專利名稱：麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及齊墩果酸相關(guān)基因——P -amyrin合成 酶基因G^4W及功能驗證。
背景技術(shù)：
植物次生代謝是指有些生物體利用某些初生代謝產(chǎn)物為"原料"，在一系列酶的催化下， 形成一些特殊的化學物質(zhì)的過程,這些特殊的化學物質(zhì)即為次生代謝產(chǎn)物，如生物堿、黃酮 類、萜類、有機酸、木質(zhì)素等,它們是植物中一大類并非生長所必需的小分子有機化合物， 但對于植物自身在復雜環(huán)境中的生存和發(fā)展卻起著不可替代的作用。
植物次生代謝產(chǎn)物具有重要的經(jīng)濟價值。臨床應(yīng)用的藥物，有很多都是取自植物的次生 代謝產(chǎn)物。西方的臨床藥物中，大約25%是直接或間接地從植物中提取的次生代謝物。在我 國，藥用植物的應(yīng)用歷史更為悠久。此外，用作食品調(diào)味劑、日用芳香劑、殺蟲劑等的植 物次生代謝產(chǎn)物也倍受人們的青睞。
隨著基因工程技術(shù)的不斷完善，對植物細胞代謝網(wǎng)絡(luò)進行修飾和改造來積累大量目的 產(chǎn)物已成為可能。目前，次生代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶基因的克隆及轉(zhuǎn)化是植物次生代謝工程的研 究熱點。應(yīng)用關(guān)鍵酶基因的代謝工程為提高植物組織、細胞培養(yǎng)及整體植株代謝產(chǎn)物的產(chǎn) 量提供了技術(shù)平臺。
植物次生代謝產(chǎn)物種類繁多，生物合成途徑也千差萬別，只有在了解目標植物特定次 生代謝途徑的基礎(chǔ)上，才能有選擇地進行有效的基因操作。因此，植物次生代謝圖譜的研 究是植物次生代謝基因工程必要的前提工作。
植物次生代謝物種類繁多，化學結(jié)構(gòu)迥異?，F(xiàn)在，已知大約有10000種次生代謝物，包括 酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、生物堿、糖苷、萜類、留類、皂苷、多炔類、有機酸等， 可分為酚性化合物、萜烯類化合物、含氮有機物三大類。萜類化合物(terpenoids)是植物 次生代謝產(chǎn)物中最大的一個家族，在自然界中廣泛分布，由異戊二烯(is叩rene， C5)單元 組成的化合物及其衍生物，按碳原子的數(shù)目可以分為單萜(C10)、倍半萜(C15) 、 二萜(C20)、 三砲(C30)和多路等。由于多數(shù)萜類化合物分子中具有不同的碳環(huán)數(shù)，因此又可分為鏈萜、 單環(huán)砲、雙環(huán)葩和三環(huán)砲等。其中三砲類化合物是由六個異戊二烯單元組成的物質(zhì)。廣泛 存在于動植物體內(nèi)，以游游離狀態(tài)或成酯或苷的形式存在。多數(shù)是含氧衍生物，為樹脂的 主要成分之一。例如甘草中的干草苷稱為甘草酸，因其味甜又稱甘草甜素，在酸性條件下 水解得到的苷元稱為甘草次酸，可溶于乙醇和氯仿中，是一個五環(huán)三萜化合物。角鯊烯是 存在于鯊魚的魚肝油、橄欖油、菜籽油中的一個鏈狀三萜，它是由一對三個異戊二烯單元 頭尾連接后的片段互相對稱連接而成，具有降低血脂和軟化血管等作用，被譽為血管清道 夫。
中草藥是中國傳統(tǒng)的藥用植物，其有效成分絕大多數(shù)都來源于次生代謝產(chǎn)物，在植物 中含量甚微，利用栽培措施大幅度地提高有效成分含量難度很大。通過次生代謝的基因工 程，來提高中藥材有效成分含量的研究剛剛起步。有效成分相關(guān)基因的克隆及其功能鑒定 的有效方法還較少，且耗時，所獲得的次級代謝途徑中的相關(guān)基因較少。
高寒藏藥麻花艽系龍膽科(Gentianaceae)、龍膽屬(Gentiana)，主要分布于西藏、青海、甘肅海拔2500-4700米的高寒地區(qū)，多年生草本，全草及根入藥，由于其分布散， 生長期長，藥材收集極為困難，因而已成為瀕危物種。主治黃膽性肝炎，風濕關(guān)節(jié)痛、結(jié) 核病潮熱、哮喘、抽搐、休克、過敏反應(yīng)。富含五環(huán)三萜類次生代謝物，{3-amyrin (P-香樹素)是其中的一類重要的三萜類化合物。
P-amyrin是植物中最常見的三路類化合物之一。它的五碳環(huán)骨架，折疊為椅式構(gòu)象， 是由2， 3-氧化角鯊烯經(jīng)過一系列反應(yīng)在e -amyrin合成酶催化下形成的(Kushiro et al.， 1998)。而其合成酶是該途徑中非常重要的限速酶，控制著這些藥用成分前體合成的第一步 反應(yīng)，因此對該基因的克隆具有極其重要的意義。齊墩果酸是該反應(yīng)中的最終產(chǎn)物，在龍 膽科植物麻花艽中P -amyrin合成酶基因?qū)τ诳垢窝子行С煞铸R墩果酸的積累具有很高的 促進作用。
到現(xiàn)在為止，已從許多雙子葉植物中分離到了P-amyrin合成酶基因，如雙子葉人參中 的PNY1 (Kushiro et al. ， 1998)， PNY2( Kushiro et al. ， 1998);干草中的GgbASl( Hayashi etal.， 2001);豌豆中的PSY (Morita et al. ， 2000);還有截形苜蓿(Suzuki et al. ， 2002) 和白樺(Zhang et al. , 2003)等單子葉植物燕麥中的AsbASl (Haralampidis et al., 2001)。 并有文章報道對其功能的驗證。對于
盡管目前己經(jīng)在許多物種中克隆到P -amyrin合成酶基因，但是對于龍膽科植物麻花艽 來說該基因都克隆、功能驗證并在植物轉(zhuǎn)化中應(yīng)用還未見報道，并且對于該基因與齊墩果 酸關(guān)系的研究也是未見報道。本發(fā)明在麻花艽中克隆得到的基因O^W與其他物種中的類 似基因相比同源性在50-75%之間，但是對于其保守區(qū)都分析發(fā)現(xiàn)麻花艽中P-amyrin合成 酶基因&A57的氨基酸序列含有4個QW和1個DCTAE基元，在已知其它物種中的P -amyrin合成 酶基因都含有該基元，而該結(jié)構(gòu)上的特征對于其功能的發(fā)揮具有一定的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種麻花艽中齊墩果酸相關(guān)基因一一P-amyrin合成酶基因及 其在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是從麻花艽中分離得到amyrin合成酶基因foAS7，在真核系 統(tǒng)中驗證功能，然后將該基因轉(zhuǎn)到原植株麻花艽中得到高齊墩果酸含量的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明提供的麻花充amyrin合成酶基因foAS7，其特征在于所述基因cDNA序 列如SEQ ID No. 1所示。
本發(fā)明還提供了一種含上述的麻花艽e-amyrin合成酶基因foAS7的酵母表達載體 pPICZA，其特征在于所述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本發(fā)明還提供了一種含上述的麻花艽e-amyrin合成酶基因foA^ 的植物表達載體 pROKII，其特征在于所述植物表達載體核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
該植物表達載體PROKII都構(gòu)建主要通過以下四步完成l)帶有Sacl和Xball酶切位 點的引物擴增目的基因foA57; 2)將目的基因foAS7克隆入pMD18-T載體；3)將含有fcAS7 基因的pMD18-T載體和PR0KII載體分別用Sacl和Xball進行雙酶切；4)將回收的 基因和PR0KII載體連接。
本發(fā)明所述麻花艽amyrin合成酶基因foAS7在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。
實驗證實將GsASl基因轉(zhuǎn)化進原植株麻花艽中，通過該基因的過表達使齊墩果 酸含量得到大的提高，其中齊墩果酸的含量通過HPLC方法測定。
本發(fā)明的有益效果利用現(xiàn)有的植物基因工程技術(shù)，本發(fā)明首次克隆得到了麻花艽的e-amyrin合成酶基因foAS7并在畢赤酵母中進行功能驗證，通過基因槍轉(zhuǎn)化的方法 將該基因轉(zhuǎn)入原植株麻花艽中，經(jīng)過比較分析證明，轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的齊墩 果酸含量可提高1倍以上。所以對于該基因foAS7的研究具有重要都意義和應(yīng)用前景。


圖1為麻花艽P -amyrin合成酶基因foA57的cDNA電泳圖，其中1為foAS7基因
的cDNA， M為Marker。
圖2為轉(zhuǎn)P -amyrin合成酶基因foAS7后麻花艽陽性愈傷組織篩選圖。
圖3為轉(zhuǎn)基因麻花艽DNA鑒定圖，其中泳道l為Marker,泳道2、 4、 6、 8、 10、
12均為麻花艽轉(zhuǎn)基因植株的cDNA。
具體實施例方式
實施例1、 GsAS7的克隆
1. 1麻花艽總腿的提取
(1) 麻花宄材料放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成均勻的粉末。注意研磨過 程中要保證材料浸在液氮中。
(2) 待液氮揮發(fā)后將材料迅速轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，每50-100mg組織材料加入1 ml TRIZ0L溶液，混勻后，于室溫放置5min， 12000r/min， 2-8。C離心10min去沉淀。
(3) 每1 ml TRIZOL溶液中加入0. 2 ml氯仿，振蕩15sec充分混勻，于室溫放置 5 min， 12000r/min， 2-8。C離心15min。
(4) 取上清，每lml TRIZ0L加入0.5ml的異丙醇，混勻，室溫放置10 20min。
(5) 2-8°C 12000 r/min離心10min，棄上清。
(6) 加l ml 75%乙醇洗滌沉淀2次，4。C不超過7500r/min離心5min，棄上清。
(7) 室溫放置晾干后，加入15 u 1 DEPC處理的雙蒸水溶解RNA。 1. 2逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA
(1) 0. 2ml Eppendorf管中，加入下列成分 用DNaseI純化的上述總RNA (0. lug/ul) 2. 0 u 1 Olige (dT) anchored primer (2 u M) 2. Oul
(2) (TC水浴變性10分鐘，立即置于冰浴中。
(3) 在10" 1反應(yīng)體系中加入下列成分2.0yl 5XMMLV RT buffer;1.0yl 250 ymol/L dNTP mix;O. 25ul Rnasin;O. 1(200u/ii 1) MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶；2wl上述RNA 變性液。42'C進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)lhr。反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA用于后面的反應(yīng)。
1. 3 PCR
以上述逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA為模板，PCR法擴增基因片段。
(1) PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成弓1物P0:5' -ATGTGGAGGCTAAAAATCGG- 3' 弓I物P1:5' -CGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG- 3' (2) PCR反應(yīng)體系
10XPCR buffer1
MgCl2(25mmol/L)1. 1
dNTP(each 250umol/L)0. 2ii 1
P0 (10umol/L)ly 1
Pl (4iimol/L)lu 1
逆轉(zhuǎn)錄第一鏈產(chǎn)物1
Ex T叫0. 2y 1
無菌水10. In 1
(3) PCR反應(yīng)程序
94°C 5min; 94°C 30sec, 50°C 30sec' 72°C 2rain, 35個循環(huán);最后72°C延伸7min。 PCR產(chǎn)物電泳如圖1所示。
1.4 5' -RACE
按照TaKaRa 5' -Full RACE Core Set說明書所示步驟操作。電泳5' -RACE產(chǎn)物。 1.5目的片段的回收
(1) 用刀片切下上述電泳結(jié)果中含目的條帶的膠條置于1. 5mlE卯endorf管中。
(2) 稱重，加入3-4倍體積的DR-I Buffer, 65。C加熱10min融化膠塊，每隔2min 混勻一次保證膠塊能充分融化。
(3) 加入DR-1 Buffer量的1/2體積的DR-IIBuffer,均勻混合。
(4) 將Spin Clo咖n安置于Collection Tube上，將上述溶液轉(zhuǎn)移至Spin Column 中，5000rpm離心lmin，棄濾液。
(5) 將500 u 1 Rinse A加入Spin Column中，5000rpm離心lmin，棄濾液。
(6) 將700 u 1 Rinse B加入Spin Column中，5000rpm離心lmin，棄濾液。
(7) 重復步驟6，然后12000rpm再離心lmin。
(8) 將Spin Cloumn安置于新的1. 5ml的離心管上，在Spin Cloumn膜的中央處加 入預(yù)熱到60。C的25 y 1的水或洗脫緩沖液，室溫靜置lmin。
(9) 12000rpm離心lmin洗脫酒A。(10) 重復步驟9， 2次，將所有洗脫液集中收集于一管內(nèi)，混勻，取少量電泳檢查 回收效率，其余加入1/10體積的3mol/LNaAc (pH5. 3)和2倍體積的無水乙醇，-2(TC沉 淀lhr。
(11) 然后4。C， 12000rpm離心15min，用70%冷乙醇洗滌沉淀，棄盡液體，用40 yl無菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的連接反應(yīng)。
1. 6連接
用上述的回收目的片段與pMD-18T載體(購自寶生物工程有限公司，下同)按摩爾 比約1:1的比例進行連接，連接體系如下
目的片段 7ul
T-vector 1 P 1
10XT4 DNA Ligase Buffer 1 u 1
T4腿Ligase 1 U 1
混勻并短暫離心，16r連接過夜。得到重組質(zhì)粒pMD18T-AW，用于后面的反應(yīng)。 1.7 CaCl2法制備感受態(tài)細胞
(1) 挑取DH10B單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜。
(2) 按l: 100-1: 50的比例，取lml菌液接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中，37"振 蕩培養(yǎng)至菌液0D6。。為0. 3-0.6。
(3) 將菌液冰浴10min， 4°C 4000rpm離心10min，收集菌體。
(4) 沉淀加10ral預(yù)冷的0. 1M CaCl2懸浮后，冰浴30rain。
(5) 4XM000rpm離心10min。沉淀重懸浮于lml預(yù)冷的0. 1MCaCl"混勻并冰水浴 中保存，備用或加入15%的甘油置于-7(TC中保存。
1.8熱擊法轉(zhuǎn)化Ecoli DH10B
(1) 在無菌條件下吸取100 y 1感受態(tài)細胞，加入1. 5ml預(yù)冷的無菌E卯endorf管 中，加入10!U連接產(chǎn)物(1.6中的重組質(zhì)粒)，輕輕混勻，立即置于冰上30min。
(2) 在42'C恒溫水浴中熱激90sec (準確記時)。
(3) 冰浴3-5rain。
(4) 加入800u 1不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻，37。C振蕩培養(yǎng)45-60min。
(5) 短暫離心收集菌體，用150yl LB液體培養(yǎng)基重懸菌體，轉(zhuǎn)至含抗生素Amp、 X-gal、 IPTG的LB固體平板上，用無菌涂布棒涂布。
(6) 將平板于37'C正向放置15-30min至液體被吸收，倒置平板，于37'C培養(yǎng) 12-16hr，觀察平板會有藍白斑。白斑用于后面的質(zhì)粒提取。1.9堿裂解法提取大腸桿菌質(zhì)粒
(1) 挑取白色單菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液體培養(yǎng)基中，同時 也要保存所挑取的白色單菌落于含抗生素A卿(50mg/L)的固體LB平板中，37'C震蕩培養(yǎng) 12-16h;
(2) 12000rpm離心30sec，收集培養(yǎng)物中的菌體，盡量棄盡上清；
(3) 加入100ul冰預(yù)冷的溶液I，在渦旋器上使菌體充分重懸；
(4) 加入200yl溶液I1，立即將離心管緩緩顛倒數(shù)次，冰浴5-10min;
(5) 加入150y 1冰預(yù)冷的溶液III,緩緩顛倒離心管數(shù)次直至白色沉淀充分形成， 冰浴5-10min;
(6) 12000rpm離心3min，取上清轉(zhuǎn)入另一微量離心管中，加入2倍體積95%乙醇， 混勻后，室溫靜置3 min;12000rpm離心3min，使質(zhì)粒DNA沉淀；
(7) 棄盡上清，取200 u 1 TE溶液溶解沉淀；
(8) 加入等體積冰預(yù)冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的認A;
(9) 12000rpm，離心3min;
(10) 轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入2倍體積的95。/。乙醇，混勻后于室溫靜置3iiiin， 12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；
(11) 棄上清后用lml 70%乙醇洗滌沉淀，棄盡液體；
(12) 室溫干燥后，取20u 1含脂aseA(20ug/ml)的TE溶液溶解沉淀，37。C水浴 30 60min消化RNA。
(13) 為減少損失，可先用TE將總體積補充至200yl，加入等體積的酚-氯仿-異 戊醇，充分振蕩5-10min， 12000rpm離心5min;
(14) 取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇，重復以上操作；
(15) 取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉(pH5. 3)和2倍體積的無水乙醇， 混勻后-20。C放置15min， 12000rpm離心3min使質(zhì)粒沉淀；
(16) 棄上清用lml 70%乙醇洗滌沉淀，棄液體，用40wl TE或無菌水溶解沉淀。 質(zhì)粒用于后面的反應(yīng)。
1. 10質(zhì)粒酶切驗證
用EcoRI酶切上述質(zhì)粒，酶切反應(yīng)體系如下表所示
重組質(zhì)粒pMD18T-A57 16 n 1
EcoRI限制性內(nèi)切酶 2ul
10X Buffer 2y 1將上述反應(yīng)體系混勻并5000rpm離心lmin， 37'C水浴反應(yīng)過夜，然后進行P/。的TAE瓊 脂糖凝膠電泳檢測。
1. 11 DNA測序
挑取含有重組質(zhì)粒的陽性單菌落用含有Amp(50mg/L)的液體LB搖過夜，然后送上海 博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到測序結(jié)果基因cDNA序列如序列表SEQIDNo. l所示。
經(jīng)過NCBIblast分析，上述cDNA序列與人參的PNYl同源，證明實驗得到的就是麻花艽 的P -amyrin合成酶基因，命名為麻花艽P -amyrin合成酶基因fcAS7。
實施例2、麻花艽e -amyrin合成酶基因foAS7的功能驗證
2. 1酵母表達載體的構(gòu)建 2.1.1目的基因的獲得
(1)引物設(shè)計設(shè)計一對PCR擴增帶EcoRI和Xhol酶切位點都foAS7基因。 P01: 5'- GAATTCATGTGGAGGCTAAAAATCGG - 3'
EcoRI
P12: 5' _ CTCGAGCGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG _ 3'
Xhol
(2) PCR反應(yīng)體系
10XPCR buffer1
MgCl2(25mmol/L)1. 5y 1
dNTP(each 250pmol/L)0. 2u 1
P01 (4iimol/L)lu 1
P02 (4umol/L)lu 1
重組質(zhì)粒pMD18T-A5Vlul
rTaq (TaiKaRa)0. 2u 1
無菌水13. In 1
(3) PCR反應(yīng)條件為
94°C 5min; 94°C 30sec, 60°C 30sec, 72°C 2min， 35個循環(huán);最后72°C延伸7min。 PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。 2. 1.2表達載體的構(gòu)建步驟
引入酵母表達載體pPICZA(購自寶生物工程有限公司)，該載體上含有中所含有EcoR 和XhoI兩個酶切位點。
將帶有EcoR和XhoI酶切位點的cDNA與質(zhì)粒分別進行EcoR和XhoI的雙酶切，再按照5:1 的比例在T4連接酶的催化下進行連接16小時以上。反應(yīng)體系及條件如下 (1) cDNA酶切反應(yīng)體系和條件:
cDNA /EcoR+Xho1 6 P 1
EcoR 1 ii 1
Xhol 1 y 1
10 XH Buffer 2u 1
37。C 16h;(2)質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件: pPICZA質(zhì)粒 EcoR
10XH Buffer
37 °C 16h;
連接反應(yīng)用T4 DNA Ligase進行，體系和條件同T載體的連接體系和條件。用連接產(chǎn) 物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，得到酵母表達載體 pPICZA-"7。提取陽性克隆pPICZA-^7的質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條 件同鑒定重組子。 2. 2 DNA導入酵母
(1) 挑取酵母菌株(畢赤酵母)的單克隆，接種至10ml液體YPD培養(yǎng)基，30°C， 200rpm， 培養(yǎng)2-3天；
(2) 按照l: 50的比例將菌液轉(zhuǎn)移至50ml YPD液體培養(yǎng)基中30'C， 200rpm，培養(yǎng)3 5h， 此時的菌液OD 0. 4 0. 6。
(3) 將菌液分裝至10ml無菌離心管中，每管5ml;
(4) 3000rpm離心5min，收集細胞。用2.5ml無菌ddH20重懸菌體；
(5) 3000rpm離心5min，收集細胞。用O. lml 100mM (IX) LiAc/TE buffer重懸菌體;
(6) 3000rpm離心l 2min沉淀細胞(僅需將菌體離心至離心管底即可)，用微量移液 器小心吸走上清；
(7) 用50ul 100mM (IX) LiAc/TE buffer重懸菌體，將菌懸液移至滅菌的l. 5ml Eppendorf管中；
(8) 將lml單鏈擔體DNA煮沸5min，快速在冰水中冷卻；(注無需每次使用時都煮沸 擔體DNA，可分裝成小份凍存；凍融3 4次后應(yīng)再煮沸，取出后應(yīng)保持在冰上)
(9) 將步驟7準備的樣品，3000rpm離心l 2min沉淀細胞，用微量取樣器小心吸走上
清；
(10) 按下列順序加入240 ul PEG (50%w/v)(加入后用槍頭上下吹打，盡量將菌 體懸浮)；36y 1 1M(10X)LiAc; 25y 1單鏈擔體DNA(2. 0mg/ml)50p l水和質(zhì)粒DNA(O. l 10ng)(—般情況下，質(zhì)粒加入10 40ui即可)；
(11) 渦旋振蕩E卯endorf管lmin，直到細胞完全混勻，3(TC水浴30min;
(12) 42。C水浴中熱激20 25min;
(13) 5000rpm離心l 2min，用微量移液器除去轉(zhuǎn)化混合液；
(14) 吸取0.2 1.0ml無菌水加到每個反應(yīng)管中，用移液器輕輕抽提以懸浮沉淀；
(15) 取50ul轉(zhuǎn)化液，均勻涂布在含卡那霉素抗性的培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)2 4d。用 未轉(zhuǎn)化的酵母做對照。
2.3酵母重組子的鑒定 2. 3. 1菌落PCR鑒定初篩
(1) 平板上的菌落長到肉眼可見時。
(2) 將除了模板以外的其他PCR反應(yīng)液組分準備好，并分裝。
(3) 用一根滅菌牙簽挑取菌落，在PCR管中測一下，放入一個滅菌的1.5ml離心管，對PCR管和1.5ml離心管編號。
(4) PC財廣增，0.8%瓊脂糖凝膠電泳。對PC財廣增顯現(xiàn)特異性條帶的克隆，置于1.5ml 離心管中的半截牙簽扔到5mlYPD培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)，24±1小時提取DNA,用DNA作為
模板再進行PCR進一步確定。
PCR反應(yīng)體系及條件如下
10XPCR buffer 2 y 1
MgCl2(25mmol/L) 1.5yl
dNTP(each 250 y mol/L) 0. 2 y 1 P0 (4 y mol/L) 1
PI (4umol/L) lul
菌液 1 y 1
rTaq (TaKaRa) 0.2 y 1
無菌水 13. 1 y 1
PCR反應(yīng)條件為
94°C 5rain; 94°C 30sec， 60°C 30sec， 72°C 2min，35個循環(huán);最后72。C延伸7min。 2. 3. 2酵母總DNA為模板進行二次鑒定 酵母基因組的提取
(1) 接種重組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子于5ml MD培養(yǎng)基，菌于YPD培養(yǎng)基作對照，3CTC，培養(yǎng) 16-18小時。
(2) 室溫下，1500g離心5-10min收集菌體。
(3) 100uL TE( pH7.0)重懸后1500g離心5-10min收集菌體。
(4) 用2ml的SCED卿.5)重懸。
(5) 加入l 3mg蝸牛酶，37°C， 50min。
(6) 加入2ml 1% SDS，輕搖混勻，然后置于冰上5min。
(7) 加入1.5ml 5M醋酸鉀，輕輕混勻。
(8) 10000g離心5-10min，棄上清。
(9 )加入2倍體積無水乙醇，室溫放置15min。 (10 ) 10000g離心20min，棄上清。 (1 1)加入0.7mlTE緩沖液。 (12 )加入等體積的苯酚:氯仿(l:l V/V). (13 )加入1/2體積的7.5M醋酸銨溶液。 (14 )加入2倍體積的無水乙醇，-20匸放置1^。 (15 )10000g離心20min。 (16 )加入lml 75%乙醇漂洗沉淀一次。 (17 )干燥后，加入50ul的TE或H20溶解，-20。C備用。 PCR反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件同菌落PCR, PCR產(chǎn)物O. 8%瓊脂糖凝膠電泳分析。
實施例3、植物表達載體的構(gòu)建
3.1目的基因的獲得
引物設(shè)計及PCR反應(yīng)的體系和條件(1) 設(shè)計如下一對PCR擴增引物，引入植物表達載體pR0K2 (購自寶生物工程有限 公司)中所含有的兩個酶切位點Sacl和Xball。
Pll: 5'- CGAGCTATGTGGAGGCTAAAAATCGG - 3'
Sacl
P12: 5'- GCTCTAGACGTCTCCTACGGCACTTGCTTGCG - 3' Xball
(2) PCR反應(yīng)體系:
10XPCR buffer2u 1
MgCl2(25,ol/L)1. 5w 1
dNTP(each 250ymol/L)0. 2w 1
Pll(4ymol/L)ly 1
P12(4y mol/L)lu 1
重組質(zhì)粒pMD18T-^57lii 1
rT叫0. 2m 1
無菌水13. 1
(3) PCR反應(yīng)條件為
94°C 5min; 94°C 30sec, 60°C 30sec, 72°C 2min，35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。 PCR產(chǎn)物電泳回收后用于后面的反應(yīng)。 3.2表達載體的構(gòu)建
將帶有Sacl， Xball酶切位點的cDNA與質(zhì)粒分別進行Sacl和Xball的雙酶切，再 按照5:1的比例在T4連接酶的催化下進行過夜連接。反應(yīng)體系及條件如下
(1) 酶切反應(yīng)體系和條件
cDNA /Sacl+Xball 6u 1
Sacl 1 u 1
10 X Buffer 2 u 1
ddH20 1 " 1 上表體系30 °C lh，下表體系37°C lh
原反應(yīng)液 10 Pi
Xball 1 u 1
0. 1%BSA 2 u 1
0. l%TritonX-100 2y 1
10 X Buffer 2w 1
ddH20 3 y 1
(2) 質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系和條件
pR0K2質(zhì)粒 6 y 1
Sacl 1 y 1
10 X k Buffer 2w 1
ddH20 1 u 1 上表體系30 °C lh，下表體系37°C lh
原反應(yīng)液 lOplXball
0. 1%BSA 2 ii 1
0. l%TritonX-100 2 1
10 X H Buffer 2u 1
ddH20 3 u 1
連接反應(yīng)用T4 DNA Ligase進行，體系和條件同pMD18-T的連接體系和條件。用連 接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從卡那霉素抗性的菌落中篩選出重組子，提取陽性克隆pR0K-AS7 的質(zhì)粒進行PCR鑒定和雙酶切鑒定，反應(yīng)體系和條件同鑒定重組子。
3. 3測序
將含有重組質(zhì)粒的陽性菌株送上海博亞生物技術(shù)有限公司測序，得到的測序結(jié)果經(jīng)過 NCBIblast分析，陽性質(zhì)粒中確實含有麻花艽P-amyrin合成酶基因foA57的cDNA序列。至 此得到了重組表達載體，即含基因fo力57的植物表達載體pR0K-^57。
實施例4、基因槍轉(zhuǎn)化麻花艽e-amyrin合成酶基因6^AS7
4. 1基因槍轉(zhuǎn)化方法
轉(zhuǎn)化使用繼代兩周的麻花艽胚性愈傷組織。在微彈轟擊之前轉(zhuǎn)至含有滲透劑的MS繼 代培養(yǎng)基上于黑暗、26。C保溫4h進行高滲處理。滲透劑為甘露醇，濃度采用0.4鵬1/L。將 2mg金粒(直徑lum)、質(zhì)粒DNA各2. 5 u 1 (lyg/ul) 、 25 y 1亞精胺(0. lmol/L)和 50ylCaC12 (215mol/L)混合，渦旋或超聲波處理多次使之均勻，10000r/min離心5s后去 上清，沉淀用250ixl乙醇洗滌并重新懸浮于240n 1乙醇溶液。將包被有DNA的金粒懸浮 液涂于微彈承載片，每片涂3. 5u 1 ，放置幾分鐘干燥后用于基因槍轟擊；每次涂液前將懸 浮液旋渦處理使之均勻。每次轟擊的微彈量約2912y g。基因槍型號為PDS1000PHe (BioRad)，氣壓采用1100psi。 4. 2培養(yǎng)選擇和再生體系
轟擊后16h將胚性愈傷組織塊從高滲培養(yǎng)基移至含600mg/mlKan的IB繼代培養(yǎng)基上進 行篩選，將褐色和黑色愈傷去掉，最終獲得綠色再生植株。 4. 3 CTAB法提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA
(1) 稱取O. 5G的剪股穎葉子，剪碎后用液氮研磨，迅速將粉末轉(zhuǎn)移至l. 5ml離心管中， 然后加入700u l預(yù)熱至65。C的2xCTAB提取緩沖液及0. 1%的疏基乙醇，輕輕顛倒離心管混 勻，然后置于65'C水浴保溫2h，不時顛倒混勻。
(2) 混合物冷卻至室溫后加入等體積的酚氛仿異戊醇(25:24:1), 4'C下10000g離 心10min。
(3) 將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇(24:1), 4"C下10000g 離心10min。
(4) 將水相轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入兩倍體積無水乙醇，溫和混勻，-20卩放置 30min沉淀DNA。
(5) 4。C下10000g離心10min，棄去液體，并用70%乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加 入100閃含無DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37。C水浴30min
(6) 加入200yl無水乙醇，溫和混勻，-2(TC放置30min沉淀DNA. 4'C下10000g離心 10min，棄去液體，并用70%乙醇洗滌兩次，室溫干燥DNA后，加入40n 1無菌水溶解DNA, 4'C保存待用。
4. 4 PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株
以CTAB法提取的DNA為模板，PCR法擴增以35S啟動子片段。 35S片段啟動子引物序列 35SS:5， -GCAGAGGCATCTTCAACG-3' 35SA:5' -GACGATCTACCCGAGCAA—3'
(1) PCR反應(yīng)體系
10XPCR buffer 1
MgCl2(25mmol/L) 1.5pl
dNTP(each 250 n mol/L) 0. 2 y 1
35SS(4umol/L) lul
35SA(4iimol/L) 1 U 1
DNA模板 1 u 1
rTaq (TaKaRa) 0. 2 n 1
無菌水 13. lyl
(2) PCR反應(yīng)程序
94。C 5min; 94°C 30sec， 53°C 30sec， 72°C 2min, 35個循環(huán);最后72。C延伸7rain。 反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液于O. 8y。TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。
實施例5、轉(zhuǎn)化后陽性再生植株齊墩果酸測定
轉(zhuǎn)化后篩選得到的陽性植株經(jīng)液氮研磨后加入10ml氯仿，超聲40rain后離心去上清。 最后將上清液進行HPLC測定齊墩果酸含量。
結(jié)果證實本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植株比非轉(zhuǎn)基因植株的齊墩果酸含量提高1倍以上。
注上述實驗中用到的試劑等購自TAKARA、 Promega、 Sigma、 Invitrogen等公司。 實驗中用到的LB培養(yǎng)基配方(均為重量比)0.5%酵母粉、l%NaCl、 1%蛋白胨。 其它試劑配方見《分子克隆》第三版。序列表
<110〉山東大學
<120〉麻花艽f3-amyrin合成酶基因G"S7及其應(yīng)用
〈141〉2009-1-18
<160> 3
<210>1
〈211〉2278
〈212〉c畫
<213>麻花艽
<221>麻花艽e -amyrin合成酶基因Oy^S7
〈222〉 (1)…(2278)
〈400〉1
atgtgg郷ctgaaggtggtatctctacag60
tatgtcgg33gacagatatggaatcgctgagg咖ggg犯120
g鄉(xiāng)ttgaagaagctcgccgcaatttctgg朋c犯ccgccgccatgtt犯gcccsgcagt180
gatatcctttggcgcttgcagtttttgcgttc犯gC3gagcataccagca240
gtg鄉(xiāng)g化g3Cg3tggCC3C3CCa犯tggccaccactgctttElCgC3ga300
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tgtgggctttcgcaagc33gtgccgtag2278
〈210〉2
〈211>3389
<212〉腿
<213〉人工序列
〈221〉酵母表達載體pPICZA-GW
〈222〉 (1) (3389)
<400〉2
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gtccattctcgccaaacgcaa^gg郷ggagcagaccgt120
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tgattttctggtgcgtaccgggttg卿3gcggtgtaagtg犯ctgcagttgccatgttt1920
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g犯gcg犯犯3CCgCCggCgaggacctggca333caggtcagcgaggcca3720
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gc朋g肌朋cgtcccgttgccaggtcctgatcgscg鄉(xiāng)aaatcgtcgtgctgtttgctg4260
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ggatgttcgactatttcagctxgcaccgggagccgtacccgCtC33gCtgg3朋ccttcc4380
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cctgcgaagagttgcgaggcagcggcctggtggaacacgcctgggtc犯tgatgacctgg4500
tgcattgcaacttgtggggtcagttccggctgggggttC3gC3gCCElgCg4560
ctttactggcatttcaggaaC犯gCgggC3ctgctcgacgcacttgcttcgctcagtatc4620
gctcgggscgcacggcgcgctctacgaactgCCg3t犯3Caattgacaat4680
tgtgattaaggctcagattcgacggcttggagcggccgacgtgcaggatttccgcgagat4740
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g333犯gCCC3tgg郷Cgttcgctga^cggttgcg卿tgccgtggcattcggcgccta4860
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cgctgtgcagccgctgatggtcgtgttcatctctgccgctctgctaggtagcccgatacg5220
attgatggcggtcctgggggctatttgcgg朋ctgcgggcgtggcgctgttggtgttgac5280
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tatattgtggttgacgcttacggacgtttt6180
taatgtactggggtggtttttcttttcaccagtg卿cgggc犯c兆ctgattgcccttc6240
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actgtcggcagaggcatcttcaacgatggcctttcctttatcgcaatgatggcatttgta7320
ggagccaccttccttttccactatcttcaccagatagctgggcaatgg犯7380
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tg解actgt3tctttgatatttttggagtag3C鄉(xiāng)tgtgtcgtgctccaccatgttgac7500
gaagattttcttcttgtcattgagtcgtaagagactctgtatgaeictgttcgccagtctt7560
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gggaactacctttttagaigELctccaatctctattacttgccttggtttgtgaagcaagcc7680
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權(quán)利要求
1、一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1，其特征在于所述基因cDNA序列如SEQID No.1所示。
2、 一種含有權(quán)利要求1所述基因foAS7的酵母表達載體pPICZA-(757，其特征在于所 述載體克隆區(qū)域核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3、 一種含有權(quán)利要求1所述基因foAS7的植物表達載體pR0K-AS7，其特征在于所述 植物表達載體核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。
4、 權(quán)利要求1所述麻花艽e-amyrin合成酶基因feAS7在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求3所述植物表達載體pROKII在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及含所述基因GsAS1的酵母和植物表達載體，同時還公開了所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS1及含所述基因GsAS1的植物表達載體在制備齊墩果酸中的應(yīng)用。本發(fā)明為提高目標產(chǎn)物齊墩果酸含量提供了理論依據(jù)和實踐基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/52GK101475945SQ20091001389
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者劉艷玲, 向鳳寧 申請人:山東大學