專利名稱：非常小的胚胎樣(vsel)干細(xì)胞的應(yīng)用和分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
當(dāng)前披露的主題總體上涉及從骨髓、臍帶血、和/或其它來源分離的干細(xì)胞(在本 文中被稱為非常小的胚胎樣(very small embryonic-like) (VSEL)干細(xì)胞)群的鑒定、分 離及應(yīng)用。更具體地，當(dāng)前披露的主題涉及分離所述VSEL干細(xì)胞并且(任選地在體外處理 后)將其用于治療需要其的受試者中的組織和/或器官損傷。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞和干細(xì)胞衍生物的應(yīng)用已經(jīng)在醫(yī)藥研究中，尤其在提供用于治療由于遺傳 缺陷、創(chuàng)傷、和/或疾病過程的任何一個造成的組織損傷的試劑領(lǐng)域中獲得提高的興趣。理 想地，能夠分化為受影響的細(xì)胞類型的細(xì)胞可以被移植入需要其的受試者中，其中它們將 與器官微環(huán)境相互作用并供應(yīng)必須的細(xì)胞類型以修復(fù)損傷。已經(jīng)付出了相當(dāng)多的努力以從大量不同的組織中分離干細(xì)胞用在再生醫(yī)藥中。例 如，授予Tsukamoto et al.的美國專利No. 5，750，397披露了據(jù)報道能夠分化為淋巴細(xì)胞、 紅細(xì)胞(erythroid)、和髓細(xì)胞單核細(xì)胞(myelomonocytic)譜系的人類造血干細(xì)胞的分離 和生長。授予Bruder etal.的美國專利No. 5，736，396披露了用于在合適的生長和/或分 化因子的影響下分離的人類間充質(zhì)干細(xì)胞的譜系定向分化的方法。隨后可以將所述得到的 細(xì)胞引入宿主用于間充質(zhì)組織再生或修復(fù)。強烈感興趣的一個領(lǐng)域涉及胚胎干(ES)細(xì)胞的應(yīng)用，其已經(jīng)在小鼠中顯示具有 分化為動物的所有不同的細(xì)胞類型的潛能。小鼠ES細(xì)胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的內(nèi) 細(xì)胞群的細(xì)胞，并且其它多能和/或全能細(xì)胞已經(jīng)從胚(germinal)組織(如原始生殖細(xì) 胞；PGC)分離。這些多能和/或全能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)在體外增殖、保持10正常核型、 以及保持分化為全部的三個胚層(內(nèi)胚層、中胚層及外胚層)的衍生物的潛能的能力使得 這些細(xì)胞作為細(xì)胞的潛在來源用在出生后受試者的再生治療中是有吸引力的。人類ES(hES)細(xì)胞的開發(fā)還不及對小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)展成功。Thomson et al.報道了來自低等靈長類(美國專利 No. 5,843,780 ;Thomson etal. (1995)92 Proc Natl Acad Sci U S A7844-7848)、以及來自人類(Thomson et al. (1998)282 Science 1145-1147)的多能干細(xì)胞。Gearhart etal.產(chǎn)生了來自胎兒性腺組織的人類胚胎生殖 (hEG)細(xì)胞系(Shamblott etal. (1998)95 Proc Natl Acad Sci U S A 13726-13731 ；及美 國專利No. 6，090, 622)。hES和hEG細(xì)胞均具有多能干細(xì)胞的理想特征，在于它們能夠在體 外增殖而不分化，它們通常維持正常的核型，并且它們?nèi)匀荒軌蚍只癁槎喾N不同的細(xì)胞類型。無性(clonally)來源的人類胚胎干細(xì)胞系在培養(yǎng)中長期維持多能性和增殖潛能(Amit et al. (2000)227Dev Biol271_278)。ES細(xì)胞或其它多能細(xì)胞用于受試者中再生治療的一個重大挑戰(zhàn)是控制細(xì)胞生長 和分化為受試者治療所需的特定細(xì)胞類型。已有許多生長因子對ES細(xì)胞分化的影響的報 道。例如，Schuldiner et al.報道了八種生長因子對細(xì)胞從hES細(xì)胞分化為不同細(xì)胞類 型的影響(參見 Schuldiner et al. (2000)97 Proc Natl Acad Sci U S A 11307-11312)。 如其中所披露的，在開始通過胚狀體樣(embryoid body-like)形成的分化后，在bFGF、 TGFPI、活化素-A、BMP-4、HGF、EGF、PNGF、或視黃酸的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。每種生長因子對分 化途徑具有獨特的影響，但是沒有生長因子排他地指導(dǎo)分化為一種細(xì)胞類型。理想地，能夠從受試者分離和純化干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞是有益的，所述細(xì)胞能 夠在被再引入受試者用于治療目的之前被純化和/或體外處理。受試者的自身細(xì)胞的應(yīng)用 將消除采用輔助免疫抑制治療的需要，由此維持受試者免疫系統(tǒng)的能力。然而，用于分離ES 細(xì)胞系，尤其是hES細(xì)胞系的目前的策略排除了從受試者分離細(xì)胞并將它們再引入相同的 受試者。因此，對于來自成年動物的其它干細(xì)胞類型的研究在繼續(xù)。例如，間充質(zhì)干細(xì) 胞(MSC)是一種這樣的細(xì)胞類型。已經(jīng)顯示MSC具有分化為包括骨(Haynesworth et al. (1992) 13 Bone 81-88)、軟骨(Mackay et al. (1998)4 Tissue Eng 415-28 ；Yoo et al. (1998)80 J Bone Joint Surg Aml745_57)、脂肪組織(Pittenger et al. (2000)251 Curr Top Microbiol Immunol-11)、腱(Young et al. (1998) 16 J Orthop Res 406—13)、肌 肉及基質(zhì)(Caplanet al. (2001)7 Trends Mol Med 259-64)的多個譜系的潛能。另一細(xì)胞群，多能成年祖細(xì)胞(MAPC)也已經(jīng)從骨髓純化(BM ；Reyeset al. (2001)98 Blood 25 261 5-2625 ；Reyes & Vetfaillie(2001)938 Ann NYAcad Sci 231-235)。這些細(xì)胞已經(jīng)顯示能夠在體外擴展為超過100次的群體倍增(lOOpopulation doubling)而沒有端?？s短或核型異常的發(fā)生。已經(jīng)顯示MAPC在限定的培養(yǎng)條件下能夠分 化為各種間充質(zhì)細(xì)胞30類型(如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼成肌細(xì)胞)、內(nèi)皮、 神經(jīng)外胚層細(xì)胞、以及更最近的，分化為肝細(xì)胞(Schwartz et al. (2000) 109 J ClinInvest 1291-1302)。此外，已報道造血干細(xì)胞(HSC)能夠分化為多種細(xì)胞類型。已報道BM造血干細(xì) 胞能夠“轉(zhuǎn)分化(transdifferentiate) ” 為表達(dá)早期心(Orlicet al. (2003)7 Pediatr Transplant 86-88 ；Makino et al. (1999) 103 J ClinInvest 697-705)、骨骼肌(Labarge & Blau(2002)111 Cell 589-601 ；Corti etal. (2002)277 Exp Cell Res 74-85)、神 經(jīng)(Sanchez-Ramos(2002)69Neurosci Res 880—893)、肝(Petersen et al. (1999)284 Science 1168-1170)、或胰腺細(xì)胞(lanus et al. (2003) 111 J Clin Invest 843-850 ；Lee & Stoffel (2003) 111 J Clin Invest 799-801)標(biāo)記物的細(xì)胞。在人類體內(nèi)實驗中還表明 CD34+外周血(PB)干細(xì)胞的移植導(dǎo)致供體-來源的肝細(xì)胞(Korbling etal. (2002)346 N Engl J Med 738-746)、上皮細(xì)胞(Korbling et al. (2002) 346N Engl J Med 738-746)、和 神經(jīng)元(Hao et al. (2003) 12 J Hematother StemCell Res 23-32)的出現(xiàn)。此外，已顯示 人類BM-來源的細(xì)胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm et al. (2003)361 Lancet 45-46)。這些報道已經(jīng)被解釋為成年干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化或可塑性現(xiàn)象存在的證據(jù)。然而，成年組織特異性干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的概念目前在科學(xué)和醫(yī)藥界內(nèi)是廣泛爭議的主題(參 見，如，Lemischka (2002) 30 Exp Hematol 848-852 ；Holden & Vogel (2002) 296 Science 2126-2129)。試圖再生的研究結(jié)果表明借助神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是不成功的(Castro et al. (2002)297 Sciencel299)。還顯示肌肉組織中發(fā)現(xiàn)的造血干/祖細(xì)胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al. (2002)99 Proc Natl Acad Sci U S A 1341-1346 ；Geiger et al. 100 Blood 721-723 ；Kawada & Ogawa(2001)98 Blood2008_2013)。此外，借助涉 及單獨的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合動物的研究表明循環(huán)HPSC和/或它們的子代 的轉(zhuǎn)分化和/或可塑性(如果其確定存在)是極稀有的事件(Wagers et al. (2002)297 Science2256-2259)。因此，持續(xù)存在產(chǎn)生適于多種應(yīng)用(包括但不限于治療多個器官和/或組織的損 傷和/或疾病)的可移植細(xì)胞群的新方法的需要。發(fā)明概述本概述部分列出了當(dāng)前披露的主題的幾個實施方式，并且在許多情況下列出了這 些實施方式的變體和改變。本概述部分僅是許多和改變的實施方式的示例。提及的給定實 施方式的一個或更多個代表性特征同樣是示例性的。這樣的實施方式通常可以伴隨或不伴 隨提及的特征而存在；同樣地，那些特征可以應(yīng)用到當(dāng)前披露的主題的其它實施方式，不管 在本概述部分中是否列出。為了避免過多重復(fù)，本概述部分沒有列出或建議這樣的特征的 所有可能組合。當(dāng)前披露的主題提供了用于從非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞或其衍生物的群體 形成胚狀體樣球體的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或 其衍生物的CD45_細(xì)胞群；以及(b)在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形 成的一個或更多個因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞或其衍生物達(dá)足以使胚狀體樣球體形 成的時間。在一些實施方式中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物包含⑶34+/lin_/⑶45_或Sca-I+/ IirT/⑶45_非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。在一些實施方式中，VSEL干細(xì)胞的直徑約為 3-4 μ m，表達(dá)SSEA-I、0ct-4、Rev-l、和Nanog的至少一種，具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的大細(xì) 胞核，并且具有開放型染色質(zhì)(常染色質(zhì))。在一些實施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生 物的CD45_細(xì)胞群從人或從小鼠分離。在一些實施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的 CD45—細(xì)胞群從人或小鼠中選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來源分離。在一些實施 方式中，誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個或更多個生長因子包括 表皮生長因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長因子-2及其組合。在一些實施方式中，通過將VSEL 干細(xì)胞或其衍生物與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)將所述一個或更多個因子提供給VSEL干細(xì)胞或其 衍生物。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括通過下述方法分離包含VSEL干 細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群，所述方法包括下述步驟(a)提供懷疑包含CD45_干細(xì)胞 的初始細(xì)胞群；(b)將所述初始細(xì)胞群與對于CD45特異的第一抗體和對于CD34或Sca-I 特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在初始細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo) (如果存在)結(jié)合；(c)選擇為⑶34+或Sca-Γ、并且⑶45_的細(xì)胞的第一亞群；(d)將所述 細(xì)胞的第一亞群與對于一個或更多個細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個或更多個抗體接觸，接觸 條件足以允許每個抗體與其在細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合，所述標(biāo)記物選自 CD45R/B220、Gr-l、TCRa β、TCR γ δ、CDllb 及 Ter-119 ； (e)從所述細(xì)胞的第一亞群 去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細(xì)胞；以及(f)收集為0034+/1^/^045_或 Sca-r/lirT/⑶45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細(xì)胞的亞群。在一些實施方式中， 每個抗體包含可檢測的標(biāo)記。在一些實施方式中，所述可檢測的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記或者可 以通過包含熒光標(biāo)記的試劑被檢測的部分。在一些實施方式中，所述分離包括FACS分類 (sorting)。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為C-met+、C-kit+、和/或 LIF-R+的那些細(xì)胞。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離表達(dá)選自SSEA-1、 Oct-4、Rex-I及Nanog的一個或更多個基因的那些細(xì)胞。在一些實施方式中，細(xì)胞群包括 骨髓樣品、臍帶血樣品、或外周血樣品。在當(dāng)前披露的主題的一些實施方式中，在用足以將包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì) 胞從骨髓遷移到受試者的外周血的量的遷移劑處理受試者后，將所述細(xì)胞群從受試者的外 周血分離。在一些實施方式中，所述遷移劑包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4 拮抗劑的至少一種。在一些實施方式中，CXCR4拮抗劑是T140肽。在一些實施方式中，所 述受試者是小鼠。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括將干細(xì)胞的亞群與結(jié)合到CXCR4 的抗體接觸以及從干細(xì)胞的亞群分離為CXCR4+的那些細(xì)胞。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為CXCR4+和/或AC133+的那 些細(xì)胞。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括選擇為HLA-DR_、MHC I類_、⑶90_、 ⑶29_、⑶105—、或其組合的那些細(xì)胞。當(dāng)前披露的主題還提供了包含多個非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的胚狀體樣球 體。當(dāng)前披露的主題還提供了包含本文披露的胚狀體樣球體的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實 施方式中，本文披露的胚狀體樣球體在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體 形成的一個或更多個因子的培養(yǎng)基中提供。當(dāng)前披露的主題還提供了將非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞分化為感興趣的細(xì)胞 類型的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚 狀體樣球體；以及(b)在包含分化誘導(dǎo)量的一個或更多個因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球 體直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)感興趣的細(xì)胞類型，所述因子誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物分化為感 興趣的細(xì)胞類型。在一些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型是神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物。在 一些實施方式中，神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物選自少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 及神經(jīng)元。在一些實施方式中，所述神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl及01ig2的標(biāo)記物。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約10天。在 一些實施方式中，所述培養(yǎng)基包含約10ng/ml rhEGF、約20ng/ml FGF-2及約20ng/ml NGF0 在一些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物。在一些實施方式中， 所述培養(yǎng)包括在包含活化素A的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體；以及其后在包含N2補充 物-A、B27補充物及約IOmM煙酰胺的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體。在一些實施方式中， 在第一培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)約48小時。在一些實施方式中，在第二培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)至 少約12天。在一些實施方式中，內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自Nkx6. 1、Pdxl及C-肽的標(biāo)記物。在一些實施方式中，感興趣的細(xì)胞類型為心肌細(xì)胞或其衍生物。在一些實施方式 中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約15天。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)基包含堿性成纖維細(xì)胞生長 因子、血管內(nèi)皮生長因子及轉(zhuǎn)化生長因子Dl的組合，數(shù)量足以造成胚狀體樣球體細(xì)胞的亞 組分化為心肌細(xì)胞。在一些實施方式中，所述心肌細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自Nsx2. 5/Csx和 GATA-4的標(biāo)記物。在當(dāng)前披露的方法的一些實施方式中，所述胚狀體樣球體通過下述制備(a)提 供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_細(xì)胞群；以及(b)在包含一個或更多個誘導(dǎo)VSEL細(xì)胞的胚狀 體樣球體形成的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞足以使胚狀體樣球體出現(xiàn)的時間。當(dāng)前披露的主題還提供了包含在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中的本文披露的 分化的非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的制劑。在一些實施方式中，所述藥學(xué)上可接受的載 體或賦形劑用于人類中是可接受的。當(dāng)前披露的主題還提供了用于治療受試者中組織損傷的方法。在一些實施方式 中，所述方法包括給予受試者一種組合物，該組合物包含在藥學(xué)上可接受的載體中的多個 分離的⑶45_干細(xì)胞，所述⑶45_干細(xì)胞包含VSEL干細(xì)胞，數(shù)量和經(jīng)由的途徑足以允許 ⑶45_干細(xì)胞群的至少一部分移植入(engraft)所述組織并且在其中分化，由此治療損傷。 在一些實施方式中，所述損傷選自缺血性損傷、心肌梗塞及中風(fēng)。在一些實施方式中，受試 者為哺乳動物。在一些實施方式中，所述哺乳動物選自人類和小鼠。在一些實施方式中， 包含VSEL干細(xì)胞的分離的CD45_干細(xì)胞從選自骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的來源分 罔。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分化分離的⑶45—干細(xì)胞以在給 予受試者所述組合物之前產(chǎn)生預(yù)定的細(xì)胞類型。在一些實施方式中，所述預(yù)定的細(xì)胞類型 選自神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、心肌細(xì)胞及其衍生物。當(dāng)前披露的主題還提供了用于產(chǎn)生嵌合動物的方法。在一些實施方式中，所述方 法包括將一個或更多個包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群添加到胚胎，從而一個或更多個 CD45—干細(xì)胞發(fā)育為胚胎的一個或更多個細(xì)胞類型。在一些實施方式中，所述添加包括將一 個或更多個CD45—干細(xì)胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些實施方式中，所述添加包括聚 集(aggregating)包含VSEL干細(xì)胞的一個或更多個⑶45_干細(xì)胞與桑葚胚期胚胎。在一些 實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在加入一個或更多個包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干 細(xì)胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合動物。當(dāng)前披露的主題還提供了從0045_干細(xì)胞群純化非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞 中感興趣的細(xì)胞類型的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞 的⑶45_干細(xì)胞群；(b)鑒定表達(dá)VSEL干細(xì)胞的標(biāo)記物的⑶45_干細(xì)胞的亞群；以及(c)純 化所述亞群。在一些實施方式中，所述群和所述亞群除了為⑶45_外，均為⑶34+/CXCR4+/ IirT或Sca-l7lin_。在一些實施方式中，包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群從選自骨髓、外 周血、脾、臍帶血及其組合的來源分離。在一些實施方式中，感興趣的細(xì)胞類型選自骨骼肌 細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟 骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞及內(nèi)胚層細(xì)胞。 在一些實施方式中，所述標(biāo)記物選自GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5, MyoD,成肌蛋白(Myogenin)、Nsx2. 5/Csx、GATA-4,甲胎蛋白(α -Fetoprotein)、CK19、Nkx2-3.Tcf4.Nkx 6. l、Pdxl、VE-鈣粘蛋白、Krt 2-5,Krt 2_6a、BNC、DCT、TYR 及 TRP。在一 些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為心肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自Nkx2. 5/Csx、GATA-4、 MEF2C。在一些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為內(nèi)皮細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自VEGFR2、 VE-鈣粘蛋白、血管性血友病因子(von Willebrand factor)及TIE2。在一些實施方式中， 所述感興趣的細(xì)胞類型為骨骼肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自Myf5、MyoD及成肌蛋白。在一些實 施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為肝細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自甲胎蛋白和CK19。在一些實 施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為神經(jīng)細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自日111微管蛋白、01181、 01ig2、GFAP及巢蛋白。在一些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為胰腺細(xì)胞，所述標(biāo)記 物選自Nkx6. 1和Pdxl。在一些實施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類型為黑色素細(xì)胞，所述標(biāo) 記物選自DCT、TYR及TRP。當(dāng)前披露的主題還提供了用于鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑的方法。在一些實 施方式中，所述方法包括(a)從已知包含誘導(dǎo)劑的細(xì)胞制備包含多個cDNA克隆的cDNA文 庫；(b)用所述cDNA文庫轉(zhuǎn)化不包含所述誘導(dǎo)劑的多個細(xì)胞；(c)在足以造成VSEL干細(xì)胞 或其衍生物形成胚狀體樣球體的條件下，在轉(zhuǎn)化的多個細(xì)胞存在下，培養(yǎng)多個VSEL干細(xì)胞 或其衍生物；(d)分離包含所述誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；(e)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞回收cDNA克?。灰?及(f)鑒定由回收的cDNA克隆編碼的多肽，由此鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑。在一些 實施方式中，已知包括誘導(dǎo)劑的細(xì)胞為C2C12細(xì)胞。在一些實施方式中，多個cDNA克隆包 含位于克隆載體(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位點的至少一側(cè)的側(cè)翼的至少一個 引物結(jié)合位點。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括利用雜交到位于cDNA克隆 位點的兩側(cè)的側(cè)翼的引物位點的引物擴增轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的cDNA克隆。在一些實施方 式中，所述鑒定是通過對cDNA克隆的測序。當(dāng)前披露的主題還提供了從臍帶血或其部分分離包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì) 胞的亞群的方法。在一些實施方式中，所述方法包括(a)將臍帶血或其部分與對于⑶45 特異的第一抗體和對于CD34或Sca-I特異的第二抗體接觸，接觸條件足以允許每個抗體 與其在細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(b)選擇為CD34+或Sca-Γ、并且為 ⑶45-的細(xì)胞的第一亞群；(c)將細(xì)胞的第一亞群與對于選自⑶45R/B220、Gr-I、TCRa β、 TCRy δ、⑶lib及Ter-119的一個或更多個細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個或更多個抗體接 觸，接觸條件足以允許每個抗體與其在細(xì)胞群的每個細(xì)胞上的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合；(d) 從細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個的那些細(xì)胞；以及(e)收集為 CD34+/lin7CD45-或Sca-l+/lin7CD45-的細(xì)胞的第二亞群，由此分離包含VSEL干細(xì)胞的 CD45—干細(xì)胞的亞群。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在低滲溶液中孵育臍 帶血或其部分或所述任何亞群達(dá)到足以基本上裂解可能存在的所有紅細(xì)胞(erythocyte) 的時間。在一些實施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離對于CXCR4、C-met、C-kit、或 LIF-R的至少一種為陽性的那些細(xì)胞。因此，當(dāng)前披露的主題的一個目的是提供新的干細(xì)胞群，以及制備和應(yīng)用其的方 法。這個目的和其它目的全部或部分通過當(dāng)前披露的主題實現(xiàn)。當(dāng)前披露的主題的一個目的已經(jīng)在上面陳述，其他目的將隨著結(jié)合下述實施例和 附圖的說明的繼續(xù)而變得顯而易見。


圖IA 和 IB 描繪了 Sca-l+/lin7CD45-和 Sca-l+/lin7CD45+ 細(xì)胞的透射電子顯微 鏡(TEM)圖像。圖IA顯示Sca-r/lirT/⑶45_細(xì)胞較小并且測量的直徑為3-4μπι。它們具有由細(xì) 胞質(zhì)的窄緣圍繞的較大細(xì)胞核。在超微水平上，細(xì)胞質(zhì)的窄緣具有一些線粒體、分散的核糖 體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的小輪廓、以及一些囊泡。細(xì)胞核被包含在具有核孔的核膜內(nèi)。染色質(zhì)松散地壓 縮并由常染色質(zhì)構(gòu)成。圖IB顯示與之相反，Sca-Γ/lirT/⑶45+細(xì)胞表現(xiàn)為異源形態(tài)并且較 大。它們的平均測量直徑為8-10 μ m，并具有分散的染色質(zhì)和突出的核仁。圖2描繪了熒光顯微圖像，描繪了對Sca-l+/lin_/⑶45_細(xì)胞的表達(dá)研究的結(jié)果并 表明Sca-l+/lin7CD45_細(xì)胞是SSEA-Γ并表達(dá)0ct_4和Nanog。如左側(cè)所示，通過FACS分 離的Sca-l+/lin7CD45_細(xì)胞被評估SSEA-1、Oct-4及Nanog的表達(dá)。所有的圖像在Plan Apo 60XA/1. 40 油性物鏡(Nikon，Japan)下采集。右側(cè)示出了在 ADOBE PHOTOSHOP CS 軟件(Adobe System Incorporated, San Jose, California, United States ofAmerica)中 進(jìn)行的代表性細(xì)胞(箭頭)的IOx放大的圖像。陰性染色對照未示出。對從四個獨立類別 分離的細(xì)胞進(jìn)行染色。示出了代表性數(shù)據(jù)。圖3A-3C 描繪了對 Sca-l+/lin7CD45-的 CXCR4、c-met 和 LIF-R 的表達(dá)研究的結(jié)^ ο圖3A描繪了 RT-PCR產(chǎn)物在其上分離并用溴化乙錠染色的凝膠的圖像，并描繪了 Sca-l7lin7CD45"中對于 CXCR4 (泳道(lane) 1)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的 mRNA 的表達(dá)結(jié)果。RT-PCR進(jìn)行30個循環(huán)。陰性RT-PCR反應(yīng)(DNA代替cDNA 泳道2、4和6)。 示出了來自三個獨立的類別的代表性結(jié)果。圖3B描繪了通過FACS分離并通過免疫組織化 學(xué)染色評估CXCR4、c-Met和LIF-R的表達(dá)的Sca-r/lirT/⑶45_細(xì)胞的熒光顯微圖像(在 Plan Apo 60XA/1. 40油性物鏡(Nikon, Japan)下采集圖像)。未示出陰性染色對照。示出 了來自四個獨立的實驗的代表性結(jié)果。圖3C是描繪了通過包含SDF-I或不包含SDF-I (陰 性對照)的MATRIGEL⑧滴狀物的Sca-1+/1 in—/⑶45—細(xì)胞的化學(xué)引誘研究結(jié)果。示出了每 100 μ m的MATRIGEL, 滴狀物周長的化學(xué)引誘的Sca-l+/lin7CD45-細(xì)胞的數(shù)量。從三個獨 立的實驗收集數(shù)據(jù)。*與對照MATRIGEL 相比ρ < 0. 00001。圖4Α和4Β描繪了 FACS分類從不同年齡的動物分離的Sca-l+/lin7CD45_細(xì)胞的 結(jié)果。圖4A是從源自3周大(上側(cè))和1歲大的小鼠(下側(cè))的BMMNC分類的細(xì)胞的 FACS點圖。左側(cè)描繪了鼠BMMNC的點圖。作為Sca-Γ/Ιin_ (中側(cè))的來自淋巴門(lymphoid gate)的細(xì)胞通過對于CD45表達(dá)的FACS進(jìn)行分類(右側(cè))。進(jìn)行三個獨立的分類實驗(對 于每類8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性類別。圖4B是條形圖，描繪了在通過FACS 分離來自3周大和1歲大的小鼠的Sca-l7lin7⑶45_細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的 mRNA的表達(dá)，并通過相同數(shù)量的分類細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行四個獨立的分類實 驗(對于每類收集8只小鼠的BM)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)士 SD。*p<0.01vS.來自年老動物的細(xì) 胞。圖5是條形圖，描繪了來自具有相對長的生命期的小鼠品系(C57BL/6)的細(xì)胞數(shù) 量與具有相對短的生命期的小鼠品系(DBA/2J)的細(xì)胞數(shù)量的比較結(jié)果。所述圖示出了與C57BL/6小鼠相比，DBA/2J小鼠中Sca-l+/lin7CD45_細(xì)胞的數(shù)量減少。通過相同數(shù)量的分 類細(xì)胞之間的RQ-PCR比較通過FACS從三周大DBA/2J和C57BL/6小鼠分離的Sca-l+/lin7 ⑶45—細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)。進(jìn)行三個獨立的分類實驗(對于 每類6只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)士 SD。*p<0.01vs.來自年老DBA/2J小鼠的 細(xì)胞。圖6A和6B描繪了骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)的側(cè)群(SP)的分類。圖6A是描繪BMMNC的SP的FACS分類的點圖。圖6B是條形圖，描繪了通過FACS 從 3 周大的小鼠分離的 BMMNC、SP、SP Sca-l+/lin7CD45\ SP Sca-Γ/1 irT/CD45+、Sca-1+/ lin_/CD45_和Sca-Γ/1 in7CD45+細(xì)胞中的PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)，并通 過相同數(shù)量的分類細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行三個獨立的分類實驗(對于每類，8 只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)士 SD表示。*p<0.01vs.來自年老動物的細(xì)胞。圖7是四個點圖，描繪了細(xì)胞的多個亞群的移植結(jié)果和這些細(xì)胞對長期血細(xì)胞生 成的貢獻(xiàn)。Sca-r/lin7⑶45—細(xì)胞對長期血細(xì)胞生成沒有貢獻(xiàn)。Ly5. 2小鼠被移植以來自 Ly5. 1 小鼠的 IO4 個 Sca-l+/lin7CD45+或 2X104 個 Sca-l+/lin7CD45-細(xì)胞，并且與 IO6 個 BMMNC Ly5. 2細(xì)胞一起移植入Ly5. 2受體小鼠，在移植后8個月通過FACS評估Ly5. 1細(xì)胞 的存在。上側(cè)描繪了來自外周血的MNC的分析。下側(cè)描繪了來自骨髓的MNC的分析。示出 了代表性結(jié)果。圖8A和8B描繪了熒光顯微圖像，描繪了具有對于SSEA-I (圖8A ;4個圖板)或 0ct-4(圖8B)特異的抗體的Sca-l+/lin7CD45_BM細(xì)胞的ES樣球體的染色。圖9A和9B描繪了在C2C12細(xì)胞上的GFP+Sca-l+/lin7CD45-BM細(xì)胞的胚狀體樣球 體的形成。圖9A描繪了在實施例20所述的條件下，共培養(yǎng)SCa-l7lin7⑶45_BM細(xì)胞與 C2C12細(xì)胞后胚狀體(EB)-樣球體的顯微圖像。圖9B是描繪Sca-l+/lin7⑶45_細(xì)胞中綠 色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的熒光顯微圖像，表明這些胚狀體源自從綠色免疫熒光陽性(GFP+) 小鼠(購自 The JacksonLaboratory, Bar Harbor, Maine, United States of Americ 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) lOsb/J 小鼠)分離的純化 Sca-Γ/1 in7CD45TM 細(xì)胞，并且不是 C2C12細(xì)胞。圖10是從鼠淋巴結(jié)分離的碘化丙啶(propidium iodide)染色的細(xì)胞、HSC(造血 干細(xì)胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干細(xì)胞(Sca-l7lin_/CD45_)的一系列點圖。圖11A-11G是鼠骨髓細(xì)胞的FACS分析的系列點圖。圖IlA是低滲裂解后鼠骨髓MNC的點圖。圖IlB是示出了來自Rl門(R1 gate) 用于譜系標(biāo)記物表達(dá)和⑶45抗原的細(xì)胞的染色的點圖。在這個圖中，R2示出了譜系-和 CD45陰性BM MNC0分析來自Rl和R2的細(xì)胞的Sca-I的表達(dá)和HLA_DR(參見圖11C)、MHC I類(參見圖11D)、⑶29(參見圖11E)、⑶90(參見圖11F)及⑶105 (參見圖11G)抗原的
共表達(dá)。圖12是來自VSEL干細(xì)胞衍生的球體(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的細(xì)胞的系列點 圖。示出了三個獨立的代表性實施例。圖13描繪了對從D3胚胎干細(xì)胞(ED-D3 ；頂側(cè))形成的胚狀體和從VSEL干細(xì)胞 (底側(cè))形成的胚狀體樣球體進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)染色的圖。
圖14描繪了熒光顯微圖像，表明VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體表達(dá)早期胚胎 發(fā)育標(biāo)記物如 SSEA-I、GATA-6、GATA-4、FOXDl 及 Nanog。圖15描繪了在VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體中存在的細(xì)胞的透射電子顯微鏡 圖，表明這些細(xì)胞在尺寸上大于它們來源的初始VSEL干細(xì)胞(圖15，上側(cè))，但仍具有非常 原始的包含常染色質(zhì)的細(xì)胞核。圖15的中側(cè)描繪了在用SDF-I、HGF/SF及LIF刺激從VSEL 干細(xì)胞-衍生的胚狀體樣球體分離的細(xì)胞后MAPKp42/44的磷酸化研究結(jié)果，表明相應(yīng)的受 體(分別為SDF-1、HGF/SF及LIF)在這些細(xì)胞的表面表達(dá)。并且最后，圖15的下側(cè)描繪 了從來自VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體的細(xì)胞的連續(xù)傳代分離的細(xì)胞的RT-PCR分析結(jié) 果，其揭示了調(diào)節(jié)胚狀體的原腸胚形成的基因GnGATA-6、CdX2、SOX2、HNF3&AFP) WmRNA 的表達(dá)增加。圖16A-16C和圖17A-17D描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為少突 膠質(zhì)細(xì)胞(圖16A-16C)或神經(jīng)元(圖17A-17D)。細(xì)胞用針對巢蛋白的抗體染色，其利用 Alexa Fluor 594-標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG第二抗體檢測，其給予紅色熒光。用抗-綠色 熒光蛋白Alexa Fluor 488結(jié)合物檢測細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，并且細(xì)胞核用DAPI 染色(藍(lán)色熒光)。圖18A-18C描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為表達(dá)胰腺細(xì)胞的標(biāo)記 物(C-肽)的內(nèi)胚層細(xì)胞。圖19A-19C和20A-20D描繪了熒光顯微圖像，描繪了 ES樣球體分化為心肌細(xì)胞。 這些細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，表明心肌細(xì)胞源于由GFP+Sca-Γ/lirT/⑶45—BM細(xì)胞形 成的胚狀體。細(xì)胞用針對肌鈣蛋白I或α橫紋肌輔肌動蛋白的抗體染色(分別為圖19和 20)，其利用AlexaFluor 594-結(jié)合的第二抗體檢測，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋 白Alexa Fluor 488結(jié)合物檢測細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色 熒光)。圖21A-21C描繪了對來自單VSEL干細(xì)胞衍生的球體的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果， 其表明這些細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞(中胚層；參見圖21A)、神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞 (外胚層；參見圖21B)及胰腺或肝細(xì)胞(內(nèi)胚層；參見圖21C)。圖22A-22I描繪了表明培養(yǎng)的細(xì)胞中心臟-特異性抗原的表達(dá)的免疫熒光和透射 共聚焦顯微鏡照片。圖22A-22C和22D-22F描繪了其中Sca-l+/lin7CD45TMMNC被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖 像。具有Sca-r/lin7⑶45—細(xì)胞的板中的許多細(xì)胞對于心臟-特異的肌球蛋白重鏈?zhǔn)顷栃?的(圖22B、22C、22E及22F;綠色熒光)。這些心臟-特異性肌球蛋白重鏈-陽性的細(xì)胞中 的許多對于心臟肌鈣蛋白I也是陽性的(圖22D和22F[箭頭]；紅色熒光)。圖22G-22I 是其中Sca-r/lirT/⑶45+細(xì)胞被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖像。這些細(xì)胞對于前述心臟-特異性 抗原的表達(dá)基本上是陰性的(參見圖22H)。通過DAPI染色鑒定圖22A-22I中的每個的細(xì) 胞核(藍(lán)色熒光)。比例尺=20 μ m。圖23描繪了 Sca-l7lin7⑶45_細(xì)胞的FACS分類結(jié)果，表明能夠被分類的這些細(xì) 胞的產(chǎn)量隨著供體動物的年齡而降低。圖24是描繪作為年齡的函數(shù)的小鼠骨髓中存在的VSEL干細(xì)胞(左側(cè))和HSC (右 側(cè))的百分?jǐn)?shù)的兩幅圖。
圖25是兩幅圖，描繪了從較老的小鼠分離的VSEL干細(xì)胞形成胚狀體樣球體的能 力下降(左側(cè))以及根據(jù)小鼠(細(xì)胞從其分離)的年齡的VSEL干細(xì)胞的培養(yǎng)物中CD45+細(xì) 胞的百分?jǐn)?shù)增加(右側(cè))。圖26為從5周大的小鼠(左側(cè))與2.5歲大的小鼠(右側(cè))分離的VSEL干細(xì)胞 的不同表達(dá)模式。在左側(cè)中，示出了免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡圖像，表明來自5周大的 小鼠的培養(yǎng)的細(xì)胞中不同造血抗原的表達(dá)。在右側(cè)中，示出了在從2. 5歲大的小鼠分離的 VSEL干細(xì)胞中，CD45被表達(dá)并且所述細(xì)胞能夠在甲基纖維素培養(yǎng)基中的第二培養(yǎng)基中生 長造血集落。圖27A-27B描繪了人類臍帶血的FACS分類結(jié)果。圖 27A 示出 了 人類 CB 包含表達(dá) CXCR4 (0. 037 士 0. 02 %，η = 9)、 CD34(0. 118士0. 028%,η = 5)及 CD133(0. 018士0. 008%,η = 5)的 lin7CD4511NC 群。圖 27B 表明這些 CXCR4+/CD133+/CD347lin7CD45-細(xì)胞非常小(約 3-5 μ m ；圖 27B，上側(cè))，而 CB-來源的lin7CD45+造血細(xì)胞較大(> 6 μ m ；圖27B,下側(cè))。圖28A-28C描繪了對來自人類臍帶血的分類的細(xì)胞的基因表達(dá)研究結(jié)果。圖28A和286是條形圖，顯示通過FACS分類的CB-來源的CXCR4+/CD133+/CD347 lin7CD45"細(xì)胞、以及 CXCR4+/lin7CD45\CD34+/lin7CD45\ 以及 CD133+/lin7CD457 細(xì)胞 高度富集由多能胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子如Oct-4和Nanog的mRNA。圖28C示出了確認(rèn) FACS分析的RT-PCR結(jié)果。圖29描繪了 CB-VSEL干細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果，表明高度純化的CB-來源的 CXCR4+/lin_/CD45_細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)SSEA-4并且在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)0ct_4和Nanog 轉(zhuǎn)錄因子。圖30描繪了三種不同的CB-VSEL干細(xì)胞的光學(xué)顯微圖片，表明這些細(xì)胞非常小 3-5 μ m,并包含相對大的細(xì)胞核和具有許多線粒體的細(xì)胞質(zhì)的窄緣。這些細(xì)胞的細(xì)胞核中 的DNA包含作為多能胚胎干細(xì)胞的特征的開放型常染色質(zhì)。圖31A-31C描繪了光學(xué)顯微圖片，表明來源于GFP+小鼠的VSEL干細(xì)胞-DS如果 被平鋪在補充有IL-3+GM-CSF的甲基纖維素培養(yǎng)基中可以形成小的第二球體(圖31A和 31B)。通過從初始甲基纖維素培養(yǎng)基的甲基纖維素溶解回收的這些第二球體制備的單細(xì)胞 懸浮液，如果再次平鋪在甲基纖維素培養(yǎng)基(圖31B)或血漿凝塊(圖31C)中并由IL-3和 GM-CSF刺激，形成造血集落。這些為造血集落的證據(jù)通過FACS分析來自甲基纖維素中生長 的溶解集落的細(xì)胞的CD45表達(dá)或通過免疫熒光染色來自血漿凝塊培養(yǎng)基中生長的集落的 細(xì)胞的⑶45而獲得。圖32是用于從人類臍帶血分離VSEL干細(xì)胞的基于FACS的策略的略圖。圖33.流式細(xì)胞術(shù)分離源自骨髓的SCa-l+/Lin-/CD45+造血干細(xì)胞和Sca-I+/ Lin-/⑶45-VSEL。代表性的點圖顯示了來自淋巴門(A)(基于Sca-I (FITC)和譜系標(biāo)記物 (PE) (C)以及⑶45 (APC)的表達(dá))的小細(xì)胞的分類。圖板D顯示了區(qū)域3(R3)含有Sca-I+/ Lin-/CD45-VSEL而區(qū)域4(R4)含有Sca_l+/lin-/CD45+細(xì)胞。通過將BMC的分類與具有 已知直徑的珠子的分類作比較，圖板B中的FSC軸確認(rèn)了圖板A中的感興趣區(qū)域中的細(xì)胞 的非常小的尺寸(2-10μ)。如(R3)所示，總BMC中只有0.02%是VSEL。FSC，前向分散特 征；SSC，側(cè)向分散特征。
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圖34.心肌梗塞尺寸。從小組I-III中的Masson三色染色心臟檢測的心機梗塞 面積分?jǐn)?shù)([梗塞面積/LV面積]xlOO)，三個小組分別經(jīng)載體、⑶45+造血干細(xì)胞和VSEL處 理。〇，個體小鼠； ，平均數(shù)士 SEM。圖35.超聲心動描記術(shù)檢測LV的功能。冠狀動脈閉塞/重灌注后35天以載體處 理(A、B)、CD45+細(xì)胞處理(C、D)和VSEL處理(E、F)的小鼠的代表性的二維(A、C、E)和 M-模式(B、D、F)圖像。箭頭代表梗塞壁(A、C、E)。與載體處理和⑶45+細(xì)胞處理的心臟 相比，VSEL處理的心臟顯示出較小的LV腔，較厚的梗塞壁和改善的梗塞壁運動。圖板G-J 證明VSEL的移植改善了 MI之后35天LV心臟收縮功能的超聲心動描記術(shù)檢測。數(shù)據(jù)為平 均數(shù)士SEM。η = 11-14只小鼠/組。*Ρ < 0. 05vs.第35天時的小組II ;#P < 0. 05vs.第 35天時的小組I ； §P < 0. 05vs.各個小組在96小時之時的數(shù)值。圖36. LV重塑的形態(tài)測量學(xué)檢測。來自于載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理 ⑶和VSEL處理(C)的心臟的代表性Masson三色染色心肌部分。分別以藍(lán)色和紅色鑒別 出結(jié)痂組織和有活力的(viable)心肌層。注意在VSEL處理的心臟中LV腔較小，梗塞壁 較厚。圖板D-H顯示了 LV結(jié)構(gòu)參數(shù)的形態(tài)測量學(xué)檢測。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14 只小鼠/組。< 0. 05vs.小組II。圖37.心肌細(xì)胞和左心室肥大的檢測。圖板A-C顯示了來自Masson三色染色的經(jīng) 載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的有活力的心肌層中的 心肌細(xì)胞的代表性圖像。比例尺=50pm。與⑶45+造血干細(xì)胞處理的心臟不同，VSEL處理 的心臟未顯示出增加的肌細(xì)胞剖面面積(與非梗塞對照心臟(D)相比)。超聲心動描記術(shù) 估計的LV質(zhì)量在VSEL處理的心臟(E)中顯著較低。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14只小 鼠 / 組。D :*Ρ < 0. 05vs.小組 II ;#P < 0. 05vs.對照；E :*P < 0. 05vs.小組 II 和 III (最 終的)；#P<0.05vs各個基線值。圖38. VSEL移植和心肌細(xì)胞再生。通過EGFP (B、D，綠色)和α -橫紋肌 (sarcomeric)輔肌動蛋白(C、D，紅色)分別鑒別VSEL和肌細(xì)胞；圖板D顯示了合并區(qū)域。 顯示了對EGFP(箭頭，B，綠色)和α-橫紋肌輔肌動蛋白(箭頭，C，紅色)均為陽性的兩個 肌細(xì)胞。細(xì)胞核以DAPI染色(A、D，藍(lán)色)。比例尺=40μπι。圖39.梗塞區(qū)域中的肌細(xì)胞面積分?jǐn)?shù)的測定。圖板A-C顯示了 Masson三色染色 的經(jīng)載體處理(A)、⑶45+造血干細(xì)胞處理(B)和VSEL處理(C)的心臟的結(jié)痂的代表性例 子。放大倍率x600。圖板D中顯示了定量數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。n= 11-14只小鼠 / 組。D :*Ρ < 0. 05vs.小組 II。圖40.外周血(PB)中循環(huán)的VSEL的流式細(xì)胞術(shù)分析。在急性MI之后24小時、 48小時和7天；在假性手術(shù)(假性對照)之后24小時；以及從未經(jīng)處理的小鼠(對照)，收 集PB樣品。使用Sca-Ι、譜系標(biāo)記物和⑶45將PB白細(xì)胞(PBL)的全部群體染色。在點圖 中顯示PBL，代表它們的前向(FSC)vs.側(cè)向分散特征(SSC)，分別與細(xì)胞內(nèi)容物的大小和粒 度/復(fù)雜度相關(guān)。區(qū)域Rl(圖板A)中包括了無粒的、小的(大小為2-10μπι)事件，其包括 VSEL群體。進(jìn)一步分析來自區(qū)域Rl的細(xì)胞的Sca-I和譜系標(biāo)記物(Lin)的表達(dá)，在區(qū)域 R2(圖板B)中只包括SCa-l+/Lin事件。然后基于⑶45的表達(dá)分析來自區(qū)域R2的細(xì)胞，將 ⑶45-和⑶45+亞群體顯示于柱狀圖(圖板C，分別為區(qū)域R3和R4)。百分率顯示了每個 亞群體在總PBL中所占的平均含量。根據(jù)FSC，圖板D分別顯示了區(qū)域R5和R6中Sca-I+/Lin-/CD45-細(xì)胞(VSEL)和Sca_l+/Lin-/CD45+細(xì)胞(HSC)的大小。紅色圓圈代表每個亞 群體中細(xì)胞的主要定位。圖41.急性MI之后VSEL運動的時間過程。顯示了 MI之后24小時、48小時和7 天，未處理的(對照)、假性操作(假性對照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環(huán)的Sca-I+/ Lin-/⑶45-VSEL的絕對數(shù)目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數(shù)據(jù)。 絕對數(shù)目是基于VSEL占外周血中PBL和總白細(xì)胞計數(shù)的百分含量計算的。數(shù)據(jù)為平均數(shù) + SEM0 ，平均數(shù)；〇，個體小鼠；*P < 0. 0025vs.對照以及假性對照。圖42.急性MI之后HSC運動的時間過程。圖形顯示了 MI之后24小時、48小時和 7天，未處理的(對照)、假性操作(假性對照)和梗塞小鼠的每微升血液中循環(huán)的Sca-I+/ Lin-/⑶45+HSC的絕對數(shù)目。圖板A和B分別代表從6周齡和15周齡小鼠獲得的數(shù)據(jù)。絕 對數(shù)目是基于HSC占PBL和總白細(xì)胞計數(shù)的百分含量計算的。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。眷，平 均數(shù)；〇，個體小鼠；卞< 0. 0025vs.各個年齡小組中的對照以及假性對照。圖43.來自急性MI之后的6周齡和15周齡小鼠(分別為圖板A和B)的源自外 周血的細(xì)胞中多能標(biāo)記物(Oct-4、Nanog、Rexl、Rifl、Dppal)和造血干細(xì)胞標(biāo)記物(Scl) 的mRNA水平。將從每個實驗小組的動物血液中收集的細(xì)胞匯集在一起以獲得每個時間點 的平均mRNA含量。對于所有的樣品進(jìn)行一式三份qRT-PCR。將mRNA含量的倍數(shù)增加與對 照進(jìn)行比較?；谌畏磻?yīng)計算平均值。數(shù)據(jù)顯示為平均數(shù)士SEM。PSC，多能干細(xì)胞。圖44.源自外周血(PB)的VSEL中的0ct_4的表達(dá)。MI之后24小時從PB分離 的運動的VSEL(下端圖板)和HSC(上端圖板)的代表性的共焦顯微鏡圖像。通過FACS分 離Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL和Sca_l+/Lin-/CD45+HSC然后進(jìn)行免疫染色。上端圖板顯示 了 Sca-1+/Lin-/CD45+細(xì)胞(HSC)，其對于CD45 (FITC，綠色熒光，造血細(xì)胞標(biāo)記物)是陽 性的，對于Oct-4 (TRITC，紅色熒光)是陰性的。下端圖板顯示了 Sca-1+/Lin-/CD45-細(xì)胞 (VSEL)，其對于CD45是陰性的，對于Oct-4 (多能細(xì)胞標(biāo)記物)是陽性的。細(xì)胞核以DAPI 染色(藍(lán)色熒光)。Tr，透射圖像。圖45.實驗方案。使用了三組WT小鼠(小組I-III，n = 11-14/組)。在基線超 聲波心動描記術(shù)四天之后，小鼠進(jìn)行30分鐘的冠狀動脈閉塞，然后進(jìn)行重灌注。MI之后48 小時，小鼠接受心肌內(nèi)注射載體(小組I)、SCa-l+/Lin-/⑶45+造血干細(xì)胞(小組II)或 Sca-1+/Lin-/CD45-VSEL(小組III)。在細(xì)胞移植后48小時和MI之后35天重復(fù)超聲波心 動描記術(shù)。在MI之后35天，處死小鼠以進(jìn)行形態(tài)測量學(xué)和組織學(xué)研究。圖46. LV重塑的超聲心動描記術(shù)檢測。圖板A和B顯示了 LV尺寸的超聲心動描 記術(shù)測量。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士SEM。η = 11-14只小鼠/組。圖47.心肌毛細(xì)血管密度的定量測定。梗塞邊界區(qū)域(A)和非缺血區(qū)域(B)中的 心肌毛細(xì)血管密度。在載體處理的、⑶45+造血干細(xì)胞處理的和VSEL處理的心臟之間沒有 顯著性差異。數(shù)據(jù)為平均數(shù)士 SEM。η= 11-14只小鼠/組。序列表的簡單描述SEQ ID Nos :1_64是可以用于擴增多個鼠核酸序列的32個引物對的核苷酸序列， 總結(jié)于表1中。^ 1用于實時RT-PCR的鼠引物的序列
基因 (GENBANK 登記號 )序列(以5’ -3，順序表示)々2微球蛋白 (NM_009735)CATACGCCTGCAGAGTTAAGCA (SEQ ID NO: 1) GATCACATGTCTCGATCCCAGTAG (SEQ ID NO: 2)Oct4 (X52437) ·ACCTTCAGGAGATATGCAAATCG (SEQ ID NO: 3) TTCTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCT (SEQ ID NO 4)Nanog (AY278951)CGTTCCCAGAATTCGATGCTT (SEQ ID NO: 5) TTTTCAGAAATCCCTTCCCTCG (SEQ ID NO: 6)
Rexl (M28382)AGATGGCTTCCCTGACGGATA(SEQ ID NO 7) CCTCCAAGCTTTCGAAGGATTT(SEQ ID NO 8)Dppa3 (NM—139218)GCAGTCTACGGAACCGCATT(SEQ ID NO :9) TTGAACTTCCCTCCGGATTTT(SEQ ID NO: 10)Rifl (NM—175238)GAGCTGGATTCTTTTGGATCAGTAA(SEQ ID NO: 11) GCCAAAGGTGACCAGACACA(SEQ ID NO =12)GFAP (X02801)GGAGCTCAATGACCGCTTTG(SEQ IDNO=13) TCCAGGAAGCGAACCTTCTC(SEQ ID NO =14)巢蛋白 (NM_016701)CCCTGATGATCCATCCTCCTT(SEQ ID NO: 15) CTGGAATATGCTAGAAACTCTAGACTCACT(SEQ ID NO =16)β III微管蛋白 (NM-023279)TCCGTTCGCTCAGGTCCTT(SEQ ID NO: 17) CCCAGACTGACCGAAAACGA(SEQ ID NO =18)Oligl (ΝΜ_016968)ACGTCGTAGCGCAGGCTTAT(SEQ ID NO =19) CGCCCAACTCCGCTTACTT(SEQ ID NO =20)01ig2 (NM_016967)GGGAGGCGCCATTGTACA(SEQ ID NO =21) GTGCAGGCAGGAAGTTCCA(SEQ ID NO =22)Myf5 (NM—008656)CTAGGAGGGCGTCCTTCATG(SEQ ID NO =23) CACGTATTCTGCCCAGCTTTT(SEQ ID NO =24)MyoD (NM—O10866)GGACAGCCGGTGTGCATT(SEQ ID NO =25) CACTCCGGAACCCCAACAG(SEQ ID NO =26)
1權(quán)利要求
一種從受試者中收集自體同源VSEL的方法，包括以下步驟給予受試者干細(xì)胞增強劑；從受試者的外周血收集至少1010個總有核細(xì)胞；使總有核細(xì)胞富集為CD34+/lin /CD45 或Sca 1+/lin /CD45 非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)；保存收集的細(xì)胞以保持細(xì)胞的細(xì)胞完整性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括從受試者的外周血收集至少IO11個總有核細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括從受試者的外周血收集至少IO12個總有核細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中富集過程包括基于總有核細(xì)胞的細(xì)胞 標(biāo)記物表達(dá)模式、細(xì)胞大小或其組合將總有核細(xì)胞進(jìn)行分類。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中富集過程使用多參數(shù)方法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中干細(xì)胞增強劑是G-CSF、GM-CSF、地塞 米松、CXCR4受體抑制劑或其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中干細(xì)胞增強劑是G-CSF。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中給予受試者至少兩劑大約1μ g/kg/天至8 μ g/ kg/ 天的 G-CSF。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其中皮下給予G-CSF。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中皮下給予受試者大約每劑480μ g的G-CSF。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項所述的方法，其中在連續(xù)兩天給予至少兩劑G-CSF，受 試者每天接受一劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項所述的方法，其中在2至6天的時間內(nèi)給予受試者至 少兩劑G-CSF。
13.根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項所述的方法，其中受試者在連續(xù)的天數(shù)內(nèi)接受所給予 的兩劑G-CSF。
14.根據(jù)權(quán)利要求8至10任一項所述的方法，其中大約每12小時至大約每36小時給 予受試者至少兩劑G-CSF。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一項所述的方法，還包括在收集的時候?qū)⑹占募?xì)胞打上 標(biāo)記以用于所述受試者的使用。
16.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中以大約4至大約6μ g/kg/天的劑量或其等同劑 量給予受試者G-CSF。
17.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中皮下給予受試者每劑大約50μ g至大約800 μ g 的 G-CSF。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中皮下給予受試者每劑大約300μ g至大約500 μ g 的 G-CSF。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18任一項所述的方法，其中使用分離性輸血方法從受試者的外 周血收集至少IOltl個總有核細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在給予第二劑G-CSF后的那一天使用分離性輸 血方法從外周血收集VESL。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中在給予第二劑G-CSF后大約12至大約36小時使用分離性輸血方法從外周血收集VESL。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一項所述的方法，其中受試者是人類受試者，其滿足選自以 下的至少一個條件體重為10至200kg，年齡為2至80歲。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中當(dāng)受試者為成人或非新生兒的時候進(jìn)行收集步馬聚ο
24.—種細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含⑶34+/lin7⑶45_或Sca-l+/lin7⑶45_非常小的胚胎 樣干細(xì)胞(VSEL)和非VSEL的自體同源混合物，其中非VSEL包含祖細(xì)胞和任選的功能細(xì) 胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含大約10%至大約90%的外周血 VSEL和大約10%至大約90%的非VSEL。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含大約10%至大約80%的外周血 VSEL和大約20%至大約90%的非VSEL。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含大約10%至大約60%的外周血 VSEL和大約40 %至大約90 %的非VSEL。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其中非VSEL選自造血祖細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞、 神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞、皮膚祖細(xì)胞、肝祖細(xì)胞、肌肉祖細(xì)胞、骨祖細(xì)胞、間 充質(zhì)干細(xì)胞或祖細(xì)胞、胰腺祖細(xì)胞、前體軟骨細(xì)胞、基質(zhì)祖細(xì)胞、培養(yǎng)的擴展的干細(xì)胞或祖 細(xì)胞、培養(yǎng)的分化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、或其組合。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其中功能細(xì)胞選自終端分化的造血細(xì)胞、 終端分化的神經(jīng)細(xì)胞、終端分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、終端分化的少突膠質(zhì)細(xì)胞、終端分化的皮 膚細(xì)胞、終端分化的肝細(xì)胞、終端分化的肌肉細(xì)胞、終端分化的骨細(xì)胞、終端分化的脂肪細(xì) 胞、終端分化的胰腺細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、培養(yǎng)的分化的干細(xì)胞或祖細(xì)胞、或其組合。
30.一種增強干細(xì)胞移植的方法，包括給予受試者⑶34+/lin_/⑶45_或Sca-l+/lin7 CD45_非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)、祖細(xì)胞和任選地功能細(xì)胞的自體同源混合物。
31.一種細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含至少IO4個⑶34+/lin7⑶45-或Sca-l+/lin7⑶45—非 常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含至少IO5個⑶34+/lin_/⑶45_或 Sca-l+/lin_/CD45_VSEL。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的細(xì)胞治療產(chǎn)品，其包含至少IO6個⑶34+/lin_/⑶45_或 Sca-l+/lin_/CD45_VSEL。
34.一種增強干細(xì)胞移植的方法，包括給予受試者權(quán)利要求31至33任一項所述的細(xì)胞 治療產(chǎn)品。
35.一種使個體可以獲得干細(xì)胞和祖細(xì)胞的方法，其包括以下步驟個體主動選擇收 集其CD347lin7CD45_或Sca-l7lin7CD45-非常小的胚胎樣干細(xì)胞(VSEL)，其中該個體沒 有直覺上感覺到需要立即以其自身收集的干細(xì)胞和祖細(xì)胞進(jìn)行治療的健康狀況；使用分離 性輸血方法從該個體的外周血收集至少IOltl個總有核細(xì)胞；在收集時，將收集的細(xì)胞打上 標(biāo)記以用于該個體；將收集的細(xì)胞保存于貯藏庫。
36.一種收集并存貯個體的⑶34+/lin7⑶45—或Sca-r/lirT/⑶45—非常小的胚胎樣干 細(xì)胞(VSEL)的方法，包括以下步驟使用分離性輸血方法從個體的外周血收集至少IOltl個總有核細(xì)胞，其中該個體沒有直覺上感覺到需要立即治療的健康狀況；在收集時，將收集的 VSEL打上標(biāo)記以用于該個體；通過儲存于細(xì)胞庫保存收集的細(xì)胞。
37.一種治療受試者的組織損傷的方法，該方法包括給予受試者組合物，所述組合物包 含處于藥學(xué)上可接受的載體中的CD34+/lin7CD45_或Sca-l7lin_/CD45_非常小的胚胎樣 干細(xì)胞(VSEL)，其中給藥數(shù)量和途徑足以允許VSEL群的至少一部分移植入組織并在其中 分化，所述損傷選自缺血性損傷、心肌梗塞和中風(fēng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中分離的VSEL分離自選自以下的來源骨髓、外 周血、脾、臍帶血及其組合。
全文摘要
本發(fā)明公開的主題提供了從骨髓、外周血和/或其它來源純化而來的干細(xì)胞群。還提供了使用干細(xì)胞治療受試者中的組織和/或器官損傷的方法。
文檔編號C12N5/074GK101978046SQ200880124210
公開日2011年2月16日 申請日期2008年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月30日
發(fā)明者D·羅杰森, G·史密斯, J·拉塔查克, M·庫恰, M·拉塔查克, R·博利, R·艾倫, W·馬拉斯科 申請人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會有限公司