專利名稱：一種肝細(xì)胞特異性大孔微載體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 一種細(xì)胞培養(yǎng)用大孔微載體、其制備方法和用途，具體涉及一種以 絲素蛋白、半乳糖基化殼聚糖為主要原料的肝細(xì)胞特異性大孔微載體及其制備方法和用 途。
背景技術(shù)：
生物人工肝是20世紀(jì)80年代后期發(fā)展起來(lái)的體外人工肝支持系統(tǒng)，其核心部分 生物反應(yīng)器是由肝細(xì)胞與生物合成材料組合而成。如何建立具有質(zhì)量高、數(shù)量足、安全 性強(qiáng)的生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)是目前生物型人工肝研究領(lǐng)域最重要、也是最困難的核心技 術(shù)問(wèn)題。肝細(xì)胞是具有極性的錨定依賴性細(xì)胞，需要一種不溶的細(xì)胞外基質(zhì)才能獲得生 存、重組、增殖并發(fā)揮功能。體內(nèi)肝細(xì)胞是處于一種三維環(huán)境之中，細(xì)胞間的相互作用 有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能分化。如果在體外培養(yǎng)時(shí)能為肝細(xì)胞提供一個(gè)類似于體內(nèi) 的三維環(huán)境，有利于促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能維持。因此模擬體內(nèi)環(huán)境制備三維多孔網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)支架用于肝細(xì)胞的培養(yǎng)，則有可能解決上述肝細(xì)胞組織化培養(yǎng)的問(wèn)題。大孔微載體具有完全連通的溝回，能最大限度地?cái)U(kuò)大比表面積。它將細(xì)胞固定 在孔內(nèi)生長(zhǎng)，因而可為細(xì)胞提供了足夠的生長(zhǎng)空間和更大的附著面積，同時(shí)有利于營(yíng)養(yǎng) 成分的進(jìn)入和代謝產(chǎn)物的排出，而不致引起細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，提高細(xì)胞培養(yǎng)密度和 代謝活性。與其他載體相比，大孔微載體具有一系列的優(yōu)點(diǎn)，例如比表面積大，是 實(shí)心微載體的幾倍甚至幾十倍；細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)，受到保護(hù)，剪切損傷?。患?xì)胞三維生 長(zhǎng)，細(xì)胞密度是實(shí)心微載體的10倍以上，有的可達(dá)IO8個(gè)/ml;微載體濃度高，實(shí)心微載 體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時(shí)，細(xì)胞密度反而下降，而大孔微載體在濃度較高時(shí)，表 面碰撞增加，能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長(zhǎng)；適用于長(zhǎng)期維持培養(yǎng)，長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況 依然良好；適合于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。但在肝細(xì)胞培養(yǎng)中，現(xiàn)存的大孔微載體均不具有肝細(xì)胞特異性，不能誘導(dǎo)和提 高肝細(xì)胞在微載體上黏附性能，放大培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞容易脫落，因而尋求一種理想的具有肝 細(xì)胞特異性的大孔微載體對(duì)目前實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞體外規(guī)模化培養(yǎng)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型大孔微載體， 該大孔微載體既具有肝細(xì)胞親和性，有助于細(xì)胞黏附、增殖，支持大量細(xì)胞生長(zhǎng)，又能 長(zhǎng)期維持細(xì)胞活性和細(xì)胞功能且成本低廉，能夠用于大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞的大孔微載體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述大孔微載體的制備方法。該方法所用原料 簡(jiǎn)單易得，且價(jià)格便宜，步驟簡(jiǎn)單。本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述大孔微載體在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用，特 別是在肝細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種大孔微載體，其對(duì)肝細(xì)胞具有高 度的親和性，該大孔微載體是由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得的 球體，其中絲素蛋白含量(重量％)占50%-80%，半乳糖基化殼聚糖含量(重量％)占 15%-40% (在本發(fā)明中，絲素蛋白含量以及半乳糖基化殼聚糖含量的測(cè)定是通過(guò)首先測(cè) 得絲素蛋白、半乳糖基化殼聚糖各自的濃度，然后按照預(yù)定的比例計(jì)算出需要的量(體 積)，再進(jìn)行共混而進(jìn)行的)。掃描電鏡觀察顯示，所述載體的直徑為200-500 μ m，孔 徑為40-80 μ m，孔隙率可達(dá)95 %。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可通過(guò)下述方法制備所述大孔微載體，該方法包括(a)將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產(chǎn)生終濃度為 4-7w/V%的絲素_半乳糖基化殼聚糖混合溶液；(b)將上述絲素_半乳糖基化殼聚糖混合溶液滴入正在攪拌中的含乳化劑的油相 中，得到白色乳液；并向該白色乳液中緩慢加入交聯(lián)劑，充分?jǐn)嚢枋顾嘟宦?lián)固化；(c)將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態(tài)的pH為9-10的極性溶劑中，并繼續(xù) 攪拌40-60分鐘，過(guò)濾得到互不粘連的微球；(d)固化所述微球并除去表面的油相，篩濾得到200-500 μ m的微球；(e)除去微球中的殘留的交聯(lián)劑，并冷凍干燥，得到所述大孔微載體。優(yōu)選地，所述乳化劑為司班80，油相為液體石蠟。所述交聯(lián)劑優(yōu)選為戊二醛。 所述極性溶劑優(yōu)選為異丙醇、乙醇和/或丙酮。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述步驟(e)中的冷凍干燥之前還包括用高濃 度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，在所述步驟(e)之后還包括消毒步驟。所述消 毒步驟優(yōu)選為以鈷60-γ射線輻照或浸泡在蒸餾水、PBS溶液中高壓蒸汽滅菌。本發(fā)明的大孔微載體在材料中引入了肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性 配體、肝靶向基團(tuán)——半乳糖基。因此，該微載體具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在絲素/半乳 糖基化殼聚糖(SF/GC)大孔微載體支架材料上的黏附性能，使其具有肝細(xì)胞特異性，適 合于大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞。


圖1是本發(fā)明的大孔微載體的1HNMR譜圖；圖2是本發(fā)明的大孔微載體的FITR譜圖；圖3是本發(fā)明的大孔微載體在倒置顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察(40X)；圖4是本發(fā)明的大孔微載體的SEM圖片；圖5是本發(fā)明的大孔微載體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)的SEM圖片；圖6顯示CL-I細(xì)胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)第6天時(shí)在倒置顯微鏡下觀察到 的圖像；圖7顯示CL-I細(xì)胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)第8天時(shí)在掃描電鏡(SEM)下 觀察到的圖像；圖8顯示CL-I細(xì) 胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)第8天時(shí)在掃描電鏡(SEM)下 觀察到的圖像的進(jìn)一步放大圖。具體 實(shí)施方式為了更好地理解本發(fā)明的方法，下面將通過(guò)實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)證據(jù)進(jìn)一步闡述本發(fā) 明及其優(yōu)勢(shì)。在詳細(xì)描述以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)之前，首先需要定義和澄清一些術(shù)語(yǔ)。絲素蛋白是一種無(wú)生理活性的天然結(jié)構(gòu)性蛋白，主要由三種簡(jiǎn)單的氨基酸甘 氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們占蛋白總量的大概85%。絲素蛋白有良好的生物相容 性，無(wú)毒，無(wú)刺激性；絲素蛋白有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)混合結(jié)構(gòu)存在，整體上帶負(fù)電，絲 素非結(jié)晶區(qū)有許多堿性氨基酸，對(duì)細(xì)胞有一定程度的吸附作用，故能吸收細(xì)胞附著在其 上面。正是由于具有上述性質(zhì)，絲素蛋白在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。而將 其用于細(xì)胞培養(yǎng)的基質(zhì)，或?qū)σ恍┥锔叻肿舆M(jìn)行修飾，改善它們的生物性能，使其適 用于組織工程，更是近年來(lái)絲素蛋白研究的熱點(diǎn)。上述優(yōu)異的生物學(xué)特性為絲素蛋白成 為細(xì)胞培養(yǎng)和組織工程支架材料的應(yīng)用建立了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。殼聚糖是近年來(lái)在生物醫(yī)藥、組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用的一種天然生物高分 子，不僅具有生物功能性、生物相容性、低毒性及幾乎無(wú)過(guò)敏性等特性而且還具有高化 學(xué)反應(yīng)活性，易于被一些化學(xué)試劑修飾，可通過(guò)各種方法對(duì)其進(jìn)行性質(zhì)改良，而半乳糖 基是肝細(xì)胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體，具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基 質(zhì)支架材料上的黏附性能。在EDC和NHS的活化作用下，將半乳糖基引入到殼聚糖的 結(jié)構(gòu)中制備半乳糖基化殼聚糖，再與其他材料復(fù)合，可誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì) 支架材料上的黏附和增殖行為。下面通過(guò)具體的實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例一1)絲素蛋白的制備將75g生蠶絲在2L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸0.5小時(shí)， 重復(fù)2次，然后用大量蒸餾水清洗以去除絲膠蛋白，60-70°C下烘干，獲絲素蛋白。將適 量絲素蛋白在80士2°C下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1 8 2)三元溶液中，在 室溫條件下蒸餾水透析3天，去除溶液中的鹽和乙醇，過(guò)濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲 素蛋白的水溶液。將絲素蛋白水溶液在50士2°C、50-60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s，獲得濃度約 7-10w/v%的絲素蛋白溶液；2)半乳糖基化殼聚糖(GC)的制備稱取2.2g殼聚糖，溶于30_40ml 2.0%的醋 酸水溶液中，再加適量TEMED/HC1的緩沖溶液(pH 4.7)將殼聚糖溶液稀釋至4w/v%， 再分別加入0.14gNHS、0.6g EDC和2.2g乳糖酸(LA)，在室溫下攪拌反應(yīng)72h后，蒸餾 水透析4天，即得到半乳糖基化殼聚糖(GC)溶液，蒸發(fā)部分水分濃縮至4w/v%。3)配制40ml絲素-半乳糖基化殼聚糖混合溶液，絲素蛋白、半乳糖基化殼聚糖 質(zhì)量比為6 4，終濃度為4w/v%;在加入油相之前以4ml 0.5%戊二醛溶液預(yù)交聯(lián)15-30 分鐘；4)取一定量160ml的液體石蠟加入至500ml燒杯中，然后加入6.4ml司班80， 混合均勻后以250轉(zhuǎn)/分恒速攪拌，將上述預(yù)交聯(lián)后的絲素_半乳糖基化殼聚糖混合溶液 緩慢滴加到油相中，在室溫下繼續(xù)維持原轉(zhuǎn)速攪拌約30分鐘，得到白色乳液，向上述乳 液中緩慢加入3ml 2.5%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，使水相交聯(lián)固化；5)取IOOml的異丙醇溶液，往其中加入相同體積的去離子水，再滴加NaOH稀溶液，調(diào)節(jié)PH至9-10;6)將5)中溶液以250轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，?)中的白色乳液緩慢加入其中，繼續(xù)攪拌 45分鐘。然后過(guò)濾，得到互不粘連的微球，將微球置于4°C冰箱中6小時(shí)，使微球充分 固化；7)將微球用如5)所述稀釋過(guò)的異丙醇溶液、石油醚、去離子水洗滌，去除表面 的油相；然后篩分出200-500 μ m的微球； 8)將篩分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡3小時(shí)，除去未反應(yīng)的戊二醛； 再用大量蒸餾水洗滌；將洗滌干凈后的微球用40%蔗糖溶液浸泡3-5分鐘，然后倒去多 余的蔗糖溶液；將上述浸泡過(guò)蔗糖溶液的微球置于_20°C冰箱中，冷凍48小時(shí)，然后冷 凍干燥48小時(shí)，得到大孔微載體；將大孔微載體分裝后，鈷60-γ射線輻照消毒，備用。實(shí)施例二1)絲素蛋白的制備將75g生蠶絲在4L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸0.5小時(shí)， 重復(fù)2次，然后用大量蒸餾水清洗以去除絲膠蛋白，60-70°C下烘干，獲絲素蛋白。將適 量絲素蛋白在80°C下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1 8 2)三元溶液中，在室溫 條件下蒸餾水透析3天，去除溶液中的鹽、乙醇以及其他小分子，再過(guò)濾去除不溶的雜 質(zhì)，制備出絲素蛋白的水溶液。將絲素蛋白水溶液在50士2°C、50-60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s， 獲得濃度約絲素蛋白溶液；2)半乳糖基化殼聚糖(GC)的制備稱取l.lg殼聚糖，溶于15_20ml 2.0%的醋 酸水溶液中，再加適量TEMED/HC1的緩沖溶液(pH4.7)將殼聚糖溶液稀釋至4w/v%， 再分別加入0.07gNHS、0.3g EDC和l.lg乳糖酸(LA)，在室溫下攪拌反應(yīng)72h后，蒸餾 水透析3天，即得到半乳糖基化殼聚糖(GC)溶液，蒸發(fā)部分水分濃縮至4w/v%。3)配制40ml絲素-半乳糖基化殼聚糖-殼聚糖混合溶液，絲素蛋白、半乳糖基 化殼聚糖、殼聚糖質(zhì)量比為3 1 1，混合溶液終濃度為4w/V%，攪拌均勻；4)取一定量160ml的液體石蠟加入至500ml燒杯中，然后加入6.4ml司班80， 混合均勻后以200轉(zhuǎn)/分恒速攪拌，將上述絲素_半乳糖基化殼聚糖_殼聚糖混合溶液緩 慢滴加到不斷攪拌的油相中，在室溫下繼續(xù)維持原轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘，得到白色乳液，向 上述乳液中緩慢加入4ml 2.5%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，使水相交聯(lián)固化；5)取IOOml的異丙醇溶液，往其中加入相同體積的蒸餾水，再滴加NaOH稀溶 液，調(diào)節(jié)PH至9-10;6)將5)中稀釋過(guò)的異丙醇溶液以300轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，?)中的白色乳液緩慢加入 其中，繼續(xù)攪拌45分鐘。然后過(guò)濾，得到互不粘連的微球，將微球置于4°C冰箱中6小 時(shí)，使微球充分固化；7)將微球用上述稀釋過(guò)的異丙醇溶液、石油醚、去離子水洗滌，去除表面的油 相；然后篩分出200-400 μ m的微球；8)將篩分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡2小時(shí)，除去未反應(yīng)的戊二醛； 再用大量蒸餾水洗滌；將洗滌干凈后的微球用40%蔗糖溶液浸泡3-5分鐘，然后倒去多 余的蔗糖溶液；將上述浸泡過(guò)蔗糖溶液的微球置于_20°C冰箱中，冷凍48小時(shí)，然后冷 凍干燥48小時(shí)，即得到大孔微載體；將大孔微載體分裝后，鈷60-γ射線輻照消毒，備用。實(shí)施例三
1)絲素蛋白的制備將75g生蠶絲在2L的5g/L的碳酸鈉溶液中煮沸0.5小時(shí)， 重復(fù)2次，然后用大量蒸餾水清洗以去除絲膠蛋白，60-70°C下烘干，獲絲素蛋白。將適 量絲素蛋白在80士2°c下溶解在氯化鈣/水/乙醇(摩爾比1 8 2)三元溶液中，在 室溫條件下蒸餾水透析3天，去除溶液中的鹽和乙醇，過(guò)濾去除不溶的雜質(zhì)，制備出絲 素蛋白的水溶液。將絲素蛋白水溶液在50士2°C、50-60轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢铦饪s，獲得濃度約 7-10w/v%的絲素蛋白溶液；2)半乳糖基化殼聚糖(GC)的制備稱取2.2g殼聚糖，溶于30_40ml 2.0%的醋 酸水溶液中，再加適量TEMED/HC1的緩沖溶液(pH4.7)將殼聚糖溶液稀釋至4w/v%， 再分別加入0.14gNHS、0.6g EDC和2.2g乳糖酸(LA)，在室溫下攪拌反應(yīng)72h后，蒸餾 水透析4天，即得到半乳糖基化殼聚糖(GC)溶液，蒸發(fā)部分水分濃縮至4w/v%。3)配制30ml絲素-半乳糖基化殼聚糖-殼聚糖混合溶液，絲素蛋白、半乳糖基 化殼聚糖、殼聚糖質(zhì)量比為5 3 2，混合溶液終濃度為5w/V%，攪拌均勻；4)取一定量150ml的液體石蠟加入至500ml燒杯中，然后加入6ml司班80，混 合均勻后以250轉(zhuǎn)/分恒速攪拌，將上述絲素_半乳糖基化殼聚糖_殼聚糖混合溶液緩慢 滴加到不斷攪拌的油相中，在室溫下繼續(xù)維持原轉(zhuǎn)速攪拌30分鐘，得到白色乳液，向上 述乳液中緩慢加入3ml 2.5%戊二醛溶液，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，使水相交聯(lián)固化；5)取IOOml的異丙醇溶液，往其中加入相同體積的蒸餾水，再滴加NaOH稀溶 液，調(diào)節(jié)PH至9-10;6)將5)中稀釋過(guò)的異丙醇溶液以300轉(zhuǎn)/分?jǐn)嚢?，?)中的白色乳液緩慢加入 其中，繼續(xù)攪拌45分鐘。然后過(guò)濾，得到互不粘連的微球，將微球置于4°C冰箱中6小 時(shí)，使微球充分固化；7)將微球用上述稀釋過(guò)的異丙醇溶液、石油醚、去離子水洗滌，去除表面的油 相；然后篩分出200-400 μ m的微球；8)將篩分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡4小時(shí)，除去未反應(yīng)的戊二醛； 再用大量蒸餾水洗滌；將洗滌干凈后的微球用40%蔗糖溶液浸泡3-5分鐘，然后倒去多 余的蔗糖溶液；將上述浸泡過(guò)蔗糖溶液的微球置于_20°C冰箱中，冷凍48小時(shí)，然后冷 凍干燥48小時(shí)，即得到大孔微載體；將大孔微載體分裝后，鈷60-γ射線輻照消毒，備用。實(shí)施例四將上述實(shí)施例所得大孔微載體進(jìn)行nmr分析和紅外分析，分別得到如圖1和圖 2所示的1hnmr譜圖和fitr譜圖。將上述大孔微載體在倒置顯微鏡和掃描電鏡下觀察， 得到如圖3-5的圖像。其中，圖1半乳糖基化殼聚糖(gc)的1hnmr譜分析，箭頭所示 為半乳糖基的特征峰，gc的1hnmr歸屬如下1hnmrgoomhz, d2o/f3ccooh) d 1.952 (-coch3 中的 H)，4.755 (Hl)，4.131，4.415 (hl'，he), 3.3—4.0 (H3，H4, H5, H6, H2'，H3'，H4'，H5'，H6'，Ha, Hb, Hd, He), 3.066 (H2),證實(shí)半乳 糖基已經(jīng)通過(guò)化學(xué)交聯(lián)，共價(jià)結(jié)合到殼聚糖(cs)的分子鏈上；圖2為sf/cs (藍(lán)色)與 sf/gc (紅色)大孔微載體材料的fitr譜圖，由于乳糖酸的羧酸基團(tuán)和殼聚糖的氨基反應(yīng)形成酰胺鍵，(右邊箭頭所示)從而酰胺鍵的吸收峰I和II發(fā)生了化學(xué)位移，且峰值增 寬，1070.7cm-l為半乳糖糖基的C-O伸展骨架振動(dòng)的吸收峰。另外，由于殼聚糖接枝半 乳糖基后，使OH的數(shù)目大大增加，所以O(shè)H峰變寬變強(qiáng)(左邊箭頭所示)。圖3為倒置 顯微鏡下觀察SF/GC大孔微載體該大孔微載體為白色或淡黃色，呈半透明的球形；其 內(nèi)部疏松多孔，孔結(jié)構(gòu)分布均勻；輕輕晃動(dòng)時(shí)能清楚地觀察到其三維立體結(jié)構(gòu)。該大孔 微載體內(nèi)部疏松多孔的結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了比表面積，并提供了較大的空體積，能將細(xì)胞固定在 孔內(nèi)生長(zhǎng)，且便于觀察，適合用于肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)；圖4a、4b為掃描電鏡結(jié)果，可見(jiàn) 微載體表面呈多孔結(jié)構(gòu)，開(kāi)口向外，呈喇叭狀，孔結(jié)構(gòu)分布較均勻。相比于市售的大孔 微載體，該微載體孔徑更大，且開(kāi)口向外；利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)，并有足夠大的孔隙使細(xì) 胞能夠長(zhǎng)入微載體內(nèi)部；圖5為較大的SF/GC大孔微載體的剖面圖，可見(jiàn)其內(nèi)部亦為疏 松多孔結(jié)構(gòu)，且孔與孔之間相互連通，細(xì)胞能夠在其內(nèi)部遷移生長(zhǎng)，有利于內(nèi)部的物質(zhì) 交換。將本發(fā)明的大孔微載體滅菌后，以PBS洗滌3次，然后使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基浸泡過(guò) 夜，充分溶脹；隨后，將大孔微載體加入48孔培養(yǎng)板中，然后滴加肝細(xì)胞CL-I懸液， 將CL-I細(xì)胞與上述大孔微載體材料共培養(yǎng)，隔日換液，換液時(shí)觀察肝細(xì)胞在材料上的黏 附、增殖及肝細(xì)胞形態(tài)變化等生長(zhǎng)情況。圖6顯示CL-I細(xì)胞與SF/GC大孔微載體在多孔 培養(yǎng)板中共培養(yǎng)第6天時(shí)在倒置顯微鏡下觀察到的圖像，可見(jiàn)細(xì)胞能夠長(zhǎng)入大孔微載體 內(nèi)部，呈多細(xì)胞聚集的團(tuán)塊，細(xì)胞呈球形體生長(zhǎng)且很好地貼附在載體上；圖7顯示CL-I 細(xì)胞與SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)第8天時(shí)在掃描電鏡(SEM)下觀察到的圖像，可見(jiàn)細(xì) 胞呈球形，細(xì)胞能夠黏附在大孔微載體上生長(zhǎng)，呈多細(xì)胞聚集的團(tuán)塊，由于肝細(xì)胞表面 ASGPR和支架上半乳糖基之間的分子識(shí)別功能，細(xì)胞附著牢固。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng) 微載體之間開(kāi)始發(fā)生團(tuán)聚，細(xì)胞密度高，分泌較多的細(xì)胞外基質(zhì)；圖8顯示CL-I細(xì)胞與 SF/GC大孔微載體共培養(yǎng)第8天時(shí)在掃描電鏡(SEM)下觀察到的圖像的進(jìn)一步放大圖， 可見(jiàn)細(xì)胞呈球形，表面可見(jiàn)大量微絨毛結(jié)構(gòu)，細(xì)胞可進(jìn)入微載體內(nèi)部，聚集生長(zhǎng)。雖然本發(fā)明已經(jīng)參考具體的實(shí)施方 式進(jìn)行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)閱讀 上述描述后，將可以對(duì)本發(fā)明做出顯而易見(jiàn)的修改和修飾，而不違背本發(fā)明的意圖和本 質(zhì)。本發(fā)明有意將這些修改和修飾包括在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種大孔微載體，其是由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得 的球體，其中絲素蛋白的含量以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)占球體的50%-80%，半乳糖基化殼聚糖 的含量以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)占球體的15%-40%，所述載體的直徑為200-500 μ m，孔徑為 40-80 μ m。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的大孔微載體的方法，其包括(a)將絲素蛋白溶液與半乳糖基化殼聚糖溶液按比例混合，使得產(chǎn)生終濃度為4-7w/ 的絲素_半乳糖基化殼聚糖混合溶液；(b)將上述絲素_半乳糖基化殼聚糖混合溶液滴入正在攪拌中的含乳化劑的油相中， 得到白色乳液；并向該白色乳液中緩慢加入交聯(lián)劑，充分?jǐn)嚢枋顾嘟宦?lián)固化；(C)將步驟(b)中的白色乳液加入攪拌狀態(tài)的pH為9-10的極性溶劑中，并繼續(xù)攪拌 40-60分鐘，過(guò)濾得到互不粘連的微球；(d)以適當(dāng)稀釋的異丙醇或/和石油醚等有機(jī)溶劑除去所述微球表面的油相，篩濾得 到200-500 μ m的微球；(e)除去微球中的殘留的交聯(lián)劑，并冷凍干燥，得到所述大孔微載體。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳化劑為石蠟和油包水乳化劑如司班 80等。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述交聯(lián)劑為戊二醛。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述極性溶劑為異丙醇、乙醇和/或丙酮。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟(e)中的冷凍干燥之前還包括 用高濃度蔗糖溶液浸泡所述微球的步驟。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步驟(e)之后還包括消毒步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述消毒步驟為以鈷60-γ射線輻照或浸 泡在蒸餾水、PBS溶液中高壓蒸汽滅菌。
9.權(quán)利要求1所述的大孔微載體在肝細(xì)胞體外培養(yǎng)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種以絲素蛋白、半乳糖基化殼聚糖為主要原料的肝細(xì)胞特異性大孔微載體及其制備方法和用途。該大孔微載體是由絲素蛋白和半乳糖基化殼聚糖在交聯(lián)劑的作用下制得的球體，其中絲素蛋白的含量以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)占球體的50％-80％，半乳糖基化殼聚糖的含量以重量百分?jǐn)?shù)計(jì)占球體的15％-40％，所述載體的直徑為200-500μm，孔徑為40-80μm。該微載體具有誘導(dǎo)和提高肝細(xì)胞在絲素/半乳糖基化殼聚糖(SF/GC)大孔微載體支架材料上的黏附性能，使其具有肝細(xì)胞特異性，適合于大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N11/00GK102010601SQ20091004176
公開(kāi)日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2009年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月11日
發(fā)明者周煥城, 張志 , 潘明新, 胡志偉, 高毅, 龔獨(dú)輝 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院