專利名稱：一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物冶金技術領域，特別涉及一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法。
背景技術：
目前，細菌胞外聚合層提取方法有物理提取法和化學提取法兩類。物理提取法主要是利 用各種外力來增強細菌胞外聚合層中各成分在溶液中的溶解度，常用的有超聲波法、離心法、 熱處理提取法等。但是由于細菌胞外聚合層與細胞壁結合得很緊密，因而物理提取法的提取 含量很低。化學提取法主要是利用試劑使細菌胞外聚合層的大分子成為水溶性成分而被提取 出來，常用的有NaOH提取法、戊二醛提取法、陽離子交換樹脂法、H2S04提取法等。但其 中NaOH提取法和戊二醛提取法雖可以提高產率，卻會造成較多細胞死亡，使胞內物質'外流 導致提取物有雜質；陽離子交換樹脂法費用較高；而H2S04提取法提取含量較低。此外，上 述方法對氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌的胞外聚合層的提取效果也不明 顯。

發(fā)明內容
針對以上技術問題，本發(fā)明提供一種提取細胞外聚合層中多糖的方法。
本發(fā)明包括以下步驟
1、 細菌培養(yǎng)在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按
菌種液體積占菌種液和培養(yǎng)基總體積的5~20%，采用硫酸調節(jié)pH值為1.0 3.0，在控溫30~60 'C和轉速100 240卬m的條件下，培養(yǎng)l 24h，至菌液電位為400 700 mV時，獲得培養(yǎng)菌k。
2、 提取方法將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為1500~12500rpm的條件下離心 5 30min，收集沉淀，在沉淀中加入重量濃度為1~20%的EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)溶液， 加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培養(yǎng)菌液EDTA-1 : 0.2 5，搖勻后在轉數(shù)為 1500~12500rpm的條件下離心5 30min;獲得的上清液用孔徑為0.01~10.00pm的微孔濾膜過 濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
提取的多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定。取多糖粗提液 0.25~2.00mL，先加入濃度為98wt。/o的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻后 1 2min顯色穩(wěn)定，測得在波長488 492nm處有最大吸收峰，說明提取物是多糖類物質，并可 根據(jù)測得的吸光值計算多糖含量。
本發(fā)明中的細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌其中的一種或者幾 種的混合菌，當為混合菌時混合比例為任意比例。本發(fā)明中采用的培養(yǎng)基為Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養(yǎng)基中任意一種 均可。
本發(fā)明中步驟(1)獲得的培養(yǎng)菌液為細菌生長進入對數(shù)期后的培養(yǎng)菌液。 本發(fā)明的提取方法選用物理與化學相結合的提取方式，由離心分離、提取劑浸提和微孔
濾膜過濾協(xié)同作用，排除了培養(yǎng)基、緩沖液和菌體的干擾；提取出的多糖可用于細菌胞外聚
合層糖類成分的鑒定、細菌浸礦過程中代謝物的測定和細菌浸礦機理的研究等。本發(fā)明提取
方法具有使用試劑簡單、操作簡便、流程簡易等特點。


圖1是本發(fā)明的細菌胞外聚合層中多糖的提取流程圖。
具體實施例方式
本發(fā)明實'施例中采用的細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌的混合 菌，可購于國家菌種保藏中心。
本發(fā)明實施例中采用Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養(yǎng)基中的一種。 本發(fā)明實施例中采用的恒溫振蕩培養(yǎng)箱為HZQ-QX型。 本發(fā)明實施例中采用的微孔濾膜為市購水溶性微孔濾膜。
本發(fā)明實施例中采用的苯酚、濃硫酸和EDTA為分析純試劑，分別與去離子水配制成溶液。
本發(fā)明實施例中采用的離心機為臺式高速TG16-WS型。 本發(fā)明實施例中測量pH值和電位的設備為PHS-2F型。 本發(fā)明實'施例中采用的紫外可見分光光度計為TU-1901型。 本發(fā)明實施例中調節(jié)pH值的硫酸為硫酸與同體積水混合制備成的硫酸溶液。 實施例1
在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的10%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0-3.0，在控溫44'C 和轉速l卯rpm的條件下，培養(yǎng)18h，至菌液電位為600mV時，獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心10min，收集沉淀， 在沉淀中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培 養(yǎng)菌液EDTA=1 : 0.2，搖勻后在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液 用孔徑為0.45;im的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/o苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.194 mg/mL。 實施例2
在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的10%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0 3.0,在控溫44'C 和轉速190rpm的條件下，培養(yǎng)18h;然后加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積占菌液體積的0.125%，繼續(xù)培養(yǎng)24h，至菌液電位為680mV時，獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心10tnin，收集沉淀， 在沉淀中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培 養(yǎng)菌液EDTA=1 : 0.5，搖勻后在轉數(shù)為12500ipm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液 用孔徑為0.45nm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5n/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在波 長488 492nra處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.182 mg/mL。 實施例3
在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的20%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0 3.0，在控溫44'C 和轉速190rpm的條件下，培養(yǎng)12h;然后加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積占菌液體積的0.25%，繼續(xù)培養(yǎng)24h，至菌液電位為650mV時，獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心5min，收集沉淀，在 沉淀中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培養(yǎng) 菌液EDTA=1 : 1，搖勻后在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心15min;獲得的上清液用孔 徑為0.45pm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.192mg/mL。 實施例4在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的5%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0 3.0，在控溫44。C 和轉速170rpm的條件下，培養(yǎng)24h;然后加入濃度為3N的三價砷離子溶液，加入量按三價砷 離子溶液體積占菌液體積的0.375%，繼續(xù)培養(yǎng)24h，至菌液電位為630mV時，獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為10000rpm的條件下常溫離心15min，收集沉淀， 在沉淀中加入重量濃度為3%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培 養(yǎng)菌液EDTA=1 : 2,搖勻后在轉數(shù)為10000rpm的條件下常溫離心20min;獲得的上清液用 孔徑為0.45pm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液1.0mL，先加入濃度 為98wt。/。的濃硫酸5.0mL，再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在波 長488 492nm處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含量 為0.161 mg/mL。 實施例5
在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的5%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0 3.0，在控溫30'C 和轉速100卬m的條件下，培養(yǎng)24h，至菌液電位為400mV時，.獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為1500rpm的條件下常溫離心30min，收集沉淀，在 沉淀中加入重量濃度為20%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培養(yǎng) 菌液EDTA=1 : 4，搖勻后在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心5min;獲得的上清液用孔 徑為10.00nm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。'
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液0.25mL，先加入濃 度為98wtW的濃硫酸5.0mL，再加入5n/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在 波長488 492nm處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含 量為0.096 mg/mL。 實施例6
在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌 種液和培養(yǎng)基總體積的20%，采用體積比為l : l的硫酸溶液調節(jié)pH值為1.0 3.0，在控溫6(TC 和轉速240rpm的條件下，培養(yǎng)2h，至菌液電位為500 mV時，獲得培養(yǎng)菌液。
將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為12500rpm的條件下常溫離心5min，收集沉淀'，在 沉淀中加入重量濃度為1%的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培養(yǎng)菌液EDTA-1 : 5，搖勻后在轉數(shù)為1500rpm的條件下常溫離心30min;獲得的上清液用孔 徑為O.Olpm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可見分光光度計測定多糖取多糖粗提液2.00mL，先加入濃 度為98wtn/。的濃硫酸5.0mL,再加入5。/。苯酚溶液1.0mL，混合均勻l 2min后顯色穩(wěn)定，測得在 波長488 492nm處有最大吸收峰，根據(jù)測得的吸光值計算出細菌菌液中胞外聚合層中多糖含 量為0.113 mg/mL。
權利要求
1、一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特征在于按以下步驟進行(1)在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，接種量按菌種液體積占菌種液和培養(yǎng)基總體積的5～20％，調節(jié)pH值為1.0～3.0，在控溫30～60℃和轉速100～240rpm的條件下，培養(yǎng)1～24h，至菌液電位為400～700mV時，獲得培養(yǎng)菌液；(2)將培養(yǎng)菌液置于離心管中，在轉數(shù)為1500～12500rpm的條件下離心5～30min，收集沉淀，在沉淀中加入重量濃度為1～20％的EDTA溶液，加入量按培養(yǎng)菌液與EDTA溶液的體積比為培養(yǎng)菌液∶EDTA＝1∶0.2～5，搖勻后在轉數(shù)為1500～12500rpm的條件下離心5～30min；獲得的上清液用孔徑為0.01～10.00μm的微孔濾膜過濾，過濾后獲得的濾液為細菌胞外聚合層中多糖粗提液。
2、 根據(jù)權利要求1所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特征在于所述的 細菌為氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵微螺菌其中的一種或者幾種的混合菌，當 為混合菌時混合比例為任意比例。
3、 根據(jù)權利要求1所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特征在于所述的 培養(yǎng)基為Leathen、 9K、 Wakesman、 ONM或Clomer培養(yǎng)基中的一種。
4、 根據(jù)權利要求l所述的一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，其特征在于調節(jié)pH 值時采用硫酸。
全文摘要
一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法，屬于生物冶金技術領域，該方法按以下步驟進行(1)將細菌接種到培養(yǎng)基中并用搖瓶培養(yǎng)，調節(jié)pH值，加熱振蕩培養(yǎng)1～24h，菌液電位為400～700mV時，獲得培養(yǎng)菌液；(2)將培養(yǎng)菌液離心5～30min，收集沉淀，加入EDTA溶液，離心5～30min；獲得的上清液用微孔濾膜過濾，獲得細菌胞外聚合層中多糖粗提液。本發(fā)明的方法排除了培養(yǎng)基、緩沖液和菌體的干擾；具有使用試劑簡單、操作簡便、流程簡易等特點。
文檔編號C12P19/00GK101481716SQ200910010238
公開日2009年7月15日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權日2009年1月21日
發(fā)明者瑤 富, 楊洪英 申請人:東北大學