專利名稱：一株綠色木霉工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程及生物防治技術(shù)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及一株過表達(dá)內(nèi) 切幾丁質(zhì)酶基因的工程菌株綠色木霉工程菌，還涉及該菌株在蔬菜生物防治中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木霉(7Wc/2o^nm spp.)屬于半知菌亞門，絲孢綱，叢孢梗目，叢孢?？?，是一類分 布廣泛的土壤習(xí)居菌，常見于植物殘?bào)w及動(dòng)物糞便上。除個(gè)別為弱病原菌外，大多數(shù)對(duì) 植物病原菌具有拮抗作用。由于木霉具有廣泛適應(yīng)性、產(chǎn)拮抗物的多樣性和寄生廣譜性， 因而作為植物病害生物防治的拮抗菌被廣泛研究。
木霉菌對(duì)植物病原菌的生防作用機(jī)制包括競(jìng)爭(zhēng)作用、重寄生作用和抗生作用等。木 霉菌的重寄生作用是其拮抗病原真菌的主要機(jī)制，它包含了對(duì)病原菌的侵襲、識(shí)別、接 觸、纏繞、穿透和寄生等一系列連續(xù)步驟的復(fù)雜過程(Elad Y， Barak R， Chet I. Parasitism of Sclerotium rolfsii by 7Wc/iofifer脂/wm'a"謡[J]. Soil Biol Biochem, 1984,16:381- 386)。 研究表明，木霉菌和寄主真菌識(shí)別后，木霉菌絲沿寄主菌絲平行生長和螺旋狀纏繞生長， 并產(chǎn)生附著胞狀分枝吸附在寄主菌絲上，通過分泌胞外酶溶解細(xì)胞壁，穿透寄主菌絲， 吸取營養(yǎng)(Elad Y, Chet I, Boyle P, et al. Parasitism of 7W'c/jocfe畫 spp. on朋/zo"om'a so/。"/ and 5Werari脂scanning electron microscopy and fluorescence microscopy [J]. Phytopathology, 1983， 73:85-88)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為拮抗木霉菌在寄生過程中產(chǎn)生了一系列 降解病原菌細(xì)胞壁的水解酶，如幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和蛋白酶等。 研究表明，與拮抗木霉菌的生防作用有關(guān)的胞外酶主要是幾丁質(zhì)酶和P-l,3-葡聚糖酶 (Lorito M, Hannan GE, Hayes CK, et al. Chitinolytic enzymes produced by 7HcAoi/er附fl ZwraVm謡antifungal activity of purified endochitinase and chitobinase [J]. Phytopathology, 1993, 83: 302-307; Sela-Buurlage MB， Ponstein AS et al. Only specific tobacco-chitinase and P-l,3-glucanase exhibit antifungal activity [J]. Plant Physiology，1993,101 :857-863)。
綠色木霉(7Wc;wAw^v/WA)是一類重要的木霉菌，具有分布廣泛、生長快速和 持效期長等特點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于植物土傳病害的生物防治(Howell C R. Mechanisms employed by 7Wc/ ocfer腦species in the biological control of plant diseases: The history and evolution of current concepts[J]. Plant Disease, 2002，87，(1):4-10)。但是，目 前所使用的綠色木霉生防制劑仍存在進(jìn)一步提高生防作用的有效性和穩(wěn)定性的問題。隨 著基因工程技術(shù)的日趨完善，克隆轉(zhuǎn)化拮抗病原真菌的基因到木霉菌中構(gòu)建具有高拮抗 效能的工程菌株己成為生防工作的重點(diǎn)。由于幾丁質(zhì)酶在生防機(jī)制中起到重要作用，其 相關(guān)編碼基因在生防工程菌改造方面受到廣泛關(guān)注。然而，目前國內(nèi)還未見通過過表達(dá) 內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建高效綠色木霉工程菌的工作。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一株過表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶的綠色 木霉工程菌以及該菌株在蔬菜生物防治中的應(yīng)用。利用本工程菌株的孢子液制劑可以有 效的提高黃瓜、番茄等蔬菜對(duì)真菌病害的抵抗力，并同時(shí)提高蔬菜產(chǎn)量。
本發(fā)明所述綠色木霉工程菌，含有過表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)基因，該菌命名為綠色木霉 (7Hc/wdmwa vz'〃V/e) R65(ech42),并已于2008月12日29日保藏于"中國典型培養(yǎng)物 保藏中心"，保藏號(hào)為CCTCCN0: M208265。上述綠色木霉工程菌的形態(tài)特征為PDA培養(yǎng)基上，其菌落為無色或淡色的絨狀， 后期菌落表面開始出現(xiàn)綠色，產(chǎn)孢叢束區(qū)可見同心環(huán)紋；菌絲分隔，分枝繁復(fù)；菌絲短 枝上對(duì)生或互生分枝，分枝上又可繼續(xù)分枝，分枝呈銳角或近乎直角，束生、對(duì)生或單 生末枝；分生孢子由最終末端分枝相繼生出，由黏液把它們聚成球形或近球形的孢子簇; 分生孢子近球形、橢圓形或圓筒形，透明或亮綠色。
上述綠色木霉工程菌的菌落、菌絲及孢子形態(tài)見圖1、 2。
上述綠色木霉工程菌的構(gòu)建方法按照常規(guī)絲狀真菌基因轉(zhuǎn)化方法，將內(nèi)切幾丁質(zhì) 酶基因過表達(dá)載體pG-ech42與攜帶乙酰胺酶基因表達(dá)盒的真菌質(zhì)粒p3SR2以3: 1比例 混合共轉(zhuǎn)化原始菌株綠色木霉(:TwWA) W512原生質(zhì)體，在以乙酰胺為唯一碳源和氮 源的培養(yǎng)基上得到26株可能的轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，經(jīng)過PCR驗(yàn)證得到 一株轉(zhuǎn)化子，將其命名為綠色木霉(7Wc/wAmmwW^) R65。驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子結(jié)果見圖3。
上述綠色木霉工程菌液體發(fā)酵48hr時(shí)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力最高，為77.4U/ml (酶活以 pH5.8，溫度為37"時(shí)每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)釋放出lug的N-乙酰氨基葡萄糖定義為一 個(gè)酶活力單位(U))，為原始菌株綠色木霉(ZwWA) W512的3.67倍；該工程菌株在 平板對(duì)峙中表現(xiàn)出對(duì)黃瓜灰霉、黑曲霉、立枯絲核菌、小麥赤霉、棉花疫霉等植物病原 菌較原始菌株綠色木霉(7:v/nWe) W512高的抑制作用。
本發(fā)明所述綠色木霉工程菌在蔬菜生物防治中的應(yīng)用。
其中所述綠色木霉工程菌以生防制劑形式實(shí)施；其中所述生防制劑以如下方法制 備將綠色木霉(7Wc/7oafema R65 CCTCC NO: M 208265接種于PDA固體培
養(yǎng)基，28 3(TC培養(yǎng)4 5天，用無菌水或涼開水將孢子洗下，收集孢子并調(diào)節(jié)其濃度 為1 5xl(^個(gè)/ml，得到孢子懸液制劑。
上述PDA固體培養(yǎng)基配制馬鈴薯200g，自來水煮沸30min， 6層紗布過濾，在 濾液中加入葡萄糖20g，瓊脂17g，補(bǔ)水至1000ml。
所述綠色木霉工程菌實(shí)施對(duì)蔬菜生物防治的方法是20 3(TC環(huán)境溫度下，以濃度 為1 5xl(^個(gè)/ml的孢子液對(duì)出土 10±1天的盆栽蔬菜幼苗進(jìn)行灌根，處理1 2次，每 隔10天一次(每次施用時(shí)間為下午3 4點(diǎn))；或以濃度為1 5xl(^個(gè)/ml的孢子液對(duì) 大棚定植的蔬菜進(jìn)行噴施，處理3 6次，每隔10天一次(每次施用時(shí)間為下午3 4 點(diǎn))。
上述的應(yīng)用中立枯病優(yōu)選采用灌根處理；白粉病及灰霉病優(yōu)選采用噴施。 上述的應(yīng)用中所述蔬菜優(yōu)選是黃瓜或番茄。
本發(fā)明所述綠色木霉工程菌能有效地防治各種對(duì)蔬菜如番茄、黃瓜造成病害的病原 真菌，并能使蔬菜產(chǎn)量有所增加。
例如施用以上工程菌株制劑后，盆栽黃瓜未有病情發(fā)生，此相對(duì)于原始菌株綠色 木霉(7:Wr/cfe)制劑70.13%的生防效果有了明顯的提高；對(duì)于大棚黃瓜，該制劑生防 效果達(dá)到92%，比原始菌株綠色木霉(7: wW血)制劑提高了 18%，同時(shí)施用該制劑后 黃瓜產(chǎn)量提高21.9%;對(duì)于大棚番茄，施用該工程菌株制劑的生防效果達(dá)到95%，比原 始菌株綠色木霉(7>/n'cfe)制劑提高了23%，同時(shí)使得番茄產(chǎn)量提高21.9%。
本發(fā)明所述綠色木霉(7Wc/7oAmu v/nWe) R65CCTCCN0: M 208265具有很高的 幾丁質(zhì)酶活力，液體發(fā)酵48hr時(shí)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力為77.4U/ml，是原始菌株(21.1U/ml) 的3.67倍；該菌株對(duì)黃瓜灰霉、黑曲霉、立枯絲核菌、小麥赤霉、棉花疫霉等多種病原 真菌都有很強(qiáng)的拮抗作用。由此菌株制成的生防制劑防效比原始菌株綠色木霉(7: Wr/A) W512高，并同時(shí)能大幅度提高所試蔬菜的產(chǎn)量，該工程菌是一株非常有應(yīng)用價(jià)值的生防菌株。


圖1.綠色木霉(Zh'c/w6few^wWofe) R65CCTCCN0: M 208265菌落形態(tài)
圖2.綠色木霉(7Hc/w血mmv,77We) R65 CCTCC NO: M 208265菌絲及孢子形態(tài)
圖3.檢測(cè)過表達(dá)載體pG-ech42轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物電泳圖
其中M, H)NAAPW; 1, pG-ech42陽性對(duì)照；2, R65轉(zhuǎn)化子染色體DNA; 3, W512染 色體DNA。
圖4.內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因過表達(dá)載體pG-ech42物理圖譜 具體實(shí)施例
實(shí)施例1.工程菌株綠色木霉(7Wc/7ocfer附fl R65 CCTCC NO: M 208265的
構(gòu)建
內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因過表達(dá)載體pG-ecW2由微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(濟(jì)南)王 曉東構(gòu)建(王曉東，抗真菌蛋白和幾丁質(zhì)酶基因克隆與表達(dá)研究，山東大學(xué)碩士畢業(yè)論 文，2006)，該載體內(nèi)切幾丁質(zhì)酶ecW2基因上游含來源于vis^rg/〃w "/flWam的砂d基 因強(qiáng)啟動(dòng)子，內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因過表達(dá)載體pG-ec^2的物理圖譜見圖4，其構(gòu)建過程如 下
以pAN7-l為模板用引物pl/p2 PCR擴(kuò)增1.1k左右的gpc/啟動(dòng)子，引物pl/p2及PCR
過程如下
pl: 5' -GCGC GAATTC AGACCTAATACAGCCCCTAC- 3'
p2: 5' -GCGC GGTACCTGTCTGCTCAAGCGGGGTAG- 3' 爭(zhēng)I
PCR條件95°C 5min,94。C 0.5min—52°C 0.5min—72°C 1.5min(35個(gè)循環(huán)),72。C 10min。聚合酶為普通Taq和高保真pfu混合，模板為質(zhì)粒pAN7-l。
PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，用EcoRI和《p"I雙酶切，純化試劑盒純化，得到 g;x/啟動(dòng)子片斷；將pUC19質(zhì)粒用￡coRI和《;wl雙酶切后，膠回收純化試劑盒純化后 與上面得到的gt^啟動(dòng)子混合后用丁4連接酶連接，得到重組質(zhì)粒pPgpd，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5ou將pAN7-l質(zhì)粒用5awHI和///"tffll雙酶切后，用膠回收純化試劑盒回收切 下來的0.8kb的TtrpC終止子。將？？8口(1質(zhì)粒用^0 ^1和///"^11雙酶切，膠回收純化 試劑盒純化后與上面得到的TtrpC終止子連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到重組質(zhì)粒pG。
PCR擴(kuò)增W512內(nèi)切幾丁質(zhì)酶ec/W2基因引物序列如下
Ech-s: 5' -TAGGGTACCATGTTGGGCTTCCTCGGA- 3' 爭(zhēng)I
Ech-a: 5' -CTCGGATCCCTAGTTGAGACCGCTTCG- 3'
模板為質(zhì)粒pMDECH， PCR條件為95°C 5min,94。C 0.5min—58°C 0.5min—72°C 1.5min(35個(gè)循環(huán)),72。C 10min。聚合酶為普通Taq和高保真pfti混合。擴(kuò)增得到的內(nèi)切 幾丁質(zhì)酶ec/ 42基因長度應(yīng)為1500bp左右。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化后，用5awHI 和i^wl雙酶切，純化試劑盒純化，與經(jīng)同樣酶切后的pG用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH5a,得到含pG-ec/2質(zhì)粒的菌株。
原始宿主菌株為綠色木霉(rv/nVfe) W512，該菌株與綠色木霉LTR-2菌株在基因 特征和對(duì)各種病原菌的抑制上有著相同的特征。將內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因過表達(dá)載體pG-"W2與攜帶乙酰胺酶基因表達(dá)盒的真菌質(zhì)粒 p3SR2以3: 1比例混合共轉(zhuǎn)化原始菌株綠色木霉W512 (7: wW&W512)原生質(zhì)體，在 以乙酰胺為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，初步得到26株可能的轉(zhuǎn)化子。具體 過程如下
原生質(zhì)體的制備
① 綠色木霉(7:v/^fc) W512孢子懸液稀釋涂布乙酰胺真菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基平板，挑選 對(duì)乙酰胺利用能力弱的菌株為出發(fā)菌株。轉(zhuǎn)接土豆斜面生孢，收集孢子。
② 在土豆培養(yǎng)基平板上放置一張玻璃紙，其上涂布出發(fā)菌株孢子懸液，28'C培養(yǎng) 20hr。
③ 將平板中玻璃紙上的菌絲轉(zhuǎn)移、懸浮于1.2mol/L山梨醇-10mmol/L磷酸鉀溶液 (pH5.6，含5mg/ml-10mg/ml Lysing Enzymes)中，28。C溫浴1.5 2hr。在此過程中不
時(shí)鏡檢，觀察原生質(zhì)體的生成情況。
④ 通過G3燒結(jié)漏斗過濾，將原生質(zhì)體與未被消化的菌絲體分離開，并用1.2mol/L 山梨醇-10mmol/LTris'HCl (pH7.5)洗滌2次。
4000rpm離心15min，棄上清，收集原生質(zhì)體，并用lmol/L山梨醇 -lOmmol/LTris'HCl (pH7.5 )洗滌2次。最后重懸于lmol/L山梨醇-10mmol/L CaCl2-10mmol/LTris'HCl(pH7.5)中，使原生質(zhì)體濃度為5xl06—5xl07/ml。
原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化
將純化后的攜帶來自Aw'^/"ra編碼乙酰胺酶,必基因的質(zhì)粒p3SR2與目的轉(zhuǎn)化 質(zhì)粒pG-ecW2各2 5昭(最多20jal，兩者質(zhì)量比例1: 3)與綠色木霉CT W〃'c/e) W512 原生質(zhì)體(100nl)混合，加入25% PEG6000-50mmol/L CaCl2-10mmol/LTris'HCl (pH7.5)，冰浴20min，后加入lml 60% PEG4000-50mmol/L CaCl2-10mmol/L Tris.HCl (pH7.5)(加入體積為原生質(zhì)的10倍)，室溫放置5min。最后加入2ml lmol/L山梨醇 -10mmol/LCaCl2-lOmmol/L Tris.HCl(pH7.5)，混勻。
再生和選擇將適量(100pl 20(^l)上述轉(zhuǎn)化液涂布于乙酰胺真菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基平板 上，28'C培養(yǎng)3 4d，挑選在乙酰胺真菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基上生長較快菌落較大的轉(zhuǎn)化子。同 時(shí)對(duì)于沒有加入目的質(zhì)粒的原生質(zhì)體按同樣的方法進(jìn)行，按相同的量涂布在不含和含有 乙酰胺為唯一碳源和氮源的山梨醇基本培養(yǎng)基上分別作為原生質(zhì)體再生情況以及陰性 對(duì)照。
以上轉(zhuǎn)化試驗(yàn)所用乙酰胺真菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基乙酰胺10tnmol/L， KH2P04 15g/L， MgS04 0.6 g/L， CaCl2 0.6 g/L， FeS04'7H20 0.005 g/L， MnS04'H20 0.0016 g/L, ZnS04-7H20 0.0014 g/L， CoCl2 0.002 g/L， Triton X-100 lml/L，瓊脂20g/L， pH5.5。
將挑選到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于土豆培養(yǎng)基斜面，3(TC培養(yǎng)3 5d左右。如果生孢不良好 可以考慮在轉(zhuǎn)接4 5d后，從土豆斜面上挑一些菌絲繼續(xù)轉(zhuǎn)接土豆斜面生孢。待孢子長 成綠色后，用無菌水沖洗下孢子，收集孢子并加入80%甘油等體積混合， 一部分置一2(TC 儲(chǔ)存?zhèn)溆?，另一部分置乙酰胺真菌轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子是否生長。如果 生長則將此轉(zhuǎn)化子作為陽性轉(zhuǎn)化子保存。
提取轉(zhuǎn)化子染色體DNA，進(jìn)行PCR驗(yàn)證(所用引物對(duì)應(yīng)該擴(kuò)增出包括gp^4啟動(dòng) 子和ecW2結(jié)構(gòu)基因在內(nèi)的2.6kbDNA片斷，引物及PCR程序如下)。
P3: 5' -GCGCGAATTCAGACCTAATACAGCCCCTAC- 3'
P4: 5 -CTCGGATCCCTAGTTGAGACCGCTTCG- 3'
PCR條件為95°C 5min,94。C 0.5min—48°C 0.5min—72。C 2.5min(35個(gè)循環(huán))，72。C
610min，擴(kuò)增g/^啟動(dòng)子和幾丁質(zhì)酶基因全長，產(chǎn)物長為2.6kb。
經(jīng)過PCR驗(yàn)證得到一株轉(zhuǎn)化子，該菌命名為綠色木霉(7Hc/zoAmjav/rWe) R65。該菌株己于2008年12月29曰保藏于"中國典型培養(yǎng)物保藏中心"，保藏號(hào)為CCTCC N0:M208265。
]實(shí)施例2.綠色木霉(7WcA^/m^wWcfe) R65CCTCCN0: M 208265形態(tài)觀察將綠色木霉(7Wc/K^/m^ R65 CCTCC NO: M 208265接種到PDA培養(yǎng)基，
3(TC培養(yǎng)3 4天，觀察菌落特征如圖1;菌絲棉蘭染色觀察，并使用NIKONALPHAPHOT-2系統(tǒng)照相，菌絲及孢子形態(tài)如圖2。
PDA培養(yǎng)基上，其菌落為無色或淡色的絨狀，后期菌落表面開始出現(xiàn)綠色，產(chǎn)孢叢束區(qū)可見同心環(huán)紋；菌絲分隔，分枝繁復(fù)。菌絲短枝上對(duì)生或互生分枝，分枝上又可繼續(xù)分枝，分枝呈銳角或近乎直角，束生、對(duì)生或單生末枝；分生孢子由最終末端分枝相繼生出，由黏液把它們聚成球形或近球形的孢子簇。分生孢子近球形、橢圓形或圓筒形，透明或亮綠色。
實(shí)施例3.綠色木霉(7Wc/w /mwa v/〃We) R65CCTCCN0: M 208265幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定
參考譚建新(譚建新,Btcry基因克隆和環(huán)狀芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶的研究.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院博士生學(xué)位論文,2001)幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定方法對(duì)綠色木霉R65 CCTCC M208265進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定。具體方法如下
蝸牛酶液配制稱取蝸牛酶干粉lg， EDTA (0.5mol/L) 0.2 mL， KC1 (lmol/L) 1mL，置于容量瓶內(nèi)混勻，添加雙蒸水至100ml溶解完全，即可得1%蝸牛酶，低溫保存。
N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作配置100ug/ml的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)母液，再將此母液分別稀釋成不同濃度(0、 20、 40、 60、 80、 100ug/ml);然后分別取幾支干凈的試管，分別加入不同濃度的N-乙酰氨基葡萄糖0.4 ml，加入0.2 ml飽和硼砂溶液，沸水浴7 min，冷卻后加2 ml冰醋酸和1 mlP/。對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液，37'C保溫15min后，測(cè)定585nm下OD值；以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，N-乙酰氨基葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活測(cè)定:取粗酶液0.4mL，加入乙酸緩沖液0.4mL (0.1 mol/L， PH5.8)， 0.4 mL膠體幾丁質(zhì)(0.1%), 37。C下反應(yīng)6h，離心(10000 rpm， 10min);取0.4mL上清液，加入O.l mL的1%蝸牛酶，37'C下反應(yīng)lh，以同樣處理的包括底物和酶(加熱失活)的反應(yīng)液為對(duì)照。其中產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖含量的測(cè)定同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程中測(cè)定方法，得到OD值后具體N-乙酰氨基葡萄糖含量由N-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出。
幾丁質(zhì)酶活力定義在上述酶反應(yīng)體系中，酶活以每小時(shí)分解膠體幾丁質(zhì)釋放出lug的N-乙酰氨基葡萄糖定義為1個(gè)酶活力單位(U)。
對(duì)綠色木霉(7h'c/2oAwjav/nWe) R65CCTCCN0: M 208265及對(duì)照原始菌株綠色木霉(7: wW&)W512進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定顯示48hr時(shí)，綠色木霉(7Hc/zoflfemw v/r!We)R65CCTCCN0: M 208265和原始菌株綠色木霉(Zv/n'fife) W512的酶活力達(dá)到最大，分別為77.4U/ml和21.1U/ml，工程菌株的幾丁質(zhì)酶活力較原始菌株提高了 2.67倍。這顯示用內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因重新轉(zhuǎn)化原宿主菌株，轉(zhuǎn)入的內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因插入綠色木霉染色體上并成功表達(dá)。由于內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因拷貝數(shù)的增多和基因表達(dá)的增強(qiáng)，轉(zhuǎn)化子分泌的幾丁質(zhì)酶活性得到大幅度提高。
7上述所用液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基葡萄糖20g/L， (NH4)2S04 5 g/L， KH2P04 15 g/L，MgS04 0.6 g/L， CaCI2 0.6 g/L， FeS04'7H20 0.005 g/L， MnS04'H20 0.0016 g/L，ZnS04.7H20 0.0014 g/L， CoCl2 0.002 g/L (pH5.5)。
上述粗酶液為發(fā)酵液4°C ， 6000rpm離心4min后取上清得到。
實(shí)施例4.平板對(duì)峙試驗(yàn)
參考Bell K等人的方法(Bell K， Wells HD, Markham CR. Irwitroantagonism of7Wc/zo6fenna species against fungal pathogens [J].Phytopath. 1982, 72:379-382)， 在PDA平板上兩側(cè)相距5cm處分別點(diǎn)種綠色木霉(7h'c/wArw" vz>/A)R65 CCTCC NO: M 208265(或原始菌株綠色木霉CTv/nWe) W512)和黃瓜灰霉、黑曲霉、立枯絲核菌、小麥赤霉、棉花疫霉等植物病原真菌，28 30'C下培養(yǎng)，觀察平板上兩種菌的生長情況。以單獨(dú)接種綠色木霉(7Wc/70&mjfl wWA) R65 CCTCC NO: M 208265 (或原始菌株綠色木霉(7:Wn'A) W512)和各種病原真菌的平板作對(duì)照。逐日觀察菌落的生長和工程菌株的抑制作用，連續(xù)觀察5 7d，每處理重復(fù)3次。結(jié)果顯示，過量表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)酶基因的工程菌株綠色木霉(Th'c/wc/m^wWcife) R65 CCTCC NO: M 208265對(duì)黃瓜灰霉、黑曲霉、立枯絲核菌、小麥赤霉、棉花疫霉等植物病原菌的抑制效果相對(duì)原始菌株綠色木霉(7:wW&) W512有不同程度的提高。
實(shí)施例5.綠色木霉(7Wc/w&mm R65 CCTCC NO: M 208265生防制劑的
制作
將綠色木霉(7Wc/ ot/mw" Wr,We) R65 CCTCC NO: M 208265接種于PDA固體培養(yǎng)基，28 3(TC培養(yǎng)4 5天后，用無菌水或涼開水將孢子洗下并調(diào)節(jié)其孢子濃度為l 5xl()7個(gè)/ml制成孢子懸液制劑。
上述PDA固體培養(yǎng)基配制馬鈴薯200g，自來水煮沸30min, 6層紗布過濾，在濾液中加入葡萄糖20g，瓊脂17g，補(bǔ)水至1000ml。
實(shí)施例6.綠色木霉(7h'c/w&ram v/〃Vfe) R65 CCTCC NO: M 208265在盆栽黃瓜上的應(yīng)用
共進(jìn)行兩茬盆栽試驗(yàn)，供試黃瓜品種為"濟(jì)優(yōu)10號(hào)"。 一期盆栽試驗(yàn)，取近年未種蔬菜的土，搗碎較大土塊，裝內(nèi)徑11.5厘米、高10厘米的塑料盆，澆透底水，4小時(shí)后每盆直播3粒黃瓜籽(經(jīng)26土2'C催芽至露白)，蓋細(xì)干土l-1.5cm，幼苗出土后要見陽光，出齊苗后每盆保留2棵苗。在出苗后10±1天，用濃度為107個(gè)/1111的工程菌株和原始菌株孢子懸液制劑分別灌根，各菌株均設(shè)稀釋5倍和不稀釋(直接灌根30ml原液)兩個(gè)處理，重復(fù)5次，以澆清水為對(duì)照。試驗(yàn)?zāi)┢谡{(diào)査病情指數(shù)及生防效果等指標(biāo)。二期盆栽試驗(yàn)在一期盆栽兩個(gè)月后進(jìn)行，方法同上， 一期從6月下旬到7月底，二期從9月下旬到10月底。
一期盆栽結(jié)果顯示植株均未遭受病原菌侵害；二期盆栽試驗(yàn)的結(jié)果如表l所示。由表1可知工程菌株綠色木霉(rn'c/wi/mwaw'r/tfe) R65 CCTCC NO: M 208265制劑生防效果較原始菌株綠色木霉(Z wW&) W512有了大幅度的提高，平均生防效果提高29.87%，并且在使用工程菌株后植株未發(fā)現(xiàn)病情。
表1二期盆栽試驗(yàn)病情指數(shù)及生防效果表
處理病情指數(shù)％生防效果％平均生防效果％W512 x6.0568.9770.13
W5125.671.28R65 x0100100
R650100對(duì)照19.5--
實(shí)施例7.綠色木霉(7Hc/ o^ram R65 CCTCC NO: M 208265在大棚黃瓜
和番茄上的應(yīng)用
大棚番茄單因素試驗(yàn)安排單因素試驗(yàn)，全面考察工程菌株綠色木霉(7h'c/wcfem"R65 CCTCC NO: M 208265和綠色木霉(7: wWA) W512的孢子懸液制劑的生防效果，同時(shí)調(diào)查株高、莖粗?jǐn)?shù)據(jù)，分析大田狀態(tài)下工程菌株的促生作用。試驗(yàn)地為潮褐土， 土壤有機(jī)質(zhì)含量1.18%，速效氮含量135ppm，速效磷含量35ppm，速效鉀108ppm，試驗(yàn)前已連續(xù)3年種植蔬菜；該棚于9月15日定植，安排試驗(yàn)時(shí)處在結(jié)第二大茬番茄始期，供試番茄品種為"金鵬超冠"；每10±1天，在晴天下午3-4點(diǎn)噴施1(f個(gè)/ml孢子濃度的工程菌株和原始菌株孢子懸液制劑，連噴4次；小區(qū)面積10.2m2。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，工程菌株綠色木霉(7Hc/wAwmv/〃We) R65CCTCCN0: M208265孢子液制劑的生防效果較原始菌株綠色木霉(7:WnYfe) W512提高了23。/。，并且使用工程菌株制劑后番茄產(chǎn)量提高29.8%。
表2番茄大棚單因素試驗(yàn)綜合數(shù)據(jù)
處理株高cm蓮粗cm生防效果％小區(qū)產(chǎn)量kg比對(duì)照±%
W512217.4bcAB1.239a72%b202.3b4.0
R65242.6aA1.350a95%a252.4a29.8
對(duì)照210.2bcB1.230a-194.5b-
大棚黃瓜單因素試驗(yàn)試驗(yàn)地點(diǎn)與番茄試驗(yàn)相同。為全面考察兩個(gè)供試菌株制劑的
生防效果，分析大田狀態(tài)下工程菌株綠色木霉(7h'c/w&m^ wV/6fe) R65 CCTCC NO:M 208265制劑的促生作用，該棚于8月底直播，供試黃瓜品種為"鑫育35號(hào)"，試驗(yàn)時(shí)棚內(nèi)有白粉病、褐斑病輕度發(fā)生。噴藥周期和方法與番茄單因素試驗(yàn)相同。小區(qū)面積10.5m2。試驗(yàn)結(jié)果如表3。結(jié)果顯示，工程菌株制劑的生防效果較原始菌株提高了 18%，并且使用工程菌株工程菌株制劑后黃瓜產(chǎn)量提高21.9%。
表3黃瓜大棚單因素試驗(yàn)綜合數(shù)據(jù)
處理株高cm蓬粗cm生防效果％小區(qū)產(chǎn)量kg比對(duì)照±%
W512294. 4ab0.910a74%b263. 2b4.2
R65317. 0a1. 073a92%a307. 8a21.9
對(duì)照281.6b1. 004a-252. 6b—
9
權(quán)利要求
1.一株綠色木霉工程菌，含有過表達(dá)內(nèi)切幾丁質(zhì)基因，該菌命名為綠色木霉(Trichoderma viride)R65，并已于2008月12日29日保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCC NOM 208265。
2. 如權(quán)利要求l所述的綠色木霉工程菌，其特征是所述綠色木霉工程菌的形態(tài)特 征為PDA培養(yǎng)基上，其菌落為無色或淡色的絨狀，后期菌落表面開始出現(xiàn)綠色，產(chǎn)孢 叢束區(qū)可見同心環(huán)紋；菌絲分隔，分枝繁復(fù)；菌絲短枝上對(duì)生或互生分枝，分枝上又可 繼續(xù)分枝，分枝呈銳角或近乎直角，束生、對(duì)生或單生末枝；分生孢子由最終末端分枝 相繼生出，由黏液把它們聚成球形或近球形的孢子簇；分生孢子近球形、橢圓形或圓筒 形，透明或亮綠色。
3. 權(quán)利要求1所述綠色木霉工程菌在蔬菜生物防治中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是:所述綠色木霉工程菌以生防制劑形式實(shí)施； 其中所述生防制劑以如下方法制備將綠色木霉(7Wc/wAmmwWA) R65CCTCCN0: M 208265接種于PDA固體培養(yǎng)基，28 30'C培養(yǎng)4 5天，用無菌水或涼開水將孢子 洗下，收集孢子并調(diào)節(jié)其濃度為l 5xl07+/ml，得到孢子懸液制劑。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征是所述綠色木霉工程菌實(shí)施對(duì)蔬菜生物 防治的方法是20 3(TC環(huán)境溫度下，以濃度為1 5xl(^個(gè)/ml的孢子液對(duì)出土 10±1 天的盆栽蔬菜幼苗進(jìn)行灌根，處理1 2次，每隔IO天一次；或以濃度為l 5><107+/ml 的孢子液對(duì)大棚定植的蔬菜進(jìn)行噴施，處理3 6次，每隔10天一次。
6. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征是所述蔬菜是黃瓜或番茄。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株綠色木霉工程菌，含有內(nèi)切幾丁質(zhì)基因，該菌命名為綠色木霉(Trichoderma viride)R65，并已于2008月12日29保藏于“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏號(hào)為CCTCC NOM 208265。本發(fā)明還公開了所述菌株在蔬菜生物防治中的應(yīng)用。所述菌株的幾丁質(zhì)酶活力最高可達(dá)77.4U/ml，是原始宿主菌株的3.67倍，該菌株對(duì)黃瓜灰霉、黑曲霉、立枯絲核菌、小麥赤霉、棉花疫霉等多種植物病原真菌有較強(qiáng)的拮抗作用，是一株在蔬菜生物防治中比較有應(yīng)用價(jià)值的工程菌株。
文檔編號(hào)C12N1/15GK101492646SQ20091001384
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2009年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月15日
發(fā)明者李秀深, 汪天虹, 皇傳華, 鵬 肖 申請(qǐng)人:山東大學(xué)