù)據(jù)。
24.ABI 7700不應長期停用。如果將其關閉，在運行前應預熱至少1小時。推薦將儀器隨時開著，這對激光有益。如果運行前剛開機，可能會出現(xiàn)顯示操作系統(tǒng)版本沖突的出錯框。如果發(fā)生此情況，選擇“AutoDownload(自動下載)”選項。
25.ABI 7700只是可購得的實時PCR系統(tǒng)中的一種，其它包括BioRad、Cepheid、Corbett Research、Roche和Stratagene的系統(tǒng)。
基因型分析許多方法可用于分析DNA的基因型。等位基因鑒別方法的綜述見Kristensen等(Biotechniques，30(2)318-322，(2001))。本文只描述了一種方法，等位基因特異性PCR法。
引物設計可利用隨意得到的計算機程序，例如Primer3(http//frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3_code.html)來設計具體等位基因的特異性上游和下游PCR引物。或者，可利用諸如ClustalW(http//www.ebi.ac.uk/clustalw/)程序和針對存在DNA序列差異但保留足夠特異性而能確保擴增正確的擴增子的區(qū)域設計的特異性引物來比對各等位基因的DNA序列。優(yōu)選設計的PCR擴增子在一個等位基因中具有限制性酶切位點，而在其它等位基因中沒有。引物通常長18-25個堿基對，具有相似的解鏈溫度。
PCR擴增對PCR反應組成的描述隨處可見(《PCR的臨床應用》(ClinicalApplications of PCR)，Dennis Lo(編)，Blackwell Publishing，1998)。簡言之，此反應含有引物、DNA、緩沖液和熱穩(wěn)定性聚合酶。反應在熱循環(huán)儀，例如PTC-96V型MJ Research熱循環(huán)儀上，通過變性、雜交和DNA延伸的溫度步驟進行循環(huán)(最多50次)。
DNA分析可用各種方法，包括用質譜、毛細管凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小鑒別來分析PCR產(chǎn)物。如果設計的PCR擴增子含有不同的限制性酶切位點，可用DNA-結合柱或沉淀純化PCR反應中的DNA，用水重懸，然后用合適的限制性酶進行限制性切割。然后將限制性切割的DNA作瓊脂糖凝膠電泳，利用電流對DNA進行大小分離。某基因的各種等位基因根據(jù)是否含有限制性位點而具有不同大小。
實施例2鑒定診斷性標記基因與這些基因的優(yōu)先排序就組1而言，按照Lonnstedt和Speed的經(jīng)驗性Bayes方法(Lonnstedt和Speed，2002，Statistica Sinica，1231-46)分析動物在感染EHV前后基因表達的差異。比較感染后各時間點與感染前時間點進行分析。利用各動物作用的多種術語，臨床狀態(tài)(感染EHV前后)術語，按照各基因擬合為通用線性模型。按照諸基因在各臨床狀態(tài)組之間差異性表達的后時性差異(posterior odds)對它們排序。只記錄統(tǒng)計學顯著改變的那些基因(根據(jù)經(jīng)驗性Bayes縮小標準偏差(shrunken standard deviation)用t統(tǒng)計來評估)。利用p值的Holm校正(Holm，S.，1979，Scandinavian Journal of Statistics，665-70)維持對1型誤差率強有力控制。在感染后的每天將EHV感染前后顯示統(tǒng)計學有顯著差異的基因列成表格。
此外，將臨床受影響的動物(證實有EHV感染的臨床體征)與健康動物作比較；將視作具有“活動性病毒感染”的動物與健康動物(“活動性病毒感染”的動物通常包括在已知EHV感染后的大約7天時期)作比較進行分析。
表5顯示了在這些分析后根據(jù)p值排序差異顯著的基因。此分析再次根據(jù)經(jīng)Holm方法校正了p值的兩組比較。這些表格中的“效果大小(effectsize)”(M)代表對數(shù)值，表明與對照相比基因表達改變的倍數(shù)。負值代表下調而正值代表上調。t統(tǒng)計與p值是本文所述的有意義值。B統(tǒng)計是差別表達的Bayesian后時性對數(shù)差異(Bayesian posterior log odds of differentialexpression)。
表6顯示了在這些分析后根據(jù)T值排序差異顯著的基因。標記表明哪種基因上調與哪種基因下調(負或正“差異”與t值)，“差異”表明反應的幅度。此分析再次根據(jù)經(jīng)Holm方法校正p值的兩組比較。
實施例3
證明對測定皰疹病毒感染具有診斷潛力根據(jù)基因表達計算的主要組分評分(Jolliffe，I.T.，《主要組分分析》(Principal components analysis)，Springer-Verlag，1986)采用辨別分析(Venables和Ripley，2002，《統(tǒng)計學在S中的現(xiàn)代應用》(Modern AppliedStatistics in S)，Springer)評估了感染后各時間點的整組基因的診斷潛力。整個方法經(jīng)交叉驗證。每次去除(drop)一只動物進行交叉驗證(而不是一次觀察)。靈敏度和特異性經(jīng)計算均為優(yōu)先級(uniform prior)。這可解釋為一種形式的縮小調節(jié)，將這些估算值縮小到減小的范圍(reduced space)內。
利用交叉驗證的辯別函數(shù)評分(discriminant function scores)來估計接收器操作曲線。將關鍵閾值沿著判別函數(shù)評分的軸移動來計算接收器操作曲線。計算兩種原始檢驗性ROC，采用Lloyd的方法校平ROC(Lloyd C.J.，1998，Journal of the American Statistical Association，931356-1364)。計算的曲線用于臨床陰性和臨床陽性動物的比較。利用感染后每天的基因表達計算不同曲線。采用梯形規(guī)則，計算接收器操作曲線下面積，應用于經(jīng)驗性ROC與校平的ROC。
可用ROC總結某試驗的診斷潛力。完美的診斷試驗的ROC是一條通過靈敏度與特異性均等于1的點的水平線。這種完美診斷(試驗)的ROC下面積是1。無用的診斷試驗的ROC是一條通過原點的45度線。這種無信息診斷(試驗)的面積是0.5。
表8顯示了組1各幼駒感染后第2、4、13和20天取得的樣品的靈敏度、選擇性和ROC下面積。從這些結果可知，有證據(jù)表明感染后第2和4天的診斷潛力強，而很少有證據(jù)表明在第13或第20天有診斷潛力。
此外，在組1幼駒有癥狀與無癥狀時間點相對應的感染后第0、13和20天時期與感染后第2、4和6天之間作比較。圖1顯示用于比較的ROC。ROC比較的靈敏度與特異性分別是1與0.867。經(jīng)驗與校平ROC下的面積分別是0.892與0.952。這些(結果)為對應于有癥狀EHV感染的差異性基因表達提供了強有力證據(jù)。
此外，利用臨床感染動物的所選擇基因得到ROC曲線(圖2)。利用基因表達標記的此檢驗靈敏度和特異性均優(yōu)秀。
此外，利用有活動性病毒感染動物的所選擇基因得到ROC曲線(圖3)。利用基因表達標記的此檢驗的靈敏度和特異性均優(yōu)秀。
此外，利用臨床感染動物的所有基因得到ROC曲線(圖4)。利用基因表達標記的此檢驗的靈敏度和特異性均優(yōu)良。
此外，利用有活動性病毒感染動物的所有基因得到ROC曲線(圖5)。利用基因表達標記的檢驗的靈敏度和特異性均優(yōu)良。
根據(jù)芯片上整組基因的縮小估計值，以此方式計算的接收器操作曲線是保守的，即，它們傾向于低估診斷潛力。根據(jù)所選擇的基因亞組在操作性診斷中應能獲得更好的診斷性能。
表7給出了組1幼駒在第2、4、6、13和20天與第0天相比的血液學與生物化學結果，臨床參數(shù)(心率(HR)與呼吸率(RR))與這些參數(shù)的統(tǒng)計學顯著性。除了PCV(壓積細胞體積)外的所有檢測值均有統(tǒng)計學顯著性，這些檢測值最可能反映了皰疹病毒感染的相關變化。然而，這些變化是非特異性的，也可能與許多其它病癥有關。組2幼駒的這些參數(shù)未提供相似結果，它們沒有顯著性差異，經(jīng)管事實上雖然這些幼駒受到亞臨床感染。
圖6是組1幼駒的基因表達指數(shù)(Log強度單位)、血清EHV Ab水平(450nm吸光度)、日期、天數(shù)(D＝天)、臨床體征的圖。組1幼駒于2003年3月18日接種(實驗性感染)?；虮磉_指數(shù)的變化與臨床體征的存在相對應，比血清抗-EHV-1抗體的出現(xiàn)早10-14天。這可能在出現(xiàn)臨床體征期間，比抗體檢驗早10-14天診斷皰疹病毒感染對治療和控制特別有實際意義。例如，目前的藥物就是在此期間最有效，而對許多皰疹病毒感染而言，動物也在此期間最具傳染性。
圖7包括利用組1幼駒所有基因的前4種主要組分基因表達的圖。各組分按照接種后的天數(shù)作圖。從這些圖中明顯可知基因表達的主要變化發(fā)生在接種皰疹病毒后的10天期間。此期間也與臨床體征的存在相對應(參見圖2)。
由于組2幼駒在不同時間點經(jīng)歷不受控制的天然感染，用組1幼駒的數(shù)據(jù)為基礎對各樣品的基因表達分類(classifier)進行訓練來預測組2幼駒的EHV感染狀態(tài)。此預測包括預測的最大后時性概率(posterior probability)與預測的鑒別函數(shù)評分(其是樣品各基因的線性組合)。表9顯示了預測的類型(EHV感染陽性和陰性)與鑒別評分。
利用血清EHV-1Ab結果，確定4只幼駒(360、364、368和369見表9)均可能在-4天受到天然感染(即實驗開始(第0天)前4天)。在這些動物中，幼駒364和368分別在第0和第2天與第2天出現(xiàn)臨床體征。當我們利用此基因方法分類時，值得注意的是在第0和第4天之間的某些天或所有4天這些幼駒各自確定受EHV-1感染。這表明此EHV-1基因特征可以是EHV-1的診斷(指標)，而不論動物是否顯示臨床體征。利用血清EHV-1Ab結果，確定幼駒362在-1天受到天然感染，這意味著應能在第-1天和第6天間任何時刻檢測到特征。利用此基因分類方法，在第0、2和6天此幼駒中均觀察到陽性結果(意味著“受感染”)。但此動物沒有出現(xiàn)臨床體征。根據(jù)血清EHV-1Ab結果，幼駒375在第6天左右診斷受感染。在第2、4和6天觀察到陽性分類結果，但也沒有出現(xiàn)臨床體征。利用血清EHV-1Ab結果，直至第14天仍不能確定幼駒366受到天然感染，這意味著血清陽轉將發(fā)生在第27或28天。應注意試驗2的動物在第21天均受攻擊(challenged)。因此，此幼駒在第21天是血清陰性。除了在第23天有輕微臨床體征外，幼駒366未產(chǎn)生任何臨床體征。這些結果表明血清Ab水平(體液免疫力)在實驗攻擊之時(第21天)幾乎足以保護動物而不會產(chǎn)生臨床疾病的明顯體征。因此，當在實驗性接種后的時期應用此基因表達分類方法時我們未觀察到任何陽性結果。
因此，當組2幼駒顯示出組1幼駒得到的初步分類指征即使在有或沒有臨床體征(或血液學與生物化學的任何顯著改變)存在下均可鑒定EHV-1早期天然感染。
實施例4具有預測性能的各組基因雖然鑒定到約63種具有診斷潛力的基因，但通?？山邮艿脑\斷性能只需要很少數(shù)目的基因。
表10顯示根據(jù)選自具有診斷潛力基因的組中兩種基因的線性鑒別分析獲得的交叉驗證分類結果、靈敏度和特異性。提出的諸對基因是能產(chǎn)生最高預測結果的基因，許多其它基因對產(chǎn)生可接受的分類結果。本領域技術人員不難鑒定其它基因對。鑒定基因對的技術包括(但不限于)正向可變性選擇(Venables W.N.和Ripley B.D.，《統(tǒng)計學在S中的現(xiàn)代應用》(ModernApplied Statistics in S)，第四版，2002.，Springer)、最佳亞組選擇、反向(backward)消除(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)選擇(Venables W.N.和Ripley B.D.，2002，同上)和隨機可變消除(FigueradoM.A.，《監(jiān)督學習的適應性稀疏》(Adaptive Sparseness for SupervisedLearning))。
表11顯示根據(jù)選自診斷組三種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組三種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)三種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表12顯示根據(jù)選自診斷組四種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組四種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)三種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表13顯示根據(jù)選自診斷組五種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組五種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)五種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表14顯示根據(jù)選自診斷組六種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組六種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)六種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表15顯示根據(jù)選自診斷組七種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組七種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)七種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表16顯示根據(jù)選自診斷組八種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組八種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)八種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表17顯示根據(jù)選自診斷組九種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組九種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)八種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表18顯示根據(jù)選自診斷組十種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組十種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)十種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表19顯示根據(jù)選自診斷組二十種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組二十種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)二十種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
表20顯示根據(jù)選自診斷組三十種基因進行線性鑒別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組二十種基因。本領域技術人員不難明白可根據(jù)二十種HVI標記基因作出其它合適的診斷選擇。
其它基因可能通過過度擬合(over-fitting)引入噪聲(隨之降低交叉驗證的靈敏度與特異性)。
實施例5特異性的證實通過只根據(jù)試驗數(shù)據(jù)進行訓練分類和對超過850個GeneChipTM的大基因表達數(shù)據(jù)集運行此分類，檢驗了所述皰疹病毒標記的特異性。該數(shù)據(jù)庫中的基因表達結果得自患各種疾病與病癥的馬樣品，所述疾病與病癥包括臨床誘導的急性與慢性EPM、皰疹病毒感染、退變性骨關節(jié)炎、應激、紅球菌感染、內毒素血癥(endotoxaemia)、蹄葉炎、胃潰瘍綜合征、運動訓練的動物與臨床正常的動物。
得到了兩種分類結果。二者依據(jù)活動性病毒感染的與臨床正常的馬匹的比較。前者利用了GeneChipTM上的所有基因。后者只利用了表1所列的那些基因。后者的標記能夠鑒定所有已知EHV-感染的動物。也鑒定出25匹未知EHV狀態(tài)的其它馬匹，包括作為另一臨床試驗一部分的處于應激下的動物，具有紅球菌馬感染相關的已知肺部病損的5匹幼駒。
利用此方法與63種基因的基因標記，從850個以上的一群樣品中檢測到皰疹病毒感染的特異性為95％，靈敏度為100％。
實施例7基因本體為根據(jù)功能、代謝過程或細胞組分對基因分組，采用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D.J.，(1990)，“局部序列比對基本檢索工具”(Basic local alignment search tool)，J.Mol.Biol.，215403-410)將基因序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫作比較，進行基因同源性和基因本體檢索。根據(jù)這些標準，表21列出了這些基因的分組。某些情況沒有可利用的信息(NA)。也參見含有各基因的序列信息的表1。
本文引用的每篇專利、專利申請和出版物的內容全文納入本文作為參考。
本文所引用的任何參考文獻不應理解為承認該參考文獻是本申請可利的“現(xiàn)有技術”。
整篇說明書的目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案而不是將本發(fā)明限制于某一實施方案或特征的特定組合。本領域技術人員應知道鑒于本文內容可對示范的具體實施方案作出各種改進與改變而不脫離本發(fā)明的范圍。所有這種改進與改變要包括在附加的權利要求書的范圍內。
表1
表2
表3氨基酸亞類
表4示范性與優(yōu)選的氨基酸取代
表5根據(jù)P值的基因排序
表6根據(jù)T值的基因排序
表7EHV-1組1臨床與血液學參數(shù)的平均值
HR＝心率，RR＝呼吸率，Temp＝直腸溫度，PCV＝壓積細胞體積(血液)，TSP＝血清總蛋白，F(xiàn)ib＝血纖蛋白原，WCC＝-白細胞計數(shù)，Neut＝嗜中性白細胞，Lymphs＝淋巴細胞。
表8
表9組2幼駒各樣品的預測類別與鑒別評分
表10選擇的兩種基因
表11選擇3種基因
表12選擇4種基因
表13選擇5種基因
表14選擇6種基因
表15選擇7種基因
表16選擇8種基因
表17選擇9種基因
表18選擇10種基因
表19選擇20種基因
表20所選擇30種基因
表21基因本體
權利要求
1.一種診斷測試對象中皰疹病毒感染的存在的方法，所述方法包括檢測測試對象中至少一種選自以下的、在免疫系統(tǒng)細胞內表達的皰疹病毒感染(HVI)標記基因的異常表達(a)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有與以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼與以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連的氨基酸殘基；和(d)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的HVI標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的HVI標記多肽的異常表達(i)含有與以下任一序列至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(ii)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少5個毗連氨基酸殘基；(iii)所含氨基酸序列與以下任一序列的至少15個毗連氨基酸殘基至少有30％相似性的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；和(iv)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少5個毗連氨基酸殘基，并且與能和(i)、(ii)或(iii)所述序列發(fā)生免疫相互作用的抗原結合分子發(fā)生免疫相互作用。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，通過以下步驟檢測所述異常表達(1)檢測獲自測試對象的生物學樣品中至少一種HVI標記基因表達產(chǎn)物的水平或功能活性，和(2)將所檢測到的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性與一位或多位正常對象或一位或多位無皰疹病毒感染的對象的參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性相比，該生物學樣品中表達產(chǎn)物的水平或功能活性有差異表明測試對象中存在皰疹病毒感染。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性比該相應表達產(chǎn)物或各相應表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性高10％時，診斷該測試對象中有皰疹病毒感染存在、階段或程度。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，通過檢測至少一種選自以下的HVI標記多核苷酸的水平或功能活性的增加來確定皰疹病毒感染的存在(a)含有與以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、2、4、8、12、13、15、17、21、23、26、27、31、39、43、45、47、49、51、55、59、67、69、71、75、76、79、81、85、87、91、98、99109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、14、16、18、22、28、32、40、44、46、48、50、52、56、60、68、70、72、80、82、86、88、92、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性比該相應表達產(chǎn)物或各相應表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性低10％時，診斷該測試對象中有皰疹病毒感染存在、階段或程度。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，通過檢測至少一種選自以下的HVI標記多核苷酸的水平或功能活性的降低來確定皰疹病毒感染的存在(a)含有與以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO6、10、19、24、25、29、33、34、35、37、38、41、53、57、61、63、65、66、73、77、83、89、93、94、96、100、101、102、104、106、107或108，，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105；(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO11、20、30、36、42、54、58、62、64、74、78、90、95、97、103或105，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
9.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括當該表達產(chǎn)物或各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性與該相應表達產(chǎn)物或各相應表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性相同或相似時，診斷該測試對象中不存在皰疹病毒感染。
10.如權利要求4所述的方法，其特征在于，各表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性與各相應表達產(chǎn)物檢測到的水平或功能活性的差異不超過約5％。
11.如權利要求4所述的方法，其特征在于，還包括檢測至少約兩種HVI標記基因的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性。
12.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的至少一種一級相關HVI標記基因的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ IDNO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25或26，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20或22；(c)含有編碼與以下序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20或22，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
13.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的至少一種二級相關HVI標記基因的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61或63，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62或64，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
14.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的至少一種三級相關HVI標記基因的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85或87，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO68、70、72、74、78、80、82、86或88；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO68、70、72、74、78、80、82、86或88，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
15.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包括檢測選自以下的至少一種四級相關HVI標記基因的各表達產(chǎn)物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列具有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連氨基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
16.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品包括血液。
17.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品包括外周血。
18.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述生物學樣品包括白細胞。
19.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物是RNA分子。
20.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物是多肽。
21.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物與所述相應的表達產(chǎn)物相同。
22.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物是所述相應表達產(chǎn)物的變體。
23.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物或相應表達產(chǎn)物是靶RNA或該靶RNA的DNA拷貝，其水平可用至少在低嚴謹性條件下與該靶RNA或該DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測，該核酸探針至少含有某HVI標記基因的15個毗連核苷酸。
24.如權利要求23所述的方法，其特征在于，將所述靶RNA或其DNA拷貝所檢測到的水平或豐度按存在于同一樣品中的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標準化。
25.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸探針固定在固體或半固體支持物上。
26.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述核酸探針構成諸核酸探針空間陣列的一部分。
27.如權利要求23所述的方法，其特征在于，通過雜交檢測與所述靶RNA或所述DNA拷貝結合的核酸探針的水平。
28.如權利要求23所述的方法，其特征在于，通過核酸擴增檢測與所述靶RNA或所述DNA拷貝結合的核酸探針的水平。
29.如權利要求23所述的方法，其特征在于，通過核酸酶保護試驗檢測與所述靶RNA或所述DNA拷貝結合的核酸探針的水平。
30.如權利要求23所述的方法，其特征在于，用于檢測HVI標記多核苷酸的探針含有如SEQ ID NO145-2150任何一種所示的序列。
31.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物或相應表達產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用與所述靶多肽免疫相互作用的至少一種抗原結合分子檢測。
32.如權利要求23所述的方法，其特征在于，將所述靶多肽檢測到的水平按存在于同一樣品中的參比多肽的水平標準化。
33.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗原結合分子固定在固體或半固體支持物上。
34.如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述抗原結合分子形成抗原結合分子空間陣列的一部分。
35.如權利要求23所述的方法，其特征在于，通過免疫測定檢測與所述靶多肽結合的抗原結合分子的水平。
36.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述表達產(chǎn)物或相應表達產(chǎn)物是靶多肽，其水平可用與所述靶多肽反應產(chǎn)生反應產(chǎn)物的至少一種底物來檢測。
37.如權利要求36所述的方法，其特征在于，將所述靶多肽檢測到的功能活性按存在于同一樣品中的參比多肽的功能活性標準化。
38.如權利要求4所述的方法，其特征在于，利用包括至少一個與基站相連接的終端站的系統(tǒng)來執(zhí)行所述方法，其中所述基站(a)通過通信網(wǎng)絡從所述終端站接受所述數(shù)據(jù)，其中所述數(shù)據(jù)代表對應于生物學樣品中至少一種表達產(chǎn)物所檢測到或標準化的水平或功能活性的參數(shù)值，和(b)將所述數(shù)據(jù)與代表參比樣品中至少一種相應表達產(chǎn)物所檢測到的或標準化的水平或功能活性的預先確定數(shù)據(jù)作比較，從而測定與參比樣品中相應表達產(chǎn)物的水平或功能活性相比，此生物學樣品中表達產(chǎn)物的水平或功能活性的任何差異。
39.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述基站可提供皰疹病毒感染存在、不存在或程度的診斷。
40.如權利要求38所述的方法，其特征在于，所述基站還可通過通信網(wǎng)絡將診斷指征傳遞至所述終端站。
41.如權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測到所述異常表達表明有皰疹病毒感染存在或風險。
42.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測試對象是馬。
43.一種治療、預防或抑制對象發(fā)生皰疹病毒感染的方法，該方法包括檢測對象中至少一種HVI標記基因的異常表達，并給予所述對象有效量的治療或緩解癥狀或逆轉或抑制所述對象發(fā)生皰疹病毒感染的藥物，其中，HVI標記基因在免疫系統(tǒng)的細胞中表達并選自下組(a)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有與以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有編碼與以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連的氨基酸殘基；和(d)一種基因，其多核苷酸表達產(chǎn)物含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列。
44.一種分離的HVI標記多核苷酸，其選自(a)含有與以下任一序列至少有50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列；(b)含有包含以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列，其中所述部分含有該序列或互補序列的至少15個毗連核苷酸；(c)至少能在低嚴謹性條件下與(a)或(b)所述序列或其互補序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQ ID NO1、12、23、24、25、26、33、34、37、38、65、66、75、76、83、84、93、98、99、100、101、106、107或108，或其互補序列，其中所述部分含有該序列或互補序列的至少15個毗連核苷酸并至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)或(c)所述序列或其互補序列雜交。
45.一種含有操作性連接于調節(jié)元件的權利要求44所述HVI標記多核苷酸的核酸構建物，所述調節(jié)元件在宿主細胞中可操作。
46.一種分離的宿主細胞，其含有如權利要求45所述的核酸構建物。
47.一種含有至少在低嚴謹性條件下與權利要求44所述多核苷酸雜交的核苷酸序列的探針。
48.如權利要求47所述的探針，其特征在于，所述探針基本上由對應于編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分或與其互補的核酸序列構成SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少長15個核苷酸。
49.如權利要求47所述的探針，其特征在于，所述探針包含能與編碼以下任一氨基酸序列的核苷酸序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分至少長15個核苷酸。
50.如權利要求47所述的探針，其特征在于，所述探針含有至少能在低嚴謹性條件下與以下序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，其中所述部分至少長15個核苷酸。
51.如權利要求47所述的探針，其特征在于，所述探針包含SEQ ID NO145-2150中任一所示的序列。
52.一種固體或半固體支持物，其包含至少一種固定于其上的如權利要求47所述的探針。
53.如權利要求44所述的一種或多種HVI標記多核苷酸，或如權利要求47所述的一種或多種探針，或選自以下的一種或多種HVI標記多肽，或者可與這些HVI標記多肽免疫相互作用的一種或多種抗原結合分子在制備診斷對象中存在皰疹病毒感染的試劑盒中的應用(i)含有與以下任一序列至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(ii)含有與HVI標記基因的多肽表達產(chǎn)物至少有50％序列相似性的氨基酸序列的多肽，所述多肽表達產(chǎn)物含有以下任一序列SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(iii)以上(i)或(ii)所述多肽的一部分，其中所述部分包含該多肽的至少5個毗連氨基酸殘基；(iv)含有與(i)或(ii)所述多肽的至少15個毗連氨基酸殘基至少具有30％相似性的氨基酸序列的多肽；與(iv)含有(i)或(ii)所述多肽的一部分的多肽，其中所述部分含有(i)或(ii)所述多肽的至少5個毗連氨基酸殘基并能與和(i)、(ii)或(iii)所述序列免疫相互作用的抗原結合分子發(fā)生免疫相互作用。
54.一種診斷測試對象存在皰疹病毒感染的方法，其包括檢測測試對象的免疫系統(tǒng)細胞中選自以下的至少一種HVI標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列有至少50％序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO1、2、4、6、7、8、10、12、13、15、17、19、21、23、24、25、26、27、29、31、33、34、35、37、38、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、66、67、69、71、73、75、76、77、79、81、83、84、85、87、89、91、93、94、96、98、99、100、101、102、104、106、107、108、109、111或113，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQ ID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114；(c)含有編碼與以下任一序列的至少一部分有至少50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQID NO3、5、9、11、14、16、18、20、22、28、30、32、36、40、42、44、46、48、50、52、56、58、60、62、64、68、70、72、74、78、80、82、86、88、90、92、95、97、103、105、110、112或114，其中所述部分含有該序列的至少15個毗連的氨基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)所述序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開的疾病相關分子與試驗可用于診斷與評估受皰疹病毒感染的動物，測定處于發(fā)生皰疹病毒感染或其后遺癥風險中的動物。本發(fā)明可實際應用于該疾病的早期診斷、監(jiān)測動物對該疾病的免疫反應并能為受臨床和亞臨床影響的動物作出更好的治療和處理決定。
文檔編號C12Q1/68GK101065502SQ200580032315
公開日2007年10月31日 申請日期2005年8月15日 優(yōu)先權日2004年8月13日
發(fā)明者R·B·布蘭登, M·R·托馬斯 申請人:阿什洛米克斯控股有限公司