專利名稱：一種酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
低聚寡糖(Oligosaccharide)是指由2-10個單糖通過糖苷鍵連接而形成的直鏈或支鏈的 低度聚合物。根據(jù)功能，低聚寡糖可以分為普通寡糖和功能性寡糖。普通寡糖可以被動物體 消化吸收，為機(jī)體提供能量和營養(yǎng)的同時也對腸道菌群生長有一定的促進(jìn)作用，常見的有蔗 糖、麥芽糖、乳糖、麥芽三糖、海藻糖等。功能性寡糖是指動物消化道內(nèi)的消化酶類對其不 發(fā)生作用，不能被機(jī)體消化、吸收，但卻為雙歧桿菌等腸道有益菌增殖所需的寡糖，包括甘 露寡糖、木寡糖、殼寡糖、果寡糖、乳果糖、半乳寡糖、異麥芽糖、葡萄寡糖和木寡糖等， 目前功能性寡糖已成為人們研究的熱點。由于功能性寡糖不能被機(jī)體消化吸收，也被稱為不 可消化性寡糖(Non-digestible oligosaccharides, NDOs)。近年來，寡糖不僅是一類功能食 品，更是作為一類新的生理活性物質(zhì)，在營養(yǎng)與保健、疾病診斷與防治、畜牧養(yǎng)殖、植物生 長調(diào)節(jié)及抗病害等方面都有著極大的應(yīng)用潛力。功能性寡糖的開發(fā)在國際上已經(jīng)發(fā)展成為一 個涉及醫(yī)學(xué)、化學(xué)、工程等學(xué)科，應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、農(nóng)業(yè)各領(lǐng)域的重要產(chǎn)業(yè)。
功能性寡糖的生理功能主要包括以下幾個方面(1)調(diào)整腸道菌群、(2)降低腸道pH、 (3)營養(yǎng)產(chǎn)物、(4)可以增加排泄物的干重、(5)減輕便秘癥狀、(6)抑制痢疾、(7)保護(hù)腸 胃系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)免受疾病傳染、(8)增強(qiáng)各類礦物元素的吸收、(9)對糖 代謝和脂代謝的有益影響、(10)降低癌癥威脅。正是由于上述生理功能，功能性寡糖被認(rèn)為 是功能食品，被稱為是"一種適時出現(xiàn)的、符合人類健康要求的、以對人體的積極作用為目 標(biāo)的、有生理功能的食品成分"。此外，功能性寡糖表現(xiàn)出優(yōu)于膳食纖維的特質(zhì)，因為它們 只需要很低的日劑量，并且只要按照推薦劑量攝取就不會引起腹瀉、痢疾等癥狀。它們甜度 輕微，沒有不好的質(zhì)地和味道，并且完全溶于水，具有良好的物理穩(wěn)定性，可以很好的與食 品 和飲品加工相聯(lián)合。
魔芋(葡萄糖甘露聚糖)是在亞洲地區(qū)廣泛分布的可食用性植物膠。特別是在我國，魔 芋被作為半纖維素類食品已經(jīng)有很長的歷史。但是到目前為止，這種豐富而廉價的半纖維素 資源除了部分作為低價值的食品添加劑之外都沒有得到充分的開發(fā)和利用。利用P-甘露聚糖 酶水解含甘露聚糖植物膠，可生成具有不同單糖分子組成的、性質(zhì)優(yōu)良的功能性寡糖——甘 露寡糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新篩選的產(chǎn)3 甘露聚糖酶的菌株，利用該菌株，
發(fā)酵制備e-甘露聚糖酶，并提供利用該e-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法。 發(fā)明概述
本發(fā)明利用產(chǎn)J3-甘露聚糖酶的菌株芽孢桿菌S""7/w sp. MSJ-5進(jìn)行發(fā)酵制備P-甘露聚 糖酶，再利用所制備的p-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備甘露寡糖,可方便低廉地實現(xiàn)甘露寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足市場對甘露寡糖的需求。 發(fā)明詳述
本發(fā)明的技術(shù)方案如下-
一、 產(chǎn)卩-甘露聚糖酶的菌株
本發(fā)明的產(chǎn)P-甘露聚糖酶的菌株為芽孢桿菌S"c77/"ssp.MSJ-5，篩自四川魔芋地土樣， 保藏號CCTCCNO: M208258,保藏單位是中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
二、 酶解魔芋粉制備甘露寡糖 一種酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法，步驟如下
(1) 菌株斜面培養(yǎng)
產(chǎn)P-甘露聚糖酶的菌株芽孢桿菌5"c!7/附sp.MSJ-5，保藏號CCTCCNO: M208258，菌株 斜面培養(yǎng)基角豆膠1.0-1.2份，(NH4)2S04 0.4-0.6份，K2HP04'3H20 0.8 1.0份，瓊脂 1.2-1.5份，水100份，以上均為重量份。
(2) 液體種子培養(yǎng)
液體種子培養(yǎng)基酵母粉2.0 2.5份、麩皮1.0 1.2份、K2HP(V3H2O0.8 1.0份、水100
份，均為重量份，下同。滅菌，冷卻，接種步驟(1)制得的芽孢桿菌^c說""p.MSJ-5的斜 面菌種的菌懸液5 10份，28 30'C，搖瓶轉(zhuǎn)速100 120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20-24小時，得芽 孢桿菌5a"7/z sp. MSJ-5的液體種子，待用。
(3) P-甘露聚糖酶液的發(fā)酵制備
將步驟(2)制得的芽孢桿菌^^7/M sp. MSJ-5的液體種子按重量份5~8份加入到產(chǎn)酶培 養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件是30 32。C、 27~34小時。
所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基是魔芋粉2.0 2.5份、酵母粉1.3 1.5份、豆粕1.(M.2份、K2HP(V3H20 0.4~0.5份，pH7.0 7.2。發(fā)酵制得的P-甘露聚糖酶液中P-甘露聚糖酶酶活為651i37 U/ml。
上述發(fā)酵酶液對甘露聚糖具有較高的酶活性、對可溶性淀粉僅有很低的酶解活性、對纖 維素和木聚糖沒有水解活性，說明該發(fā)酵酶液中主要以甘露聚糖酶為主。該甘露聚糖酶對 p-l,4-甘露聚糖(魔芋粉、角豆膠)有活性，而對a-l,6-甘露聚糖(酵母甘露聚糖)沒有活性， 因此，芽孢桿菌^"7/附sp.MSJ-5發(fā)酵生產(chǎn)的甘露聚糖酶為(3-甘露聚糖酶。以角豆膠為底物， 最適pH5.5， pH6 9， 50。C下保溫1小時，仍然能夠保持70%以上的酶活。以角豆膠為底物， 該酶對角豆膠的最適酶活溫度為50 6(TC， 35 65°C，保溫1小時，仍然能夠保持50%以上 的酶活性。
(4) p-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備甘露寡糖
用去離子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量為10 15mg/ml，將步驟(3)制得的(3-甘露聚糖 酶液按l3-甘露聚糖酶5 10U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0， 50 70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，50 55 。C，酶解20-30小時。酶解完畢，加溫至IO(TC，保溫5 10 min使酶滅活，冷卻后，10000 rpm、室溫離心5 10min，上清即為甘露寡糖液。
以上制備方法中未詳加限定的，均按本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)即可。 三、酶解產(chǎn)物的分析
將上述制備的酶解產(chǎn)物甘露寡糖液用孔徑為0.22 pm的硝酸纖維素膜過濾，采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)測定酶解液中的單糖和寡糖的 量，分析柱采用Aminex HPX-42C (Bio-rad， 300 mm><7.8 mm)，檢測器為RID-10A型示差 折光檢測器，以雙蒸水(ddH20)為流動相，流速為0.4ml/min，柱溫為75 °C。以購自Sigma 公司的甘露2-6糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測寡糖產(chǎn)物的聚合度(如圖1、圖2)。酶解分析結(jié)果表明， P-甘露聚糖酶在高效酶解魔芋粉的過程中產(chǎn)生聚合度為2-6的寡糖，其中三糖是主要產(chǎn)物。 最佳的酶解條件底物濃度，10mg/ml，酶濃度10U/mg魔芋粉。 本發(fā)明的方法的優(yōu)良效果如下 7、本發(fā)明提供的產(chǎn)(3-甘露聚糖酶的菌株——芽孢桿菌&d腸sp. MSJ-5 (保藏號CCTCC NO: M208258)具有較高的產(chǎn)酶活力，富含甘露聚糖的魔芋粉可誘導(dǎo)該菌株分泌p-甘露聚糖 酶。利用廉價的魔芋粉等為原料，發(fā)酵制得的P-甘露聚糖酶液中(3-甘露聚糖酶酶活為651±37 U/ml。
么本發(fā)明利用芽孢桿菌^^7^sp.MSJ-5發(fā)酵制得的P-甘露聚糖酶，可高效酶解魔芋粉， 并且在高效酶解魔芋粉的過程中產(chǎn)生產(chǎn)生的寡糖的聚合度為2-6的寡糖，其中三糖是主要產(chǎn) 物，而單糖甘露糖很少。
< 、魔芋(葡萄糖甘露聚糖)是在亞洲地區(qū)廣泛分布的可食用性植物膠。在我國，魔芋這 種豐富而廉價的半纖維素資源除了部分作為低價值的食品添加劑之外都沒有得到充分的開 發(fā)和利用，本發(fā)明為魔芋資源提供了一條高效生產(chǎn)高值化的甘露寡糖的途徑，滿足市場對甘 露寡糖的需求。


圖1是e -甘露聚糖酶酶解不同濃度的魔芋粉的高效液相色譜法(HPLC)分析測定結(jié)果。 用ddH20分別配制l、 5、 10mg/ml的魔芋粉，添加5 U/mg的0-甘露聚糖酶，按照本發(fā)明
方法步驟(4)中的條件酶解。橫坐標(biāo)是時間，單位分鐘；縱坐標(biāo)是折光度，單位伏特。
圖中曲線由上往下依次是魔芋粉含量10mg/ml、 5mg/ml、 1 mg/ml的酶解物、標(biāo)準(zhǔn)品混合溶 液HPLC洗脫曲線。其中的M1-M6依次是一糖峰、二糖峰、三糖峰、四糖峰、五糖峰、六 糖峰。結(jié)果表明，10mg/ml的魔芋粉是較好的底物濃度。
圖2是e-甘露聚糖酶酶解魔芋粉的高效液相色譜法(HPLC)分析測定結(jié)果。用ddH20 配置10mg/ml的魔芋粉，添加10U/mg的甘露聚糖酶，按照本發(fā)明方法步驟(4)中的 條件酶解，分別于20min、 lh、 2h、 12h、 24h和48h時取樣，HPLC測定產(chǎn)物的量。橫坐 標(biāo)是時間，單位分鐘；縱坐標(biāo)是折光度，單位伏特。圖中曲線是不同酶解時間的魔芋粉 酶解產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品甘露寡糖混合溶液的HPLC洗脫曲線。其中的M1-M6依次是一糖峰、二 糖峰、三糖峰、四糖峰、五糖峰、六糖峰。P-甘露聚糖酶在高效酶解魔芋粉的過程中產(chǎn)生 聚合度為2-6的寡糖，其中三糖是主要產(chǎn)物，從三糖峰的保留時間可以推斷，該三糖以葡萄 甘露三糖為主，伴有少量的甘露三糖。同時產(chǎn)物中還包含一定量的甘露二糖和很少量的甘露 糖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但不先于此。實施例中所用的菌株為芽孢桿菌 ^"7/附sp.MSJ-5，保藏號CCTCCNO: M208258;所用的魔芋粉購自重慶里茂農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)有限公司。
實施例酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法，步驟如下 (1)菌株斜面培養(yǎng)
產(chǎn)p-甘露聚糖酶的菌株芽孢桿菌^"7tosp.MSJ-5，保藏號CCTCCNO: M208258，菌株 斜面培養(yǎng)基角豆膠1.1份，(NH4)2S04 0.5份，K2HP04'3H20， 0.9份，瓊月旨1.3份，水100 份，均為重量份。劃線接種5。/。wt。斜面菌種按現(xiàn)有技術(shù)配置為菌懸液，待用。
(2)液體種子培養(yǎng)
液體種子培養(yǎng)基酵母粉2.2份、麩皮1.2份、K2HP(V3H20， 0.9份、水100份，均為 重量份，下同。滅菌，冷卻，接種芽孢桿菌^^7/""p.MSJ-5的斜面菌種的菌懸液7份，28 30°C，搖瓶轉(zhuǎn)速100 120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)22小時，作為液體種子待用。 (3) P-甘露聚糖酶的發(fā)酵
將步驟(2)制得的芽孢桿菌^"7/w sp. MSJ-5的液體種子按重量份5份加入到產(chǎn)酶培養(yǎng) 基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件是30 32'C、 27~34小時。產(chǎn)酶培養(yǎng)基是魔芋粉2.2份、酵母粉 1.4份、豆粕1.1份、K2HPCV3H2O0.45份，pH7.0~7.2。在此發(fā)酵條件下制得的P-甘露聚糖 酶酶活為651±37U/ml。
卩-甘露聚糖酶酶活測定方法吸取0.9ml5g/L (W/V)角豆膠溶液(pH6.0， 20 mmol/L 磷酸緩沖液)，于5(TC保溫5min,加入0.1 ml適當(dāng)稀釋的酶液，及1 ml 20 mmol/L磷酸緩 沖液(pH6.0)， 5(TC水浴反應(yīng)10min后，DNS法測酶解液中還原糖的含量。酶活力單位定 義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放lnmol甘露糖所需酶量為一個酶活單位(U)。 (4)酶解魔芋粉制備甘露寡糖
用去離子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量為10mg/ml,將步驟(3)制得的卩-甘露聚糖酶 液按P-甘露聚糖酶12U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0， 50 70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，53±1°C， 酶解24小時。酶解完畢，加溫至100'C，保溫8min使酶滅活，冷卻后，10000rpm、室溫離 心8min，上清即為甘露寡糖液。
權(quán)利要求
1. 產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，該菌株是芽孢桿菌Bacillussp.MSJ-5，保藏號CCTCC NOM208258，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
2. —種酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法，步驟如下(1) 菌株斜面培養(yǎng)產(chǎn)p-甘露聚糖酶的菌株芽孢桿菌^C//tosp.MSJ-5，保藏號CCTCCNO: M208258,菌 株斜面培養(yǎng)基角豆膠1.0~1.2份，(NH4)2S04 0.4-0.6份，K2HP04'3H20 0.8~1.0份，瓊脂 1.2-1.5份，水100份，均為重量份；(2) 液體種子培養(yǎng)液體種子培養(yǎng)基酵母粉2.0-2.5份、麩皮1.0 1.2份、K2HP04'3H20 0.8-1.0份、水 100份，均為重量份，下同;滅菌，冷卻，接種步驟(1)制得的芽孢桿菌^"7/附sp. MSJ-5 的斜面菌種的菌懸液5 10份，28 30°C，搖瓶轉(zhuǎn)速100 120轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)20 24小時， 得芽孢桿菌^ac!7/附sp. MSJ-5的液體種子，待用； (3) (3-甘露聚糖酶液的發(fā)酵制備將步驟(2)制得的芽孢桿菌&CZ//"S sp. MSJ-5的液體種子按重量份5~8份加入到產(chǎn)酶 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件是30 32'C、 27~34小時；產(chǎn)酶培養(yǎng)基是魔芋粉2.0-2.5份、酵母粉1.3~1.5份、豆粕1.0~1.2份、K2HP04'3H20 0.4~0.5份，pH 7.0 7.2;發(fā)酵制得的(3-甘露聚糖酶液中(3-甘露聚糖酶酶活為651±37 U/ml; (4)P-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備甘露寡糖用去離子水配制魔芋粉液使魔芋粉含量為10 15mg/ml，將步驟(3)制得的卩-甘露聚 糖酶液按P-甘露聚糖酶10 15U/mg魔芋粉加入魔芋粉液中，pH7.0， 50 70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，50 55 。C，酶解20-30小時;酶解完畢，加溫至10(TC，保溫5 10min使酶滅活，冷卻后，10000 rpm、 室溫離心5 10min，上清即為甘露寡糖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶解魔芋粉制備甘露寡糖的方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明利用產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株芽孢桿菌Bacillus sp.MSJ-5保藏號CCTCC NOM208258，進(jìn)行發(fā)酵制備β-甘露聚糖酶，再利用所制備的β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制備甘露寡糖，酶解條件50～55℃，50～70轉(zhuǎn)/分鐘攪拌，酶解20-30小時?？煞奖愕土貙崿F(xiàn)甘露寡糖的工業(yè)化生產(chǎn)，滿足市場對甘露寡糖的需求。
文檔編號C12P19/00GK101508966SQ200910014349
公開日2009年8月19日 申請日期2009年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月20日
發(fā)明者周百成, 孫彩云, 閔 張, 張玉忠, 陳秀蘭 申請人:山東大學(xué)