專利名稱：異環(huán)麥芽寡糖和異環(huán)麥芽寡糖合酶以及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有由通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖和異環(huán)麥芽寡糖合酶(isocyclomaltooligosaccharide synthase)及其制備方法和用途，詳細(xì)地講，涉及具有由通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖和異環(huán)麥芽寡糖合酶及其制備方法，產(chǎn)生異環(huán)麥芽寡糖合酶的微生物，編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，使用該酶的異環(huán)麥芽寡糖的生成方法和制備方法，以及含有異環(huán)麥芽寡糖的組合物。
通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)背景技術(shù)作為以葡萄糖作為組成糖的糖，已知有例如，以淀粉作為原料制備的淀粉部分分解物-直鏈淀粉，淀粉糊精，麥芽糖糊精，麥芽寡糖，異麥芽寡糖等。已知這些糖，通常在分子的一端具有非還原性末端，在另一端具有還原性末端，表現(xiàn)出還原性。一般而言，淀粉部分分解物的相當(dāng)于其固體物質(zhì)的還原力的大小可表示為葡糖當(dāng)量(DextroseEquivalent，DE)。已知，該值大的分解物，通常分子小，低粘度，甜味強(qiáng)，反應(yīng)性強(qiáng)，容易與氨基酸和蛋白質(zhì)等具有氨基的物質(zhì)發(fā)生氨基羰基反應(yīng)，變褐，發(fā)出惡臭，具有品質(zhì)容易劣化的性質(zhì)。
為了改善這些缺點(diǎn)，長(zhǎng)久以來(lái)一直期待一種減低其還原力或使之消失的簡(jiǎn)便方法。例如，已知有，如Journal of American ChemicalSociety，美國(guó)，1949年，第71卷，第353-358頁(yè)中公開(kāi)的，通過(guò)使軟化淀粉酶(macerans amylase)作用于淀粉，使6-8分子的葡萄糖生成通過(guò)α-1，4葡糖苷結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的α-，β-或γ-環(huán)糊精的方法?，F(xiàn)在，以工業(yè)規(guī)模由淀粉生產(chǎn)環(huán)糊精，這些環(huán)糊精由于它們所具有的非還原性，而且無(wú)味，可以用于有效利用其具有包合能力等特性的用途中。此外，首先，還已知有先前如特開(kāi)平7-143876號(hào)公報(bào)，特開(kāi)平7-213283號(hào)公報(bào)等中公開(kāi)的，本申請(qǐng)人通過(guò)使非還原性糖合酶和海藻糖游離酶作用于麥芽寡糖等淀粉部分分解物，使2分子的葡萄糖生成結(jié)合了α，α-1，1的海藻糖的方法?，F(xiàn)在，以工業(yè)規(guī)模由淀粉生產(chǎn)海藻糖，可以用于利用其還原性和溫和的、高品質(zhì)的甜味特性等的用途。進(jìn)而，還已知有先前如WO01/90338A1說(shuō)明書(shū)，WO02/055708A1說(shuō)明書(shū)，WO02/40659A1說(shuō)明書(shū)等中公開(kāi)的，本申請(qǐng)人通過(guò)使α-異麥芽糖基葡萄糖合酶和α-異麥芽糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉或其部分分解物，使4分子的葡萄糖生成具有通過(guò)α-1，3葡糖苷結(jié)合和α-1，6葡糖苷結(jié)合而相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)，即環(huán){→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖的方法。此外，進(jìn)而，還已知有，如特開(kāi)2005-95148號(hào)公報(bào)中公開(kāi)的，本申請(qǐng)人首先通過(guò)使環(huán)狀異麥芽糖基麥芽糖合酶作用于淀粉或其部分分解物，使4分子的葡萄糖生成具有通過(guò)α-1，4葡糖苷結(jié)合和α-1，6葡糖苷結(jié)合而相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)，即環(huán){→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖(別名為環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖)的方法。由于這些環(huán)狀四糖具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此具有包合能力，其表現(xiàn)出穩(wěn)定發(fā)揮性有機(jī)物的作用，并且是一種非還原性糖類，因此不發(fā)生氨基羰基反應(yīng)，不用擔(dān)心變褐和劣化，因此有望可以對(duì)其進(jìn)行利用和加工。
這樣一來(lái)，作為以葡萄糖作為組成糖的非還原性糖，葡萄糖聚合度為6-8的α-，β-，γ-環(huán)糊精，葡萄糖聚合度為2的α，α-海藻糖，葡萄糖聚合度為4的具有環(huán){→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖和具有{→6}-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}的結(jié)構(gòu)的環(huán)狀四糖(別名為環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖)通過(guò)利用各自的特性，可利用于或可有望利用于各種領(lǐng)域中。如果可以提供這些糖之外以葡萄糖作為組成糖的非還原性糖，可擴(kuò)大非還原性糖的選擇范圍，并且可有望在多種用途中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的課題是提供以葡萄糖作為組成糖的新型非還原性糖，提供在擴(kuò)大非還原性糖的選擇范圍的同時(shí)生成該非還原性糖的新酶和它們的生成方法和制備方法，編碼該酶的DNA，含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，以及含有該非還原性糖的組合物。
本發(fā)明人等為了解決上述課題，傾注于期待由淀粉部分分解物生成新型非還原性糖的全新的酶，廣泛尋找產(chǎn)生這種酶的微生物。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從岡山縣岡山市的土壤中新分離的桿菌屬(Bacillus)的微生物AM7株產(chǎn)生新的酶，通過(guò)這種酶的作用，由淀粉或其部分分解物等α-1，4葡聚糖大量生產(chǎn)具有通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖。此外，弄清楚了異環(huán)麥芽寡糖合酶的各種性質(zhì)，并且建立其制備方法，而且建立編碼該酶的DNA和含有該DNA的轉(zhuǎn)化體，進(jìn)而，建立由該酶生成異環(huán)麥芽寡糖的方法和使用該酶制備異環(huán)麥芽寡糖或含有這些的組合物的方法和用途，從而完成本發(fā)明。
通式1環(huán){-6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)也就是說(shuō)，本發(fā)明通過(guò)提供具有由通式1表示的結(jié)構(gòu)的新型異環(huán)麥芽寡糖和生成該糖的新型異環(huán)麥芽寡糖合酶和它們的生成方法和制備方法，以及編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，以及由含有異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖類組合物構(gòu)成飲食品，化妝品和藥物組合物，從而解決上述課題。
如果根據(jù)本發(fā)明，在擴(kuò)大以葡萄糖作為組成糖的非還原性糖的選擇范圍上，可以大量提供以往未知的新型環(huán)狀糖，異環(huán)麥芽寡糖可以在以飲食品，化妝品，藥物為代表的各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用。


圖1是表示糖I制品的HPLC洗脫模式的圖。
圖2是表示糖II制品的HPLC洗脫模式的圖。
圖3是表示糖I制品的1H-NMR譜圖的圖。
圖4是表示糖I制品的13C-NMR譜圖的圖。
圖5是表示本發(fā)明的異環(huán)麥芽五糖的結(jié)構(gòu)的圖。
圖6是表示糖II制品的1H-NMR譜圖的圖。
圖7是表示糖II制品的13C-NMR譜圖的圖。
圖8是表示本發(fā)明的異環(huán)麥芽六糖的結(jié)構(gòu)的圖。
圖9是表示異環(huán)麥芽寡糖合酶的最適溫度的圖。
圖10是表示異環(huán)麥芽寡糖合酶的最適pH的圖。
圖11是表示異環(huán)麥芽寡糖合酶的溫度穩(wěn)定性的圖。
圖12是表示異環(huán)麥芽寡糖合酶的pH穩(wěn)定性的圖。
圖13是表示重組DNA，pBAMH1的圖。圖中，黑色粗線表示的部分是編碼環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)來(lái)源的本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA。
圖14是表示異環(huán)麥芽寡糖合酶表達(dá)用的重組DNA，pETAM1的圖。圖中，黑色粗線表示的部分是編碼環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)來(lái)源的本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA。
符號(hào)的說(shuō)明a1位為結(jié)合了α-1，4葡糖苷的葡萄糖殘基b1位為結(jié)合了α-1，6葡糖苷的葡萄糖殘基具體實(shí)施方式
本發(fā)明中所謂異環(huán)麥芽寡糖，是指具有由下述通式1表示的結(jié)構(gòu)的環(huán)狀糖通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
所謂異環(huán)麥芽寡糖，在上述通式1中，存在n為4的異環(huán)麥芽寡糖，即麥芽五糖分子的還原末端葡萄糖的1位和非還原末端葡萄糖的6位羥基通過(guò)α-1，6葡糖苷結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的五糖(本說(shuō)明書(shū)中，稱為異環(huán)麥芽五糖)，和上述通式1中，存在n為5的異環(huán)麥芽寡糖，即麥芽六糖分子的還原末端葡萄糖的1位和非還原末端葡萄糖的6位羥基通過(guò)α-1，6葡糖苷結(jié)合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的六糖(本說(shuō)明書(shū)中，稱為異環(huán)麥芽六糖)。這些糖是本發(fā)明人首次從由土壤中獲得的微生物的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的以往未知的新糖，以葡萄糖作為組成糖的環(huán)狀的五糖或六糖只要具有上述結(jié)構(gòu)，無(wú)論其來(lái)源，形態(tài)，純度，制備方法，都包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明中所謂的異環(huán)麥芽寡糖合酶，是指作用于葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，催化分子間轉(zhuǎn)移反應(yīng)中在α-1，4葡聚糖的非還原末端葡萄糖的4位上通過(guò)α-1，4轉(zhuǎn)移，生成各種葡萄糖聚合度的α-1，4葡聚糖的歧化反應(yīng)，另一方面，在作用于葡萄糖聚合度為7的α-1，4葡聚糖(麥芽七糖)時(shí)，其催化在麥芽六糖單位切斷，通過(guò)該麥芽六糖的還原末端葡萄糖的1位α-1，6轉(zhuǎn)移到同一分子的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移反應(yīng)而環(huán)化生成異環(huán)麥芽六糖的反應(yīng)，在作用于葡萄糖聚合度為8的α-1，4葡聚糖時(shí)，催化在麥芽五糖或麥芽六糖單位切斷，通過(guò)該麥芽五糖或麥芽六糖的還原末端葡萄糖的1位α-1，6轉(zhuǎn)移到同一分子的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移反應(yīng)而環(huán)化生成異環(huán)麥芽五糖或異環(huán)麥芽六糖的反應(yīng)的所有酶。催化上述反應(yīng)的酶無(wú)需區(qū)別其來(lái)源，形態(tài)，粗酶或純化酶都包含于發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶中。
本發(fā)明中的異環(huán)麥芽寡糖合酶的酶活性可以以如下方式測(cè)定。使直鏈淀粉以1.25w/v％的終濃度溶解于含有1mM氯化鈣的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)中，以之作為底物液，在0.8ml該底物液中加入0.2ml酶液，在30℃下進(jìn)行30分鐘酶反應(yīng)，在約100℃下對(duì)該反應(yīng)液加熱10分鐘，使反應(yīng)停止后，通過(guò)每1g固體物質(zhì)加入4000單位的α-葡糖苷酶且每1g固體物質(zhì)加入250單位的葡萄糖淀粉酶，50℃下處理1小時(shí)，從而分解殘存的可溶性淀粉和夾雜的寡糖，用后述實(shí)驗(yàn)1記載的HPLC定量該處理液中的異環(huán)麥芽五糖量。異環(huán)麥芽寡糖合酶活性的1單位定義為在上述條件下1分鐘內(nèi)生成1μmol的異環(huán)麥芽五糖的酶量。
作為本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的具體例，可以例舉有例如具有下述物化性質(zhì)的異環(huán)麥芽寡糖合酶。
(1)分子量在SDS-凝膠電泳法中，分子量為106000±20000道爾頓。
(2)等電點(diǎn)通過(guò)含有兩性電解質(zhì)(Ampholine)的等電點(diǎn)電泳法中，pI7.5±0.5。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適溫度為50℃至55℃。
(4)最適pH在30℃、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適pH為pH4.5至8.0。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在35℃以下穩(wěn)定，1mM鈣離子存在下，在40℃以下穩(wěn)定。
(6)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH4.5至9.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
此外，一種具有上述物化性質(zhì)的本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶，也存在不僅具有上述物化性質(zhì)，而且具有序列表中的序列號(hào)1表示的氨基酸序列作為其N末端序列的情況。
本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶通常具有規(guī)定的氨基酸序列，作為其中的一個(gè)例子，可以例舉有，例如序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列或與之相同的氨基酸序列。作為具有與序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列相同的氨基酸序列的變異體酶，可以例舉有在保持作用于葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，生成通式1表示的異環(huán)麥芽寡糖的酶活性的范圍內(nèi)，具有序列號(hào)2表示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的氨基酸序列的酶，通常，合適的是對(duì)于序列號(hào)2表示的氨基酸序列具有60％以上，優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，最優(yōu)選90％以上的同源性的氨基酸序列的酶。
不過(guò)，具有上述物化性質(zhì)或氨基酸序列的異環(huán)麥芽寡糖合酶只不過(guò)是一例，具有與上述不同的物化性質(zhì)或N末端氨基酸序列的酶，只要生成異環(huán)麥芽寡糖，當(dāng)然也包含于本發(fā)明中。
本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶不受其來(lái)源的限制，作為優(yōu)選的來(lái)源，可以例舉有微生物，尤其適合使用由本發(fā)明人從土壤中分離的微生物AM7株或其變異株。以下，顯示的是具有異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的微生物AM7株的鑒定試驗(yàn)結(jié)果。并且，鑒定試驗(yàn)按照《微生物的分類和鑒定》(長(zhǎng)谷川武治編，學(xué)會(huì)出版中心，1985年)進(jìn)行。
<A細(xì)胞形態(tài)>
(1)肉湯瓊脂培養(yǎng)，27℃通常為0.5×2至0.7×5μm的桿菌。革蘭氏陽(yáng)性。具有運(yùn)動(dòng)性。具有橢圓形的孢子。在菌體的端點(diǎn)形成膨脹的孢子囊。
<B培養(yǎng)性質(zhì)>
(1)肉湯瓊脂平板培養(yǎng)，27℃形狀圓形，大小為3天內(nèi)為1-2mm。
周緣完整的邊緣隆起扁平狀光澤鈍光表面粗糙色調(diào)不透明，白色(2)肉湯瓊脂斜板培養(yǎng)，27℃生長(zhǎng)中等程度形狀絲狀<C生理學(xué)性質(zhì)>
(1)VP試驗(yàn)陰性(2)過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性(3)淀粉的加水分解陽(yáng)性(4)酪氨酸的分解陰性(5)苯丙氨酸脫氨化陰性(6)硝酸的還原陽(yáng)性(7)由D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露醇生成酸(8)生長(zhǎng)的范圍pH5.7-9.8，溫度10-37℃，NaCl濃度為0-2％(9)對(duì)氧的狀態(tài)通性厭氧性(10)DNA的GC含量50.7％基于以上的菌學(xué)性質(zhì)，參考《柏捷氏細(xì)菌分類學(xué)手冊(cè)》(Bergey’sManual of Systematic Bacteriology)，第2卷(1986年)，研究了其與公知菌的異同。其結(jié)果是，判斷為本菌是屬于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)屬的微生物。根據(jù)這些結(jié)果，本發(fā)明人等將本菌命名為新型微生物環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7，于平成16年8月25日以保藏號(hào)FERM BP-10111保藏于日本茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6所在的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心。
本發(fā)明的具有異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的微生物中包含上述菌本身，其變異株，進(jìn)而還包括具有異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的其它微生物和其變異株等。
所謂本發(fā)明的DNA，是指編碼上述異環(huán)麥芽寡糖合酶的所有DNA。本發(fā)明的DNA只要是編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA，其可以是天然來(lái)源的DNA，也可以是人工合成的DNA。作為天然的來(lái)源，可以例舉有例如包括環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)的桿菌屬的微生物，可以從這些菌體中獲得含有本發(fā)明的DNA的基因DNA。也就是說(shuō)，將這些微生物接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，在需氧條件下培養(yǎng)約1至3天后，從培養(yǎng)物中收集菌體，通過(guò)用溶菌酶或β-葡聚糖酶等溶解細(xì)胞壁的酶或超聲波進(jìn)行處理，使含有該DNA的基因溶出到菌體外。此時(shí)，也可以組合使用蛋白酶等蛋白質(zhì)水解酶，或使SDS等表面活性劑共存下進(jìn)行凍融。如果對(duì)這樣得到的處理物例如使用酚萃取、醇沉淀、離心分離、核酸酶處理等通常用的方法，可以得到目的基因DNA。為了人工合成本發(fā)明的DNA，例如可以根據(jù)序列表中序列號(hào)2所示的氨基酸序列進(jìn)行化學(xué)合成。另外，也可以以含有該DNA的基因DNA作為模板，使用作為適當(dāng)引物的化學(xué)合成DNA，有效實(shí)施PCR合成。
本發(fā)明的DNA通常具有規(guī)定的堿基序列，作為其的一個(gè)例子，可以例舉有，例如序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列或與之相同的堿基序列。作為具有與序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列相同的堿基序列的變異體DNA，可以例舉有在保持編碼酶的活性的范圍內(nèi)，具有序列號(hào)3表示的堿基序列中缺失、取代或添加了1個(gè)或2個(gè)以上的堿基的堿基序列的DNA，通常，合適的是對(duì)于序列號(hào)3表示的堿基序列具有60％以上，優(yōu)選70％以上，更優(yōu)選80％以上，最優(yōu)選90％以上的同源性的堿基序列的DNA。此外，基于基因編碼的簡(jiǎn)并，不改變其編碼的酶的氨基酸序列且1個(gè)或2個(gè)以上的堿基被取代為其它堿基的DNA當(dāng)然也包含于本發(fā)明的DNA中。
通過(guò)在可自我復(fù)制的合適載體中插入本發(fā)明的DNA可以有效實(shí)施重組DNA。重組DNA通常由DNA和可以自我復(fù)制的載體組成，如果可以獲得DNA，就可以比常規(guī)方法的重組DNA技術(shù)更容易地制備重組DNA。作為這種載體的例子，可以例舉有，例如pBR 322、pUC18、pBluescriptII SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等質(zhì)粒載體和λgt·λC、λgt·λB、p11、φ1和φ105等噬菌體載體。其中，用大腸桿菌表達(dá)本發(fā)明的DNA時(shí)，pBR 322、pUC18、Bluescript IISK(+)、λgt·λC和λgt·λB合適，另一方面，用枯草桿菌表達(dá)時(shí)，pUB110、pTZ4、pC194、p11、φ1和φ105合適。pHV14、TRp7、YEp7和pBS7在二種以上的宿主內(nèi)使重組DNA復(fù)制時(shí)有用。為了在上述載體中插入DNA，可以采用該領(lǐng)域中通常用的方法。具體來(lái)說(shuō)，首先將含有DNA的基因和可自我復(fù)制的載體用限制酶和/或超聲波切斷，然后對(duì)生成的DNA片段和載體片段進(jìn)行連接。如果利用對(duì)基因和載體切斷處核苷酸特異性作用的限制酶，特別是II型限制酶，詳細(xì)地講如果使用Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等，容易對(duì)DNA片段和載體片段進(jìn)行連接。根據(jù)需要，可以將兩者進(jìn)行退火后，在生物體內(nèi)或生物體外使DNA連接酶作用。這樣得到的重組DNA導(dǎo)入適宜宿主之后，作成轉(zhuǎn)化體，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，可以無(wú)限復(fù)制。
這樣獲得的重組DNA可以導(dǎo)入于以大腸桿菌、枯草桿菌、放線菌、酵母為代表地合適的宿主微生物中。為了獲得轉(zhuǎn)化體，可以使用菌落雜交法，也可以在含有聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，選擇由該糖生成異環(huán)麥芽寡糖的轉(zhuǎn)化體。
用于包含本發(fā)明的具有異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的轉(zhuǎn)化體的微生物的培養(yǎng)的培養(yǎng)基如果是微生物可以生長(zhǎng)，可以是產(chǎn)生異環(huán)麥芽寡糖合酶的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，也可以是合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基的任一種。作為碳源，如果是微生物生長(zhǎng)可以利用的物質(zhì)，可使用例如植物來(lái)源的淀粉或フイトゲリコ一ゲン，動(dòng)物或植物來(lái)源的糖原或支鏈淀粉，和其部分分解物或葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，糖蜜等糖類，以及檸檬酸，琥珀酸等有機(jī)酸。這些碳源在培養(yǎng)基中的濃度可以通過(guò)碳源的種類進(jìn)行適當(dāng)選擇。作為氮源，可以適當(dāng)使用例如銨鹽，硝酸鹽等無(wú)機(jī)氮化合物以及例如尿素，玉米漿，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物，肉湯等含氮有機(jī)物。此外，作為無(wú)機(jī)成分，可以適當(dāng)使用例如鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽，錳鹽，鋅鹽，鐵鹽，銅鹽，鉬鹽，鈷鹽等鹽類。進(jìn)而，根據(jù)需要，可以適當(dāng)使用氨基酸，維生素等。
培養(yǎng)通常在選自于溫度為15至37℃，pH在5.5至10的范圍內(nèi)，優(yōu)選溫度為20-34℃下，pH5.5-8.5的范圍內(nèi)的條件下進(jìn)行需氧培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間如果是該微生物可以增殖的時(shí)間，優(yōu)選為10小時(shí)至150小時(shí)。此外，培養(yǎng)條件中培養(yǎng)液的溶解氧濃度沒(méi)有特別的限定，通常，優(yōu)選為0.5-20ppm。為此，適當(dāng)采用調(diào)節(jié)通氣量，或是攪拌等手段。此外，培養(yǎng)方式可以是分次培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中的任一種方式。
這樣培養(yǎng)微生物后，回收含有本發(fā)明的酶的培養(yǎng)物。主要在培養(yǎng)物的除菌液中發(fā)現(xiàn)了異環(huán)麥芽寡糖合酶活性，可以收集除菌液作為粗酶液，也可以使用所有培養(yǎng)物作為粗酶液。為了從培養(yǎng)物中除去菌體，可以采用公知的固液分離法。例如，可以適當(dāng)采用將培養(yǎng)物本身離心分離的方法或使用預(yù)涂濾器過(guò)濾培養(yǎng)物等過(guò)濾分離的方法，通過(guò)平膜、中空纖維膜等膜過(guò)濾分離的方法等。盡管除菌液可以原封不動(dòng)的用作粗酶液，但一般可濃縮使用。作為濃縮法，可以采用例如硫酸氨鹽析，丙酮和乙醇沉淀，使用平膜、中空纖維膜等的膜濃縮法等。
進(jìn)而，還可以使用具有異環(huán)麥芽寡糖合酶活性的除菌液及其濃縮液，通過(guò)公知的方法進(jìn)行固定。例如，可以適當(dāng)與離子交換體的結(jié)合法，樹(shù)脂和膜等的共價(jià)鍵結(jié)合和吸收法，以及利用高分子物質(zhì)的內(nèi)包法。
如上所述，本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶，可照原樣或經(jīng)濃縮使用其粗酶液，但是根據(jù)需要，也可以通過(guò)公知的方法，再分離純化后使用。例如，對(duì)通過(guò)硫酸氨鹽析培養(yǎng)液的處理物濃縮的粗酶制品進(jìn)行透析后，通過(guò)使用“DEAE Toyopearl 650S”樹(shù)脂的陰離子交換柱層析、接著采用“Phenyl-Toyopearl 650M”樹(shù)脂的疏水性層析進(jìn)行純化，可以獲得作為在電泳中單一的酶的本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶。
異環(huán)麥芽寡糖合酶為重組型酶時(shí)，根據(jù)宿主的種類不同，酶會(huì)積蓄在菌體中。這種情況下，可以原樣使用菌體或培養(yǎng)物，但是，通常也可以有效實(shí)施以下方法在使用前，根據(jù)需要，通過(guò)滲壓休克或表面活性劑從菌體中提取后，或通過(guò)超聲波或細(xì)胞壁溶解酶破碎菌體后，通過(guò)過(guò)濾，離心分離等從菌體或菌體破碎物中分離重組型酶后，再使用。
這樣獲得的異環(huán)麥芽寡糖合酶，具體而言，也存在具有以下物化性質(zhì)的情況。
(1)分子量在SDS-凝膠電泳法中，分子量為106000±20000道爾頓。
(2)等電點(diǎn)通過(guò)含有兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳法中，pI7.5±0.5。
(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適溫度為50℃至55℃。
(4)最適pH在30℃、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適pH為pH4.5至8.0。
(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在35℃以下穩(wěn)定。
在1mM鈣離子存在下，在40℃以下穩(wěn)定。
(6)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH4.5至9.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。
(7)N末端氨基酸序列具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列，也就是丙氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-蘇氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-精氨酸-苯丙氨酸的氨基酸序列。
作為本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的底物的葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，可以例舉有淀粉，直鏈淀粉，支鏈淀粉，糖原等，和由淀粉酶或酸等對(duì)它們加水分解獲得的淀粉糊精，麥芽糖糊精，麥芽寡糖等部分分解物。作為用淀粉酶分解的分解物，可以使用利用例如Handbook of Amylases and Related Enzymes(1988年)パ-ガモン·Press公司(東京)(1988年)記載的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、麥芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麥芽五糖生成淀粉酶、麥芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶來(lái)分解淀粉，直鏈淀粉，支鏈淀粉，糖原等獲得的部分分解物。另外，在制備部分分解物時(shí)也可以使支鏈淀粉酶(3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉脫支酶隨意作用。
作為底物的淀粉，例如可以使用玉米、小麥、米等來(lái)源的地上淀粉，也可以使用土豆、甘薯、木薯等來(lái)源的地下淀粉，優(yōu)選使用淀粉經(jīng)糊化和/或液化的溶液。由于該淀粉部分分解的程度越低，異環(huán)麥芽寡糖的產(chǎn)率越高，因此DE在約20以下、優(yōu)選在約12以下、更優(yōu)選在約5以下的部分分解物合適。并且，本說(shuō)明書(shū)中所謂的異環(huán)麥芽寡糖生成率是指用下式計(jì)算的值異環(huán)麥芽寡糖生成率(％)＝{(生成的異環(huán)麥芽寡糖的質(zhì)量)/(反應(yīng)液中的所有糖的質(zhì)量)}×100。
在使本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶作用于底物時(shí)，其底物的濃度沒(méi)有特別的限定，例如，即使在使用底物濃度為0.1％(w/v)的較低濃度溶液時(shí)，本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶反應(yīng)也可進(jìn)行，生成異環(huán)麥芽寡糖。工業(yè)上，底物濃度為1％(w/v)以上合適，在該條件下，可以有效生成異環(huán)麥芽寡糖?？梢栽诜磻?yīng)溫度，也就是進(jìn)行反應(yīng)的溫度，即55℃附近下進(jìn)行。優(yōu)選使用30至45℃附近的溫度。反應(yīng)pH通?？梢哉{(diào)整到4.5至8的范圍內(nèi)，優(yōu)選是將pH調(diào)整到5.0至7.5的范圍內(nèi)。酶的使用量與反應(yīng)時(shí)間緊密相關(guān)，可以通過(guò)作為目的的酶反應(yīng)的進(jìn)行適當(dāng)選擇。
例如，通過(guò)使本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶作用于底物濃度為0.1％(w/v)的淀粉或其部分分解物或支鏈淀粉的水溶液，可以從淀粉或其部分分解物以約20％，從支鏈淀粉中以約30％的高異環(huán)麥芽寡糖生成率獲得本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖。由該異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生異環(huán)麥芽寡糖的生成機(jī)制推測(cè)如下。
(1)該酶作用于作為底物的葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖，分子間轉(zhuǎn)移反應(yīng)中，在α-1，4葡聚糖的非還原末端的4位羥基上通過(guò)α-1，4轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的歧化反應(yīng)，生成各種葡萄糖聚合度的α-1，4葡聚糖。
(2)該酶作用于葡萄糖聚合度為7的α-1，4葡聚糖(麥芽七糖)時(shí)，在麥芽六糖單位切斷，通過(guò)將該麥芽六糖的還原末端葡萄糖的1位轉(zhuǎn)移到同一分子的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的分子轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行環(huán)化，生成異環(huán)麥芽七糖和麥芽糖。
(3)該酶作用于葡萄糖聚合度為8以上的α-1，4葡聚糖時(shí)，在麥芽五糖或麥芽六糖單位切斷，通過(guò)該麥芽五糖或麥芽六糖的還原末端葡萄糖的1位α-1，6轉(zhuǎn)移到同一分子的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移反應(yīng)而環(huán)化，生成異環(huán)麥芽五糖或異環(huán)麥芽六糖和葡萄糖聚合度減少5或6的α-1，4葡聚糖。
(4)(2)和(3)中新產(chǎn)生的麥芽糖和α-1，4葡聚糖，由于再次受到(1)-(3)的反應(yīng)，而生成異環(huán)麥芽寡糖。
此外，在該異環(huán)麥芽寡糖生成反應(yīng)時(shí)，也可以有效實(shí)施通過(guò)與其它酶合用，使異環(huán)麥芽寡糖生成率提高。例如，可以有效實(shí)施通過(guò)聯(lián)合使用異環(huán)麥芽寡糖合酶和異淀粉酶或支鏈淀粉酶等淀粉脫支酶，使之作用于淀粉，從而使異環(huán)麥芽寡糖生成率進(jìn)一步提高。
也可以原樣使用由上述反應(yīng)獲得的反應(yīng)液作為含有異環(huán)麥芽寡糖的糖液。此外，根據(jù)需要，也可以使選自于α-淀粉酶，β-淀粉酶，葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1種或2種以上的酶作用于含有異環(huán)麥芽寡糖的糖液，加水分解夾雜的寡糖，以其作為含有異環(huán)麥芽寡糖的糖液來(lái)使用。此外，還可隨意實(shí)施通過(guò)添加氧將反應(yīng)液中殘留的還原性糖轉(zhuǎn)換為糖醇，使還原力消失等進(jìn)一步的加工處理。一般是，可以進(jìn)一步純化含有異環(huán)麥芽寡糖的糖液，再使用。作為純化方法，可以適當(dāng)采用糖純化中通常使用的方法，例如可以適當(dāng)采用用活性炭進(jìn)行脫色，用H型，OH型離子交換樹(shù)脂脫鹽，通過(guò)離子交換柱層析，活性炭柱層析，硅膠柱層析等柱層析進(jìn)行分級(jí)，用乙醇和丙酮等有機(jī)溶劑分級(jí)，用具有適度分離性能的膜進(jìn)行分離，進(jìn)而通過(guò)不利用異環(huán)麥芽寡糖而吸收分解夾雜的糖類的微生物，例如酵母等進(jìn)行發(fā)酵處理，或通過(guò)堿處理等分解除去殘留的還原性糖等一種或兩種以上的純化方法。
尤其是，作為工業(yè)的大量生產(chǎn)方法，采用離子交換柱層析是合適的。例如，例如通過(guò)使用特開(kāi)昭58-23799號(hào)公報(bào)、特開(kāi)昭58-72598號(hào)公報(bào)等中公開(kāi)的使用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的柱層析除去夾雜的糖，可以有效制造含有使目的物含量提高的異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖類。此時(shí)，可以隨意采用固定床方式、移動(dòng)床方法、類似移動(dòng)床方法中的任一種方法。
這樣得到的含有異環(huán)麥芽寡糖的水溶液或使其含量提高的糖水溶液，通常是含有相當(dāng)于固體的10質(zhì)量％以上，優(yōu)選40質(zhì)量％以上的異環(huán)麥芽寡糖的糖水溶液，通常，將其濃縮，做成糖漿狀制品。這種糖漿狀制品，可以再干燥，隨意制成非晶質(zhì)固狀物制品或非晶質(zhì)粉末狀制品。
此外，由于本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖具有包合能力，防止包合的香味成分、有效成分等揮散、防止品質(zhì)劣化，因此在穩(wěn)定，保持香味成分、有效成分方面極為優(yōu)異。此時(shí)，根據(jù)需要，可以通過(guò)聯(lián)合使用環(huán)糊精類、分支環(huán)糊精類、葡萄糖4分子通過(guò)α-1，3和α-1，6結(jié)合而相互結(jié)合的環(huán)狀四糖、分支環(huán)狀四糖類、葡萄糖4分子通過(guò)α-1，4和α-1，6結(jié)合而相互結(jié)合的環(huán)狀麥芽糖基麥芽糖，環(huán)葡聚糖類，環(huán)果聚糖類等其它環(huán)狀糖，通過(guò)包合能力有效實(shí)施穩(wěn)定性的強(qiáng)化。作為環(huán)糊精類等環(huán)狀糖，不必限定于高純度的糖，也可以利用低純度的環(huán)狀糖、例如大量麥芽糊精以及含有各種環(huán)狀糖的淀粉部分分解物。
而且，由于本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖無(wú)法被α-淀粉酶或α-葡糖苷酶實(shí)質(zhì)上分解，即使口服也無(wú)法消化吸收，是一種難消化性的糖，是一種無(wú)毒，無(wú)害的新型糖。
因此，本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖可以作為甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑等有效應(yīng)用于飲食品、嗜好品、飼料、餌料、化妝品、藥品等各種組合物中。
本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖可以原樣作為用于添加甜味的調(diào)味料來(lái)使用。如果需要，也可以與例如粉飴、葡萄糖、異構(gòu)化糖、砂糖、麥芽糖、海藻糖、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查爾酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、羅漢果甜味物、甘草甜素、ソ-マチン、sucralose、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等其它甜味劑，和糊精、淀粉、乳糖等增量劑混合使用。
此外，可以照原樣使用本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖的粉末狀制品，或者根據(jù)需要，與增量劑，賦形劑，結(jié)合劑等混合后，隨意做成顆粒、球狀、短棒狀、板狀、立方體、片劑等各種形狀再使用。
使用本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖的甜味與具有酸味、咸味、澀味、香味、苦味等其它味道的各種物質(zhì)充分調(diào)和，因?yàn)槟退嵝?、耐熱性?qiáng)，所以可以在使一般食品附上甜味、改善味道、改善品質(zhì)等中有效利用。
例如，可以作為醬油、粉末醬油、大醬、粉末大醬、未過(guò)濾的酒(もろみ)、醬菜、(撒在飯上)粉狀食品、蛋黃醬、調(diào)味品、食用醋、三杯醋、粉末飯卷醋、中國(guó)調(diào)料、天夫羅汁、面汁、醬汁、番茄醬、燒肉料汁、咖哩湯、燉(燜)食品的調(diào)料、湯料、湯汁調(diào)料、復(fù)合調(diào)味料、日式料酒、新日式料酒、餐用糖、咖啡用糖等各種調(diào)味料的甜味劑，并且也可以作為味道改良劑、品質(zhì)改良劑等有效實(shí)施。另外，可以在向例如干米餅、小方塊糯米點(diǎn)心、米花糖、求肥(皮糖樣點(diǎn)心)、餅類、豆沙包、米粉糕、餡類、羊羹、水羊羹、錦玉、果凍、蛋糕、麥芽糖球等各種日本點(diǎn)心、面包、餅干、椒鹽餅干、小糖餅、餡餅、布丁、加糖奶油漿、蛋奶羹、奶油填餡點(diǎn)心、華夫餅干、海棉狀點(diǎn)心、炸面圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛軋?zhí)?、水果糖等各種洋點(diǎn)心、冰淇淋、雪糕等冰糕、果汁、冰蜜汁類、花醬、花生醬、果泥等醬類、果子醬、橘子果醬、成果醬、糖果等果實(shí)、蔬菜的加工食品類、什錦醬菜、暴腌的成甜蘿卜、千枚漬、腌野薤等腌物類、日本羅卜咸菜素、腌白菜素等腌物的素、火腿、香腸等畜肉制品類、魚(yú)肉火腿、魚(yú)肉香腸、魚(yú)糕、筒狀魚(yú)卷、炸蝦(魚(yú))等魚(yú)肉制品、海膽、咸烏賊、醋海帶、尖墨魚(yú)干、料酒浸的河豚干、鱈、真鯛、蝦等田麩等各種珍味類、用海苔、野菜、墨魚(yú)干、小魚(yú)、貝等制造的用調(diào)料煮的制品類、煮豆、土豆沙拉、海帶卷等家常菜食品、乳制品、魚(yú)肉、畜肉、果實(shí)、蔬菜罐頭、罐裝類、合成酒、增釀酒、清酒、果酒、發(fā)泡酒、啤酒等酒類、咖啡、可可、果汁、碳酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料等清涼飲料、預(yù)混合料、熱餅混合料、即飲飲料、即飲咖啡、即飲小豆湯、即飲湯等方便食品、另外斷奶食品、治療食品、健康飲料、肽食品、冷凍食品等各種飲食物給予甜味、味道改良，品質(zhì)改良等中有效實(shí)施。
另外也可以用于提高家畜、家禽、以及其它的蜜蜂、蠶、魚(yú)等飼養(yǎng)動(dòng)物的飼料、餌料等嗜好性為目的的用途中。此外，可以作為香煙、牙膏、口紅、唇膏、內(nèi)服液、片劑、口含片、肝油糖球、口腔清涼劑、口腔香劑、漱口劑等各種固體物質(zhì)、膏狀、液體狀等嗜好物、化妝品、藥品等各種組合物的甜味劑、或味道改良劑、矯味劑、以及作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑等有效利用。
作為品質(zhì)改良劑、穩(wěn)定劑，可以有效利用于容易失去有效成分、活性等各種生理活性物質(zhì)或含有這些物質(zhì)的健康食品、藥品等中。例如，干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、巨噬細(xì)胞游走抑制因子、神經(jīng)刺激因子、轉(zhuǎn)移因子、白介素II等淋巴因子含有液；胰島素、生長(zhǎng)激素、催乳激素、促紅細(xì)胞生成素、卵細(xì)胞刺激激素等激素含有液；BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、小兒麻痹疫苗、天花疫苗、破傷風(fēng)類病毒、蛇毒抗毒素、人免疫球蛋白等生物制劑含有液；青霉素、紅霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液；硫胺素、核黃素、L-抗壞血酸、肝油、胡蘿卜素、麥角甾醇、生育酚等維生素含有液；EPA、DHA、花生四烯酸等高度不飽和脂肪酸或其酯的衍生物；脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白激酶、β-淀粉酶、異淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶含有液；藥用人參提取物、甲魚(yú)提取物、小球藻提取物、蘆薈提取物、蜂膠提取物等提取物等，病毒、乳酸菌、酵母等活菌糊，蜂王漿等各種生理活性物質(zhì)、可以容易地制成不失去其有效成分、活性，而且穩(wěn)定的高品質(zhì)液體狀、膏狀或固狀健康食品和藥品等。
作為使上述那樣的各種組合物中含有異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖的方法，只要是包括在直至完成該制品的工序中都可以，例如可以適宜選擇混合、混揉、溶解、熔融、浸漬、浸透、散布、涂布、包衣、噴霧、注入、結(jié)晶、固化等眾所周知的方法。其量通常含有0.1質(zhì)量％以上合適，優(yōu)選含有1質(zhì)量％以上合適。
以下根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。
<實(shí)驗(yàn)1非還原性糖的制備>
將由1.5％(w/v)淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#4”，松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)、0.5％(w/v)酵母提取物(商品名“ポリペプトン(POLYPEPTON)”，日本制藥株式會(huì)社制造)、0.1％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制藥株式會(huì)社制造)、0.1％(w/v)磷酸二鉀、0.06％(w/v)磷酸一鈉·2水合物、0.05％(w/v)硫酸鎂·7水合物、0.3％(w/v)碳酸鈣和水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基以平均30ml裝入到10個(gè)容量為500ml的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻。然后，接種環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下進(jìn)行120小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)后，離心分離(8000rpm，20分鐘)，除去菌體，獲得了培養(yǎng)上清(約0.3L)。使用0.25L獲得的培養(yǎng)上清作為酶液，將其添加于0.25L含有2％(w/v)淀粉酶和2mM氯化鈣的50mM醋酸緩沖液(pH6.0)中，使之于40℃反應(yīng)48小時(shí)后，通過(guò)于約100℃熱處理10分鐘停止反應(yīng)。
接著，為了將夾雜的還原糖加水分解成葡萄糖，用鹽酸將上述反應(yīng)物調(diào)整成pH5.0后，每1g固體物質(zhì)加入400單位的α-葡糖苷酶(商品名糖苷轉(zhuǎn)移酶L“AMANO”，天野エンザイム株式會(huì)社制)和每1g固體物質(zhì)添加25單位的葡萄糖淀粉酶(ナガせ生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社銷售)，使之于50℃反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)后，通過(guò)于約100℃熱處理10分鐘使反應(yīng)停止。通過(guò)分析用高效液相色譜(以下，簡(jiǎn)稱HPLC。)分析獲得的反應(yīng)液中的糖，結(jié)果檢測(cè)出洗脫時(shí)間為57.3分鐘的葡萄糖，洗脫時(shí)間為43.7分鐘的糖(以下，簡(jiǎn)稱為糖I)，洗脫時(shí)間為37.1分鐘的糖(以下，簡(jiǎn)稱為糖II)。各個(gè)組成葡萄糖為73.3％，糖I為24.2％，糖II為2.5％。
并且，分析HPLC，在柱中串聯(lián)連接上兩個(gè)“MCIgel CK04SS”(三菱化學(xué)株式會(huì)社制)，用水作為洗脫液，在柱溫度80℃，流速0.4ml/分鐘的條件下進(jìn)行，用差示折射儀RID-10A(株式會(huì)社島津制作所制造)進(jìn)行檢測(cè)。
接著，通過(guò)過(guò)濾除去上述的反應(yīng)液中的不溶物后，用三菱化學(xué)制離子交換樹(shù)脂“(Diaion SK-1B)”和“Diaion WA30”以及Organo公司制造的陰離子交換樹(shù)脂(IRA411)脫色，脫鹽，濃縮，精密過(guò)濾后，采用調(diào)制用HPLC分級(jí)，結(jié)果，葡萄糖在29分鐘至40分鐘的洗脫時(shí)間洗脫，糖I在57分鐘至75分鐘的洗脫時(shí)間洗脫，糖II在120分鐘至180分鐘的洗脫時(shí)間洗脫。分別回收糖I和糖II的級(jí)分，精密過(guò)濾后，通過(guò)真空干燥，獲得了約850mg固體物質(zhì)的糖I，100mg固體物質(zhì)的糖II。并且，使用“ODS-AQ R-355-15AQ”柱(YMC株式會(huì)社)，使用7.5％(v/v)甲醇作為洗脫液，在柱溫度25℃，流速20ml/分的條件下進(jìn)行調(diào)制用HPLC。
用分析HPLC研究獲得的糖I和糖II制品的糖組成，結(jié)果表明，如圖1和圖2所示，糖I和糖II的含量均在97％以上，純度極高。
此外，用Somogyi-Nelson’s法測(cè)定糖I和糖II制品的還原力，結(jié)果表明兩制品的還原力在檢測(cè)界限以下，糖I和糖II基本上是非還原性的。
<實(shí)驗(yàn)2糖I的結(jié)構(gòu)分析>
<實(shí)驗(yàn)2-1質(zhì)量分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖I制品，使用質(zhì)量分析裝置“LCQ-Advantage”(サ一モエレクトロン公司制)進(jìn)行質(zhì)量分析，結(jié)果顯著地檢測(cè)出質(zhì)量數(shù)為833的鈉添加分子離子，判明糖I的質(zhì)量數(shù)為810。
<實(shí)驗(yàn)2-2組成糖分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖I制品，按照常規(guī)方法，用硫酸加水分解成單糖，用氣相色譜法研究組成糖，結(jié)果只檢測(cè)出D-葡萄糖，判明只有D-葡萄糖為糖I的組成糖。如果考慮上述的質(zhì)量數(shù)，表明糖I為由5分子D-葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)2-3甲基化分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖I制品，按照常規(guī)方法，進(jìn)行甲基化分析，用氣相色譜法研究甲基化物。結(jié)果匯集在表1中。


根據(jù)表1的結(jié)果，表明2，3，4-三甲基化物與2，3，6-三甲基化物的比率大約為1∶4，因此構(gòu)成糖I的5分子D-葡萄糖中，1分子在1位和6位葡糖苷結(jié)合，而且其它4分子在1位和4位葡糖苷結(jié)合。
<實(shí)驗(yàn)2-4核磁共振分析>
使用實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖I制品，按照常規(guī)方法，進(jìn)行核磁共振(NMR)分析。1H-NMR譜示于圖3，13C-NMR譜示于圖4。在1H-NMR譜中約5.07ppm的信號(hào)，約5.00ppm的信號(hào)，約4.99ppm的信號(hào)，約4.98ppm的信號(hào)和約4.87ppm的信號(hào)歸屬于D-葡萄糖殘基的1位質(zhì)子，求出其spin-spin結(jié)合常數(shù)，為約3.49Hz(約5.07ppm的信號(hào))，約3.86Hz(約5.00ppm的信號(hào))，約2.39Hz(約4.99ppm的信號(hào))，約2.94Hz(約4.98ppm的信號(hào))和約3.31Hz(約4.87ppm的信號(hào))，由此判明結(jié)合1，4葡糖苷的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物型和結(jié)合1，6葡糖苷的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物型均為α型。
根據(jù)以上的結(jié)果，判明糖I為具有圖5所示的環(huán){→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1)}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀五糖，即異環(huán)麥芽五糖。具有這種結(jié)構(gòu)的糖是以往未知的，本發(fā)明的異環(huán)麥芽五糖是新的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)3糖II的結(jié)構(gòu)分析>
<實(shí)驗(yàn)3-1質(zhì)量分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖II制品，使用質(zhì)量分析裝置“LCQ-Advantage”進(jìn)行質(zhì)量分析，結(jié)果顯著地檢測(cè)出質(zhì)量數(shù)為995的鈉添加分子離子，判明糖II的質(zhì)量數(shù)為972。
<實(shí)驗(yàn)3-2組成糖分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖II制品，按照常規(guī)方法，用硫酸加水分解成單糖，用氣相色譜法研究組成糖，結(jié)果只檢測(cè)出D-葡萄糖，判明只有D-葡萄糖為糖II的組成糖。如果考慮上述的質(zhì)量數(shù)，表明糖II為由6分子D-葡萄糖構(gòu)成的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)3-3甲基化分析>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖II制品，按照常規(guī)方法，進(jìn)行甲基化分析，用氣相色譜法研究甲基化物。結(jié)果匯集在表2中。


根據(jù)表2的結(jié)果，表明2，3，4-三甲基化物與2，3，6-三甲基化物的比率大約為1∶5，因此構(gòu)成糖II的6分子D-葡萄糖中，1分子在1位和6位葡糖苷結(jié)合，而且其它5分子在1位和4位葡糖苷結(jié)合。
<實(shí)驗(yàn)3-4核磁共振分析>
使用實(shí)驗(yàn)1的方法獲得的糖II制品，按照常規(guī)方法，進(jìn)行核磁共振(NMR)分析。1H-NMR譜示于圖6，13C-NMR譜示于圖7。在1H-NMR譜中約5.20ppm的信號(hào)，約5.00ppm的信號(hào)，約4.99ppm的信號(hào)，約4.97ppm的信號(hào)，約4.96ppm的信號(hào)和4.86ppm的信號(hào)歸屬于D-葡萄糖殘基的1位質(zhì)子，求出其spin-spin結(jié)合常數(shù)，為約3.49Hz(約5.20ppm的信號(hào))，約2.57Hz(約5.00ppm的信號(hào))，約3.13Hz(約4.99ppm的信號(hào))，約4.04Hz(約4.97ppm的信號(hào))，約3.86Hz(約4.96ppm的信號(hào))和約3.86Hz(約4.86ppm的信號(hào))，由此判明結(jié)合1，4葡糖苷的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物型和結(jié)合1，6葡糖苷的D-葡萄糖殘基的1位的異頭物型均為α型。
根據(jù)以上的結(jié)果，判明糖II為具有圖8所示的環(huán){→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-(1→)}結(jié)構(gòu)的環(huán)狀六糖，即異環(huán)麥芽六糖。具有這種結(jié)構(gòu)的糖是以往未知的，本發(fā)明的異環(huán)麥芽六糖是新的環(huán)狀糖。
<實(shí)驗(yàn)4異環(huán)麥芽寡糖合酶的生產(chǎn)>
將實(shí)驗(yàn)1記載的液體培養(yǎng)基以每瓶100ml裝入兩個(gè)500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻。然后，接種環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下進(jìn)行48小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。
將20L與起子培養(yǎng)組成相同的液體培養(yǎng)基裝入在容量為30L發(fā)酵器中，加熱滅菌，冷卻，溫度到27℃后，接種約200ml起子培養(yǎng)液，邊保持溫度27℃、pH6.0～8.0，邊通氣攪拌培養(yǎng)96小時(shí)。培養(yǎng)后，從發(fā)酵器中取出培養(yǎng)液，通過(guò)離心分離(8000rpm，20分鐘)除去菌體，獲得約18L培養(yǎng)上清。對(duì)于培養(yǎng)液和培養(yǎng)上清，測(cè)定異環(huán)麥芽寡糖合酶活性，結(jié)果清楚了培養(yǎng)液中含約0.027單位/ml的酶活性，上清中含有約0.025單位/ml的酶活性，判明了由環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)產(chǎn)生的異環(huán)麥芽寡糖合酶大部分存在于菌體外。
<實(shí)驗(yàn)5異環(huán)麥芽寡糖合酶的純化>
通過(guò)在實(shí)驗(yàn)4獲得的培養(yǎng)上清中，在約10L(總活性為約250單位)中以終濃度80％飽和來(lái)添加硫酸銨，于4℃放置24小時(shí)，進(jìn)行鹽析。通過(guò)離心分離(11000rpm，30分鐘)回收生成的鹽析沉淀物，將其溶解于10mM醋酸緩沖液(pH6.0)中后，對(duì)同一種緩沖液進(jìn)行透析，獲得約240ml的粗酶液。粗酶液中的異環(huán)麥芽寡糖活性為0.96單位/ml(總活性為約230單位)。將該粗酶液提供給采用東曹株式會(huì)社制造的“DEAE-Toyopearl 650S”凝膠的離子交換層析(凝膠容量為120ml)。使異環(huán)麥芽寡糖合酶活性的某個(gè)級(jí)分不吸附于經(jīng)10mM醋酸(pH6.0)平衡的“DEAE-Toyopearl 650S”凝膠，洗脫出非吸附的級(jí)分?；厥赵摶钚约?jí)分，以達(dá)到1M的終濃度添加硫酸銨，于4℃放置24小時(shí)后，通過(guò)離心分離除去不溶物，提供給采用東曹株式會(huì)社制造的“Buthyl-Toyopearl 650M”凝膠的疏水層析(凝膠容量為60ml)。使異環(huán)麥芽寡糖合酶活性的某個(gè)級(jí)分吸附于經(jīng)含有1M硫酸銨的10mM醋酸(pH6.0)平衡的“Buthyl-Toyopearl 650M”凝膠，以硫酸銨濃度為1M至0M的線性梯度洗脫，結(jié)果在硫酸銨濃度為約0.1M左右洗脫出來(lái)。在這種純化的各步驟中異環(huán)麥芽寡糖合酶的活性，比活性和產(chǎn)率示于表3。


用以5-20w/v％濃度梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)純化的異環(huán)麥芽寡糖合酶制品的純度，結(jié)果蛋白條帶是均一的，是高純度的制品。
<實(shí)驗(yàn)6異環(huán)麥芽寡糖合酶的性質(zhì)>
<實(shí)驗(yàn)6-1分子量>
將實(shí)驗(yàn)5的方法純化得到的異環(huán)麥芽寡糖合酶制品提供給SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(5-20w/v％濃度梯度)，同時(shí)與泳動(dòng)的分子量標(biāo)記(日本バイオ·ラツド·ラボラトリ-ズ株式會(huì)社制造)進(jìn)行比較，測(cè)定分子量，結(jié)果判明來(lái)自異環(huán)麥芽寡糖合酶的分子量為106000±20000道爾頓。
<實(shí)驗(yàn)6-2等電點(diǎn)>
用實(shí)驗(yàn)5的方法純化得到的異環(huán)麥芽寡糖合酶制品提供給含有2.2w/v％兩性電解質(zhì)(Amersham pharmacia bioscience(株)制造)的等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳法，同時(shí)與電泳的等電點(diǎn)標(biāo)記(Amershampharmacia bioscience(株)制造)比較，求出等電點(diǎn)，結(jié)果判定為異環(huán)麥芽寡糖合酶的等電點(diǎn)為pI7.5±0.5。
<實(shí)驗(yàn)6-3酶反應(yīng)的最適溫度和最適pH>
使用實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，按照活性測(cè)定的方法研究溫度對(duì)酶活性，pH對(duì)酶活性的影響。其結(jié)果示于圖9(最適溫度)，圖10(最適pH)。判明在pH6.0，30分鐘反應(yīng)條件下，異環(huán)麥芽寡糖合酶的最適溫度為50-55℃，在30分鐘反應(yīng)條件下，最適pH為4.5-8.0。
<實(shí)驗(yàn)6-4酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性>
使用實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，研究本酶的溫度穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。通過(guò)在不存在氯化鈣或1mM氯化鈣存在下，將酶溶液(10mM醋酸緩沖液，pH6.0)于各溫度下保持60分鐘，水冷卻后，測(cè)定殘留的酶活性，求出溫度穩(wěn)定性。通過(guò)在各pH的100mM緩沖液中將該酶于4℃保持24小時(shí)后，將pH調(diào)整成6.0，測(cè)定殘留的酶活性，求出pH穩(wěn)定性。其結(jié)果示于圖11(溫度穩(wěn)定性)，圖12(pH穩(wěn)定性)。如圖11清楚所示，判明異環(huán)麥芽寡糖合酶的溫度穩(wěn)定性，在不存在氯化鈣下達(dá)到35℃，在存在氯化鈣1mM下達(dá)到40℃，清楚了該酶的溫度穩(wěn)定性由于鈣離子而提高。此外，如圖12清楚所示，判明異環(huán)麥芽寡糖合酶的pH穩(wěn)定性在pH4.5-9.0的范圍內(nèi)。
<實(shí)驗(yàn)6-5金屬鹽對(duì)酶活性的影響>
使用實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，按照活性測(cè)定的方法研究濃度為1mM的各種金屬鹽存在下金屬鹽對(duì)酶活性的影響。結(jié)果示于表4。


根據(jù)表4的結(jié)果清楚地所示，表明異環(huán)麥芽寡糖合酶活性被HgCl2抑制45％，被FeCl3和CuCl2抑制約20％。此外，即使用金屬離子的螯合劑EDTA，也會(huì)受到較弱抑制。
<實(shí)驗(yàn)6-6N末端氨基酸序列>
使用實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，用蛋白測(cè)序儀型號(hào)492HT(Applyed biosystems公司生產(chǎn))分析該酶的N末端氨基酸序列，結(jié)果表明具有序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列，即丙氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-蘇氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-酪氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。
<實(shí)驗(yàn)6-7部分氨基酸序列>
取適量實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，對(duì)10mMTris-HCl緩沖液(pH9.0)在4℃、18小時(shí)透析后，加入相同緩沖液，使蛋白濃度為約1mg/ml。取1ml該溶液，加入20μg的賴氨酰肽鏈內(nèi)切酶(和光純藥株式會(huì)社銷售)，于30℃下保持20小時(shí)，加水分解酶蛋白。將加水分解物注入預(yù)先用含有10％(v/v)乙腈的0.1％(v/v)三氟乙酸平衡的HPLC用柱(商品名“microbondpack C18柱”，直徑3.9mm×長(zhǎng)150mm、Waters公司制造)，在流速為0.9ml/分，室溫條件下，從0.1％(v/v)三氟乙酸-10％乙腈溶液中，以0.1％(v/v)三氟乙酸-50％(v/v)乙腈溶液的100分鐘的線性梯度的條件下通液，分級(jí)出肽片段。通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)210nm的吸光度測(cè)定從柱洗脫的肽片段。通過(guò)測(cè)定在波長(zhǎng)210nm的吸光度檢測(cè)從柱子上洗脫下來(lái)的肽。用與實(shí)驗(yàn)6-6相同的方法分別分析從通液開(kāi)始約14分鐘，約18分鐘，約30分鐘，約35分鐘，約38分鐘，約61分鐘，約64分鐘，約67分鐘和約82分鐘時(shí)洗脫的9種肽片段的氨基酸序列，結(jié)果，它們分別具有序列表中序列號(hào)4-12表示的氨基酸序列。
<實(shí)驗(yàn)7編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA的克隆和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體的制備>
從環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)中克隆編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA，制備可自我復(fù)制的重組DNA，進(jìn)行編碼酶的DNA的堿基序列的測(cè)定以及轉(zhuǎn)化體的制備。
<實(shí)驗(yàn)7-1染色體DNA的制備>
將由0.25％(w/v)淀粉部分分解物(“パインデツクス#4”，松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)、0.2％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制藥株式會(huì)社制造)、0.1％(w/v)磷酸二鉀、0.06％(w/v)磷酸一鈉·2水合物、0.05％(w/v)硫酸鎂·7水合物以及水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基以每100ml裝入到500ml容量的三角燒瓶中，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，接種環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)，于27℃、230rpm下進(jìn)行5天的旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。
然后使經(jīng)離心分離從培養(yǎng)物中收集的菌體懸浮于TES緩沖液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃溫育30分鐘。于-80℃下對(duì)該處理物冷凍1小時(shí)后，加入TSS緩沖液(pH9.0)后，加溫至60℃，加入TES緩沖液/酚混合液，于冰水中一邊冷卻，一邊激烈振蕩10分鐘，經(jīng)離心分離收集上清。向該上清加入2倍上清容積的冷乙醇，回收沉淀的粗染色體DNA，溶解于SSC緩沖液(pH7.1)后，分別加入7.5μg和125μg核酸酶和蛋白酶，于37℃保持1小時(shí)使其反應(yīng)。向反應(yīng)物中加入氯仿/異戊醇混合液，對(duì)染色體DNA進(jìn)行提取，加入冷乙醇，收集含有生成染色體DNA的沉淀。將這樣得到的純化染色體DNA溶解于SSC緩沖液(pH7.1)，使終濃度約為1mg/ml，將該溶液于-80℃下冷凍。
<實(shí)驗(yàn)7-2通過(guò)PCR對(duì)部分DNA片段的克隆>
在進(jìn)行編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA的克隆前，首先，進(jìn)行其部分DNA片段的PCR克隆?；诋惌h(huán)麥芽寡糖合酶的N末端氨基酸序列的序列表中序列號(hào)1表示的氨基酸序列中第10-15位和第13-18位的氨基酸序列，合成序列表中序列號(hào)13和14表示的兩種有義引物F1和F2。此外，基于該酶的內(nèi)部氨基酸序列的序列表中序列號(hào)4表示的氨基酸序列中第4-8位和第1-5位的氨基酸序列，合成序列表中序列號(hào)15和16表示的兩種反義引物R1和R2。通過(guò)組合有義引物F1和反義引物R1，以實(shí)驗(yàn)7-1獲得的染色體DNA作為模板，按照常規(guī)方法進(jìn)行第1輪PCR。接著，以獲得的PCR產(chǎn)物作為模板，通過(guò)組合有義引物F2和反義引物R2，進(jìn)行第2輪PCR，結(jié)果確認(rèn)了約200個(gè)堿基對(duì)和約300個(gè)堿基對(duì)這兩種PCR擴(kuò)增DNA片段。將PCR擴(kuò)增DNA片段插入于質(zhì)粒(商品名pCR-Script Amp SK(+)，Stratagene公司制)的限制性酶Srf I部位后，通過(guò)常規(guī)的感受態(tài)細(xì)胞法對(duì)感受態(tài)細(xì)胞(商品名“Epicurian Coli XL2-Blue”，Stratagene·cloning system公司制造)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。用常規(guī)的堿-SDS法從獲得的轉(zhuǎn)化體中提取重組DNA，選擇出攜帶具有作為目的片段的約300個(gè)堿基對(duì)的插入片段的重組DNA的轉(zhuǎn)化體。接著，通過(guò)常規(guī)的雙脫氧法分析該重組DNA的堿基序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該重組DNA含有具有序列表中序列號(hào)17表示的鏈長(zhǎng)為251個(gè)堿基對(duì)的堿基序列的DNA。
由于合寫(xiě)于在序列表中序列號(hào)17中的氨基酸序列的第37-46位和第47-60位的氨基酸序列與異環(huán)麥芽寡糖合酶的部分氨基酸序列的序列表中序列號(hào)6和10表示的氨基酸序列完全一致，因此表明上述DNA片段是編碼來(lái)源于環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERMBP-10111)的異環(huán)麥芽寡糖合酶的一部分的DNA片段。
<實(shí)驗(yàn)7-3通過(guò)菌落雜交法對(duì)編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA的克隆>
取0.1ml由實(shí)驗(yàn)7-3制備的純化染色體DNA溶液，在其中加入約100單位限制性酶Hind III，使之于37℃反應(yīng)1小時(shí)，加水分解染色體DNA后，通過(guò)瓊脂糖電泳法收集由約5000-9000個(gè)堿基對(duì)構(gòu)成的DNA片段。另一方面，通過(guò)常規(guī)方法使限制性酶Hind III作用，完全切斷質(zhì)粒載體(Stratagene·cloning system公司制造，注冊(cè)商標(biāo)“pBluescript II SK(+)”)后，使用0.5μg該被切斷的質(zhì)粒載體和約5μg先前得到的DNA片段，用市售的試劑盒(寶酒造制造，商品名“DNA連接試劑盒”)按照附帶的說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行連接。用得到的重組DNA通過(guò)通常的感受態(tài)細(xì)胞法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(商品名“EpicurianColi XL2-Blue”，Stratagene·cloning system公司制造)，制作Hind III染色體DNA文庫(kù)。
將得到的轉(zhuǎn)化體接種于按照常規(guī)方法制備的含有10g/L胰蛋白酶、5g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉、100mg/L氨芐青霉素鈉鹽以及50mg/L 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的瓊脂平板培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)基上形成的約655個(gè)菌落固定于尼龍膜(商品名“Hybond-N+”，Amersham制)上。另一方面，用限制性酶Not I和Bam HI消化由實(shí)驗(yàn)例7-2制備的重組DNA后，通過(guò)常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳法收集目的片段的約300個(gè)堿基對(duì)的DNA片段，用DNA標(biāo)識(shí)試劑盒(商品名“DIG DNA Labeling and Detection Kit”，Rosche Diagnostics株式會(huì)社售)標(biāo)識(shí)，制成DIG(地高辛配基)標(biāo)識(shí)探針。對(duì)前述的固定在尼龍膜上的655株菌落，使用DNA標(biāo)識(shí)探針進(jìn)行通常的菌落雜交，獲得了作為陽(yáng)性克隆的1種轉(zhuǎn)化體。將該轉(zhuǎn)化體命名為“BAMH1”。
<實(shí)驗(yàn)7-4編碼異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA的堿基序列的測(cè)定>
將轉(zhuǎn)化體BAMH1按照常規(guī)方法接種于含有100μg/ml氨芐青霉素鈉鹽的L-肉湯(broth)培養(yǎng)基(pH7.0)，于37℃下進(jìn)行24小時(shí)旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離從培養(yǎng)物中收集菌體，用通常的堿-SDS法提取重組DNA。用通常的雙脫氧法對(duì)該重組DNA的堿基序列進(jìn)行分析，表明該重組DNA是來(lái)自環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)，含有具有序列表中序列號(hào)18所示的鏈長(zhǎng)為2985個(gè)堿基對(duì)的堿基序列的DNA。如圖13所示，在該重組DNA中，該DNA連接在限制酶Hind III識(shí)別部位的下游。另一方面，由該堿基序列推定的氨基酸序列是合記于序列號(hào)18中的堿基序列，該氨基酸序列與用實(shí)驗(yàn)6-6的方法確認(rèn)的本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的N末端氨基酸序列和用實(shí)驗(yàn)6-7方法闡明的部分氨基酸序列、序列表中序列號(hào)1和序列號(hào)4至12所示的氨基酸序列進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)序列表中序列號(hào)1所示的氨基酸序列與合記在序列號(hào)18的氨基酸序列第36至55位的氨基酸序列完全一致。另外，序列表中序列號(hào)4、5、6、7、8、9、10、11和12所示的氨基酸序列分別與合記在序列表中序列號(hào)18表示的堿基序列中的氨基酸序列中第126至135、第140至149、第84至93、第152至163、第806至816、第925至939、第94至107、第185至197、和第272至286的氨基酸序列完全一致。以上表明，本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶含有序列表中序列號(hào)2所示的氨基酸序列，該酶由環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(FERM BP-10111)中序列表中序列號(hào)3所示堿基序列的DNA編碼。另外，合記在序列表中序列號(hào)18中的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定為該多肽的分泌信號(hào)肽序列。從這些事實(shí)可以判明，該多肽分泌前的前體由合記在序列表中序列號(hào)18中的氨基酸序列構(gòu)成，該氨基酸序列由序列表中序列號(hào)18所示堿基序列編碼。將如上所述制備的，確認(rèn)了其堿基序列的重組DNA命名為“pBAMH1”。
<實(shí)驗(yàn)8表達(dá)用重組DNApETAM1的制備和由該轉(zhuǎn)化體ETAM1產(chǎn)生重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶>
將重組DNA“pBAMH1”中的重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶基因插入于表達(dá)載體中，研究重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶在大腸桿菌中的表達(dá)。
<實(shí)驗(yàn)8-1表達(dá)用重組DNA，pETAM1的制備和轉(zhuǎn)化體ETAM1的制備>
在將pBAMH1中的異環(huán)麥芽寡糖合酶基因插入于表達(dá)用載體時(shí)，在異環(huán)麥芽寡糖合酶的結(jié)構(gòu)基因的上游插入限制性酶Nde I識(shí)別位點(diǎn)，以消除存在于該結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部的Nde I識(shí)別位點(diǎn)為目的通過(guò)PCR導(dǎo)入變異。使用pBAMH1作為模板，通過(guò)組合基于位于pBAMH1的載體的pBluescript II SK(+)中異環(huán)麥芽寡糖合酶的結(jié)構(gòu)基因的上游的堿基序列合成的具有序列表中序列號(hào)19所示的堿基序列的有義引物和基于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部的Nde I識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列合成的具有序列表中序列號(hào)22所示的堿基序列的反義引物，以及組合基于結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部的Nde I識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列合成的具有序列表中序列號(hào)21所示的堿基序列的有義序列和基于位于結(jié)構(gòu)基因的下游的限制性酶Bam HI識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列合成的具有序列表中序列號(hào)23所示的堿基序列的反義引物，進(jìn)行第1次PCR，獲得了擴(kuò)增的PCR。接著，以獲得的擴(kuò)增的DNA片段作為模板，為了在結(jié)構(gòu)基因的上游導(dǎo)入Nde I識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)組合基于合成的具有序列表中序列號(hào)20表示的堿基序列的有義引物和基于位于結(jié)構(gòu)基因下游的限制性酶Bam HI識(shí)別位點(diǎn)的堿基序列合成的具有序列表中序列號(hào)23所示的堿基序列的反義引物，進(jìn)行第2次PCR，擴(kuò)增在結(jié)構(gòu)基因上有具有目的片段的Nde I識(shí)別位點(diǎn)，并且消除了結(jié)構(gòu)基因內(nèi)部的Nde I識(shí)別位點(diǎn)的異環(huán)麥芽寡糖合酶基因。將通過(guò)常規(guī)方法，在用限制性酶Nde I和Bam HI消化的表達(dá)用載體pET-38b(+)(Novagene公司制)中整合了上述擴(kuò)增的DNA而獲得的重組DNA命名為“pETAM1”。pETAM1示于圖14。用pETAM1轉(zhuǎn)化對(duì)大腸桿菌JM109(東洋紡株式會(huì)社售)，從得到的轉(zhuǎn)化體中制備pETAM1，通過(guò)轉(zhuǎn)化表達(dá)用宿主大腸桿菌BL21(DE3)(Novagene公司制)，從而制備轉(zhuǎn)化體“ETAM1”。
<實(shí)驗(yàn)8-2由轉(zhuǎn)化體ETAM1生產(chǎn)重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶>
將由10g/L胰蛋白酶(商品名“Bacto-tryptone”，Difco公司售)、5g/L酵母提取物(商品名“Bacto-yeast extract”，Difco公司售)、10g/L食鹽和水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基以每100ml裝入容量為500ml的三角燒瓶，用高壓滅菌鍋于121℃下滅菌20分鐘，冷卻之后，無(wú)菌條件下調(diào)整成pH7.5后，無(wú)菌條件下添加2mg卡那霉素，從而制備出液體培養(yǎng)基。在該液體培養(yǎng)基中接種實(shí)驗(yàn)8-1的方法獲得的轉(zhuǎn)化體ETAM1，于27℃旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)，在濁度達(dá)到約0.6時(shí)，通過(guò)以0.4mM的終濃度添加異丙基-1-硫代-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)來(lái)誘導(dǎo)異環(huán)麥芽寡糖合酶基因的表達(dá)，再培養(yǎng)3小時(shí)。按照常規(guī)的方法通過(guò)對(duì)所獲得的培養(yǎng)物進(jìn)行離心分離，從而分離培養(yǎng)上清和菌體，進(jìn)行回收。對(duì)于菌體，通過(guò)超聲波破碎法從細(xì)胞中制備總提取物。通過(guò)將菌體懸浮于20mMTris-磷酸緩沖液(pH7.5)后，一邊將該菌體懸浮液在冰水中冷卻一邊用超聲波勻漿器(型號(hào)UH-600，株式會(huì)社エスエムテ-制造)破碎細(xì)胞來(lái)進(jìn)行超聲波破碎法，以這種破碎物作為全細(xì)胞提取物的方法。
對(duì)這樣制備的培養(yǎng)上清和全細(xì)胞提取物，分別測(cè)定異環(huán)麥芽寡糖合酶活性，將它們的活性值分別換算成每1ml培養(yǎng)物的值。并且，在于上述轉(zhuǎn)化體相同的條件下培養(yǎng)作為對(duì)照的攜帶質(zhì)粒pET-38b(+)的大腸桿菌BL21(DE3)，從培養(yǎng)物中制備培養(yǎng)上清和全細(xì)胞提取物，同樣測(cè)定異環(huán)麥芽寡糖合酶活性。其結(jié)果示于表5。


根據(jù)表5的結(jié)果清楚地表明，轉(zhuǎn)化體ETAM1在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶。在宿主的對(duì)照大腸桿菌中，其培養(yǎng)上清，全細(xì)胞提取物中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該酶活性。
再按照實(shí)驗(yàn)5所示的方法，對(duì)這種由實(shí)驗(yàn)8的方法獲得的全細(xì)胞提取物進(jìn)行鹽析，透析，提供給采用DEAE-Toyopearl 650S凝膠、Buthyl-Toyopearl 650M凝膠的柱層析進(jìn)行純化，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)6所示的方法分析這種純化酶制品。其結(jié)果是，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的分子量為約106000±20000道爾頓，通過(guò)等電點(diǎn)聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的等電點(diǎn)為約7.5±0.5，異環(huán)麥芽寡糖合酶活性的最適溫度在pH6.0，反應(yīng)30分鐘的條件下，為約50-55℃，在30℃，30分鐘反應(yīng)的條件下最適pH為約4.5-8.0，關(guān)于溫度穩(wěn)定性，在保持于各個(gè)溫度60分鐘的條件下，不存在氯化鈣下溫度穩(wěn)定性達(dá)到35℃，在1mM氯化鈣存在下達(dá)到約40℃，在4℃保持在各個(gè)pH值24小時(shí)的條件下，pH穩(wěn)定性在約4.5-9.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定。這些物化性質(zhì)與由實(shí)驗(yàn)5中所示的方法制備的這種酶的性質(zhì)實(shí)質(zhì)上相同。以上的結(jié)果表明本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶可以由重組DNA技術(shù)良好地制造。
<實(shí)驗(yàn)9對(duì)各種糖的作用>
用各種糖，研究異環(huán)麥芽寡糖合酶的底物特異性。制備含有麥芽糖，麥芽丙糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥芽庚糖，新海藻糖，海藻糖，曲二糖，黑曲霉糖，異麥芽糖，異麥芽丙糖，潘糖，異潘糖，麥芽糖醇，麥芽三糖醇(Maltotriitol)，α-、β-或γ-環(huán)糊精，淀粉酶，可溶性淀粉，糖原，支鏈淀粉或葡聚糖的水溶液。在這些底物溶液中添加最終濃度為20mM的醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度為1mM的氯化鈣后，每1g底物固體物質(zhì)分別添加每1單位的由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品，將底物濃度調(diào)整成2w/v％，在40℃，pH6.0下使之作用24小時(shí)。為了研究酶反應(yīng)前后的反應(yīng)液中的糖，使用n-丁醇、吡啶、水混合液(容量比6∶4∶1)作為洗脫劑，并且使用墨克公司制“キ-ゼ兒凝膠60”(鋁板，10×20cm)作為薄層板，進(jìn)行2次展開(kāi)的二氧化硅凝膠薄層層析(以下，簡(jiǎn)稱為T(mén)LC)，分離糖類。通過(guò)硫酸-甲醇法使之發(fā)色，檢測(cè)分離出的糖類，確認(rèn)對(duì)各個(gè)糖類的酶作用的有無(wú)或強(qiáng)弱的程度。結(jié)果示于表6。


注)酶反應(yīng)前后，-表示“沒(méi)變化”，+表示“底物的點(diǎn)稍有減少，發(fā)現(xiàn)了異環(huán)麥芽寡糖的生成”，++表示“底物的點(diǎn)大為減少，發(fā)現(xiàn)了異環(huán)麥芽寡糖的生成”，+++表示“底物的點(diǎn)幾乎消失，發(fā)現(xiàn)了異環(huán)麥芽寡糖的生成”，根據(jù)表6的結(jié)果清楚地表明，異環(huán)麥芽寡糖合酶對(duì)試驗(yàn)的糖中的麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖，麥芽庚糖作用充分，而且，與麥芽丙糖稍有作用，而且，本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶對(duì)淀粉酶，可溶性淀粉，糖原也較好作用。根據(jù)這些結(jié)果，表明該酶作用于葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖。
<實(shí)驗(yàn)10作用機(jī)制>
<實(shí)驗(yàn)10-1由麥芽六糖產(chǎn)生的生成物>
在最終濃度為1w/v％的麥芽六糖水溶液中加入最終濃度為20mM的醋酸緩沖液(pH6.0)和最終濃度為1mM的氯化鈣后，每1g底物固體物質(zhì)加入1單位由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶，于45℃，pH6.0使之作用，進(jìn)行經(jīng)時(shí)的取樣，通過(guò)于100℃保持10分鐘停止反應(yīng)。用HPLC測(cè)定該酶反應(yīng)液的糖組成。在柱中連續(xù)連接上兩個(gè)“MCIgelCK04SS”(三菱化學(xué)株式會(huì)社制)，用水作為洗脫液，在柱溫度80℃，流速0.4ml/分鐘的條件下進(jìn)行，用差示折射儀RID-10A(株式會(huì)社島津制作所制造)進(jìn)行HPLC。其結(jié)果示于表7。


根據(jù)表7的結(jié)果清楚地表明，該酶作用的結(jié)果是由底物麥芽六糖生成比麥芽六糖聚合度低的麥芽寡糖，比異環(huán)麥芽五糖，異環(huán)麥芽六糖和麥芽六糖聚合度高的麥芽寡糖。如果根據(jù)這些結(jié)果推測(cè)，可以推定本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶作用于麥芽六糖，在分子間通過(guò)α-1，4轉(zhuǎn)移麥芽糖至麥芽五糖的系列麥芽寡糖，催化包括聚合度在8以上的麥芽寡糖的葡萄糖聚合度各不相同的麥芽寡糖的生成(歧化反應(yīng))，與此同時(shí)，在麥芽五糖單位切斷，通過(guò)分子內(nèi)α-1，6轉(zhuǎn)移，由葡萄糖聚合度為7的麥芽寡糖(麥芽庚糖)生成異環(huán)麥芽五糖，而且在麥芽五糖或麥芽六糖單位切斷，通過(guò)分子內(nèi)α-1，6轉(zhuǎn)移，由葡萄糖聚合度為8以上的麥芽寡糖生成異環(huán)麥芽五糖和異環(huán)麥芽六糖。
根據(jù)以上內(nèi)容，認(rèn)為本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生的異環(huán)麥芽寡糖的反應(yīng)機(jī)制如下所示。該酶作用于作為底物的葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，在分子間α-1，4轉(zhuǎn)移一系列的麥芽寡糖，催化聚合度各不相同的麥芽寡糖的生成(歧化反應(yīng))。另一方面，在作用于葡萄糖聚合度為7的α-1，4葡聚糖(麥芽庚糖)時(shí)，通過(guò)催化從其還原性末端起在麥芽五糖單位切斷，將還原末端葡萄糖的1位分子內(nèi)轉(zhuǎn)移到麥芽五糖的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的環(huán)化反應(yīng)，從而生成異環(huán)麥芽五糖和麥芽糖。此外，在作用于葡萄糖聚合度為8以上的α-1，4葡聚糖時(shí)，通過(guò)催化從其還原性末端起在麥芽五糖或麥芽六糖單位切斷，將還原末端葡萄糖的1位分子內(nèi)轉(zhuǎn)移到麥芽五糖或麥芽六糖的非還原末端葡萄糖的6位羥基上的環(huán)化反應(yīng)，從而生成異環(huán)麥芽五糖和異環(huán)麥芽六糖，生成葡萄糖聚合度減至5或6的α-1，4葡聚糖。
<實(shí)驗(yàn)11由各種底物生成異環(huán)麥芽寡糖>
使用本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶，進(jìn)行由各種糖生成異環(huán)麥芽寡糖的試驗(yàn)。制備麥芽六糖，麥芽七糖，淀粉酶，可溶性淀粉，淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#100”松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)，糖原(來(lái)源于玉米，キユ一ピ一株式會(huì)社制造)的各種水溶液。
在這些水溶液(終濃度為1.0w/v％)中以終濃度20mM加入醋酸緩沖液(pH6.0)，以終濃度1mM加入氯化鈣后，每1g固體物質(zhì)添加由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品1單位，使之于45℃，pH6.0下作用48小時(shí)后，通過(guò)將該反應(yīng)液于100℃加熱10分鐘，使反應(yīng)停止。與實(shí)驗(yàn)1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶處理后，用HPLC定量異環(huán)麥芽寡糖，求出異環(huán)麥芽寡糖的生成率。其結(jié)果示于表8。


根據(jù)表8的結(jié)果清楚地表明，試驗(yàn)的任一種糖受到異環(huán)麥芽寡糖合酶的作用都生成異環(huán)麥芽五糖和異環(huán)麥芽六糖。其生成率的合計(jì)，底物為麥芽六糖時(shí)生成率低至約14％，與之相對(duì)，底物為淀粉酶時(shí)最高約為29％，隨后依次為可溶性淀粉，淀粉部分分解物。
<實(shí)驗(yàn)12異環(huán)麥芽寡糖生成反應(yīng)和反應(yīng)產(chǎn)物的還原力>
在淀粉水溶液(最終濃度為1.0w/v％)中以終濃度20mM加入醋酸緩沖液(pH6.0)，以終濃度1mM加入氯化鈣后，每1g固體物質(zhì)添加由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品1單位，使之于45℃，pH6.0下反應(yīng)，在添加酶之后立刻取樣，立即于約100℃將取樣的樣品加熱10分鐘從而使反應(yīng)停止，用水冷卻，獲得反應(yīng)0小時(shí)的反應(yīng)液。接著，分別在反應(yīng)1、2、3、4小時(shí)時(shí)取樣，立即于約100℃加熱10分鐘來(lái)停止反應(yīng)，用水冷卻，獲得反應(yīng)1小時(shí)、反應(yīng)2小時(shí)、反應(yīng)3小時(shí)、反應(yīng)4小時(shí)的各個(gè)反應(yīng)液。用Somogyi-Nelson’s法測(cè)定獲得的反應(yīng)液的還原糖量，用蒽酮硫酸法測(cè)定總糖量，以百分率(％)表示還原糖量在總糖量中所占比率，以此作為還原力。此外，與實(shí)驗(yàn)1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶處理后，用HPLC定量異環(huán)麥芽寡糖，求出異環(huán)麥芽寡糖的生成率。其結(jié)果示于表9。



根據(jù)表9的結(jié)果清楚地表明，使本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶作用于可溶性淀粉，生成異環(huán)麥芽寡糖，當(dāng)異環(huán)麥芽寡糖的生成率在10％以上時(shí)，還原力有0.1％左右的略微增加。這意味著本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶是基本上催化轉(zhuǎn)移環(huán)化反應(yīng)的酶，這些反應(yīng)時(shí)幾乎不伴隨加水分解。可知在使該酶作用于淀粉和其分解物等，生成異環(huán)麥芽寡糖時(shí)，如果預(yù)先降低反應(yīng)前的淀粉和其分解物的還原力，即DE，增加的還原力少，因此可以獲得還原力低的生成物。
<實(shí)驗(yàn)13異淀粉酶和支鏈淀粉酶的添加對(duì)異環(huán)麥芽寡糖的生成的效果>
制備淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#100”松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)水溶液，以終濃度20mM加入醋酸緩沖液(pH5.5)，以終濃度1mM加入氯化鈣后，每1g固體物質(zhì)添加由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶制品1單位，并且每1g固體物質(zhì)分別添加0、125、250、500、1250或2500單位的異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，使之于45℃，pH5.5下作用24小時(shí)后，于100℃加熱10分鐘，使酶失活。接著，與實(shí)驗(yàn)1相同，用α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶處理后，用HPLC定量異環(huán)麥芽寡糖，求出異環(huán)麥芽寡糖的生成率。此外，使用支鏈淀粉酶代替異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，每1g固體物質(zhì)分別添加0、1.3、2.7、5.3、13.3或26.7單位，進(jìn)行相同的操作，求出異環(huán)麥芽寡糖的生成率。其結(jié)果示于表10和表11。



根據(jù)表10和表11的結(jié)果清楚地表明，通過(guò)添加異淀粉酶和支鏈淀粉酶，異環(huán)麥芽寡糖的生成率增加。
<實(shí)驗(yàn)14液化淀粉DE對(duì)異環(huán)麥芽寡糖的生成的影響>
將玉米淀粉制成濃度為2質(zhì)量％的淀粉乳，在其中加入0.1質(zhì)量％的碳酸鈣，調(diào)整成pH6.0，每克淀粉加入0.2、0.4、0.6、1.0、1.5或2.0質(zhì)量％的α-淀粉酶(商品名“タ一マシ一ル60L”，ノボ公司制)，分別在95℃反應(yīng)10分鐘，然后于120℃高壓滅菌，急冷到約40℃，制得DE3.1～20.4的表10中所示的6種淀粉液化溶液。在這些淀粉液化溶液(最終濃度為1質(zhì)量％)中按1g固形物質(zhì)添加由實(shí)驗(yàn)5的方法獲得的純化異環(huán)麥芽寡糖合酶1單位，使之于45℃，pH6.0下作用48小時(shí)后，通過(guò)對(duì)該反應(yīng)液煮沸10分鐘來(lái)使該反應(yīng)液停止。為了研究這些熱失活的反應(yīng)液中的異環(huán)麥芽寡糖的生產(chǎn)量，與實(shí)驗(yàn)1相同，添加α-葡糖苷酶和葡萄糖淀粉酶使之反應(yīng)后，用HPLC定量異環(huán)麥芽寡糖，求出異環(huán)麥芽寡糖的生成率。其結(jié)果示于表12。


根據(jù)表12的結(jié)果清楚地表明，由本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生的異環(huán)麥芽寡糖的生成率受到液化淀粉的DE影響，DE值越低，異環(huán)麥芽寡糖生成率越高，相反，DE值越高，異環(huán)麥芽寡糖生成率越低。具體的是，表明液化淀粉的DE約20以下合適，理想的是DE為約8以下合適，更理想的是DE為約5以下合適。
<實(shí)驗(yàn)15異環(huán)麥芽寡糖的熱穩(wěn)定性>
按實(shí)驗(yàn)11的方法由可溶性淀粉制備，將通過(guò)按實(shí)驗(yàn)1的方法純化至純度100％所獲得的異環(huán)麥芽五糖溶解于無(wú)離子水，制備濃度為5w/v％的異環(huán)麥芽五糖溶液。將8ml該溶液收集于玻璃制試管中，密封后，于120℃加熱30-90分鐘。放冷后，進(jìn)行這些溶液的著色度的測(cè)定和用HPLC法進(jìn)行的異環(huán)麥芽五糖的純度測(cè)定。以1cm小室中480nm處的吸光度為著色度。結(jié)果示于表13。


根據(jù)表13的結(jié)果清楚所示，使異環(huán)麥芽五糖水溶液于120℃的高溫加熱也無(wú)著色，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)由于分解而導(dǎo)致的純度降低，表明異環(huán)麥芽五糖是對(duì)熱穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)16異環(huán)麥芽寡糖的pH穩(wěn)定性>
將實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖溶解于各種緩沖液中，制備異環(huán)麥芽五糖濃度為4w/v％，pH調(diào)整成2-10的9種異環(huán)麥芽五糖溶液。將8ml各個(gè)溶液收集于玻璃制試管中，密封后，于100℃加熱24小時(shí)。放冷后，與實(shí)驗(yàn)15同樣，進(jìn)行這些溶液的著色度的測(cè)定和用HPLC法進(jìn)行的異環(huán)麥芽五糖的純度測(cè)定。結(jié)果示于表14。


根據(jù)表14的結(jié)果清楚所示，異環(huán)麥芽五糖水溶液在100℃的24小時(shí)加熱中，在pH5-10的范圍內(nèi)基本不分解，可知其在弱酸性至堿性的大范圍內(nèi)穩(wěn)定。但是，在pH4時(shí)稍有分解，在pH3時(shí)一半以上分解，在pH2時(shí)完全分解而小時(shí)。
<實(shí)驗(yàn)17氨基羰基反應(yīng)>
將實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖和市售的試劑特級(jí)甘氨酸溶解于無(wú)離子水中，進(jìn)而制備出用磷酸緩沖液調(diào)整成pH7.0的含有1w/v％甘氨酸的5w/v異環(huán)麥芽五糖溶液。作為對(duì)照，除了使用α-環(huán)糊精代替異環(huán)麥芽五糖之外，以與上述相同的方式制備含有α-環(huán)糊精的溶液。將4ml各溶液收集于玻璃制試管中，密封后，于120℃加熱30-90分鐘。室溫下放冷后，測(cè)定它們的著色度，研究氨基羰基的反應(yīng)性。同時(shí)，同樣加熱只含有甘氨酸的溶液，將其作為空白。著色度為1cm小室中480nm處的吸光度，其值為減去空白的值之后的值。結(jié)果示于表15。


根據(jù)表15的結(jié)果清楚所示，異環(huán)麥芽五糖并未顯示出著色度上升，與對(duì)照的α-環(huán)糊精相同，在甘氨酸共存下既使加熱也不容易發(fā)生著色，褐變，表明其是氨基羰基反應(yīng)性低的穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)18氨基羰基反應(yīng)>
將實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖和市售的多蛋白胨(日本制藥制造)溶解于無(wú)離子水中，進(jìn)而制備出用含有5w/v％多蛋白胨的異環(huán)麥芽五糖溶液。作為對(duì)照，除了使用α-環(huán)糊精代替異環(huán)麥芽五糖之外，以與上述相同的方式制備含有α-環(huán)糊精(α-CD)的溶液。將4ml各溶液收集于玻璃制試管中，密封后，于120℃加熱30-90分鐘。室溫下放冷后，測(cè)定它們的著色度，研究氨基羰基的反應(yīng)性。同時(shí)，同樣加熱只含有多蛋白胨的溶液，將其作為空白。著色度為1cm小室中480nm處的吸光度，其值為減去空白的值之后的值。結(jié)果示于表16。


根據(jù)表16的結(jié)果清楚所示，異環(huán)麥芽五糖的著色度極低，與對(duì)照的α-環(huán)糊精相同，在多蛋白胨共存下既使加熱也不容易發(fā)生著色，褐變，表明其是氨基羰基反應(yīng)性低的穩(wěn)定的糖。
<實(shí)驗(yàn)19異環(huán)麥芽寡糖的包合作用>
將實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖溶解于無(wú)離子水中，制備20質(zhì)量％水溶液。在平均20ml水溶液中分別添加以摩爾換算的相對(duì)于異環(huán)麥芽五糖3倍量的甲醇、乙醇、正丙醇和正丁醇4種短鏈醇，醋酸、丙酸、n-丁酸和n-戊酸4種短鏈脂肪酸，和苯甲醇，苯乙醇，4-苯基-1-正丙醇和o-甲氧甲酚4種芳香族化合物作為香味成分，攪拌均勻，使之包合。然后，將它們分別過(guò)濾，通過(guò)將濾液冷凍干燥除去未包合物。為了測(cè)定冷凍干燥物中的包合物，對(duì)各個(gè)冷凍干燥物，用氣相色譜法定量化合物。使用α-環(huán)糊精(α-CD)作為對(duì)照，進(jìn)行同樣試驗(yàn)。結(jié)果示于表17。


根據(jù)表17的結(jié)果清楚地表明，異環(huán)麥芽五糖具有包合短鏈醇，短鏈脂肪酸和芳香族化合物等各種化合物的能力。異環(huán)麥芽五糖對(duì)于甲醇，乙醇，醋酸，丙酸，n-丁酸的包合量比α-環(huán)糊精要多。由于異環(huán)麥芽五糖顯示出芳香族化合物的包合能力，因此其包合量根據(jù)所包合的化合物的種類而大不相同。
<實(shí)驗(yàn)20異環(huán)麥芽寡糖的消化性試驗(yàn)>
對(duì)于實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖，按照岡田等人的記載于日本營(yíng)養(yǎng)和食品科學(xué)學(xué)會(huì)雜志(日本栄善食糧學(xué)會(huì)誌)，Vol.43，pp.23-29(1990)中報(bào)道的方法在試管中研究由唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶以及腸粘膜酶產(chǎn)生的消化性。作為對(duì)照，使用同為環(huán)狀糖的α-，β-和γ-環(huán)糊精，同樣研究消化性。結(jié)果示于表18。并且，表中的分解率(％)是指，在上述各消化反應(yīng)中，用式分解率(％)＝{(反應(yīng)液中的還原糖量)/(反應(yīng)液中的總糖量)}×100計(jì)算出的值。


*環(huán)糊精根據(jù)表17的結(jié)果清楚地表明，與α-和β-環(huán)糊精相同，唾液淀粉酶，合成胃液，胰淀粉酶和腸粘膜酶的任一種都基本無(wú)法消化異環(huán)麥芽五糖。另一方面，γ-環(huán)糊精被胰淀粉酶和腸粘膜酶進(jìn)行部分消化。異環(huán)麥芽五糖是一種難消化的糖。
<實(shí)驗(yàn)21急性毒性試驗(yàn)>
將實(shí)驗(yàn)15中使用的異環(huán)麥芽五糖經(jīng)口施于小鼠，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。其結(jié)果是，確認(rèn)了異環(huán)麥芽五糖是一種低毒性物質(zhì)，即使在可以給藥的最大量時(shí)也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)死亡例，其LD50值為5g/kg小鼠體重以上。
以下，通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。但是，本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限制。
實(shí)施例1按照實(shí)驗(yàn)1的方法起始培養(yǎng)環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)AM7(FERM BP-10111)。然后將約20L由1.5％(w/v)淀粉部分分解物(商品名“パインデツクス#4”，松谷化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制造)、0.5％(w/v)酵母提取物(商品名“ポリペプトン(POLYPEPTON)”，日本制藥株式會(huì)社制造)、0.1％(w/v)酵母提取物(商品名“酵母エキスS”，日本制藥株式會(huì)社制造)、0.1％(w/v)磷酸二鉀、0.06％(w/v)磷酸一鈉·2水合物、0.05％(w/v)硫酸鎂·7水合物、0.3％(w/v)碳酸鈣和水構(gòu)成的液體培養(yǎng)基裝入容量為30L的發(fā)酵器中，加熱滅菌，冷卻，溫度達(dá)到27℃后，pH保持于5.5-8.0，通氣培養(yǎng)96小時(shí)。培養(yǎng)后，用SF膜除菌過(guò)濾，回收約18L培養(yǎng)濾液，進(jìn)而用UF膜濃縮其濾液，回收約1L含有0.41單位/ml本發(fā)明的異環(huán)麥芽寡糖合酶的濃縮酶液。
實(shí)施例2將馬鈴薯淀粉乳制成濃度為約1質(zhì)量％的淀粉乳，在其中以1mM的終濃度加入氯化鈣，調(diào)整成pH6.0，于95℃加熱約20分鐘進(jìn)行糊化，然后冷卻至約40℃，以每1g淀粉固體物質(zhì)2.44ml(約1單位)的比例加入含有由實(shí)施例1的方法獲得的異環(huán)麥芽寡糖合酶的濃縮酶液，于pH6.0，溫度40℃使之反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，冷卻，過(guò)濾，將過(guò)濾得到的濾液按照常規(guī)的方法用活性炭脫色，通過(guò)H型和OH型離子交換樹(shù)脂脫鹽來(lái)純化，再通過(guò)濃縮，以相當(dāng)于固體物質(zhì)約90％的產(chǎn)率獲得了含有濃度為65質(zhì)量％的異環(huán)麥芽寡糖的糖漿。本品，含有27.5質(zhì)量％相當(dāng)于固體物質(zhì)的異環(huán)麥芽寡糖，含有72.5質(zhì)量％其它的糖，其具有低還原性，具有適度粘度，可以作為甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可有效應(yīng)用于各種飲食品、化妝品、藥品等各種組合物中。
實(shí)施例3將木薯淀粉制成濃度為約1質(zhì)量％的淀粉乳，在其中加入使成為0.1％的碳酸鈣，將pH調(diào)整到6.0，在其中以每克淀粉固體物質(zhì)加入使成為0.2質(zhì)量％的α-淀粉酶(商品名“ダ-マミ-ル60L”、ノボ公司制造)，于95℃使之反應(yīng)10分鐘，然后于120℃高壓滅菌20分鐘，再急劇冷卻到約40℃，得到DE為約3的液化溶液，按照每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)2.44ml(約1單位)的比例向液化溶液中加入用實(shí)施例1方法得到的含有異環(huán)麥芽寡糖合酶的濃縮液，并以每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)1000單位的比例向液化溶液中加入異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，于pH6.0、溫度40℃使之反應(yīng)48小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，冷卻，過(guò)濾，將過(guò)濾得到的濾液按照常規(guī)的方法用活性炭脫色，通過(guò)H型和OH型離子交換樹(shù)脂脫鹽來(lái)純化，再通過(guò)濃縮，獲得了濃度為60質(zhì)量％含有31.5％相當(dāng)于固體物質(zhì)的異環(huán)麥芽寡糖的糖漿。將得到的糖漿作為糖液，使用采用強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(AMBERLITE CR-1310、Na型、Organo株式會(huì)社制造)的柱進(jìn)行分級(jí)。把樹(shù)脂填充在4根內(nèi)徑5.4cm帶夾套的不銹鋼制柱中，將這些柱串聯(lián)連接使樹(shù)脂總長(zhǎng)為20米。將柱內(nèi)溫度保持在60℃，相對(duì)于樹(shù)脂量加5v/v％糖漿，向其中通60℃的溫水，以SV0.13洗脫進(jìn)行分離，用HPLC法監(jiān)控洗脫液的糖組成，收集含有異環(huán)麥芽寡糖的級(jí)分，將其進(jìn)行純化，濃縮，噴霧干燥，以相當(dāng)于固體物質(zhì)的約54％的收率獲得含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末。本品含有51.5質(zhì)量％相當(dāng)于固體物質(zhì)的異環(huán)麥芽寡糖，含有48.5質(zhì)量％其它的糖，其具有低還原性，可以作為甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑等，可有效應(yīng)用于各種飲食品、化妝品、藥品等各種組合物中。
<實(shí)施例4>
將玉米淀粉制成濃度為約1質(zhì)量％的淀粉乳，在其中加入使成為0.1％的碳酸鈣，將pH調(diào)整到6.0，在其中以每克淀粉固體物質(zhì)加入使成為0.2質(zhì)量％的α-淀粉酶(商品名”ダ-マミ-ル60L”、ノボ公司制造)，于85-90℃使之反應(yīng)20分鐘，然后于120℃高壓滅菌20分鐘，再急劇冷卻到約40℃，得到DE約3的液化溶液，按照每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)2.44ml(約1單位)的比例向液化溶液中加入用實(shí)施例1方法得到的含有異環(huán)麥芽寡糖合酶的濃縮液，并以每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)1000單位的比例向液化溶液中加入異淀粉酶(株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所制造)，于pH6.0、溫度40℃，使反應(yīng)48小時(shí)。該反應(yīng)液在加熱至95℃并保持30分鐘后，使pH5.0、溫度50℃，在其中以每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)1000單位的比例向其中加入α-葡糖苷酶(商品名糖苷轉(zhuǎn)移酶L“AMANO”，天野制藥制)，以每克淀粉固體物質(zhì)對(duì)應(yīng)100單位的比例向其中加入葡萄糖淀粉酶(商品名“グルコチ一ム”，ナガせ生化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)，于pH5.0，溫度50℃使之反應(yīng)16小時(shí)。將該反應(yīng)液加熱到95℃，保持30分鐘后，冷卻，過(guò)濾，將過(guò)濾得到的濾液按照常規(guī)的方法用活性炭脫色，通過(guò)H型和OH型離子交換樹(shù)脂脫鹽來(lái)純化，再通過(guò)濃縮，以相當(dāng)于固體物質(zhì)的約95％的收率獲得了濃度為60質(zhì)量％含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿。本品含有32.6質(zhì)量％相當(dāng)于固體物質(zhì)的異環(huán)麥芽寡糖，63.0質(zhì)量％葡萄糖和4.4質(zhì)量％其它糖，其具有低還原性，具有適度粘度，可以作為甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可有效應(yīng)用于各種飲食品、化妝品、藥品等各種組合物中。
<實(shí)施例5>
將實(shí)施例4的方法獲得的含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿裝入高壓滅菌鍋中，添加相對(duì)于固體成分的約9質(zhì)量％的拉奈鎳作為催化劑，一邊攪拌一邊使溫度上升到130℃，通過(guò)氫壓上升到75kg/cm2后，添加氫，將包含于含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿中的葡萄糖和其它還原性糖置換為這些糖的糖醇。從該反應(yīng)液中除去拉奈鎳，通過(guò)按常規(guī)方法脫色，脫鹽，進(jìn)行純化，濃縮，真空干燥，粉碎，以相當(dāng)于固體物質(zhì)約90％的收率獲得了含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末。本品含有相當(dāng)于固體物質(zhì)的32.5質(zhì)量％的異環(huán)麥芽寡糖，63.2質(zhì)量％山梨糖醇和4.3質(zhì)量％其它的糖，其基本沒(méi)有顯示出還原性，不容易發(fā)生氨基羰基反應(yīng)，可以作為甜味劑、調(diào)味劑、品質(zhì)改良劑、脫水防止劑、穩(wěn)定劑、變色防止劑、賦形劑、包合劑等，可有效應(yīng)用于各種飲食品、化妝品、藥品等各種組合物中。
<實(shí)施例6甜味劑>
向0.8質(zhì)量份由實(shí)施例3的方法獲得的含異環(huán)麥芽寡糖的粉末中均勻混入0.2質(zhì)量份海藻糖含水結(jié)晶(株式會(huì)社林原商事售，注冊(cè)商標(biāo)“トレハ”)，0.01質(zhì)量份“α-グリコシルステビオシド”(東洋精糖株式會(huì)社售，商品名“αGsweet”)和0.01質(zhì)量份的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(商品名“糖精(aspartame)”)，將該混合物裝入顆粒成型機(jī)得到粒狀甜味劑。本品甜味品質(zhì)優(yōu)異，其具有蔗糖的約兩倍的甜味度。本品適于作為在室溫保存下，不必?fù)?dān)心變質(zhì)劣化的穩(wěn)定的甜味劑。
<實(shí)施例7硬糖果>
將100質(zhì)量份的濃度為55％蔗糖溶液與50質(zhì)量份的含有用實(shí)施例4方法獲得的異環(huán)麥芽寡糖的糖漿加熱混合，然后在減壓下加熱濃縮至水分含量低于2％。該濃縮液與0.6質(zhì)量份檸檬酸和適量的檸檬香料及著色劑混合，所得混合物以常規(guī)方法成形，得到制品。本品香脆，口味和香味良好，是一種不引起蔗糖的結(jié)晶化，吸濕性少，且不引起垂流的穩(wěn)定的高品質(zhì)的硬糖。
<實(shí)施例8口香糖>
將3質(zhì)量份的樹(shù)膠基加熱熔化至柔軟的程度，在其中加入2質(zhì)量份無(wú)水麥芽糖，2質(zhì)量份木糖醇，2質(zhì)量份含有由實(shí)施例5的方法獲得的含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末和1質(zhì)量份含水結(jié)晶海藻糖，再混合適量的香料和著色劑，按照常規(guī)方法，通過(guò)滾動(dòng)揉捏，成形并包裝，以獲得制品。本品質(zhì)感、口味和香味良好，適于作為一種低蝕性，低熱量的口香糖。
<實(shí)施例9加糖煉乳>
將4質(zhì)量份的用實(shí)施例2方法所獲得的含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿和2質(zhì)量份的蔗糖溶解在100質(zhì)量份原乳中，用一平底加熱器加熱滅菌，然后濃縮成濃度為70％的溶液，在無(wú)菌狀態(tài)下裝罐，從而獲得制品。本品甜味適中，香味好，可有效用于水果、咖啡、可可和茶等的調(diào)味。
<實(shí)施例10乳酸菌飲料>
將175質(zhì)量份的脫脂奶粉、100質(zhì)量份的用實(shí)施例3的方法所獲含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末和高乳蔗糖(Lactosucrose)(株式會(huì)社林原商事售，注冊(cè)商標(biāo)“乳果オリゴ”)粉溶于1500質(zhì)量份的水中，將得溶液在65℃滅菌30分鐘，冷卻至40℃后，在其中按常規(guī)方法接種30質(zhì)量份的乳酸菌促酵物，并在37℃培養(yǎng)8小時(shí)，得到乳酸菌飲料。本品香味好，含有寡糖，異環(huán)麥芽寡糖，適于作為一種穩(wěn)定維持乳酸菌并具有促進(jìn)雙歧桿菌增殖作用和整腸作用的乳酸菌飲料。
<實(shí)施例11粉末果汁>
將33質(zhì)量份通過(guò)噴霧干燥制備的橙汁粉與用實(shí)施例5的方法所的獲得的50質(zhì)量份的富含非還原性糖類的粉末、10質(zhì)量份的無(wú)水結(jié)晶マルチト一ル、0.65質(zhì)量份的無(wú)水檸檬酸、0.1質(zhì)量份的蘋(píng)果酸、0.1質(zhì)量份的2-O-α-糖基-L-抗壞血酸、0.1質(zhì)量份的檸檬酸鈉、0.5質(zhì)量份的葡聚糖和足量的香料粉在攪拌條件下混合均勻。將所得混合物粉碎成微粉，送入流化床制粒機(jī)內(nèi)?；?0分鐘，向其噴灑用實(shí)施例2方法所獲作為粘接劑的含有非還原性糖類的糖漿作為粘合劑，同時(shí)排風(fēng)溫度為40℃。對(duì)所獲顆粒稱重并包裝，獲得所需產(chǎn)品。該產(chǎn)品的果汁含有率約30％的顆粒果汁。該產(chǎn)品無(wú)異味、異臭，高品質(zhì)，作為低卡路里的果汁，商品價(jià)值高。
<實(shí)施例12乳蛋糕乳脂>
將100質(zhì)量份的玉米淀粉，100質(zhì)量份由實(shí)施例2方法得到的含有含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿，60質(zhì)量份的海藻糖含水結(jié)晶，40質(zhì)量份的蔗糖和1質(zhì)量份的鹽充分混合，加入280質(zhì)量份的雞蛋攪拌，在其中慢慢加入1000質(zhì)量份的沸騰的牛奶，再加熱繼續(xù)攪拌，在玉米淀粉完全糊化，整體呈半透明狀態(tài)時(shí)停止加熱，隨后將其冷卻，加入適量的香草香料。將所得混合物稱重、填充并包裝，制得制品。本品具有柔滑的光澤，是一種香味良好，可抑制淀粉氧化的高品質(zhì)乳蛋糕乳脂。
<實(shí)施例13火腿>
向1000質(zhì)量份的豬腿肉中加入15質(zhì)量份的鹽、3質(zhì)量份的硝酸鉀，并揉搓均勻，將其堆積起來(lái)并在冷藏室中放置過(guò)夜。隨后，在冷藏室中將其浸漬于由500質(zhì)量份的水、100質(zhì)量份的鹽、3質(zhì)量份的硝酸鉀、40質(zhì)量份用實(shí)施例5方法獲得的含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末和調(diào)味品組成的鹽溶液中7天，然后通過(guò)用常規(guī)方法用冷水沖洗，用繩包扎、熏制、蒸煮、冷卻并包裝而獲得產(chǎn)品。該產(chǎn)品是一種色調(diào)好、香味良好的高品質(zhì)的火腿。
<實(shí)施例14粉狀肽>
在1質(zhì)量份的40％食用大豆的肽溶液(不二制油株式會(huì)社售，商品名“Hinute S”)中混合2質(zhì)量份的由實(shí)施例3方法制備的含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末，將所得混合物放入塑料容器中，在50℃溫度下減壓干燥，粉碎得到粉狀肽。該產(chǎn)品香味良好，可有利作為預(yù)混合物、冰淇淋等低卡路里的糖果制造材料，還可有利用作用于口服流食和插管流食的難消化性的食物纖維、整腸劑量。
<實(shí)施例15化妝品乳膏>
將2質(zhì)量份的聚氧乙烯乙二醇-單硬脂酸酯、5質(zhì)量份的自乳化型單硬脂酸甘油酯、2質(zhì)量份按實(shí)施例5方法獲得的含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末、1質(zhì)量份的α-糖基蕓香苷(株式會(huì)社林原售，商品名αG蕓香苷)、1質(zhì)量份的液體石蠟、10質(zhì)量份的三辛酸甘油酯，以及適量防腐劑按常規(guī)方法加熱溶解，在其中加入2質(zhì)量份的L-乳酸、5質(zhì)量份的1，3-丁二醇和66質(zhì)量份的純化水，所得混合物由勻漿器乳化，再加入適量的香料，攪拌混合，制得化妝用乳膏。本品具有抗氧化性，穩(wěn)定性高，可有效用作優(yōu)質(zhì)防曬霜、皮膚嫩化劑和皮膚增白劑。
<實(shí)施例16牙膏>
把45質(zhì)量份磷酸氫鈣、1.5質(zhì)量份月桂基硫酸鈉、25質(zhì)量份甘油、0.5質(zhì)量份聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酯、10質(zhì)量份的由實(shí)施例3的方法制得的含有異環(huán)麥芽寡糖的粉末、0.02質(zhì)量份糖精與18質(zhì)量份水混合制得牙膏。本品不降低表面活性劑的洗滌力，改善難聞味道，使用后感覺(jué)也良好。
<實(shí)施例17流食用固體制劑>
配制100質(zhì)量份由實(shí)施例2的方法制得的含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿，200質(zhì)量份海藻糖含水結(jié)晶，200質(zhì)量份麥芽四糖高含量粉末、270質(zhì)量份粉末蛋黃，209質(zhì)量份脫脂奶粉，4.4質(zhì)量份氯化鈉、1.8質(zhì)量份氯化鉀，4質(zhì)量份硫酸鎂、0.01質(zhì)量份硫胺素，0.1質(zhì)量份抗壞血酸鈉，0.6質(zhì)量份維生素E乙酸酯和0.04質(zhì)量份煙酰胺組成的組合物，每25克該組合物填充到防潮性復(fù)合小袋中，密封制得制品。本品作為流食，可經(jīng)口，或通過(guò)管向鼻腔，胃，腸等的使用方法利用，可有效地用于補(bǔ)充生物體的能量。
<實(shí)施例18外傷治療用藥膏>
在100質(zhì)量份由實(shí)施例5的方法制得的含有異環(huán)麥芽寡糖的糖漿和300質(zhì)量份麥芽糖中，加入50質(zhì)量份溶解有3質(zhì)量份碘的甲醇，進(jìn)行混合，再加入200質(zhì)量份的10w/v％支鏈淀粉水溶液，進(jìn)行混合，制得顯示出適度的延展和粘附性的外傷治療用藥膏。本品是一種經(jīng)時(shí)變化少、商品價(jià)值高的藥膏。此外，本品不僅具有由碘產(chǎn)生的殺菌作用，而且因麥芽糖也作為能量補(bǔ)充劑作用于細(xì)胞，故可縮短治療時(shí)間，很好地治療創(chuàng)傷面。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性如果根據(jù)本發(fā)明，可以使用異環(huán)麥芽寡糖合酶大量制備、提供具有由通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖?？梢蕴峁┤碌漠惌h(huán)麥芽寡糖的本發(fā)明，對(duì)飲食品、化妝品、藥品等各種應(yīng)用領(lǐng)域大有貢獻(xiàn)，其產(chǎn)業(yè)的意義極大。
通式1[化4]環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→)}(n是指4或5)。
序列表<110>株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所<120>異環(huán)麥芽寡糖和異環(huán)麥芽寡糖合酶以其制備方法和用途<130>10107902<160>23<210>1<211>20<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)<400>1Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met1 5 10 15Val Asp Arg Phe20<210>2<211>960<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>2Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr Gln Ile Met1 5 10 15Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Ala Thr Gly Ala20 25 30Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe Arg Tyr Met Lys35 40 45
Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro Tyr Ile His Asn50 55 60Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala Glu Pro Gln Met65 70 75 80Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ala Tyr His Gly85 90 95Tyr Asn Val Lys Asp Pro Asn Lys Ala Asn Pro Tyr Phe Gly Thr Lys100 105 110Glu Lys Leu Lys Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys115 120 125Val Ile Ile Asp Val Val Pro Asn His Ile Gly Asp Tyr Met Leu Gly130 135 140Thr Gln Ala Phe Tyr Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe145 150 155 160Asn Asn Pro Ala Trp Tyr His His Asn Gly Asp Ile Asn Trp Ser Leu165 170 175Ala Asp Gly Arg Tyr Asp Gln Trp Ala Gln Asp Tyr Leu Glu Asn His180 185 190Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Ile Asp Phe Asp Val Pro Ala Ala Lys195 200 205Gln Ala Ile Phe Ser Ser Ile Lys Gly Trp Phe Asp Tyr Thr Gly Ala210 215 220Asp Gly Ala Arg Val Asp Ala Ala Lys Leu Met Lys Pro Thr Asp Ile225 230 235 240Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr Phe Gly Glu Asn Phe245 250 255Asp Gly Asn Ala Glu Phe Val Ser Arg Trp Val Gly Thr Asn Lys Glu260 265 270Trp Gly Met Leu Asp Phe Pro Leu Phe Phe Ser Val Leu Asn Ser Phe275 280 285Ala Tyr Gly Gln Ser Phe Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr Leu Ala Gln290 295 300Asp Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Ala Asn His Met Val Thr Phe Ile Asp
305 310 315 320Asn His Asp Arg Asn Arg Phe Leu Thr Glu Ala Gly Gly Ser Val Glu325 330 335Lys Leu Gln Asn Ala Leu Ser Phe Ile Phe Thr Val Arg Gly Thr Pro340 345 350Val Val Phe Gln Gly Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Gly Asn Gly Gln355 360 365Ile Met Thr Gly Gly Ile Ala Asp Thr Trp Asn Arg Trp Ser Met Val370 375 380Lys Arg Asp Ala Asn Gly Asn Val Leu Glu Asn Tyr Phe Asn Glu Asn385 390 395 400Ala Ser Thr Phe Lys His Val Ala Lys Leu Asn Glu Ile Arg Lys Asn405 410 415Asn Pro Ala Leu Arg Thr Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp Ser Ala Gln420 425 430Asn Leu Tyr Ala Phe Ser Arg Arg Ile Asp Thr Gly Thr Asn Val Gly435 440 445Gln Glu Val Ile Ser Ala Phe Ser Asn Ala Ser Gly Gly Ser Gln Thr450 455 460Val Thr Leu Pro Leu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Thr Ala Gly Thr Val465 470 475 480Leu Val Asn Gln Leu Asn Pro Ser Asp Thr Val Thr Val Gln Ala Gly485 490 495Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala Asn Ser Ala500 505 510Lys Ile Tyr Ala Lys Thr Gln Pro Val Thr Asp Thr Gln Ala Pro Ser515 520 525Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Thr Val Gln Asn Ala Ser Ser Ala Leu530 535 540Val Ser Trp Ser Ala Ser Thr Asp Asn Val Gly Val Thr Gly Tyr Glu545 550 555 560Ile Tyr Arg Asn Gly Val Lys Ile Gly Thr Ser Ala Thr Thr Ser Phe565 570 575Thr Asp Asn Gly Leu Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Tyr Thr Val Lys
580 585 590Ala Tyr Asp Ala Ala Met Asn Leu Ser Ala Phe Ser Ala Ala Ala Leu595 600 605Ile Val Thr Pro Ala Gly Asn Ser Val Thr Ile Tyr Tyr Lys Gln Gly610 615 620Tyr Thr Asn Pro Tyr Ile His Tyr Arg Pro Val Gly Gly Thr Trp Thr625 630 635 640Thr Ser Pro Gly Val Ala Ile Pro Ala Ala Glu Val Ala Gly Tyr Asn645 650 655Lys Ile Thr Ile Asn Ile Gly Ala Ala Thr Gln Leu Glu Ala Cys Phe660 665 670Asn Asn Gly Ser Gly Ile Trp Asp Ser Asn Gly Gly Ser Asn Tyr Leu675 680 685Phe Gly Thr Gly Thr Trp Thr Tyr Thr Pro Thr Gly Asn Ile Gln Ala690 695 700Gly Gly Pro Val Thr Pro Thr Ala Ser Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val705 710 715 720Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala725 730 735Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Val Ala Pro Thr Ala740 745 750Thr Pro Val Pro Thr Ala Thr Pro Ala Gly Asn Thr Ala Thr Ile Tyr755 760 765Tyr Lys Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr Ile His Tyr Lys Leu Asp770 775 780Gly Ala Thr Thr Trp Thr Thr Ser Pro Gly Val Pro Met Gln Ala Ser785 790 795 800Thr Phe Ser Gly Tyr Lys Ser Ile Thr Ile Pro Leu Gly Thr Ala Thr805 810 815Gly Leu Thr Ala Ala Phe Asn Asn Gly Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asn820 825 830Gly Gly Asn Asn Tyr His Phe Gly Thr Gly Ser Ser Ser Leu Val Gly835 840 845Gly Ser Leu Thr Thr Gly Glu Pro Gln Ala Asp Ser Val Thr Phe Arg
850 855 860Val Ser Val Pro Gly Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val Tyr Leu Thr865 870 875 880Gly Ser Phe Asn Ser Trp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr885 890 895Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser Val Thr Leu Asn Leu Pro Ala Gly900 905 910Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu Thr Arg Gly Ser Trp Ala Thr Val Glu915 920 925Thr Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ile Thr Ash Arg Thr Leu Thr Pro Ala930 935 940Gly Gly Ala Gln Thr Val Thr Ile Ser Val Gln Arg Trp Lys Asp Gln945 950 955 960<210>3<211>2880<212>DNA<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>3gcgagtattg gtacagtaac cgagaatgac acgatctatc agattatggt tgaccgcttc 60aatgacgggg attcttccaa taacgcaaca ggagctgcca tccgctatgg ggagaactct 120gaggaggatt tccgttacat gaagggcggc gactggcagg gggtcattga caagctcccg 180tatattcaca atatgggcta tactgcgatc tggatctcgc ccgtagccga gccgcagatg 240actaaccgtg agaacaacgg aacaggcaag aacactgcct accacggcta caatgtcaaa 300gatccgaaca aggccaaccc ttacttcggc accaaagaaa agctgaaaga gcttgtagac 360tccgcgcatg cgctcggaat taaggtcatc attgatgtcg ttcccaacca catcggcgat 420tacatgctgg gcactcaggc tttttacgat atcccatcct tgcagcctgc cgctccgttc 480aataatccgg cctggtatca ccacaatggg gacattaact ggtcgcttgc cgatggacgg 540tacgatcagt gggctcagga ttatctggag aatcatgatc tgggtggtct ggatgatatc 600gacttcgatg ttcctgccgc caagcaggct attttcagct cgatcaaggg ctggtttgac 660tatacggggg cagacggcgc ccgtgttgat gcggccaagc tgatgaagcc gaccgatatc 720ggcgagctgc agaatttgct gggcgtgaat acgtttgggg agaatttcga cggcaatgcc 780gaattcgtct cccgctgggt cggtaccaac aaggagtggg ggatgctcga cttcccgtta 840
ttcttctccg tgctgaacag cttcgcgtac gggcagtctt ttgacgcgaa tattaaaggc 900actctggctc aagactccta ctacggcggc aacgccaacc atatggttac cttcatcgac 960aatcatgacc gcaaccgctt cctgacggag gccgggggca gtgtagagaa gctgcagaat 1020gcgttgtcct ttattttcac cgtgcgcgga acgcctgtcg tcttccaggg aaccgagcag 1080aacaagggca acggcaacgg gcagatcatg acgggcggga tcgccgatac gtggaaccgc 1140tggtcgatgg tgaagcggga tgcaaacggc aatgtgctgg agaattattt caatgagaat 1200gctagtacct tcaagcatgt agccaagctg aacgagatcc gcaaaaataa cccggccctg 1260cgcaccggca cccagcgcga aatgtggtcc gcacagaatc tgtatgcctt ctcccggcgg 1320attgataccg gcacgaatgt cggccaggaa gtgatctccg cattcagtaa tgcgtctggg 1380ggatcacaga cagtgacgct gccgctgcgc gccgaaagca cgcttaccgc aggtacggtt 1440ctggtgaatc agctgaaccc ctccgatact gtgaccgtgc aggcgggcgg tgttaccggt 1500aagcaaatta cagttaccct aggcgccaat tcggccaaaa tctacgccaa aacacaaccg 1560gtaaccgata cgcaagcacc aagtgttccc ggaaatgtaa cagccaccgt acagaatgcc 1620tccagcgcgt tggtatcctg gtcagcatcc accgataatg tcggggtgac tgggtatgaa 1680atttaccgca atggagtgaa gatcggaact tcggcaacga cctcttttac agataacgga 1740ctggtaggca gcaccaatta ttcttatacg gtaaaagcgt atgatgccgc catgaatctg 1800tcggccttca gcgcagccgc cctgattgtc acccctgccg gtaacagtgt gacgatctac 1860tacaagcagg gttacaccaa tccgtacatt cattaccgcc cggtgggcgg gacttggacg 1920acatctccgg gtgtagccat tccagccgcc gaagtagcag gctataacaa aatcacaatc 1980aatatcggcg cagccacgca gctcgaagcc tgcttcaaca acggcagcgg catctgggac 2040agcaacggcg gcagcaatta cctgttcggg acaggcactt ggacctatac gcctacaggc 2100aatattcagg caggcggtcc ggtgacgcca acagcatcgc cgacggcgac accaaccgta 2160gccccaacgg ctacaccgac cgtgacacca acaccaactc caacggctac accgaccgta 2220gctccaaccg caacaccaac cgttgcgcca acggcgacac ctgtgccaac cgccactccg 2280gcgggcaaca ccgcgacgat ctattacaag aatacagcat tcagtaactc gtatatccat 2340tacaagctgg atggggcaac cacctggacg acctcaccgg gagtgcctat gcaggcctca 2400accttcagcg gctacaagtc cattaccatt ccgctcggca ctgcaaccgg attgaccgca 2460gcgttcaata acggcagcgg cacttgggac agcaatggcg ggaataacta tcatttcggt 2520actggcagct ccagcctggt aggggggagc ttaaccacag gggaaccgca agcagacagc 2580gtgaccttcc gggtcagcgt tcccgggtcc accccggcga atgctccagt ctacctgaca 2640ggatcgttca acagctggaa tgcggcagat acggcctacc tgctgacccg cggaagtgat 2700ggcgtctatt ccgtcacctt gaatcttccg gcaggcactg ctgtaacgta taagctgaca 2760cgtggaagct gggctacggt agagaccaca tccagcggcg cggatattac caaccggacg 2820ctcacgcccg caggcggagc acagaccgtg acaataagtg tgcagcgctg gaaggatcag 2880
<210>4<211>10<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>4Asn Thr Ala Tyr His Gly Tyr Asn Val Lys1 5 10<210>5<211>10<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>5Ala Asn Pro Tyr Phe Gly Thr Lys Glu Lys1 5 10<210>6<211>10<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>6Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys1 5 10<210>7<211>12<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>7
Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu Gly Ile Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>8Asn Thr Ala Phe Ser Asn Ser Tyr IIe His Tyr1 5 10<210>9<211>15<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>9Asp Thr Ala Tyr Leu Leu Thr Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser1 5 10 15<210>10<211>14<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>10Leu Pro Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile1 5 10<210>11<211>13<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌
<400>11Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala Ala Pro Phe Asn Asn1 5 10<210>12<211>15<212>PRT<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>12Pro Thr Asp Ile Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr1 5 10 15<210>13<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>13gayacnatht aycarat 17<210>14<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>14taycaratha tggtnga 17<210>15<211>17<212>DNA
<213>人工序列<400>15acrttrtanc crtgrta 17<210>16<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>16ccrtgrtang cngtrtt 17<210>17<211>251<212>DNA<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>17tat cag att atg gtt gac cgc ttc aat gac ggg gat tct tcc aat aac48Tyr Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn1 5 10 15gca aca gga gct gcc atc cgc tat ggg gag aac tct gag gag gat ttc96Ala Thr Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe20 25 30cgt tac atg aag ggc ggc gac tgg cag ggg gtc att gac aag ctc ccg144Arg Tyr Met Lys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro35 40 45tat att cac aat atg ggc tat act gcg atc tgg atc tcg ccc gta gcc192Tyr Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala
50 55 60gag ccg cag atg act aac cgt gag aac aac gga aca ggc aag aac act240Glu Pro Gln Met Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr65 70 75 80gcc tac cac gg 251Ala Tyr His<210>18<211>2985<212>DNA<213>環(huán)狀芽孢桿菌<400>18atg aaa aga gaa cgt aac cgc cta ctt att ccc gtt cta atc gca tcc48Met Lys Arg Glu Arg Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Leu Ile Ala Ser1 5 10 15att gta ctg tct atc acg atg agt ctg ttt gtt gta ccg cct tct aag96Ile Val Leu Ser Ile Thr Met Ser Leu Phe Val Val Pro Pro Ser Lys20 25 30gcg gag gct gcg agt att ggt aca gta acc gag aat gac acg atc tat144Ala Glu Ala Ala Ser Ile Gly Thr Val Thr Glu Asn Asp Thr Ile Tyr35 40 45cag att atg gtt gac cgc ttc aat gac ggg gat tct tcc aat aac gca192Gln Ile Met Val Asp Arg Phe Asn Asp Gly Asp Ser Ser Asn Asn Ala50 55 60aca gga gct gcc atc cgc tat ggg gag aac tct gag gag gat ttc cgt240Thr Gly Ala Ala Ile Arg Tyr Gly Glu Asn Ser Glu Glu Asp Phe Arg
65 70 75 80tac atg aag ggc ggc gac tgg cag ggg gtc att gac aag ctc ccg tat288Tyr Met Lys Gly Gly Asp Trp Gln Gly Val Ile Asp Lys Leu Pro Tyr85 90 95att cac aat atg ggc tat act gcg atc tgg atc tcg ccc gta gcc gag336Ile His Asn Met Gly Tyr Thr Ala Ile Trp Ile Ser Pro Val Ala Glu100 105 110ccg cag atg act aac cgt gag aac aac gga aca ggc aag aac act gcc384Pro Gln Met Thr Asn Arg Glu Asn Asn Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ala115 120 125tac cac ggc tac aat gtc aaa gat ccg aac aag gcc aac cct tac ttc432Tyr His Gly Tyr Asn Val Lys Asp Pro Asn Lys Ala Asn Pro Tyr Phe130 135 140ggc acc aaa gaa aag ctg aaa gag ctt gta gac tcc gcg cat gcg ctc480Gly Thr Lys Glu Lys Leu Lys Glu Leu Val Asp Ser Ala His Ala Leu145 150 155 160gga att aag gtc atc att gat gtc gtt ccc aac cac atc ggc gat tac528Gly Ile Lys Val Ile Ile Asp Val Val Pro Asn His Ile Gly Asp Tyr165 170 175atg ctg ggc act cag gct ttt tac gat atc cca tcc ttg cag cct gcc576Met Leu Gly Thr Gln Ala Phe Tyr Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Ala180 185 190gct ccg ttc aat aat ccg gcc tgg tat cac cac aat ggg gac att aac624Ala Pro Phe Asn Asn Pro Ala Trp Tyr His His Asn Gly Asp Ile Asn195 200 205
tgg tcg ctt gcc gat gga cgg tac gat cag tgg gct cag gat tat ctg672Trp Ser Leu Ala Asp Gly Arg Tyr Asp Gln Trp Ala Gln Asp Tyr Leu210 215 220gag aat cat gat ctg ggt ggt ctg gat gat atc gac ttc gat gtt cct720Glu Asn His Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Ile Asp Phe Asp Val Pro225 230 235 240gcc gcc aag cag gct att ttc agc tcg atc aag ggc tgg ttt gac tat768Ala Ala Lys Gln Ala Ile Phe Ser Ser Ile Lys Gly Trp Phe Asp Tyr245 250 255acg ggg gca gac ggc gcc cgt gtt gat gcg gcc aag ctg atg aag ccg816Thr Gly Ala Asp Gly Ala Arg Val Asp Ala Ala Lys Leu Met Lys Pro260 265 270acc gat atc ggc gag ctg cag aat ttg ctg ggc gtg aat acg ttt ggg864Thr Asp Ile Gly Glu Leu Gln Asn Leu Leu Gly Val Asn Thr Phe Gly275 280 285gag aat ttc gac ggc aat gcc gaa ttc gtc tcc cgc tgg gtc ggt acc912Glu Asn Phe Asp Gly Asn Ala Glu Phe Val Ser Arg Trp Val Gly Thr290 295 300aac aag gag tgg ggg atg ctc gac ttc ccg tta ttc ttc tcc gtg ctg960Asn Lys Glu Trp Gly Met Leu Asp Phe Pro Leu Phe Phe Ser Val Leu305 310 315 320aac agc ttc gcg tac ggg cag tct ttt gac gcg aat att aaa ggc act1008Asn Ser Phe Ala Tyr Gly Gln Ser Phe Asp Ala Asn Ile Lys Gly Thr325 330 335ctg gct caa gac tcc tac tac ggc ggc aac gcc aac cat atg gtt acc1056Leu Ala Gln Asp Ser Tyr Tyr Gly Gly Asn Ala Asn His Met Val Thr
340 345 350ttc atc gac aat cat gac cgc aac cgc ttc ctg acg gag gcc ggg ggc1104Phe Ile Asp Asn His Asp Arg Asn Arg Phe Leu Thr Glu Ala Gly Gly355 360 365agt gta gag aag ctg cag aat gcg ttg tcc ttt att ttc acc gtg cgc1152Ser Val Glu Lys Leu Gln Asn Ala Leu Ser Phe Ile Phe Thr Val Arg370 375 380gga acg cct gtc gtc ttc cag gga acc gag cag aac aag ggc aac ggc1200Gly Thr Pro Val Val Phe Gln Gly Thr Glu Gln Asn Lys Gly Asn Gly385 390 395 400aac ggg cag atc atg acg ggc ggg atc gcc gat acg tgg aac cgc tgg1248Asn Gly Gln Ile Met Thr Gly Gly Ile Ala Asp Thr Trp Asn Arg Trp405 410 415tcg atg gtg aag cgg gat gca aac ggc aat gtg ctg gag aat tat ttc1296Ser Met Val Lys Arg Asp Ala Asn Gly Asn Val Leu Glu Asn Tyr Phe420 425 430aat gag aat gct agt acc ttc aag cat gta gcc aag ctg aac gag atc1344Asn Glu Asn Ala Ser Thr Phe Lys His Val Ala Lys Leu Asn Glu Ile435 440 445cgc aaa aat aac ccg gcc ctg cgc acc ggc acc cag cgc gaa atg tgg1392Arg Lys Asn Asn Pro Ala Leu Arg Thr Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp450 455 460tcc gca cag aat ctg tat gcc ttc tcc cgg cgg att gat acc ggc acg1440Ser Ala Gln Asn Leu Tyr Ala Phe Ser Arg Arg Ile Asp Thr Gly Thr465 470 475 480
aat gtc ggc cag gaa gtg atc tcc gca ttc agt aat gcg tct ggg gga1488Asn Val Gly Gln Glu Val Ile Ser Ala Phe Ser Asn Ala Ser Gly Gly485 490 495tca cag aca gtg acg ctg ccg ctg cgc gcc gaa agc acg ctt acc gca1536Ser Gln Thr Val Thr Leu Pro Leu Arg Ala Glu Ser Thr Leu Thr Ala500 505 510ggt acg gtt ctg gtg aat cag ctg aac ccc tcc gat act gtg acc gtg1584Gly Thr Val Leu Val Asn Gln Leu Asn Pro Ser Asp Thr Val Thr Val515 520 525cag gcg ggc ggt gtt acc ggt aag caa att aca gtt acc cta ggc gcc1632Gln Ala Gly Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala530 535 540aat tcg gcc aaa atc tac gcc aaa aca caa ccg gta acc gat acg caa1680Asn Ser Ala Lys Ile Tyr Ala Lys Thr Gln Pro Val Thr Asp Thr Gln545 550 555 560gca cca agt gtt ccc gga aat gta aca gcc acc gta cag aat gcc tcc1728Ala Pro Ser Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Thr Val Gln Asn Ala Ser565 570 575agc gcg ttg gta tcc tgg tca gca tcc acc gat aat gtc ggg gtg act1776Ser Ala Leu Val Ser Trp Ser Ala Ser Thr Asp Asn Val Gly Val Thr580 585 590ggg tat gaa att tac cgc aat gga gtg aag atc gga act tcg gca acg1824Gly Tyr Glu Ile Tyr Arg Asn Gly Val Lys Ile Gly Thr Ser Ala Thr595 600 605acc tct ttt aca gat aac gga ctg gta ggc agc acc aat tat tct tat1872Thr Ser Phe Thr Asp Asn Gly Leu Val Gly Ser Thr Asn Tyr Ser Tyr
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885 890 895acc ttc cgg gtc agc gtt ccc ggg tcc acc ccg gcg aat gct cca gtc2736Thr Phe Arg Val Ser Val Pro Gly Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val900 905 910tac ctg aca gga tcg ttc aac agc tgg aat gcg gca gat acg gcc tac2784Tyr Leu Thr Gly Ser Phe Asn Ser Trp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Tyr915 920 925ctg ctg acc cgc gga agt gat ggc gtc tat tcc gtc acc ttg aat ctt2832Leu Leu Thr Arg Gly Ser Asp Gly Val Tyr Ser Val Thr Leu Asn Leu930 935 940ccg gca ggc act gct gta acg tat aag ctg aca cgt gga agc tgg gct2880Pro Ala Gly Thr Ala Val Thr Tyr Lys Leu Thr Arg Gly Ser Trp Ala945 950 955 960acg gta gag acc aca tcc agc ggc gcg gat att acc aac cgg acg ctc2928Thr Val Glu Thr Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ile Thr Asn Arg Thr Leu965 970 975acg ccc gca ggc gga gca cag acc gtg aca ata agt gtg cag cgc tgg2976Thr Pro Ala Gly Gly Ala Gln Thr Val Thr Ile Ser Val Gln Arg Trp980 985 990aag gat cag2985Lys Asp Gln995<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列
<400>19gcaattaacc ctcactaaag gg 22<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>20aaaaacatat gaaaagagaa cgtaaccgcc 30<210>21<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>21cggcaacgcc aaccacatgg ttaccttcat 30<210>22<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>22atgaaggtaa ccatgtggtt ggcgttgccg 30<210>23<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>23
aaaaaggatc cttactgatc cttccagcgc301權(quán)利要求
1.具有由下述通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
2.含異環(huán)麥芽寡糖的糖，含有權(quán)利要求1記載的異環(huán)麥芽寡糖和其它糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2記載的含異環(huán)麥芽寡糖的糖，其特征在于形態(tài)是糖漿、粉末或固狀物質(zhì)中的任一種。
4.異環(huán)麥芽寡糖合酶，具有作用于葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖，生成具有通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖的作用通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，具有以下物化性質(zhì)(1)分子量在SDS-凝膠電泳法中，分子量為106000±20000道爾頓；(2)等電點(diǎn)在含有兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳法中，pI7.5±0.5；(3)最適溫度在pH6.0、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適溫度為50℃至55℃；(4)最適pH在30℃、反應(yīng)30分鐘的條件下，最適pH為pH4.5至8.0；(5)溫度穩(wěn)定性在pH6.0下保持60分鐘的條件下，在35℃以下穩(wěn)定，1mM鈣離子存在下，在40℃以下穩(wěn)定；(6)pH穩(wěn)定性于4℃下保持24小時(shí)的條件下，在pH4.5至9.0穩(wěn)定。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，具有序列表中的序列號(hào)1表示的氨基酸序列作為N末端氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，具有序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列，或序列表中序列號(hào)2表示的氨基酸序列中在保持其酶活性的范圍內(nèi)缺失、取代或添加了1個(gè)或2個(gè)以上氨基酸的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，其中葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖是選自于麥芽寡糖、麥芽糖糊精、淀粉糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原的1種或2種以上的糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-8中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，是微生物來(lái)源的酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，其中微生物是屬于芽孢桿菌屬的微生物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶，其中屬于芽孢桿菌屬的微生物是環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(以保藏號(hào)FERM BP-10111保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)或其變異株。
12.具有權(quán)利要求4-11任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的微生物，該微生物是環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)AM7(以保藏號(hào)FERM BP-10111保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心)或其變異株。
13.編碼權(quán)利要求4-11任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶的DNA。
14.根據(jù)權(quán)利要求13記載的DNA，具有序列表中序列號(hào)3表示的堿基序列，或具有序列號(hào)3表示的堿基序列中在保持其編碼的酶的活性的范圍內(nèi)，缺失、取代或添加了1個(gè)或2個(gè)以上堿基的堿基序列，或與這些序列互補(bǔ)的堿基序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14記載的DNA，是基于基因編碼的簡(jiǎn)并，不改變其編碼的氨基酸序列且序列表中序列號(hào)3所示的堿基序列中1個(gè)或2個(gè)以上的堿基被取代為其它堿基的DNA。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)記載的DNA，是來(lái)源于芽孢桿菌屬微生物的。
17.可復(fù)制的重組DNA，含有權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)記載的DNA和可自我復(fù)制的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求17記載的重組DNA，其中可自我復(fù)制的載體是質(zhì)粒載體pBluescript II SK(+)。
19.在適當(dāng)宿主中導(dǎo)入了權(quán)利要求17或18記載的重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19記載的轉(zhuǎn)化體，其中宿主是大腸桿菌。
21.異環(huán)麥芽寡糖合酶的制備方法，其特征在于在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)具有產(chǎn)生權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶能力的微生物，從所得的培養(yǎng)物中收集權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶。
22.重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶的制備方法，其特征在于培養(yǎng)權(quán)利要求19或20記載的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中收集重組型異環(huán)麥芽寡糖合酶。
23.具有通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖的生成方法，其特征在于使權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶或權(quán)利要求12記載的具有異環(huán)麥芽寡糖合酶產(chǎn)生能力的微生物作用于含有葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖的溶液通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23記載的異環(huán)麥芽寡糖的生成方法，其中葡萄糖聚合度為3以上的α-1，4葡聚糖是選自于麥芽寡糖、麥芽糖糊精、淀粉糊精、直鏈淀粉、支鏈淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原的1種或2種以上的糖。
25.具有通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖或含有它的糖組合物的制備方法，其特征在于使權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶作用于淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液通式1環(huán){→6)-[α-D-Glcp-(1→4)]n-α-D-Glcp-(1→}(n是指4或5)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25記載的異環(huán)麥芽寡糖或含有它的糖組合物的制備方法，其中淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液是DE20以下的溶液。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26記載的異環(huán)麥芽寡糖或含有它的糖組合物的制備方法，其特征在于使權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶與異淀粉酶或支鏈淀粉酶一起作用于淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液，根據(jù)需要，使選自于α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1種或2種以上的酶也作用于淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液。
28.權(quán)利要求25-27中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖或含有它的糖組合物的制備方法，其特征在于使權(quán)利要求4-11中任一項(xiàng)記載的異環(huán)麥芽寡糖合酶與異淀粉酶或支鏈淀粉酶一起作用于淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液，根據(jù)需要，使選自于α-淀粉酶、β-淀粉酶、環(huán)麥芽糖糊精葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的1種或2種以上的酶也作用于淀粉經(jīng)糊化和/或液化了的溶液后，采用選自于通過(guò)柱層析進(jìn)行分級(jí)，通過(guò)膜分離，通過(guò)用微生物進(jìn)行發(fā)酵處理和堿處理分解除去中的1種或2種以上的純化方法。
29.飲食品、化妝品或藥品，含有權(quán)利要求1記載的異環(huán)麥芽寡糖、或權(quán)利要求2或3記載的含異環(huán)麥芽寡糖的糖。
全文摘要
本發(fā)明提供以葡萄糖作為組成糖的非還原性糖，提供在擴(kuò)大非還原性糖的選擇范圍的同時(shí)生成該非還原性糖的新酶和它們的生成方法和制備方法，編碼該酶的DNA，含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，以及含有該非還原性糖的組合物及其用途作為課題，通過(guò)提供具有由通式1表示的結(jié)構(gòu)的異環(huán)麥芽寡糖和生成該糖的新型異環(huán)麥芽寡糖合酶和它們的生成方法和制備方法，以及編碼該酶的DNA和含有該DNA的重組DNA和轉(zhuǎn)化體，以及含有異環(huán)麥芽寡糖或含有該糖的糖類的組合物及其用途，從而解決上述課題。通式1環(huán){→6)－[α－D－Glcp－(1→4)]
文檔編號(hào)A23L1/09GK101044244SQ20058003570
公開(kāi)日2007年9月26日 申請(qǐng)日期2005年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者渡邊光, 西本友之, 久保田倫夫, 福田惠溫, 三宅俊雄 申請(qǐng)人:株式會(huì)社林原生物化學(xué)研究所