一種酶解制備褐藻膠寡糖的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種酶解制備褐藻膠寡糖的方法，所用菌株是一種無(wú)致病性的鏈霉菌屬微生物---紫色鏈霉菌(Streptomyces?violaceoruber)。該菌分泌到胞外的褐藻膠裂解酶具有較高的降解活力，可降解褐藻膠生產(chǎn)褐藻膠寡糖。酶解液經(jīng)過(guò)乙醇沉淀，離心，冷凍干燥后得到的褐藻膠寡糖主要聚合度為2-6，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該寡糖具有促進(jìn)小麥生長(zhǎng)的生物活性。本發(fā)明的制備方法具有成本低、操作及工藝路線簡(jiǎn)單，設(shè)備少等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種酶解制備褐藻膠寡糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種酶解褐藻膠寡糖及其制備方法，屬于農(nóng)業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 褐藻膠寡糖（alginate oligosaccharides)是褐藻膠經(jīng)水解而得到的聚合度較 小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻膠寡糖具有多種生理活性，可廣泛應(yīng)用在食品、 醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及化妝品等領(lǐng)域中，因此具有巨大的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)價(jià)值。褐藻膠寡糖的制備方法 主要有化學(xué)水解法以及褐藻膠裂解酶水解法。由于褐藻膠裂解酶水解法具有底物專(zhuān)一性 好、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注。褐藻膠裂解酶在自然界中來(lái)源廣泛。目前，已 報(bào)道有多種微生物具有褐藻膠裂解酶的活性，如交替單胞菌（Alteromonas sp.)，假交替單 胞菌（Pseudoalteromonas)，海洋弧菌（Vibrio sp.)等。然而，這些微生物中有許多為致 病菌，如海洋弧菌可感染哺乳動(dòng)物引起敗血癥，因而限制了這一類(lèi)微生物的應(yīng)用。紫色鏈 霉菌（Streptomyces violaceoruber)是從土壤中分離得到的具有褐藻膠裂解酶活性且無(wú) 致病性的鏈霉菌屬微生物（紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏編號(hào)： CPCC200534,來(lái)源：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，收藏時(shí)間1970年）。該菌產(chǎn)生的 褐藻膠裂解酶活性較高且可分泌到胞外。本發(fā)明以褐藻膠多糖為原料，制備出主要聚合度 2-6的褐藻膠寡糖，植物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有促生長(zhǎng)作用，可用于制備植物促生長(zhǎng)劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)制備褐藻膠寡糖過(guò)程繁瑣、寡糖功效不明確的缺 陷，提供一種具有農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的褐藻膠寡糖，簡(jiǎn)稱(chēng)A0S(Alginate Oligosaccharides),并 提供了提取上述物質(zhì)的制備方法，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 本發(fā)明涉及一種從酶解后的褐藻膠多糖中制備褐藻膠寡糖的方法，包括以下步 驟：
[0006] (1)產(chǎn)酶：取菌種紫色鏈霉（紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保 藏編號(hào)：CPCC200534,來(lái)源：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，收藏時(shí)間1970年）一環(huán) 加入液體培養(yǎng)基中，28°C -35°C搖床培養(yǎng)5-8天，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分。離心除去菌 體后，得發(fā)酵粗酶液。
[0007] (2)酶解：將濃度為0. 5%_2%的褐藻膠多糖溶液，加入等體積的紫色鏈霉菌發(fā)酵粗 酶液，反應(yīng)溫度為45°C -55°C，持續(xù)攪拌8h-10h。
[0008] (3 )醇沉：提取液等體積加入加乙醇調(diào)濃度至70-85%，靜置12h_24h后， 8000-10000轉(zhuǎn)/分離心除雜。
[0009] (4)濃縮：將糖液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得褐藻膠寡糖（A0S)。
[0010] 所得的酶解褐藻膠寡糖具有如下特征：
[0011] (1)物理性狀：微黃或白色粉末，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。
[0012] (2)組成分析：電噴霧-質(zhì)譜顯示其主要的聚合度為2-6。
[0013] 該酶解褐藻膠寡糖具有促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)、增加小麥鮮重的生物活性。
[0014] 所述褐藻膠寡糖可制成水劑，在使用時(shí)可采取噴施或灌根處理。
[0015] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 1本發(fā)明采用的褐藻膠降解酶酶活力高且為胞外酶，短時(shí)間內(nèi)就可將多糖降解完 全，工藝步驟少，所用設(shè)備少，成本低。
[0017] 2所得褐藻膠寡糖可檢測(cè)的聚合度為2-10,主要聚合度為2-6。
[0018] 3本發(fā)明表明褐藻膠寡糖具有促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)、增加小麥鮮重，對(duì)環(huán)境無(wú)污染、 無(wú)殘留，是一種低成本、綠色環(huán)保的新型農(nóng)用促生長(zhǎng)劑。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020] 圖1褐藻膠寡糖的電噴霧-質(zhì)譜圖；
[0021] 圖2褐藻膠寡糖對(duì)小麥根系生長(zhǎng)的影響；
[0022] 圖3褐藻膠寡糖對(duì)小麥苗長(zhǎng)的影響；
[0023] 圖4褐藻膠寡糖對(duì)小麥鮮重的影響。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1紫色鏈霉菌發(fā)酵粗酶液的制備方法，包括以下步驟：
[0025] (1)菌體活化：將保存在-80 °C冰箱中的甘油中的紫色鏈霉菌（紫色鏈霉菌 (Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏編號(hào)：CPCC200534,來(lái)源：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥 生物技術(shù)研究所，收藏時(shí)間1970年）吸取100 μ 1，均勻涂布于褐藻膠平板培養(yǎng)基(質(zhì)量分 數(shù)分別為〇. 05%_0. 5%的蛋白胨和0. 05%-0. 5%酵母粉為氮源，0. 5%-2%褐藻膠，0. 1%-1%的 ΚΗ2Ρ04,0. 01%-0. 1%的MgS04 · 7Η20,1%-2%瓊脂，余量為水）中，30°C下培養(yǎng)3天，直至菌落 出現(xiàn)。
[0026] (2)菌體發(fā)酵：取平板培養(yǎng)基中的紫色鏈霉菌一環(huán)加入褐藻膠液體培養(yǎng)基(液體培 養(yǎng)基組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為〇. 2%的蛋白胨和0. 3%酵母粉為氮源，1. 4%褐藻膠，0. 4%KH2P04， 0. 06%MgS04 ·7Η20,余量為水）中，30°C搖床培養(yǎng)6天，搖床轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。4000轉(zhuǎn)/分 離心除去菌體后，得發(fā)酵粗酶液。
[0027] 實(shí)施例2 -種酶解褐藻膠寡糖的的制備方法，包括以下步驟：
[0028] (1)酶解：將質(zhì)量濃度為2%的褐藻膠溶液，加入等體積的紫色鏈霉菌發(fā)酵粗酶液， 反應(yīng)溫度為50°C，持續(xù)攪拌10h。
[0029] (2)醇沉：酶解液加入乙醇調(diào)濃度乙醇終質(zhì)量濃度至70-85%，靜置12h后，8000轉(zhuǎn) /分離心除雜，得糖液。
[0030] (3)濃縮：將糖液經(jīng)過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，冷凍干燥得褐藻膠寡糖（A0S)。
[0031] 實(shí)施例3褐藻膠寡糖的聚合度檢測(cè)
[0032] 其中褐藻膠寡糖的質(zhì)量由配有電噴霧離子源（ESI)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。 色譜測(cè)定條件為：質(zhì)譜模式為正離子模式；電噴霧離子源（ESI);噴霧電壓4. 5kV ;傳輸毛細(xì) 管溫度 35〇°C;鞘氣（Sheath gas, N2)壓力為3〇au (lau 約為 lpsi)，輔助氣（Aux gas, N2) 壓力為5au，離子吹掃氣（Ion swe印gas, N2)壓力為Oau;掃描范圍：150?2000。含量采 用比色法測(cè)定。其電噴物電離質(zhì)譜圖譜見(jiàn)圖1。
[0033] 經(jīng)檢測(cè)如圖1所示，褐藻膠寡糖聚合度為2-10,其主要聚合度為2-6。
[0034] 實(shí)施例4植物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)酶解褐藻膠寡糖的促生長(zhǎng)活性
[0035] ( 1)受試樣品：褐藻膠寡糖糖，按照實(shí)驗(yàn)施例1所述的方法制備。
[0036] (2)實(shí)驗(yàn)植物：小麥西農(nóng)979 (Triticum aestivum L.)。培養(yǎng)條件為：小麥種子用 75%酒精滅菌lOmin，用蒸餾水沖洗干凈后，將種子浸泡在無(wú)菌的雙蒸水中浸種8h，黑暗中 發(fā)芽3天，選取相同長(zhǎng)勢(shì)的麥苗在霍德蘭培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天，晝夜循環(huán)為12h/12h，溫度為 25°C /20°C，相對(duì)濕度 60%，光照強(qiáng)度為 800 μ mol · πΓ2 · s'
[0037] (3)檢測(cè)項(xiàng)目：小麥根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和鮮重。
[0038] (4)實(shí)驗(yàn)方法：設(shè)立4組處理，包括空白對(duì)照組（Control，蒸餾水噴施)，褐藻膠寡 糖處理組A0S1(質(zhì)量濃度0. 01%A0S，余量為水)，褐藻膠寡糖處理組A0S2(質(zhì)量濃度0. 1%A0S， 余量為水)和褐藻膠寡糖處理組A0S3 (質(zhì)量濃度1%A0S，余量為水)。小麥培養(yǎng)至3天時(shí)，用 不同濃度褐藻膠寡糖或蒸餾水葉片噴施小麥，平均每株施用量為10mL，96h后取樣測(cè)定。
[0039] (5)結(jié)果：
[0040] 褐藻膠寡糖對(duì)小麥根系生長(zhǎng)的影響：A表示蒸餾水處理的空白對(duì)照組，B表示 1%A0S處理組。由圖2所示，3個(gè)濃度的的A0S均可顯著促進(jìn)小麥根部生長(zhǎng)，尤其以0. 01% 和1%濃度最佳。
[0041] 褐藻膠寡糖對(duì)小麥苗長(zhǎng)的影響：由圖3可見(jiàn)，所有的A0S處理組小麥苗的長(zhǎng)勢(shì)明顯 商于空白對(duì)照組。
[0042] 褐藻膠寡糖對(duì)小麥鮮重的影響：圖4所示，所有的A0S處理組小麥鮮重均高于空白 對(duì)照組,0. 1%和1%濃度的A0S對(duì)小麥鮮重的提高作用更加明顯。
[〇〇43] 本發(fā)明在植物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，褐藻膠寡糖能夠促進(jìn)小麥根系生長(zhǎng)、增加小麥鮮重。綜 上結(jié)果顯示褐藻膠寡糖具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。
【權(quán)利要求】
1. 一種酶解制備褐藻膠寡糖的方法，其特征在于：由紫色鏈霉菌所產(chǎn)的褐藻膠降解酶 降解褐藻膠得到褐藻膠寡糖，褐藻膠寡糖聚合度為2-10。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：褐藻膠寡糖聚合度為2-6。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于： 具體過(guò)程為：紫色鏈霉菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶后，得到的粗酶液加入褐藻膠多糖 溶液中降解，得到的酶解液分別經(jīng)過(guò)乙醇沉淀，離心，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍真空干燥得褐藻 膠寡糖(AOS)。
4. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 所用褐藻膠裂解酶具有較高的酶活力和穩(wěn)定性，褐藻膠寡糖降解過(guò)程為：配制1%_5% 質(zhì)量濃度的褐藻膠多糖溶液；紫色鏈霉菌發(fā)酵液離心除去菌體，得到紫色鏈霉菌發(fā)酵粗酶 液，將褐藻膠多糖與等體積粗酶液混合，45°C -55°C下持續(xù)攪拌，降解8h-10h，得酶解液。
5. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 所述酶解液的后處理過(guò)程為：將降解后的酶解液加入乙醇，調(diào)乙醇終質(zhì)量濃度為 70%-85%，靜置12h-24h，8000-10000轉(zhuǎn)/分離心除去未反應(yīng)的聚糖和雜質(zhì)，得到上清為褐藻 膠寡糖混合液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮除去乙醇，濃縮后的糖液冷凍真空干燥，得褐藻膠寡糖粉末。
6. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 紫色鏈霉菌經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)褐藻膠裂解酶后得到粗酶液過(guò)程為：取菌種紫色鏈霉一環(huán)加 入50mL-150mL液體培養(yǎng)基中，28°C -35°C搖床培養(yǎng)5-8天，搖床轉(zhuǎn)速為150-200轉(zhuǎn)/分；離 心除去菌體后，得發(fā)酵粗酶液；液體培養(yǎng)基組成：質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0. 05%-0. 5%的蛋白胨和 0· 05%-0· 5% 酵母粉為氮源，0· 5%-2% 褐藻膠，0· 1%-1% 的 ΚΗ2Ρ04,0· 01%-0· 1% 的 MgS04 ·7Η20， 余量為水。
7. 按照權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于： 所述紫色鏈霉菌為下述菌株之一： 紫色鏈霉菌（Streptomyces violaceoruber)，菌株保藏編號(hào)：CPCC200534,來(lái)源：中國(guó) 醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，收藏時(shí)間1970年； 菌株保藏編號(hào)：SCTCC200045,來(lái)源：四川大學(xué)生命科學(xué)院，機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：四川省委生物資 源保藏中心，隸屬單位：四川大學(xué)，收藏時(shí)間：1986年； 菌株保藏編號(hào)：CCTCC AA92074,來(lái)源：中科院微生物研究所，機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：中國(guó)典型培養(yǎng) 物保藏中心，隸屬單位：武漢大學(xué)，收藏時(shí)間：1992年； 菌株保藏編號(hào)：ACCC40986,來(lái)源：湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，機(jī)構(gòu)名稱(chēng)：湖北省生 物農(nóng)藥工程研究中心，收藏時(shí)間：2006年。
【文檔編號(hào)】C12R1/465GK104099386SQ201310116610
【公開(kāi)日】2014年10月15日 申請(qǐng)日期:2013年4月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月3日
【發(fā)明者】杜昱光, 劉航, 趙小明, 尹恒, 王文霞, 劉啟順 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所