專利名稱：：一種抗豬瘟多表位dna疫苗及構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及一種由編碼tPA信號(hào)肽核苷酸序列、編碼豬瘟病毒石門株E2和Erns蛋白抗原表位區(qū)核苷酸序列、抗原表位之間的連接序列和真核表達(dá)載體pVAXl構(gòu)成的抗豬瘟多表位DNA疫苗，同時(shí)涉及抗豬瘟多表位DNA疫苗的構(gòu)建方法，還涉及抗豬瘟多表位DNA疫苗在作為制備治療或預(yù)防豬瘟藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬瘟(ClassicalSwineFever，CSF)是由豬瘟病毒(ClassicalSwineFeverVirus,CSFV)引起的、豬的一種高度致死性烈性傳染病，呈世界性分布，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重危害，經(jīng)濟(jì)損失巨大。國際獸醫(yī)局(OIE)制定的《國際動(dòng)物衛(wèi)生法典》中，豬瘟被列入必須報(bào)告的法定傳染病之一。我國也將豬瘟作為I類動(dòng)物疫病加以重點(diǎn)控制。自50年代以來，我國自行研制的豬瘟兔化弱毒疫苗("C"株)的廣泛應(yīng)用，在控制豬瘟大流行中發(fā)揮了重要作用。然而，豬瘟兔化弱毒疫苗五十多年的長期使用，并未能有效控制豬瘟的發(fā)生和傳播。近年來，我國的豬瘟發(fā)生呈明顯上升態(tài)勢(shì)，并出現(xiàn)諸^散發(fā)流行、慢性豬瘟、持續(xù)感染和妊娠母豬帶毒綜合征等許多新特點(diǎn)。病毒逃避機(jī)體的免疫清除和在豬體內(nèi)局部的持續(xù)存留，疫苗制品質(zhì)量問題，運(yùn)輸和保存不當(dāng)導(dǎo)致疫苗效力降低或失效，以及疫苗株毒力返強(qiáng)的回復(fù)突變等是其主要原因。在美國，通過實(shí)施對(duì)自然感染豬的診斷、撲殺等根除措施，已于1976年消滅了豬瘟；歐共體國家(EC)執(zhí)行統(tǒng)一的豬瘟撲滅計(jì)劃，為根除豬瘟，明確禁止使用豬瘟弱毒活疫苗接種；我國是農(nóng)業(yè)大國，養(yǎng)豬業(yè)是廣大農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的支柱產(chǎn)業(yè)之一。近年來因傳染病死亡生豬占養(yǎng)豬總數(shù)的8%—10%，其中1/3由豬瘟所致。豬瘟的發(fā)生和流行，是制約農(nóng)村養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的瓶頸，更是限制我國生豬和肉制品出口的主要原因之一。為滿足我國對(duì)豬瘟預(yù)防、控制和最終根除的需要，研制新一代抗豬瘟疫苗制品以替代傳統(tǒng)的豬瘟兔化弱毒疫苗，勢(shì)在必行。近年來發(fā)展起來的DNA疫苗，被譽(yù)為第三次疫苗革命。DNA疫苗新技術(shù)的核心是將編碼病原體保護(hù)性抗原的核酸序列組裝到含有必要表達(dá)調(diào)控元件的真核表達(dá)載體中，然后用其直接注射接種動(dòng)物，利用動(dòng)物細(xì)胞的酶系合成DNA疫苗編碼的保護(hù)性抗原蛋白，經(jīng)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抗原加工和遞呈，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)該病原體的特異性免疫應(yīng)答。編碼病毒抗原基因的DNA疫苗接種既能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病毒抗體，阻止病毒感染發(fā)生，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒效應(yīng)(CTL)，清除機(jī)體內(nèi)病毒感染細(xì)胞。與常規(guī)的減毒活苗疫苗或滅活疫苗相比，DNA疫苗具有以下特點(diǎn)l)只含有部分病毒基因組序列，不會(huì)因病毒毒力回復(fù)或滅活失敗而導(dǎo)致疫苗病例；安全性類似滅活疫苗；2)抗原在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，模擬了病毒感染后的抗原合成和遞呈過程，可同時(shí)誘導(dǎo)抗原特異的體液和細(xì)胞免疫，保護(hù)效力類似于減毒活疫苗；3)通過特定抗體或病毒基因組核酸檢測(cè)區(qū)分病毒自然感染和疫苗接種豬，是一種標(biāo)記疫苗；4)安全穩(wěn)定，無毒副作用；5)發(fā)酵、純化等生產(chǎn)工藝簡單，大規(guī)模制備成本很低；6)儲(chǔ)存運(yùn)輸簡單，儲(chǔ)存時(shí)間長，無需冷鏈。CSFV是基因組約12.3kb的正鏈RNA病毒，基因組編碼一個(gè)3898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，經(jīng)病毒和/或宿主細(xì)胞編碼的酶加工成12種成熟的病毒蛋白。研究證實(shí)，CSFV編碼的12種蛋白中，囊膜糖蛋白E2和E"^是主要的保護(hù)性抗原。目前己有構(gòu)建CSFVE2單基因DNA疫苗的報(bào)道(余興隆等，2000，Llilianne,2005)，但這種基于E2基因構(gòu)建的DNA疫苗在豬體的免疫保護(hù)效力需要改進(jìn)。CSFV是基因組約12.3kb的正鏈RNA病毒，基因組編碼一個(gè)3898個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白，經(jīng)病毒和/或宿主細(xì)胞編碼的酶加工成12種成熟的病毒蛋白。研究證實(shí)，CSFV'編碼的12種蛋白中，囊膜糖蛋白E2和E皿是主要的保護(hù)性抗原。目前己有構(gòu)建CSFVE2單基因DNA疫苗的報(bào)道(余興隆等，2000，Llilianne,2005)，但這種基于E2基因構(gòu)建的DNA疫苗在豬體的免疫保護(hù)效力需要改進(jìn)。本發(fā)明在分析CSFV石門株的E2和Efns抗原結(jié)構(gòu)和表位序列的基礎(chǔ)上，借鑒國內(nèi)外CSFV分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究的最新成果，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，構(gòu)建并篩選出由編碼tPA信號(hào)肽、E2和E皿抗原表位、以及兩者之間加入柔性肽連接序列構(gòu)成的、安全、有效的抗豬瘟多表位DNA疫苗。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于與已報(bào)道的CSFVE2DNA疫苗相比較，抗豬瘟多表位DNA疫苗包含CSFV囊膜E2和Ems的保護(hù)性抗原區(qū)域并將兩者融合，增加了免疫保護(hù)性抗原表位；多表位疫苗能有效的應(yīng)對(duì)病毒的變異和免疫反應(yīng)中的某些不利因素；多表位疫苗通過串聯(lián)不同抗原表位，可以選擇誘導(dǎo)的免疫方式及提高免疫效果；通過引入tPA信號(hào)肽，增加了保護(hù)性抗原的表達(dá)量和分泌特性。該新型疫苗免疫接種能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著提高了疫苗的抗豬瘟效果，使其更具開發(fā)價(jià)值，可用于替代現(xiàn)行使用的豬瘟兔化弱毒疫苗，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗豬瘟多表位DNA疫苗，該疫苗成本低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不需要冷鏈運(yùn)輸和低溫保存、儲(chǔ)存期長、安全有效等特點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種抗豬瘟多表位DNA疫苗構(gòu)建方法。該疫苗具有制備簡單，操作簡便。.本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種抗豬瘟多表位DNA疫苗在作為制備治療或預(yù)防豬瘟藥物中控制和根除的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種新型抗豬瘟多表位DNA疫苗，由編碼tPA信號(hào)肽核苷酸序列、E2核苷酸序列和E""s抗原表位核苷酸序列、真核表達(dá)載體pVAXl、以及兩兩之間柔性肽連接序列構(gòu)成，其特征在于編碼E2抗原區(qū)核苷酸序列位于豬瘟病毒基因組全長cDNA中第2371至2922位核苷酸，編碼Erns抗原區(qū)核苷酸序列位于豬瘟病毒基因組全長cDNA中第1297-1764位核苷酸。DNA疫苗質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)見圖1。一種新型抗豬瘟多表位DNA疫苗，其特征是由tPA信號(hào)肽、E2抗原基因片段和E"^抗原基因片段構(gòu)成的完整DNA疫苗核苷酸序列，具有SEQIDNO.10所示核苷酸序列。一種新型抗豬瘟多表位DNA疫苗，其特征是由tPA信號(hào)肽、E2抗原基因片段和E""s抗原基因片段構(gòu)成的完整DNA疫苗核苷酸編碼的氨基酸序列，氨基酸序列具有SEQIDNO.ll所示氨基酸序列。一種新型抗豬瘟多表位DNA疫苗，其特征是EscherichiacoliDH5a(ptPAs/AE2/AEms)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，M208254,保藏日期2008年12月15日，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)。一種新型抗豬瘟多表位DNA疫苗，其特征是抗豬瘟多表位DNA疫苗作為制備治療或預(yù)防豬瘟的藥物在控制和根除中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的抗豬瘟多表位DNA疫苗，由編碼tPA信號(hào)肽、豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2、Ems的抗原決定簇及兩者之間由甘氨酸構(gòu)成的柔性連接肽的核苷酸序列、以及真核表達(dá)載體pVAXl構(gòu)成，其特征在于所述抗豬瘟多表位DNA疫苗包含囊膜糖蛋白E2、E"^主要抗原決定簇和tPA信號(hào)肽編碼序列(SEQIDNO.9)(序列的獲得詳見具體實(shí)施例1)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種構(gòu)建的DNA融合分子，它包括編碼具有豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2和E""抗原區(qū)多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列分別為豬瘟病毒基因組中第2371至2922位核苷酸序列(SEQIDN0.7)和從豬瘟病毒基因組中第1297至1764位核苷酸序列(SEQIDNO.8);所述的序列編碼一個(gè)分子分泌型融合多肽核苷酸序列，該核苷酸具有SEQIDNO.10所示的序列(詳見具體實(shí)施例1)。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種真核重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms，由上述構(gòu)建的DNA融合分子和pVAXl真核表達(dá)載體構(gòu)成(詳見具體實(shí)施例1)。在本發(fā)明的再一方面，提供了一種制備真核重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AE"^的方法(詳見具體實(shí)施例1第7、8步驟和實(shí)施例4)，該重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AErns編碼多表位保護(hù)性抗原蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO.ll)(詳見具體實(shí)施例l)和在預(yù)防、控制豬瘟中的應(yīng)用(具體實(shí)施例3)。本發(fā)明的ptPAs/AE2/AEms的核苷酸序列或其片斷可以用重疊PCR和減PCR擴(kuò)增方法獲得。根據(jù)本發(fā)明所公開的各種引物核苷酸序列，用豬瘟病毒標(biāo)準(zhǔn)石門株或地方分離株金因組RNA制備的cDNA為模板，擴(kuò)增得到所需序列。然后按所公開的構(gòu)建步驟，將其克隆到pVAXl真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a[天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，下同]，采用Omega小量質(zhì)粒提取試劑盒(PlasmidMiniKitI，D6943-01，Omega公司產(chǎn)品，下同)操作手冊(cè)小量制備質(zhì)粒，進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證DNA疫苗表達(dá)閱讀框和序列正確，無堿基突變，即獲得抗豬瘟多表位DNA疫苗。抗豬瘟多表位DNA疫苗的大量制備按常規(guī)方法(Sambrook等人《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版。NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)進(jìn)行(詳8見具體實(shí)施例4)。本發(fā)明在分析CSFV石門株的E2和Erns抗原結(jié)構(gòu)和表位序列的基礎(chǔ)上，借鑒國內(nèi)外CSFV分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究的最新成果，借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)研究相結(jié)合，構(gòu)建并篩選出由編碼tPA信號(hào)肽、E2和E"^抗原表位、以及兩者之間加入柔性肽連接序列構(gòu)成的、安全、有效的抗豬瘟多表位DNA疫苗。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于與已報(bào)道的CSFVE2DNA疫苗相比較，抗豬瘟多表位DNA疫苗包含CSFV囊膜E2和Ems的保護(hù)性抗原區(qū)域并將兩者融合，增加了免疫保護(hù)性抗原表位；多表位疫苗能有效的應(yīng)對(duì)病毒的變異和免疫反應(yīng)中的某些不利因素；多表位疫苗通過串聯(lián)不同抗原表位，可以選擇誘導(dǎo)的免疫方式及提高免疫效果；通過引入tPA信號(hào)肽，增加了保護(hù)性抗原的表達(dá)量和分泌特性。該新型疫苗免疫接種能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著提高了疫苗的抗豬瘟效果，使其更具開發(fā)價(jià)值，可用于替代現(xiàn)行使用的豬瘟兔化弱毒疫苗，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。圖1為一種抗豬瘟多表位DNA疫苗結(jié)構(gòu)與組成示意圖圖2為間接免疫熒光檢測(cè)ptPAs/AE2/AErns轉(zhuǎn)染細(xì)胞中重組蛋白(Erns抗原)表達(dá)由圖可知，本發(fā)明所構(gòu)建提供的抗豬瘟多表位DNA疫苗能在真核細(xì)胞PK15(豬腎細(xì)胞系，A.重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEnis轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色觀察；B.載體質(zhì)粒pVAXl轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞經(jīng)免疫熒光染色觀察。來自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CTCC，下同)中表達(dá)Erns抗原。圖3Westernblot檢測(cè)ptPAs/△E2/AErns重組蛋白(E2抗原)表達(dá)由圖可知，本發(fā)明所構(gòu)建提供的抗豬瘟多表位DNA疫苗能在真核細(xì)胞PK15中表達(dá)E2抗原，包括在細(xì)胞內(nèi)和分泌兩種形式表達(dá)。1.pVAXl轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液；2.pVAXl轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液；3.ptPAs/AE2/AEs轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液；4.ptPAs/AE2/AEnis轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液。圖4CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后，該DNA疫苗接種豬和對(duì)照實(shí)驗(yàn)豬體溫變化曲線由圖可知，CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后試驗(yàn)豬體溫變化曲線，"pVAXl"表示pVAXl載體質(zhì)粒接種豬體溫變化；"ptPAs/AE2/AErns"表示DNA疫苗免疫接種豬體溫變化。對(duì)照組豬用CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后體溫于第二天開始升高超過40'C，3頭豬中2頭在第三天超過4rC,并持續(xù)到死亡；另1頭對(duì)照組豬體溫持續(xù)在40-4rC之間，到第9天升高至41.2'C，持續(xù)至死亡。DNA疫苗免疫接種豬體溫于第三天開始升高至40-40.3'C，持續(xù)2-4天后降至4(TC以下，在第10天時(shí)體溫全部恢復(fù)正常。圖5CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后白細(xì)胞數(shù)量變化由圖可知，經(jīng)本發(fā)明所構(gòu)建的抗豬瘟多表位DNA疫苗免疫接種豬在CSFV強(qiáng)毒攻擊感染后白細(xì)胞數(shù)量保持在5-10xl09/L水平。接種pVAXl對(duì)照組豬體白細(xì)胞總數(shù)在每次計(jì)數(shù)時(shí)均顯著低于疫苗免疫組約2倍左右，并持續(xù)降低。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，迸一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本'發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照Sambrook等人《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件。具體實(shí)施例描述的方法步驟，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不需付出創(chuàng)造性勞動(dòng)均能順利實(shí)施。所涉及的DNA疫苗質(zhì)粒、工程菌株都可提供給本發(fā)明實(shí)施者。實(shí)施例1抗豬瘟多表位DNA疫苗及其制備方法1.引物的設(shè)計(jì)、合成根據(jù)豬瘟病毒'石門株(為中國豬瘟病毒強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)株，來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)囊膜糖蛋白E2和E"^基因序列分析設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，用于PCR擴(kuò)增編碼豬瘟病毒E2、Erns主要抗原區(qū)的基因片段；根據(jù)編碼人tPA信號(hào)肽的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于PCR擴(kuò)增編碼tPA信號(hào)肽的核苷酸序列。各引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；各引物的序列和編號(hào)如下1).E2抗原區(qū)PCR擴(kuò)增引物上游引物Pl(+)(SEQIDNO.l):5'-TCTCTTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3'10下游引物Pl(-)(SEQIDN0.2):A-3'(在上游引物上加入8bp的tPA序列TCTCTTCA;在下游引物5'端引入酶切位點(diǎn)KpnI和BamHI，為了保證酶切效率加入CC)。2).Ems抗原多表位PCR擴(kuò)增引物上游弓i物P2(+)(SEQIDN0.3)5'墨GAGGTACCGGAGGTGGCAACTATACGTGCTGTAAGTTACAGA-3'(上游引物加入Kpnl酶切位點(diǎn)GGTACC)下游引物P2(-)(SEQIDN0.4)5'-CCGGATCCTTTGCTTCTACCCTCCAACC-3'(下游引物加入BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC)3).tPA信號(hào)肽編碼序列合成引物上游引物P3(+)(SEQIDNO.5)GCTGTGTGGA-3'(上游引物加入HindIII酶切位點(diǎn)AAGCTT)下游引物P3(-)(SEQIDNO.6)CAGCAGCA-3'(下游引物中包含8bp的E2序列GCCGATCG)2.豬瘟病毒總RNA的提取及cDNA的合成取200W感染豬瘟病毒的豬全血或增殖CSFV的PK15細(xì)胞(如果是凍存樣品則在室溫下解凍)，用總RNA提取試劑盒(一步法總RNA抽提試劑盒，BSC51S1，上海華舜生物工i呈有限公司產(chǎn)品)，按試劑盒操作說明書介紹的方法提取病豬全血樣品總RNA。提取的RNA溶于16^1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理過的雙蒸餾水中，加入1lalE2片段PCR擴(kuò)增引物Pl(-)(SEQIDN0.2)，85°C，5min，迅速置冰浴5min，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液5x逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(RTBuffer)5^1，核苷酸混合物(dNTPs)(10pM)0.5|Lil，核酸酶抑制齊U(RNsin)0.5ial，逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV)1^1。在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)42°C30分鐘，95r變性5分鐘，置冰浴，凍存?zhèn)溆谩?.3.以步驟2合成的cDNA為模板，PCR分別擴(kuò)增E2、E皿抗原區(qū)編碼基因片段cDNA序列(SEQIDNO.7、8);重疊PCR擴(kuò)增tPA信號(hào)肽編碼序列(SEQIDN0.9)，具體反應(yīng)條件如下1).E2抗原區(qū)編碼序列擴(kuò)增cDNA模板Pl(十)(lO,PI(-)(10,dNTP(10,10xPCR緩沖液pfUDNA聚合酶(3U/111)滅菌雙蒸水用移液器將上述組分混勻，在分鐘，再94°C30秒，55°C30秒，2).Erns抗原區(qū)編碼序列擴(kuò)增cDNA模板P2(+)(10,P2(-)(10nM)dNTP(10,10xPCR緩沖液pfuDNA聚合酶(3U/pl)滅菌雙蒸水1^12nl2pi2|Lll2.5pi1^19.5nlPCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)94"C變性370°C30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。12|al2pi2pi2.5pi9.5nl用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)94'C變性3分鐘，再94。C30^，55"C30秒，70°C30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。3).tPA信號(hào)肽編碼序列擴(kuò)增P3(+)(10pM)2plP3(-)(10,2^ildNTP(10闊2^110xPCR緩沖液2.5plpfuDNA聚合酶(3U/(il)1(il滅菌雙蒸水9.5^用移液器將上述組分混勻，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)94。C變性3分鐘，94。C10秒，55°C20秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。(所用PCR試劑包括核苷酸混合物dNTPs、10xPCR緩沖液和pfiiDNA聚合酶，均為Songon生物工程有限公司產(chǎn)品，下同)。4.步驟3擴(kuò)增的tPA信號(hào)cDNA序列和E2、E"'s抗原區(qū)基因cDNA序列的PCR產(chǎn)物，分別利用DNA純化體系試劑盒(瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，W5211,上海華舜生物工程有限公司產(chǎn)品，按試劑盒說明書操作，下同)回收純化目的DNA片段。5.重疊PCR方法擴(kuò)增tPAs/AE2融合片段。擴(kuò)增條件如下步驟4回收純化tPA信號(hào)肽編碼序列PCR產(chǎn)物2pl步驟4回收純化E2抗原區(qū)編碼序列PCR產(chǎn)物2pidNTP(lO,2pl10xPCR緩沖液2.5nlpfliDNA聚合酶(3U/V1)1pl滅菌雙蒸水9.5nl94。C變性5分鐘，然后94。C30秒，55。C30秒，70°C30秒進(jìn)行10個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，然后向反應(yīng)體系中加入引物Pl(+)、P3(-)各2(il，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)94。C變性3分鐘，再94。C30秒，55。C30秒，70°C30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物即為重組的tPAs/AE2融合片段，DNA純化試劑盒回收產(chǎn)物DNA。6.重組質(zhì)粒DNA的詢建步驟1)將tPAs/AE2融合片段用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段；用BamHI和HindIII雙酶消化的pVAXl(Irwitrogen公司產(chǎn)品)，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段，將雙酶消化后的tPAs/AE2抗原區(qū)融合片段和pVAXl的質(zhì)粒DNA片段按4:1比例混合，加入10x連接酶緩沖液lnl,T4DNA連接酶lpl，補(bǔ)加滅菌雙蒸餾水至總體積10^1，4。C連接過夜；連接產(chǎn)物用氯化鈣(CaCl2)法(分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選陽性重組子克隆，Omega小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒ptPAs/AE2;2)將E""抗原區(qū)片段用限制性核酸內(nèi)切酶Kpnl和BamHI雙酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段；用Kpnl禾QBamHI雙酶消化ptPAs/AE2質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段，將Kpnl和Bamffl雙酶消化后的Eras抗原區(qū)片段和ptPAs/AE2質(zhì)粒DNA片段按4:1比例混合，加入10x連接酶緩沖液lnl，T4DNA連接酶lnl，補(bǔ)加滅菌雙蒸餾水至總體積10(al，4'C連接過夜；連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選陽性重組子克隆，Omega小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定驗(yàn)證，獲得編碼分泌型多抗原表位融合多肽tPAsME2/AE""核苷酸序列(SEQIDNO.10)的重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AE服，，此即抗豬瘟多表位DNA疫苗質(zhì)粒。7.制備ptPAs/AE2/AEms工程菌DH5a取DNA疫苗質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms，用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，篩選獲得陽性重組子，即獲得含有重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms的工程菌DH5a(具體實(shí)驗(yàn)操作按《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》介紹的步驟進(jìn)行)。8.抗豬瘟多表位DNA疫苗的小量制備本發(fā)明的抗豬瘟多表位DNA疫苗(ptPAs/AE2/AE"")用上述工程菌株DH5a制備。細(xì)菌培養(yǎng)按常規(guī)方法進(jìn)行(按照Sambrook等人《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版)；采用Omega小量質(zhì)粒提取試劑盒制備DNA疫苗質(zhì)粒，具體按操作手冊(cè)進(jìn)行。歩驟如下1)將ptPAs/AE2/AE"^工程菌DH5a平板劃線培養(yǎng)，形成單菌落，挑取單菌落接種5-10mlLB±^養(yǎng)基37。C振搖培養(yǎng)過夜。2)取1-5ml菌液至離々管中，10000xg離心10分鐘或4000xg離心15分鐘收集細(xì)菌。3)加入200(il的溶液1(SolutionI)[已加入核酸酶A(RNaseA)]，渦旋振蕩器或移液器吹打重懸細(xì)菌。加入400pl的溶液2(Solution11)，顛倒混勻數(shù)次，讓細(xì)菌充分接觸溶液。加入350(il的溶液3(SolutionIII),迅速顛倒充分混勻至出現(xiàn)白色沉淀(溶液l、2和3的配方見Sambrook等人《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三4)10000-12000xg，4'C離心10分鐘，去除蛋白質(zhì)和染色體DNA。5)小心吸取上清轉(zhuǎn)移至干凈的DNA結(jié)合柱中，室溫(20-25。C，下同)10000-12000xg離心1分鐘，使裂解液完全通過柱子；6)去除廢液，加入500(il的緩沖液HB(BufferHB)洗滌DNA結(jié)合柱。室溫條件下，10000-12000xg離心1分鐘，去除廢液并加入700的DNA洗滌緩沖液HB(WashBufferHB)，室溫，10000-12000xg離心1分鐘；重新加入700pl的DNA洗滌緩沖液HB，室溫，10000-12000xg離心1分鐘；室溫13000xg離心2分鐘徹底去除廢液。7)DNA結(jié)合柱轉(zhuǎn)至干凈的離心管中，加入30-50pl的洗脫緩沖液(ElutionBuffer)。室溫，13000xg離心l分鐘。收集慮過液，得到了ptPAs/AE2/AE冊(cè)的DNA疫苗。取1.0pl在紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定純化質(zhì)粒DNA含量，-70°〇凍存?zhèn)溆?。得到一種EscherichiacoliDH5a(ptPAs/AE2/AEms)，中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),M208254。實(shí)施例2抗豬瘟多表位DNA疫苗功能檢測(cè)(抗豬瘟多抗原表位DNA疫苗的抗原表達(dá)檢測(cè))，抗豬瘟多表位DNA疫苗作為制備治療或預(yù)防豬瘟的藥物在控制和根除中的應(yīng)用。.用脂質(zhì)體Lipofectamine200將ptPAs/AE2/AEms重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞(具體操作見《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)，同時(shí)設(shè)空載體pVAXl對(duì)照，36h后分別收獲細(xì)胞和培養(yǎng)上清，采用間接免疫熒光檢測(cè)Ems抗原的表達(dá)；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印漬(Westernblot)檢測(cè)E2抗原PK15細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中的表達(dá)。1.間接免疫熒光檢測(cè)PK-15細(xì)胞中重組蛋白tPAs/AE2/AE，(SEQIDNO.11)(E，抗原)表達(dá)所制備的DNA疫苗質(zhì)粒ptPAs/AE2/AErns轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞，5%C0237'C培養(yǎng)72h后，細(xì)胞用甲醛丙酮(l:l)固定處理lh，然后用PBS洗滌3次，加入抗E"15兔血清(一抗，1:1000)(抗Efns兔血清由本實(shí)驗(yàn)室制備[具體方法見ChenL.Wa/,2007,五x;mw/o"awdPw折cario",55:379-387]),37。C孵育lh，PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗,1:500，Pierce公司產(chǎn)品)，室溫孵育lh，PBS洗滌后于倒置熒光顯微鏡觀察。轉(zhuǎn)染DNA疫苗質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEras的PK15細(xì)胞能與特異性Erns多克隆抗體反應(yīng)，呈綠色熒光(圖2A)，轉(zhuǎn)染載體質(zhì)粒pVAXl的PK15不與Ems多克隆抗體反應(yīng)，無熒光(圖2B)。2.間接EUSA法檢測(cè)PK-15細(xì)胞中重組蛋白tPAs/AE2/AE，(SEQIDNO.11)(E2抗原)表達(dá)1)樣品處理將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms和對(duì)照質(zhì)粒pVAXl的PK15細(xì)胞，5%C02，37。C培養(yǎng)36h后，分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，PK15細(xì)胞用刮刷收集，用25(HilPBS重懸。上清液真空凍干，加入250plPBS溶解，用作抗原包被液。.2)間接ELISA檢測(cè)(l)包被將上述制備的上清液和細(xì)胞裂解液分別用PBS進(jìn)行1:1稀釋，力口入96孔ELISA板，每孔100nl，4。C包被過夜，用洗液PBST(0.05°/。Tween20的磷酸鹽緩沖液，下同)洗滌6次，5min/次，濾紙吸干。(2)封閉每孔加封閉液300^[封閉液組成含3X牛血清蛋白(BSA)的PBST]，37'C條件下封閉60min后，洗滌6次。(3)與一抗反應(yīng)一抗為小鼠抗CSFVE2單克隆抗體(見Weiland,E.等VeterinaryMicrobiology,1995,47:111-118.)，一抗用含1%牛血清蛋白(BSA)的PBST按1:1000倍稀釋，每孔加100)xl，37。C作用lh后，洗滌6次。(4)與酶標(biāo)二抗反應(yīng)酶標(biāo)二抗為HRP(辣根過氧化物酶，下同)標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(31432，Pierce公司產(chǎn)品)，按1:5000稀釋，每孔加入100pl，37。C溫箱內(nèi)作用m后，洗滌6次。(5)加底物溶液:每孔加入10(^1顯色液[含0.004。/。鄰苯二胺(OPD)和0.045%雙氧水(11202)],37。C避光顯色10min，用2摩爾硫酸(2M112304)終止反應(yīng)，20min內(nèi)測(cè)定OD492光密度值。(6)OD柳值的測(cè)定:用自動(dòng)酶標(biāo)測(cè)定儀在波長492nm處，測(cè)定每孔內(nèi)光密度吸收值(00492)。每份樣品平行做3孔，取其平均值。結(jié)果表明，ptPAs/AE2/AEms轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液OD柳值是pVAXl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化PK細(xì)胞對(duì)照組的2-3倍(pO.05)(表1)，表明該多表位DNA疫苗在PK細(xì)胞中以細(xì)胞內(nèi)和分泌兩種形式表達(dá)融合蛋白。表1ELISA檢測(cè)重組蛋白(E2抗原)在PK細(xì)胞中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>03.免疫印漬(Westernblot)檢測(cè)PK15細(xì)胞中重組蛋白(SEQIDNO.11)(E2抗原)的表達(dá)(1)樣品處理將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AE""和對(duì)照質(zhì)粒pVAXl的PK15細(xì)胞，5%C02，37T:培養(yǎng)36h后，分別收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞，細(xì)胞用刮刷收集，用20(^1PBS重懸。上清液真空凍干，加入200plPBS溶解。取20(^1細(xì)胞重懸液和上清凍干粉重懸液，分別加入等體積樣品緩沖液(Loadingbuffer)(組分見《分子克隆，操作手冊(cè)》第三版)混勻，10(TC煮沸5分鐘，冷卻備用。(2)制膠按下列體積和順序依次加入各組分，分別配制分離膠和濃縮膠。分離膠(10%).5mol/LTris(pH8.0)1.3ml30%丙烯酰胺2mldH201.6ml腦AP0.05ml腦SDS0,05mlTEMED2pl濃縮膠(5%)1,5mol/LTris(pH6.8)0.25ml30%丙烯酰胺0.33mlddH201.4ml10%AP0.02ml腦SDS0.02mlTEMED2pi先將分離膠灌入，膠面至距離頂端約1.5cm，緩緩加入lml雙蒸餾水于上層壓封凝膠，室溫靜置待膠體凝固，倒出雙蒸餾水，濾紙吸干，然后灌入濃縮膠(灌注前配制)，同時(shí)插入樣品梳，室溫靜置待膠體凝固，取出樣品梳備用。(3)上樣分別取處理好的蛋白樣品lOpl加入濃縮膠樣品槽中，確保各樣品槽中加樣體積相等。.(4)電泳50V電泳30分鐘，調(diào)節(jié)電壓至IOOV繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)距底線0.5cm處停止電泳，取出凝膠，清水洗滌。(5)轉(zhuǎn)膜取硝酸纖維素(NC)膜、海綿和濾紙分別用轉(zhuǎn)膜緩沖液(tmnsferbuffer)浸泡5分鐘，按陰極-海綿-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-海綿-陽極順序鋪設(shè)凝膠和NC膜，放入電泳槽，采用88V電壓，4。C條件下電泳3h。(6)封閉取出NC膜，用1xPBST洗滌3-5分鐘，加入含5X脫脂奶粉的PBST的封閉緩沖液(blockingbuffer),37°C，孵育2h。(7)與一抗反應(yīng)用PBST洗NC膜3次，每次5分鐘。加入一抗(兔抗CSFVP2多克隆抗體，用PBST進(jìn)行1:1000倍稀釋)，37°C，孵育lh。(8)與二抗反應(yīng)PBST洗NC膜3次，每次5分鐘。加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(二抗，31460，Pierce公司產(chǎn)品，用PBST作1:2500倍稀釋)，37。C孵育lh,4'C或室溫?fù)ulh。(9)顯色PBST洗滌NC膜3次，每次5分鐘。加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液(具體配方見《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)，室溫避光顯色5-10分鐘，清水洗NC膜后拍照保存(圖2)。實(shí)施例3抗豬^i多表位DNA疫苗豬體免疫效力檢測(cè)將所構(gòu)建的抗豬瘟多表位DNA疫苗質(zhì)粒溶解于滅菌的PBS(pH7.2)，稀釋至DNA終濃度為lmg/ml';用于豬體免疫接種。1.豬體免疫接種2月齡CSFV血清抗體陰性豬6頭，隨機(jī)分成兩組，每組3頭豬，試驗(yàn)組用DNA疫苗ptPAs/AE2/AEfns免疫；對(duì)照組用載體質(zhì)粒pVAXl免疫。具體地，試驗(yàn)前選取新生未進(jìn)行豬瘟疫苗免疫接種的4周齡健康仔豬，前腔靜脈采血分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)豬瘟病毒E2抗體，E2抗體陰性仔豬分欄飼18養(yǎng)，至8周齡再次采血檢測(cè)豬瘟病毒E2抗體，挑選E2抗體陰性、健康狀況良好的仔豬，隨機(jī)分組，每組3頭，做好標(biāo)記，用于DNA疫苗免疫接種。試驗(yàn)組將純化的DNA疫苗質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms溶解于滅菌的PBS(pH7.2)中，稀釋至終濃度lmg/mL，用力振蕩混勻，采用股四頭肌、左右胸頭肌和耳朵皮內(nèi)多點(diǎn)接種，每點(diǎn)200pL，共lmL。免疫3次，每次間隔15天。對(duì)照組將純化的pVAXl質(zhì)粒分別溶解于滅菌的PBS(pH7.2),稀釋至終濃度lmg/mL，用力振蕩混勻，采用股四頭肌、左右胸頭肌和耳朵皮內(nèi)多點(diǎn)接種，每點(diǎn)200pL,共lmL。免疫3次，每次間隔15天。2.豬體攻毒最后一次免疫后第15天，以3x105丁(:105()劑量的CSFV強(qiáng)毒石門株，采用肌肉途徑注射攻毒，攻毒后每日用體溫計(jì)測(cè)量各試驗(yàn)豬體溫變化，并于攻毒后第0、4、8和12天采血，取2(^1用于計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)量；剩余全血分離血清，檢測(cè)血清中和抗體效價(jià)。1)白細(xì)胞計(jì)數(shù)方法取2(Hil豬全血加入到38(Hil3。/。的冰醋酸稀釋液中，混勻，室溫靜置20分鐘，取IOW滴入蓋有干凈蓋玻片的細(xì)胞計(jì)數(shù)板，使稀釋的細(xì)胞懸液充滿蓋玻片下面的計(jì)數(shù)室。待白細(xì)胞下沉后，將計(jì)數(shù)板置于顯微鏡低倍鏡下，數(shù)出位于計(jì)數(shù)室四角的4個(gè)大方格(每個(gè)大方格分16個(gè)中方格)中的白細(xì)胞的總數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，要注意顯微鏡的載物臺(tái)應(yīng)平置，以免血細(xì)胞向一邊集中。計(jì)算方法(血液稀釋倍數(shù)1:20)細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞/ml)=(數(shù)得細(xì)胞數(shù)/4)x104x20(細(xì)胞/ml)細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞/'L)=(數(shù)得細(xì)胞數(shù)/4)x104x20x103(細(xì)胞/L)2)中和抗體檢測(cè)方法按2xl06細(xì)胞/ml濃度將PK15細(xì)胞懸液接種平底微量96孔培養(yǎng)板中(100p1/孔)；5%C0237匸培養(yǎng)至細(xì)胞形成70%-80%單層，將待檢血清56。C滅活30分鐘，用無血清EMEM培養(yǎng)液作2倍系列稀釋；將稀釋的待檢血清與含200TCIDW0.1mL的豬瘟病毒懸液等體積混合，置37'C孵育l-2h;用無血清DMEM培養(yǎng)基(SH30002.01，HyClone公司產(chǎn)品)洗滌PK15細(xì)胞單層，然后，加入血清病毒混合物，37。C孵育lh,吸出血清病毒混合物，加入含2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液(小牛血清，2600202，HyClone公司產(chǎn)品)，37。C繼續(xù)培養(yǎng)48-72h;按前述的間接免疫熒光法檢測(cè)PK15細(xì)胞中是否有CSFV病毒增殖，計(jì)算血清的病毒中和效價(jià)(每份血清樣品重復(fù)2次實(shí)驗(yàn))。具體地，將接種了CSFV與血清中和混合物的PK15細(xì)胞，用100%丙酮固定在蓋玻片上。依次加入一抗(小鼠抗CSFVE2單克隆抗體，1:100)、二抗(兔抗豬IgG/FITC，B649019,上海滬尚生物科技有限公司，1:100)進(jìn)行抗原抗體免疫反應(yīng)，Olympus倒置熒光顯微鏡觀察。PK15細(xì)胞呈綠色熒光為陽性反應(yīng)。以血清的最高稀釋倍數(shù)并能中和CSFV感染(無熒光染色反應(yīng))作為血清的中和效價(jià)。3.豬體試驗(yàn)結(jié)果1)CSFV石門強(qiáng)毒感染攻毒后豬體溫變化對(duì)照組豬用CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后體溫于第二天開始升高超過40°C，3頭豬中2頭在第三天超過4rC，并持續(xù)到死亡；另1頭對(duì)照組豬體溫持續(xù)在40-41'C之間，到第9天升高至41.2°<:，持續(xù)至死亡。DNA疫苗免疫接種豬體溫于第三天開始升高至40-40.3。C，持續(xù)2-4天后降至40。C以下，在第10天時(shí)體溫全部恢復(fù)正常(圖3)。2)CSFV石門強(qiáng)毒感染攻毒后豬血清中和抗體效價(jià)試驗(yàn)組和對(duì)照組豬于攻毒后第0，4，8，12天的中和抗體效價(jià)見表2(其中，N表示采血時(shí)豬已死亡，無檢測(cè)結(jié)果)。表2實(shí)驗(yàn)豬攻毒前后血清中和抗體效價(jià)攻毒后不同時(shí)間(天)血清中和抗體效價(jià)試驗(yàn)豬編號(hào)o天4天8天12天試驗(yàn)組1號(hào)豬1:161:1281:1281:256試驗(yàn)組2號(hào)豬1:161:641:5121:512試驗(yàn)組3號(hào)豬1:321:641:5121:1024對(duì)照組1號(hào)豬1:41:41:4N對(duì)照組2號(hào)豬1:41:81:8N對(duì)照組3號(hào)豬1:4NNN203)CSFV石門強(qiáng)毒感染攻毒后第0，4，8，12天豬的白細(xì)胞數(shù)量變化如圖4。該DNA疫苗免疫組試驗(yàn)豬外周血白細(xì)胞數(shù)量在5-10"09水平；pVAXl對(duì)照組試驗(yàn)豬白細(xì)胞顯著減少(約減少2倍，并持續(xù)減少)；4)CSFV石門強(qiáng)毒感染攻毒后豬的存活情況對(duì)照組3頭豬用CSFV石門強(qiáng)毒株攻毒后分別在第3，10和11天死亡；DNA疫苗免疫接種3頭豬全部成活(表3)。表3試驗(yàn)組與對(duì)照組豬強(qiáng)毒攻毒后存活情況<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例4抗豬瘟多表位DNA疫苗大量提取及純化抗豬瘟多抗原表位DNA疫苗大量提取及純化(具體方法見《分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》第三版)。1)將ptPAs/AE2/AE""工程菌DH5ot平板劃線培養(yǎng)，形成單菌落，挑取菌落接種5-10mlLB培養(yǎng)基37'C振搖培養(yǎng)8h，然后按培養(yǎng)物L(fēng)B=1:1000接種于1000mlLB培養(yǎng)基中，37'C搖動(dòng)培養(yǎng)14h。2)用50ml的離心管吹集菌液，5000rpm，離心10min，棄上清，可用多管多次收集。加入10ml溶液1(SolutionI)重懸細(xì)菌，合并成兩管(10ml/管)；每管加入20ml溶液2(Solution11)，輕輕旋轉(zhuǎn)，顛倒充分混勻4-6次，室溫放置不超過5min;每管加入冰預(yù)冷的溶液3(SolutionIII)15ml,迅速輕輕顛倒混勻4-6次，冰上放置20min，以促進(jìn)沉淀形成。3)4°C，13000rpm，離心30min，轉(zhuǎn)移上清至另一支干凈離心管中，4'C，13000rpm，離心15min;轉(zhuǎn)移上清至另一支干凈離心管中，加入60。/。體積的(18ml)異丙醇(室溫)，混勻，室溫放置10min，15000rpm，離心30min，緩慢地倒出上清(切勿將管底的DNA沉淀一并棄去)；用70%的冰乙醇20ml洗滌沉淀物，合并至一支離心管中，15000rpm，離心10min，緩慢地倒出上清，充分晾干；4)加入3ml37X:預(yù)熱的lxTE溶液，37'C溫育15min;加入等體積冰預(yù)冷的5摩爾(5M)氯化鋰(LiCl)溶液，充分混勻，4°C，10000rpm，離心10min;轉(zhuǎn)移上清至另一支干凈離心管中，加入等體積(6ml)異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，室溫條件下，10000rpm，離心10min;棄盡上清，加入70%冰預(yù)冷乙醇10ml洗滌沉淀物，15000rpm，離心5min，充分晾干；5)加入lml37'C預(yù)熱的1xTE溶液(pH8.0)，37。C溫育15min，分裝于2支1.5離心管中；每管加入RNaseA50W(200W/ml)，37。C溫育30min;取出，加入含13%(W/V)聚乙二醇8000(PEG8000)的1.6M氯化鈉(NaCI)溶液500pl，充分混勻，室溫靜置20min，12000rpm，離心5min，棄上清，回收沉淀的質(zhì)粒DNA;6)用400^137i:預(yù)熱的1xTE溶液溶解質(zhì)粒DNA，37。C溫育15min;加入等體積的酚:氯仿(200(il:20(Vl，氯仿:異戊醇24:l(v/v)),充分混勻，12000rpm，離心10min;轉(zhuǎn)移上層水相至另一支干凈離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇=24:1(v/v)400(^1，充分混勻，12000rpm，離心10min;轉(zhuǎn)移上層水相至另一支干凈離心管中，加入1/10體積(40pl)3M的醋酸鈉(NaAc)溶液，充分混勻，再加入2倍體積(800(il)冰預(yù)冷的無水乙醇，輕輕混勻，冰浴10min，4'C，12000rpm，離心5min,棄盡上清，回收質(zhì)粒DNA;加入4'C預(yù)冷的70%的乙醇20(^1，振蕩混勻，4'C，12000rpm，離心5min，重復(fù)此步驟3次；吸除殘余乙醇，室溫充分晾干；7)加入lml37'C預(yù)熱的1xTE溶液溶解涼干的DNA,37。C溫育30min，混勻，獲得純化的DNA疫苗制品。取l.Onl電泳檢測(cè)DNA純度；取1.(^1紫外分光光度計(jì)定量測(cè)定DNA濃度，分裝DNA，-70°〇保存?zhèn)溆?。SEQUENCELISTING〈110〉武漢大學(xué)<120〉一種抗豬瘟多表位DNA疫苗及構(gòu)建方法和應(yīng)用<130>—種抗豬瘟多表位DNA疫苗及構(gòu)建方法和應(yīng)用<160>11<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉28〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>1tctcttcacggctagcctgcaaggaaga28<210〉2<211〉48<212〉DNA<213>人工合成〈400〉2ccggatccacctccgccggtaccgccccccaacttacagtagaataga48〈210〉3<211〉42<212〉DNA<213>人工合成<400〉3gaggtaccggaggtggcaactatacgtgctgtaagttacaga42<210>4<211〉28<212>DNA.<213>人工合成〈400〉4ccg'gatcctttgcttctaccctccaacc28<210〉5<211〉59〈212〉DNA<213〉人工合成〈400〉5cgaagcttaccatggatgcaatga卿gagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtgga59<210>6<211〉55<212〉DNA<213〉人工合成<400〉6g'ctagccgtgaagagatt"tcgctgggcgaaacgaagactgctccacacagcagc355〈210〉7〈211〉81<212〉DNA〈213〉人〈400〉7atccatccaacctctcctctctcctcctcctctctccaccactcttcctt60tcccccacccaaatctcttc81〈210〉8<211>651〈212〉腿<213〉豬瘟病毒〈400〉8gcatcaaccacggcattcctcatctgcttgtaagaggacagatcgtgcaa60ggtgtg'atctggctgctactagtaactggggcacaaggccggctagcctgc犯ggaaga/t120tacEiggtacgcaatatcatcaaccaatgag3t3gggCt3Ctcggggccggaggtctcact180acceicctggaccacgatttgacgggaccgttaaggccatt240tgcgtggcaggttcctttaaagtcacagcacttaatgtggtca^gt鄉(xiāng)aggtatttggca300tcattg'cata鄉(xiāng)鵬ctttactcacttccgtgacattcgagctcctgtt360犯cccatc犯ccg肌ga^atggg卿tg3Cttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacg420agtcctgttgtcaaggga犯gtacaatacaaccttgttgaacggt3gcgctttctatctt480gtctgcccaat娜gtggacgggtgUat3gagtgcacagcagtgagcccaacaactctg540tggt犯agaccttcaggagag3gaagccttttccacacagaatggattgt600gtgaccaccacagtggaaaatg犯g3tCt3ttctactgta敏tggggggc651〈210〉9〈211〉468〈212〉讓<213〉豬瘟病毒〈400〉9犯ctatacgtgctgtaagttgei3tggaBca犯C3tggEltggtgtaactgg60tacaatatagacccatggatacagctgatgaa/tag犯cccggc卿aggc120cctccggccaaggagtgcgctgtgacttgcaggtax:gata犯gatgccg3CELtC犯Cgtg180gtcaccc郷ccagaaacaggccaac犯ccctgaccggct240tctUtgtgg柳gggcccatgtaatttcaatgtttccgtgg鄉(xiāng)at.atc300ttgtac鵬gatcatg3gtgcggcagUtgcggctctgt3360acactatagagaBtgccagaC鄉(xiāng)g,3gccagggt犯catcttggctc420g.ggaggc咖tcagcactgccggga卿ggttggagggtag犯gcaaa468<210>10<211>1113〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>10.gctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt60tcgcccagcgaaatctcttcacggctagcctgc犯gg卿attacaggtacgc犯tatca120tcaacc肌tgactcggggccgg鄉(xiāng)tctC3ctaccacctg180agccacgatttgc犯ctgaatgacgggaccgtt犯ggccatttgcgtggcaggttccttt240cacttaatgtggtc柳aggCatCELttgCataagggggct300ttactcacttccgtgacattcgagctcctgttcgacgggBcc^cccstc犯ccg犯gaa360atgg.g卿tgacttcgggttcgggctgtgcccgtttgatacgagtcctgttgtca^ggg3420caaccttgttgctttctatcttgtctgccc33tagggtgg480acgggtgttata_ga<gtgcacagcagtgagcccaac犯ctctg3gaacag33gtggtaa3g540accttcag'gag,g犯gccttttccacacag犯tggattgtgtgaccaccacgLgtggaa600tattctactgggcgg鄉(xiāng)tggtgctgtaag660ttac已gagaca^ga^tgg貼c犯acatggatggtgtaactggtaca3tat3g3cccatgg720atacag'ctgacc犯gca^acgccctccggccaa鵬gtgc780gCtgtg3CttgC3ggt3Cg3t犯agatgccgacatcaacgtggtcaccca840aggccaacaaccctgaccggtttcttttgtgggtacaatt900atagagggcccatgtaatttcaMgtttccgtggaggatatcttgtacggggatcatgag960tgcg'g'cagtttgctccaggacacg'g.ctctg'tacctagtagcaacax;tata1020gacagggagcagcc鄉(xiāng)gtaacatcttggctcgggaggcaactcagcact誦gCCggg3卿ggttggagggtag犯gcaaatag1113<210>11〈211〉403<212〉PRT<213>人工合成〈400>11MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGly15.1015AlaValPheValSerProSerGlulieSerSerAlaSerThrThrAla202530PheLeulieCysLeulieLysValLeuArgGlyGinlieValGinGly35'4045VallieTrpLeuLeuLeuValThrGlyAlaGinGlyArgLeuAlaCys505560LysGluAspTyrArgTyrAlalieSerSerThrAsnGlulieGlyLeu65707580LeuGlyAlaGlyGlyLeuThrThrThrTrpLysGluTyrSerHisAsp859095LeuGinLeuAsnAspGlyThrValLysAlalieCysValAlaGlySer100105110<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>權(quán)利要求1.一種抗豬瘟多表位DNA疫苗，其特征是EscherichiacoliDH5α(ptPAs/ΔE2/ΔErns)，CCTCC，M208254。2.—種分離的融合基因，其序列為SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。3.—種分離的融合多肽，其序列為SEQIDNO.ll所示的氨基酸序列。4.一種制備權(quán)利要求1所述的抗豬瘟多表位DNA疫苗的方法，包括下列步驟A.引物的設(shè)計(jì)、合成B.豬瘟病毒總RNA的提取及cDNA的合成取200nl感染豬瘟病毒的豬全血或增殖CSFV的PK15細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒，提取病豬全血樣品總RNA，提取的RNA溶于16pl焦碳酸二乙酯處理過的雙蒸餾水中，加入lplEms片段PCR擴(kuò)增引物P2(+)，85°C，5min，置冰浴5min，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合液5x逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5^1，核苷酸混合物0.5pl，核酸酶抑制劑0.5nl，逆轉(zhuǎn)錄酶l)Lil，在PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行以下反應(yīng)42°C30分鐘，95'C變性5分鐘，置冰浴，凍存?zhèn)溆?；C.以步驟B合成的cDNA為模板，PCR分別擴(kuò)增E2、E皿抗原區(qū)基因片段cDNA序列；重疊PCR擴(kuò)增tPA信號(hào)肽cDNA序列；D.步驟C擴(kuò)增的tPA信號(hào)cDNA序列和E2、Ems抗原區(qū)基因cDNA序列的PCR產(chǎn)物，分別利用DNA純化體系試劑盒回收純化目的DNA片段；E.重疊PCR方法擴(kuò)增tPAs/AE2融合片段擴(kuò)增條件如f-步驟D回收純化tPA信號(hào)肽編碼序列PCR產(chǎn)物2^步驟D回收純化E2抗原區(qū)編碼序列PCR產(chǎn)物2dNTP(10,2nl10xPCR緩沖液2.5nlpfuDNA聚合酶(3U/nl)1pl滅菌雙蒸水9.5plF.重組質(zhì)粒DNA的構(gòu)建步驟1)將tPAs/AE2融合片段用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段；用BamHI和HindIII雙酶消化的pVAXl，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段，將雙酶消化后的tPAs/AE2抗原區(qū)融合片段和pVAXl的質(zhì)粒DNA片段按4:1比例混合，加入10x連接酶緩沖液lpl，T4DNA連接酶lial，補(bǔ)加滅菌雙蒸餾水至總體積lO)al，4'C連接過夜；連接產(chǎn)物用氯化鈣法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選陽性重組子克隆，Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒ptPAs/AE2;2)將Erns抗原區(qū)片段用限制性核酸內(nèi)切酶Kpnl和BamHI雙酶消化，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段；用Kpnl和BamHI雙酶消化ptPAs/AE2質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳，DNA純化試劑盒回收DNA片段，將Kpnl和BamHI雙酶消化后的E"，s抗原區(qū)片段和ptPAs/AE2質(zhì)粒DNA片段按4:1比例混合，加入10x連接酶緩沖液lpl，T4DNA連接酶lpl，補(bǔ)加滅菌雙蒸餾水至總體積10W，4'C連接過夜；連接產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，挑選陽性重組子克隆，Omega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定驗(yàn)證，獲得重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms，抗豬瘟多表位DNA疫苗質(zhì)粒；G.制備ptPAs/AE2/AEms工程菌DH5a:取DNA疫苗質(zhì)粒ptPAs/AE2/AE"ls，用CaCl2法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a，篩選獲得陽性重組子，獲得含有重組質(zhì)粒ptPAs/AE2/AEms的工程菌DH5a;H.抗豬瘟多表位DNA疫苗的制備其步驟是-1)將ptPAs/AE2/AEms工程菌DH5a平板劃線培養(yǎng)，形成單菌落，挑取單菌落接種5-10mlLB朵養(yǎng)基37。C振搖培養(yǎng)過夜；2)取1-5ml菌液至離心管中，10000xg離心10分鐘或4000xg離心15分鐘收集細(xì)菌；3)加入200pi的溶液1，渦旋振蕩器或移液器吹打重懸細(xì)菌，加入400pl的溶液2，顛倒混勻，讓細(xì)菌接觸溶液，加入35(^1的溶液3，顛倒充分混勻至出現(xiàn)白色沉淀；4)10000-12000xg，4°〇離心10分鐘，去除蛋白質(zhì)和染色體DNA;5)吸取上清轉(zhuǎn)移至干凈的DNA結(jié)合柱中，室溫10000-12000xg離心1分鐘，使裂解液完全通過柱子；6)去除廢液，加入500pi的緩沖液HB洗滌DNA結(jié)合柱，室溫條件下，10000-12000xg離心1分鐘，去除廢液并加入700pl的DNA洗滌緩沖液HB，室溫，10000-12000xg離心1分鐘；重新加入700|il的DNA洗滌緩沖液HB，室溫，10000-12000xg離心1分鐘；室溫13000xg離心2分鐘徹底去除廢液；7)DNA結(jié)合柱轉(zhuǎn)至干凈的離心管中，加入30-50pl的洗脫緩沖液，室溫，13000xg離心1分鐘，收集慮過液，得到了ptPAs/AE2/AEms的DNA疫苗。5.權(quán)利要求1所述的一種抗豬瘟多表位DNA疫苗(ptPAs/AE2/AE，在制備治療或預(yù)防豬瘟的藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了一種抗豬瘟多表位DNA疫苗及構(gòu)建方法和應(yīng)用。通過篩選出CSFVE2和E^rns抗原區(qū)編碼基因片段并與tPA信號(hào)肽融合，克隆到pVAX1真核表達(dá)載體構(gòu)建了抗豬瘟多表位DNA疫苗。該疫苗為EscherichiacoliDH5α(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)，CCTCC，M208254?？关i瘟多表位DNA疫苗編碼CSFVE2、E^rns囊膜糖蛋白主要抗原表位和tPA信號(hào)肽。能增強(qiáng)保護(hù)性抗原的表達(dá)量和分泌性；顯著提高該DNA疫苗的免疫保護(hù)效果。該疫苗成本低廉、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不需要冷鏈運(yùn)輸和低溫保存、儲(chǔ)存期長、安全有效等特點(diǎn)。這種抗豬瘟多表位DNA疫苗免疫接種豬能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)豬瘟強(qiáng)毒株致死攻擊的完全保護(hù)，并能加速免疫豬對(duì)感染病毒的清除，結(jié)合血清中豬瘟病毒特異性NS3抗體和/或豬瘟病毒基因組核酸的檢測(cè)，能夠廣泛用于豬場(chǎng)中豬瘟凈化、預(yù)防和根除。文檔編號(hào)C12N1/21GK101481675SQ20091006043公開日2009年7月15日申請(qǐng)日期2009年1月6日優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日發(fā)明者超萬,張楚瑜,潘茲書申請(qǐng)人:武漢大學(xué)