專利名稱:哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基以及該培養(yǎng)基的添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞時(shí)所使用的培養(yǎng)基以及用于構(gòu)成該培養(yǎng) 基的添加劑。
背景技術(shù):
體細(xì)胞是可在細(xì)胞治療或再生醫(yī)療中應(yīng)用的重要的細(xì)胞,所述體細(xì)胞含有包括人 在內(nèi)的哺乳類的具有多分化能力的細(xì)胞和這些細(xì)胞所分化的細(xì)胞。培養(yǎng)這些細(xì)胞使其增 殖,這從細(xì)胞治療用的細(xì)胞生產(chǎn)性或促進(jìn)這些醫(yī)療研究的進(jìn)展方面考慮非常重要。已知體細(xì)胞通常是在添加10%左右的血清的血清培養(yǎng)基中增殖。作為血清,通常 使用由作為上述所欲培養(yǎng)的體細(xì)胞所來(lái)源的來(lái)自個(gè)體的血液(例如采集了要培養(yǎng)的體細(xì) 胞的患者的血液)得到的、來(lái)自自身的血清,或牛血清等來(lái)自其它種的血清。但是,使用來(lái)自自身的血清時(shí),必須較大量地使用患者的血液,因此患者的負(fù)擔(dān)增 大。而使用來(lái)自其它種的血清時(shí),存在可能混入未知的病毒或朊病毒等感染性病原體的問(wèn) 題。任何血清的成分都尚未完全了解,根據(jù)所使用的血清的起源或市售產(chǎn)品批次的不 同,其含有成分可能不同,因此在大量使用血清進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),難以使所得培養(yǎng)細(xì)胞的品質(zhì)一定。因此,人們希望能夠在不使用血清或者是盡可能地抑制其使用量的培養(yǎng)基中使體 細(xì)胞增殖。日本特表平11-506610號(hào)(專利文獻(xiàn)1)中公開(kāi)了含有最小必需培養(yǎng)基、血清白蛋 白、鐵源、胰島素以及谷氨酰胺的人間葉系細(xì)胞用的無(wú)血清培養(yǎng)基。并記載該無(wú)血清培養(yǎng)基 中可以加入具有人間葉系細(xì)胞核有絲分裂促進(jìn)活性的血清素。但是,在加入了血清素的無(wú) 血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)間葉系干細(xì)胞后,有增殖較為緩慢、短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞特性變化、增殖性降低 的問(wèn)題。日本特表2006-505248號(hào)(專利文獻(xiàn)2)中公開(kāi)了含有溶血磷脂受體、即,內(nèi)皮細(xì) 胞分化基因(Edg)家族受體的配體,例如溶血磷脂酸(LPA)、1-磷酸鞘氨醇(SlP)等的、用 于調(diào)節(jié)人胚胎干細(xì)胞(ES)分化的無(wú)血清培養(yǎng)基。已知LPA具有抑制脂肪前體細(xì)胞向脂肪 細(xì)胞分化的效果(J. Biol. Chem. Vol. 280,15,14656-14662 (2005);非專利文獻(xiàn)1)。還已知 LPA 具有細(xì)胞增殖促進(jìn)效果(Sci.STKE,Vol.2005,Issue 292,pe35 頁(yè),12 July 2005 ;非 專利文獻(xiàn) 2 ;American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. Vol. 34, 274-285頁(yè),2006;非專利文獻(xiàn)3),但細(xì)胞增殖促進(jìn)效果是在含血清培養(yǎng)基中確認(rèn)的,在無(wú) 血清培養(yǎng)基或者是在以下的低血清培養(yǎng)基中細(xì)胞增殖促進(jìn)效果尚未得知。W02007/080919(專利文獻(xiàn)3)中記載了來(lái)自人骨髓的間葉系干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng) 基,并記載作為培養(yǎng)條件,除ITS添加物(含胰島素、運(yùn)鐵蛋白、硒等的添加物)之外,堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)、血小板源性 生長(zhǎng)因子(PDGF)是必須的,但是如果要添加的生長(zhǎng)因子為3種以下,則有增殖性降低的問(wèn)題。對(duì)于包括人在內(nèi)的哺乳類的具有多分化能力的細(xì)胞增殖,已知細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因 子對(duì)其產(chǎn)生影響。例如有血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)等(Folia Histochemica Et Cytobiological Vol. 44,No. 4, 215-230 頁(yè),2006 ;非專利文獻(xiàn) 6 J Cell Biochem. Vol. 64,2,278-94 頁(yè),1997 ;非專利文獻(xiàn) 7)。在體外培養(yǎng)包括人的哺乳類的體細(xì)胞時(shí),已知N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)具有通 過(guò)抑制程序性細(xì)胞死亡來(lái)減少細(xì)胞死亡的效果(Molecular Human Reproduction Vol. 8, No3. 3,228-236 頁(yè),2002 ;非專利文獻(xiàn) 8 ;J Leukoc Biol. Vol. 76, No. 1,152-61 頁(yè),2004 ;非 專利文獻(xiàn)9)。專利文獻(xiàn)1 日本特表平11-506610號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特表2006-505248號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 :W02007/080919非專利文獻(xiàn)1 J. Biol. Chem. Vol. 280,15,14656-14662 (2005)非專利文獻(xiàn)2 :Sci. STKE, Vol. 2005,Issue 292,p. pe35,12 July2005非專利文獻(xiàn)3 American Journal of Respiratory Cell and MolecularBiology. Vol. 34,274-285 頁(yè),2006非專利文獻(xiàn)4 :Science. Vol. 294,1875-1878 頁(yè),2001非專利文獻(xiàn)5:J Biol Chem. Vol. 277,No. 29,25851-25854 頁(yè),2002非專利文獻(xiàn)6:Folia Histochemica Et Cytobiological Vol. 44, No. 4,215-230 頁(yè),2006非專利文獻(xiàn)7 :J Cell Biochem. Vol. 64,2,278-94 頁(yè),1997非專利文獻(xiàn) 8 =Molecular Human Reproduction Vol. 8,Νο3· 3,228—236 頁(yè),2002非專利文獻(xiàn)9 :J Leukoc Biol. Vol. 76,No. 1,152-61 頁(yè),200
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所需解決的課題本發(fā)明的課題在于提供哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基以及用于構(gòu)成該培養(yǎng)基的添加 劑,所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞時(shí),在盡可能地抑制在培養(yǎng)基中添加血清或者是 不添加血清的情況下可以有效地使哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞增殖。用于解決課題的方法本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中摻混內(nèi)皮細(xì)胞分化基因 (Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體,即使培養(yǎng)基完全不含有或只含有少量血清, 也可以使哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞有效增殖。從而完成了本發(fā)明。S卩,本發(fā)明提供哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基含有內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg) 家族受體的配體、和血清素受體的配體。本發(fā)明還提供哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基的添加劑, 該添加劑含有內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體。發(fā)明的效果本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)基添加劑可以在不使用以往培養(yǎng)體細(xì)胞時(shí)添加到培養(yǎng)基中的血清、或者降低其添加量的條件下,有效地使體細(xì)胞增殖。因此,可以解決由于使用血 清而產(chǎn)生的問(wèn)題,即,對(duì)患者的負(fù)擔(dān)、感染性病原體的混入等問(wèn)題。即使在添加血清的情況 下,也可以抑制由于所添加的血清批次之間的偏差而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖性的偏差。并且即使 使用人血清作為血清,也可以有效地使體細(xì)胞增殖。通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)方法,可以抑制血清 的使用量來(lái)培養(yǎng)體細(xì)胞,因此可以提供穩(wěn)定品質(zhì)的培養(yǎng)體細(xì)胞。因此,所得培養(yǎng)體細(xì)胞是感 染性病原體混入問(wèn)題被抑制到最小限度的穩(wěn)定品質(zhì)的培養(yǎng)體細(xì)胞。實(shí)施發(fā)明的最佳方式本說(shuō)明書中,“體細(xì)胞”是構(gòu)成多細(xì)胞生物的細(xì)胞中的增殖細(xì)胞以外的細(xì)胞,包括 為某種目的進(jìn)行特化而不會(huì)成為除此以外的細(xì)胞的分化的細(xì)胞,以及具有分化分化為具有 幾種不同功能的細(xì)胞的能力的細(xì)胞。前者的細(xì)胞是成體的功能性細(xì)胞,包括皮膚細(xì)胞、神 經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、血液系細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等形成生物體內(nèi)各 器官的細(xì)胞。后者稱為干細(xì)胞,是可分化轉(zhuǎn)換為上述已分化的細(xì)胞中至少1種以上的分化 細(xì)胞的細(xì)胞,包含胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞?!俺审w干細(xì)胞”是具有分化為具有幾種不同功 能的細(xì)胞的能力的干細(xì)胞和前體細(xì)胞中除了胚胎干細(xì)胞以外的細(xì)胞,包含誘導(dǎo)多功能干細(xì) 胞、造血干細(xì)胞、間葉系干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞等。作為在本發(fā)明的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞,只要是哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞即可,沒(méi)有任何 限定。優(yōu)選的實(shí)例可例舉成纖維細(xì)胞等的間葉系細(xì)胞、脂肪組織源性干細(xì)胞或骨髓源性間 葉系干細(xì)胞等的成體干細(xì)胞,但并不受其限定。本發(fā)明的培養(yǎng)基中含有內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族受體的配體作為必須成分。 這里,Edg家族受體是基因序列同源性高的G蛋白偶聯(lián)型受體的一組,目前在人、小鼠、綿羊 等哺乳類中鑒定出Edg-I至Edg-8 (非專利文獻(xiàn)4、5)。其中,已知Edg-2、Edg-4和Edg_7發(fā) 揮LPA受體功能,Edg-l、Edg-3、Edg-5、Edg-6和Edg-8發(fā)揮SlP受體功能。另外,“受體的 配體”是與該受體特異性結(jié)合的物質(zhì),不只是存在于生物體內(nèi)的天然的配體,也包含作為激 動(dòng)劑或拮抗劑已知的天然的或合成的其它化合物。Edg家族受體的配體(以下為了便利,可稱為“Edg配體”)優(yōu)選選自溶血磷脂酸 LPA及其鹽、1-磷酸鞘氨醇(SlP)以及Edg家族受體的激動(dòng)劑的一種或多種的化合物。Edg家族受體的激動(dòng)劑是與Edg家族受體結(jié)合、與LPA和SlP同樣作用的物質(zhì), 例如有1-磷酸二氫鞘氨醇、血小板活化因子(PAF)、鞘氨醇磷脂酰膽堿、烷基LPA類似物、 FTY720 等。LPA是由下述通式(I)所示的化合物R-O-CH2CH(OH) CH2PO4H2(I)(式中,R是碳原子數(shù)10-30的烷基、碳原子數(shù)10-30的鏈烯基或碳原子數(shù)10_30 的?;?。上式(I)的R基中,?;奶荚訑?shù)不包含羰基的碳原子數(shù)。LPA的鹽可以使用以往公知的鹽,例如有鈉鹽、鉀鹽等堿金屬鹽,銨鹽等。LPA或LPA的鹽例如有1_油?;苎字徕c鹽、LPA鉀鹽。Edg配體可以單獨(dú)使用,還可以將兩種以上混合使用。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有血清素受體的配體(為了便利,可稱為“血清素 配體”)。血清素受體是主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的G蛋白結(jié)合受體的一種。作為血清素配
6體,優(yōu)選選自血清素、其鹽以及血清素激動(dòng)劑的一種或多種化合物。血清素被稱為5-羥色 胺,已知發(fā)揮神經(jīng)遞質(zhì)的作用。血清素激動(dòng)劑是已知與血清素受體結(jié)合、與血清素同樣作用 的物質(zhì),例如有伊沙匹隆、S 口 C >、丁螺環(huán)酮、1-[2-(4_氨基苯基)乙基]-4-(3_雙氟甲 基苯基)哌嗪(PADD)、N, N- 二丙基-5-羧酰胺色胺(DP-5CT)、α -甲基-5-羥色胺(HT)、 2-甲基-5-ΗΤ等。血清素的鹽可以使用以往公知的鹽,例如鹽酸鹽等。血清素配體可以單獨(dú)使用,也可以將2種以上組合使用。培養(yǎng)基中的Edg配體的濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)通常是0.01-100μΜ 左右。Edg配體為選自溶血磷脂酸(LPA)及其鹽的至少一種時(shí),其在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu) 選0.25-10 μ Μ。另外,Edg配體為1-磷酸鞘氨醇(SlP)時(shí),其在培養(yǎng)基中的濃度優(yōu)選 0.01 μ Μ-0. 2 μ M0另外,培養(yǎng)基中的血清素配體的濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)優(yōu)選 0. 1-100 μ Μ,進(jìn)一步優(yōu)選 0. 25-20 μ Μ。本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選含有抗氧化劑。抗氧化劑的優(yōu)選實(shí)例為選自N-乙酰 半胱氨酸(NAC)、L-半胱氨酸、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和2-巰基乙醇的至少一種,進(jìn) 一步優(yōu)選選自N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨酸的至少一種。已知這些抗氧化劑具有程序性 細(xì)胞死亡抑制作用,因此對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的保持、增殖有效。抗氧化劑可以單獨(dú)使用,也可以 將兩種以上組合使用。培養(yǎng)基中的抗氧化劑濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)優(yōu)選O.OlmM-lOmM,進(jìn)一步 優(yōu)選 0. ImM-ImM0本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)選含有動(dòng)物血清白蛋白。白蛋白是血清的主要成分,已 知在血液中擔(dān)負(fù)著藥物的傳遞等作用。通過(guò)含有動(dòng)物血清白蛋白,可以進(jìn)一步促進(jìn)培養(yǎng)細(xì) 胞的增殖。動(dòng)物血清白蛋白的優(yōu)選實(shí)例有人血清白蛋白(HSA)和基因重組人血清白蛋白 (rHSA)、牛血清白蛋白(BSA)等。這些白蛋白可以單獨(dú)使用,也可以將兩種以上組合使用。培養(yǎng)基中的白蛋白的濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)優(yōu)選0.0001-10重量%,進(jìn) 一步優(yōu)選0. 0001-1重量%。本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選進(jìn)一步含有生長(zhǎng)因子。通過(guò)含有生長(zhǎng)因子,可以進(jìn)一步促進(jìn) 培養(yǎng)細(xì)胞增殖。生長(zhǎng)因子的優(yōu)選實(shí)例有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子(TGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng) 因子(VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅 細(xì)胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)等,進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)例是 血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)。這 些生長(zhǎng)因子本身在該領(lǐng)域都是周知的。生長(zhǎng)因子可以單獨(dú)使用也可以將兩種以上組合使 用。特別如下述實(shí)施例中具體所示,即使只含有血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)和堿性成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)兩種作為生長(zhǎng)因子,也可以充分實(shí)現(xiàn)間葉系細(xì)胞的增殖,因此在間葉 系干細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中所含的生長(zhǎng)因子即使只含有這兩種生長(zhǎng)因子也 足夠。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的配體 (PDGF),特別是在培養(yǎng)間葉系干細(xì)胞的培養(yǎng)基中,優(yōu)選含有它們。PDGFR是主要存在于間葉 系細(xì)胞中的酪氨酸激酶關(guān)聯(lián)型受體的一種,通過(guò)含有其配體,可以高效地使間葉系干細(xì)胞 的細(xì)胞增殖。作為 PDGFR 的配體,可例舉PDGF-AA、PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD
7等,它們均為眾所周知的。PDGFR的配體可以單獨(dú)使用,也可以將兩種以上組合使用。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(FGFR)的配體(FGF),特 別優(yōu)選在培養(yǎng)間葉系干細(xì)胞的培養(yǎng)基中含有它們。已知FGFR主要存在于間葉系細(xì)胞中, 通過(guò)含有對(duì)應(yīng)于它的配體,可以改善間葉系干細(xì)胞的壽命。PDGFR的配體已知存在有堿性 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)等共20種以上。例如有 FGF-l、FGF-4等。特別已知bFGF強(qiáng)烈參與組織的形成。它們均為眾所周知。生長(zhǎng)因子的濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)優(yōu)選0. Ι-lOOng/mL,進(jìn)一步優(yōu)選 1-lOng/mLo本發(fā)明的培養(yǎng)基可以進(jìn)一步含有表面活性劑??梢哉J(rèn)為,通過(guò)含有低濃度的表面 活性劑,具有減少對(duì)細(xì)胞膜的不良影響的效果。已知如果將高濃度的表面活性劑添加到 培養(yǎng)基中,則抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。作為表面活性劑,優(yōu)選聚氧乙烯失水山梨醇 脂肪酸酯(商品名吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80等)、烷基苯氧基聚乙二醇(商品名 TritonX-IOO等)、烷基苯基聚乙二醇(商品名TritonX-114、NP_40等)的非離子性表面活 性劑。表面活性劑可以單獨(dú)使用,也可以將2種以上組合使用。表面活性劑的濃度(含有多種時(shí),為其總濃度)通常為0. Ι-lOOng/mL,優(yōu)選 1-lOng/mLo本發(fā)明的培養(yǎng)基可以與常規(guī)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基同樣地含有血清,但通過(guò)含 有Edg配體和血清素配體兩者,即使是不含有或者是只以低濃度含有血清的培養(yǎng)基也可以 使細(xì)胞高效增殖,因此培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基時(shí),可以最良好地發(fā)揮本發(fā) 明的效果。即,相對(duì)于培養(yǎng)基總量,本發(fā)明的培養(yǎng)基中的血清含量?jī)?yōu)選0-5重量%,更優(yōu)選 0-1重量%。本說(shuō)明書和權(quán)利要求的范圍中,將含有血清但其含量為5重量%以下、優(yōu)選1 重量%的培養(yǎng)基稱為低血清培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基除含有上述Edg配體和血清素配體、進(jìn)一步優(yōu)選含有上述抗氧化 劑、動(dòng)物血清白蛋白、生長(zhǎng)因子和表面活性劑的一種以上之外,還可以與公知的哺乳動(dòng)物細(xì) 胞用培養(yǎng)基同樣。因此基本上通過(guò)在公知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)選無(wú)血清或低血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中添加上述兩種必須成分、進(jìn)一步優(yōu)選一種以上上述優(yōu)選的成分,可以獲得本發(fā)明的培養(yǎng)基。以往共知的無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基有Eagle培養(yǎng)基等的最小必需培養(yǎng)基(MEM)、 Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、最小必需培養(yǎng)基α (MEM-α )、間葉系細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (MSCBM)、Ham,s F-12 和 F-10 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)基、WiIliams 培養(yǎng)基 E、RPMI-1640 培 養(yǎng)基、MCDB培養(yǎng)基、199培養(yǎng)基、Fisher培養(yǎng)基、Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基(IMDM) ,McCoy
改良培養(yǎng)基等。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有周知的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基中含有的各種添加劑。 上述周知的添加劑可例舉氨基酸類、無(wú)機(jī)鹽類、維生素類和碳源或抗生素等其它的添加 劑。作為氨基酸類,可例舉甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、 L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴 氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和 L-纈氨酸。
作為無(wú)機(jī)鹽類,可例舉氯化鈣、硫酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、硫酸鎂、 氯化鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸鋅和硒酸。作為維生素類,可例舉膽堿、維生素A、維生素Bi、維生素B2、維生素B3、維生素 B4、維生素B5、維生素B6、維生素B7、維生素B12、維生素B13、維生素B15、維生素B17、維生 素Bh、維生素Bt、維生素Bx、維生素C、維生素D、維生素E、維生素F、維生素K、維生素M和 維生素P。將這些添加劑添加到哺乳動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基中,這本身是公知的,各添加劑的添 加量也可以與公知的培養(yǎng)基同樣,還可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定。例如氨基酸類的添加量 通常是每種氨基酸為5mg/L-500mg/L左右,優(yōu)選10mg/L-400mg/L左右,無(wú)機(jī)鹽類的添加量 通常是每種無(wú)機(jī)鹽類為0mg/L-10g/L左右,優(yōu)選0.01mg/L-7g/L左右,維生素的添加量是每 種維生素為 0. 01mg/L-500mg/L 左右,優(yōu)選 0. 05mg/L-300mg/L 左右。作為其它添加劑,可例舉(1)皮質(zhì)酮、孕酮等的生長(zhǎng)因子,(2)青霉素、鏈霉素、慶 大霉素和卡那霉素等抗生素,⑶葡萄糖、半乳糖、果糖和蔗糖等碳源,⑷鎂、鐵、鋅、鈣、 鉀、鈉、銅、硒、鈷、錫、鉬、鎳和硅等微量金屬元素以及腺苷5’ - 一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨 酸、運(yùn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等其它添加劑。這些添加劑的添加量也與以往同樣,還可以根據(jù)各 添加劑的目的通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)適當(dāng)設(shè)定。通常為0. 001mg/L-5g/L,特別為0. l_3g/L左右。本發(fā)明的培養(yǎng)基除用于為了體細(xì)胞的增殖或保持的培養(yǎng)之外,當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞為干 細(xì)胞時(shí),可以用于干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。用于干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)時(shí),可以進(jìn)一步添加分化誘導(dǎo) 劑。作為分化誘導(dǎo)劑,可例舉細(xì)胞因子(各種白細(xì)胞介素、促紅細(xì)胞生成素、血小板生成素 等)、集落刺激因子(例如G-CSF等)、類固醇激素(地塞米松等)、吲哚(吲哚美辛)、噻唑 烷衍生物(羅西格列酮等)等??梢允褂盟鼈兊囊环N或多種。分化誘導(dǎo)劑的添加量也與以 往同樣,通常相對(duì)于培養(yǎng)基的總量可以加入IX 10,至IX 10_6重量%左右。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以含有上述各種添加劑的一種或多種。通??梢越M合含有多種 添加劑。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞培養(yǎng)本身可以按照與以往同樣的方法進(jìn)行, 通常在30-37°C的溫度和5% CO2的環(huán)境下以及5-21% O2的環(huán)境下進(jìn)行。本發(fā)明還提供用于構(gòu)成上述本發(fā)明的培養(yǎng)基的添加劑。因此,本發(fā)明的添加劑含 有上述Edg配體和血清素配體。進(jìn)一步優(yōu)選含有上述優(yōu)選的各種成分。還進(jìn)一步優(yōu)選含有 上述各種添加劑的一種或多種。就本發(fā)明的添加劑而言,如下添加劑是簡(jiǎn)便的,因而優(yōu)選, 所述添加劑具有通過(guò)溶解于水或基礎(chǔ)培養(yǎng)基中而可以形成上述本發(fā)明培養(yǎng)基的組成。這種 情況下,添加劑中所含的各種成分的摻混比例與培養(yǎng)基中各成分的含量的比例相同。需說(shuō) 明的是,作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,可例舉以往在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)中使用的上述各種培養(yǎng)基。以下根據(jù)實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明并不受這些實(shí)施例的限定。如沒(méi)有 特別說(shuō)明,“ %,,是指“重量% ”,各種添加物的濃度是指在培養(yǎng)基中的終濃度。因此,例如 “加入了 2.5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的低血清培養(yǎng)基C”是指加入在低血清 培養(yǎng)基C中的終濃度為2. 5ng/mL的bFGF量。實(shí)施例1實(shí)施例1 來(lái)自人脂肪組織的干細(xì)胞(hMADS)的培養(yǎng)
(1-1)配體的制備將2. Img的血清素鹽酸鹽(Sigma制備)溶解于IOmL DMEM(L0NZA制備),制備配體 1 (S-I),作為血清素配體。將2. 3mg 1-油?;苎字徕c鹽(LPA =CAYMAN制備)溶解于 IOmL PBS中,制備配體2 (S-2),作為Edg配體。進(jìn)一步將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mgLPA 溶解于IOmL PBS中,制備配體3 (S-3)。(l_2)hMADS 的增殖在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無(wú)機(jī)鹽類(上述全部無(wú)機(jī)鹽類)、維生素 類(上述的全部維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、D-半乳 糖、D-葡萄糖、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、 三碘甲腺原氨酸和運(yùn)鐵蛋白)的培養(yǎng)基中加入7X10_4% 2-巰基乙醇(2-Me)、100U/mL青 霉素·鏈霉素(GIBG0制備)、0. 5%胎牛血清(FCS)和2. 5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF),得到低血清培養(yǎng)基C。以各種濃度向低血清培養(yǎng)基C中添加(1-1)制備的S-I和/或S-2,得到低血清培 養(yǎng)基。具體是按照以下濃度添加S-I和/或S-2。在培養(yǎng)基C中添加了 0% S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S_2),在培養(yǎng)基C中添加了 0.001% S-I和0.2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0.2% S-2, 0. 001% S-1)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. 01% S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S_2,0. 01%
s-l)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. 1% S-I和0. 2% s-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S-2,0. 1% s-l)、在培養(yǎng)基C中添加了 S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S-2,1% S-l)、在培養(yǎng)基C中添加了 10% S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2 % S-2,10%
s-l)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. S-I和0% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S_l)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. S-I和0.002% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1 % S-I, 0. 002%S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. S-I和0. 02% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,0. 02% S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. 1% S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,0. 2% S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. 1% S-I和0. 5% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,0. 5% S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,1% S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 0. S-I和2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,2% S-2)、在培養(yǎng)基C中添加了 S-I和0% S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_l)、在培養(yǎng)基C中添加了 0% S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_2)、在培養(yǎng)基C中添加了 S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_l,S-2)。需說(shuō)明的是,S-I相當(dāng)于約10μΜ,1% 3_2相當(dāng)于約51^。
10
在DMEM/F12中加入非必需氨基酸(GIBC0制備)、7 X 1(Γ4% 2-ME、100U/L青霉 素·鏈霉素、10% FCS、2. 5ng/L bFGF,得到以往的含血清的培養(yǎng)基(以往培養(yǎng)基)將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)10,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hMADS,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。由使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù)的結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始的21天 期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。群體倍增數(shù)是進(jìn)行細(xì)胞分裂的次數(shù)(η)。細(xì)胞分裂中,1個(gè) 細(xì)胞分裂為2個(gè),因此,進(jìn)行η次分裂,則細(xì)胞數(shù)為2η。群體倍增數(shù)按照以下公式求出。群體倍增數(shù)(n) = Log⑵[(Pl計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)/Pl接種細(xì)胞數(shù))X (P2計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)/P2 接種細(xì)胞數(shù))X…](上式中,Pl、P2…表示第1繼代、第2繼代…)群體倍增數(shù)多1次則表示細(xì)胞數(shù)多2倍,多2次則表示細(xì)胞數(shù)多4倍,因此群體倍 增數(shù)多η次,則細(xì)胞倍數(shù)多2Χ倍。結(jié)果表示在
圖1-3中。圖1表示使S-2的濃度一定時(shí)的群體倍增數(shù)的變化。圖1中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基C( A),0.2% S-2(X),0.2% S-2,0. 001% S-l(-),0. 2% S-2,0. 01% S-I ( * ) ,0. 2% S-2,0. 1% S-I (+),0. 2% S-2,1% S-I ( Δ )和 0. 2% S-2,10% S-l( )的群體倍增數(shù)。圖2表示使S-I的濃度一定時(shí)的群體倍增數(shù)的變化。圖2中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基((▲)、(). 1%S-1(X),0. 1%S-1, 0. 002% S-2 (-)、0· 1 % S-1,0. 02% S-2( * )、0· 1 % S-1,0. 2% S-2 (+)、0· 1 % S-1,0. 5% S-2(A )、0· 1% S-1,1% S-2( )和 0. S-1,2% S_2 ( )的群體倍增數(shù)。上述低血清培養(yǎng)基C中加入S-3的結(jié)果如圖3所示。圖3中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基C ( ▲ )、1 % S-I ( )、1 % S-2 ( ■) 和1%S_3(·)的群體倍增數(shù)。(l_3)hMADS向脂肪細(xì)胞的分化將細(xì)胞以21000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. ImL脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEM、10% FCS,500 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西 格列酮)的96孔培養(yǎng)板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)使用(1-2)的以往培養(yǎng)基和在低血清培養(yǎng)基 C中加入S-3的培養(yǎng)基維持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)10天,進(jìn)行向脂肪細(xì)胞的分 化誘導(dǎo)。向脂肪細(xì)胞的分化通過(guò)油紅0染色確認(rèn)。結(jié)果表示在圖4(A)中。(l_4)hMADS向骨細(xì)胞的分化將細(xì)胞以10000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 5mL骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEM、10% FCS、200yM抗壞血酸、0. ΙμΜ地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的24孔培養(yǎng) 板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)使用(1-2)的以往培養(yǎng)基和在低血清培養(yǎng)基C中加入S-3的培養(yǎng) 基維持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)15天,進(jìn)行向骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向骨細(xì)胞的分 化通過(guò)茜素紅0染色確認(rèn)。結(jié)果表示在圖4(B)中。由圖4的結(jié)果可知,在低血清培養(yǎng)基C中加入S-3的培養(yǎng)基所培養(yǎng)的hMADS與在 含有10%血清的以往培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞同程度地染色,因此,同程度地分化為脂肪細(xì)胞 和骨細(xì)胞。由此可知,在這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞均具有保持未分化性的能力,作為干細(xì)胞的分化能力沒(méi)有差別。另外,即使使用人血清代替(1-2)中使用的FCS,也可確認(rèn)圖1-4所示的增殖和分 化傾向沒(méi)有變化。實(shí)施例2實(shí)施例2 來(lái)自人骨髓的間葉系干細(xì)胞(hMSC)的培養(yǎng)(2-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽(Sigma制備)溶解于IOmL DMEM(L0NZA制備),制備配體 1 (S-I),將其作為血清素配體。將2. 3mg 1-油?;苎字徕c鹽(LPA =CAYMAN制備)溶解于IOmL PBS,制備 配體2 (S-2),將1. 9mg 1-磷酸鞘氨醇(SIP =CAYMAN制備)溶解于IOmL DMEM中,制備配體 2(S-2’),將它們作為Edg配體。進(jìn)一步將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中,制備配體3 (S-3)。(2-2) hMSC 的增殖從實(shí)施例1中制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無(wú)機(jī)鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅),在所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及0. 5% FCS,得到低血清培養(yǎng)基Cl。在上述基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及1. 0% FCS,得到低血清培養(yǎng)
^S C2 ο以各種濃度在低血清培養(yǎng)基Cl中添加(2-1)制備的S-I和/或2,得到低血清培 養(yǎng)基。具體來(lái)說(shuō),是以以下濃度添加S-I和/或S-2。在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0% S-I和0. 2% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S_2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. 001% S-I和0.2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0.2% S-2,0. 001% S-1)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0.01% S-I和0.2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0.2% S-2,0. 01% S-1)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. S-I和0. 2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S-2, 0. 1% S-1)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 S-I和0. 2% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S_2,
1% s-1)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 10% S-I ^P 0.2% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 2% S-2,
10% s-1)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0.S-I和0% S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S_l)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. 1% S-I和0. 002% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,0. 002% S-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. S-I和0.02% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 1 % S-1,0. 02% s-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0.S-I和0. 2% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 1%S-1,
0. 2% s-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1,
121 % S-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. S-I和2% S_2的低血清培養(yǎng)基(0. 1% S-1, 2% S-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 S-I和0% S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_l)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0% S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 S-I和S-2的低血清培養(yǎng)基(1% S_l,l% S-2)、在低血清培養(yǎng)基Cl中加入了 0. 5%的FCS、1 % S-1和S-2的低血清培養(yǎng)基 (1% S-3,1% FCS)。以各種濃度在低血清培養(yǎng)基C2中添加(2-1)制備的S-I和/或2’,得到低血清培 養(yǎng)基。具體是以以下濃度添加S-I和/或S-2’。在低血清培養(yǎng)基C2中加入了S-2’的低血清培養(yǎng)基(0. l%S-2',
1% s-1)、在低血清培養(yǎng)基C2中加入了 S-I和0.02% S-2’的低血清培養(yǎng)基(0.02% S-2M% s-1)、在低血清培養(yǎng)基C2中加入了 S-I和0.01% S-2,的低血清培養(yǎng)基(0.01% S-2M% s-1)、在低血清培養(yǎng)基C2中加入了 S-I和0. 002% S_2’的低血清培養(yǎng)基(0. 002% S-2M% s-1)、在低血清培養(yǎng)基C2中加入了 1%5-1和0.0002%5_2,的低血清培養(yǎng)基(0.0002% S-2M% s-1)。將含有10% FCS、L-谷氨酰胺和抗生素的人間葉系干細(xì)胞專用培養(yǎng)基試劑盒 (hMSC Bullet試劑盒,LONZA制備)作為以往的培養(yǎng)基。將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)10,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hMSC,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)各個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),圖5-7是使用計(jì)數(shù)的結(jié)果計(jì)算自 培養(yǎng)開(kāi)始的19天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化,圖8是使用計(jì)數(shù)的結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)的開(kāi)始 18天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。結(jié)果如圖5-8所示。圖5表示使S-2的濃度一定時(shí)的群體倍增數(shù)的變化。圖5中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基Cl( ▲)、(). 2% S-2(X),0.2% S-2,0. 001% S-I (-)、0· 2% S-2,0. 01% S_l( * )、0· 2% S-2,0. 1% S_1 (+)、0· 2% S-2,1% S-I(A)、0· 2% S-2,10% S-l( )、1% S-l( □ )、1% S-2( ■)和 S-1,1% S-2 ( ·) 的群體倍增數(shù)。圖6表示使S-I的濃度一定時(shí)的群體倍增數(shù)的變化。圖6中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基Cl (▲)、(). S-I(X),0. 1% S-1,0. 002% S-2 (-)、0· 1% S-1,0. 02% S_2 ( * )、0· 1% S-1,0. 2% S-2 (+)、0. 1% S-1,1% S-2( )、0. 1% S-1, 2% S-2( O ) ,1% S-I ( □ ) ,1% S-2 ( ■)禾Π 1 % S-1,1% S-2 ( ·) 的群體倍增數(shù)。在上述低血清培養(yǎng)基Cl中加入S-3時(shí)的結(jié)果如圖7所示。
圖7中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、低血清培養(yǎng)基Cl( ▲ )、1 % S-l( S-2 ( ■ )、1 % S-3 ( ·)和 1 % S-3,1 % FCS ( )的群體倍增數(shù)。圖8表示使S-I的濃度一定時(shí)的群體倍增數(shù)的變化。圖8 中給出了 以往培養(yǎng)基(〇)、0. 1 % S-2M % S-K Δ )>0. 02% S-2M % s-l( )、0. 01 % S-2M % s-l( ■ )、0· 002 % S-2M % s-l( O )、0· 0002 % S-2M % S-I(D)的群體倍增數(shù)。(2-3)hMSC向脂肪細(xì)胞的分化將細(xì)胞以20000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. ImL脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEM、10% FCS,500 μ M異丁基甲基黃嘌呤(IBMS)、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西 格列酮)的96孔培養(yǎng)板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)使用(2-2)的以往培養(yǎng)基以及1%S-3,1% FCS保持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)14天,進(jìn)行向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向脂肪細(xì) 胞的分化通過(guò)油紅0染色確認(rèn)。結(jié)果如圖9(A)所示。(2_4)hMSC向骨細(xì)胞的分化將細(xì)胞以3000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 5mL骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEMU0% FCS,200 μ M抗壞血酸、0. 1 μ M地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的24孔培養(yǎng) 板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)使用(2-2)的以往培養(yǎng)基以及1%3-3,1% 05保持多個(gè)繼代,在 37°C,5% CO2中培養(yǎng)14天,進(jìn)行向骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向骨細(xì)胞的分化通過(guò)茜素紅S染色 確認(rèn)。結(jié)果如圖9(B)所示。由圖9的結(jié)果可知,在S_3,1%FCS中培養(yǎng)的hMADS與在含有10%血清的以往 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞同程度染色,因此,同程度地分化為脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞。由此可知,在 這些培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞均具有保持未分化性的能力,作為干細(xì)胞的分化能力沒(méi)有差別。另外,即使使用人血清代替(2-2)中使用的FCS,也可確認(rèn)圖5-9所示的增殖和分 化傾向沒(méi)有變化。另外,即使使用SlP代替LPA作為Edg配體,也可確認(rèn)分化傾向沒(méi)有變化。實(shí)施例3在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無(wú)機(jī)鹽類(上述全部無(wú)機(jī)鹽類)、維生素 類(上述的全部維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’-一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、D-半乳糖、 D-葡萄糖、胰島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、次黃嘌呤、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三 碘甲腺原氨酸和運(yùn)鐵蛋白)的培養(yǎng)基中加入7X10_4% 2-ME、100U/L青霉素 鏈霉素、0. 5% FCS、2.5ng/mL bFGF和1% (1-1)中制備的S-3,得到低血清培養(yǎng)基3 (1 % S-3LS)。除不含有FCS以外,按照與上述低血清培養(yǎng)基3同樣的組成,得到無(wú)血清培養(yǎng)基 3(1% S-3SF)。在DMEM/F12 中加入 lmg/L 非必需氨基酸(GIBC0 制備)、7 X 2_ME、100U/L 青 霉素·鏈霉素、10% FCS、2. 5ng/L bFGF,得到以往的含血清的培養(yǎng)基(以往培養(yǎng)基)將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)10,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hFB,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),由計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始的22 天期間的群體倍增數(shù)(η)。結(jié)果如圖10所示。圖10中給出了以往培養(yǎng)基(〇)、1%S_3LS(·)和1%S_3SF(A)的群體倍增數(shù)。實(shí)施例4實(shí)施例4 血清批次差異的降低效果(hMSC的培養(yǎng))(4-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中,制備配體3 (S-3)。(4-2) hMSC 的增殖從實(shí)施例1中制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無(wú)機(jī)鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅),在所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 100U/mL青霉素 鏈霉素(GIBC0制備)以及各1. 0%的批次不同的FCS,得到低血清培養(yǎng)基 C2 (FCS1-4)。在低血清培養(yǎng)基C2(FCS1_4)中添加(4-1)制備的1 % S_3,得到低血清培養(yǎng)基 (1% S-3,1% FCS (1-4))。在DMEM中分別加入10 %的L-谷氨酰胺、抗生素以及與上述4種批次對(duì)應(yīng)的 FCS(1-4),得到以往的含血清培養(yǎng)基(以往培養(yǎng)基(FCS1-4))。將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)10,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hMSC,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)各個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),使用計(jì)數(shù)的結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始 18天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。改變FCS批次時(shí)的群體倍增數(shù)的變化如圖11-14所示。 圖11-14中,以往培養(yǎng)基(FCS1-4)用(〇)表示。低血清培養(yǎng)基(1% S-3,1% FCS(1-4)) 用(·)表示。將使用以往培養(yǎng)基(FCS1-4)和低血清培養(yǎng)基(1 % S-3,1 % FCS (1-4))培養(yǎng)14天 時(shí)的群體倍增數(shù)(η)匯總于圖15表示。由圖11-15的結(jié)果可知,在低血清培養(yǎng)基(1% S_3,l% FCS)中,與含有10%血清 的以往培養(yǎng)基比較,F(xiàn)CS的制備批次差異對(duì)細(xì)胞增殖的影響降低。實(shí)施例5實(shí)施例5 在人血清中的培養(yǎng)(hMSC的培養(yǎng))(5-1)配體的制備將2. Img血清素鹽酸鹽和2. 3mg LPA溶解于IOmL PBS中,制備配體3 (S-3)。(5-2) hMSC 的增殖從實(shí)施例1中制備的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中除去次黃嘌呤和胸苷以及一部份無(wú)機(jī)鹽類(硫 酸銅、硝酸鐵(III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅),在所得的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 100U/mL青霉素·鏈霉素(GIBC0制備)以及各1. 0%的批次不同的人血清HS,得到低血清 培養(yǎng)基 C3 (HS1,2)。在低血清培養(yǎng)基C3 (HSl,2)中添加(5_1)制備的1 % S_3,得到低血清培養(yǎng)基(1% S-3,1% HS(1,2))。在DMEM中分別加入10% L-谷氨酰胺、抗生素以及與上述2種批次對(duì)應(yīng)的人血清 HS(1,2),得到以往的含血清培養(yǎng)基(以往培養(yǎng)基(HS 1,2)) 0將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)10,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hMSC,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。
使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)各個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),使用計(jì)數(shù)的結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始 的18天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。改變HS批次時(shí)的群體倍增數(shù)的變化如圖16、17所 示。以往培養(yǎng)基(HS1,2)用(〇)表示,低血清培養(yǎng)基(1% S-3,1% HS(1,2))用(·)表
7J\ ο由圖16、17的結(jié)果可知,可以在使用人血清的低血清培養(yǎng)基(1% S-3,1% HS)中培養(yǎng)。實(shí)施例6實(shí)施例6 來(lái)自人骨髓的間葉系干細(xì)胞(hMSC)的培養(yǎng)2在水中,在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無(wú)機(jī)鹽類(除硫酸銅、硝酸鐵 (III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅之外的全部無(wú)機(jī)鹽類)、維生素類(上述的全部 維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲腺原氨酸和運(yùn)鐵蛋 白)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入Ing/mL血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、2. 5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞 生長(zhǎng)因子(bFGF)、0. 02重量%人血清白蛋白和500 μ M N-乙酰半胱氨酸(NAC)、100U/mL青 霉素·鏈霉素(GIBG0制備)以及(1-1)中制備的S-3,得到無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A。在DMEM中加入100U/mL青霉素·鏈霉素和10% FBS,得到以往的含血清培養(yǎng)基 (以往培養(yǎng)基A)。將IOmL這些培養(yǎng)基分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)15,000個(gè) 細(xì)胞/mL接種hMSC,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),由計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始的18 天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。結(jié)果如圖18所示。如圖18所示,在本發(fā)明的無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A中培養(yǎng),則不管 是無(wú)血清還是只含有2種生長(zhǎng)因子,群體倍增數(shù)與在含有血清的以往培養(yǎng)基A中培養(yǎng)時(shí)同寸。hMSC向脂肪細(xì)胞的分化將細(xì)胞以30000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 3mL脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEM、10% FCS,500 μ M ΙΒΜΧ、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西格列酮)的48孔培養(yǎng) 板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)在以往培養(yǎng)基A和無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A中保持多個(gè)繼代,在37°C、 5% CO2中培養(yǎng)14天,進(jìn)行向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向脂肪細(xì)胞的分化通過(guò)油紅0染色確 認(rèn)。結(jié)果如圖19(A)所示。如圖19(A)所示,在本發(fā)明的無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A中將細(xì) 胞保持多個(gè)繼代后施加分化誘導(dǎo)時(shí),雖然比在含有血清的以往培養(yǎng)基A中保持多個(gè)繼代時(shí) 的情況稍少,但是細(xì)胞與以往培養(yǎng)基大致相同程度地被染色,可確認(rèn)有向脂肪細(xì)胞的明確 的分化。hMSC向骨細(xì)胞的分化將細(xì)胞以3000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 7mL骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (01^11、10% 05、20(^11抗壞血酸、0.1“11地塞米松、101111 β-磷酸甘油酯)的12孔培養(yǎng)板 的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)在以往培養(yǎng)基和無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A中保持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)21天,進(jìn)行向骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向骨細(xì)胞的分化通過(guò)茜素紅S染色確認(rèn)。
16
實(shí)施例7實(shí)施例7 來(lái)自人骨髓的間葉系干細(xì)胞(hMSC)的培養(yǎng)3在水中,在含有氨基酸類(上述全部氨基酸類)、無(wú)機(jī)鹽類(除硫酸銅、硝酸鐵 (III)、硫酸鐵、氯化鎂、磷酸氫二鈉、硫酸鋅之外的全部無(wú)機(jī)鹽類)、維生素類(上述的全部 維生素類)以及其它添加劑(腺苷5’ - 一磷酸、皮質(zhì)酮、乙醇胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、胰 島素、還原型谷胱甘肽、硫辛酸、酚紅、孕酮、腐胺、丙酮酸、三碘甲腺原氨酸和運(yùn)鐵蛋白)的 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0.02重量%人血清白蛋白和500 μ M N-乙酰半胱氨酸(NAC)、100U/mL 青霉素 鏈霉素(GIBG0制備)以及(1-1)中制備的S-3,得到無(wú)血清增殖培養(yǎng)基B。將所得的無(wú)血清增殖培養(yǎng)基B以及實(shí)施例6中制備的無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A以及以 往培養(yǎng)基各IOmL分別加入到直徑IOOmm的培養(yǎng)皿中,以初始細(xì)胞數(shù)20,000個(gè)細(xì)胞/mL接 種hMSC,在37°C下、5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)每個(gè)細(xì)胞繼代的細(xì)胞數(shù),由計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算自培養(yǎng)開(kāi)始的21 天期間的群體倍增數(shù)(η)的變化。結(jié)果如圖20所示。如圖20所示,在不含有生長(zhǎng)因子的本發(fā)明的無(wú)血清增殖培養(yǎng) 基B中培養(yǎng)時(shí),與在含有生長(zhǎng)因子的本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基B中培養(yǎng)時(shí)、以及在往培養(yǎng)基A 中培養(yǎng)時(shí)比較,群體倍增數(shù)減少,但細(xì)胞可以增殖。hMSC向脂肪細(xì)胞的分化將細(xì)胞以30000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 3mL脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEMU0% FCS,500yM IBMX、1 μ M地塞米松、1 μ M胰島素、1 μ M羅西格列酮)的48孔培 養(yǎng)板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)在以往培養(yǎng)基A或無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A或者無(wú)血清增殖培養(yǎng)基B 中保持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)14天,進(jìn)行向脂肪細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向脂肪細(xì)胞 的分化通過(guò)油紅0染色確認(rèn)。結(jié)果如圖21㈧所示。如圖21㈧所示,分別在3種培養(yǎng)基中保持繼代后施加分 化誘導(dǎo)的細(xì)胞被相同程度地染色,在不含有生長(zhǎng)因子的本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基B中保持繼 代后施加分化誘導(dǎo)時(shí),也可確認(rèn)與含有血清的以往培養(yǎng)基同等地分化。hMSC向骨細(xì)胞的分化將細(xì)胞以3000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度轉(zhuǎn)移至含有0. 7mL骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基 (DMEMU0% FCS,200 μ M抗壞血酸、0. 1 μ M地塞米松、IOmM β -磷酸甘油酯)的12孔培養(yǎng) 板的孔中,所述細(xì)胞已經(jīng)在以往培養(yǎng)基A或無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A或者無(wú)血清增殖培養(yǎng)基B 中保持多個(gè)繼代,在37°C、5% CO2中培養(yǎng)21天,進(jìn)行向骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。向骨細(xì)胞的分 化通過(guò)茜素紅S染色確認(rèn)。結(jié)果如圖21(A)所示。如圖21(A)所示,在無(wú)血清增殖培養(yǎng)基A或無(wú)血清增殖培 養(yǎng)基B中保持繼代后施加分化誘導(dǎo)的細(xì)胞,與在以往培養(yǎng)基A中保持多個(gè)繼代的情況相比, 被相同程度地染色,可確認(rèn)向骨細(xì)胞的分化。可以確認(rèn),本發(fā)明的無(wú)血清培養(yǎng)基在即使不含 有生長(zhǎng)因子的情況下,也可以保持向骨細(xì)胞的分化能力。附圖簡(jiǎn)述圖1是表示實(shí)施例1中得到的人脂肪組織源性干細(xì)胞(hMADS)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖2是表示實(shí)施例1中得到的人脂肪組織源性干細(xì)胞(hMADS)的群體倍增數(shù)變化的圖表。圖3是表示實(shí)施例1中得到的人脂肪組織源性干細(xì)胞(hMADS)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖4表示人脂肪組織源性干細(xì)胞(hMADS)向脂肪細(xì)胞的分化㈧以及向骨細(xì)胞的 分化⑶。圖5是表示實(shí)施例2所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖6是表示實(shí)施例2所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖7是表示實(shí)施例2所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖8是表示實(shí)施例2所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖9表示人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)向脂肪細(xì)胞的分化㈧以及向骨細(xì)胞 的分化⑶。圖10是表示實(shí)施例3所得的人成纖維細(xì)胞(hFB)的群體倍增數(shù)變化的圖表。圖11是表示實(shí)施例4所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖12是表示實(shí)施例4所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖13是表示實(shí)施例4所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖14是表示實(shí)施例4所得的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化 的圖表。圖15是表示實(shí)施例4中得到的、在含有不同批次胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 14天的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)的圖。圖16是表示實(shí)施例5中得到的、在含有人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人骨髓源性間葉 系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化的圖表。圖17是表示實(shí)施例5中得到的、在含有人血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人骨髓源性間葉 系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變化的圖表。圖18是表示實(shí)施例6中得到的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變 化的圖表。圖19是表示實(shí)施例6中得到的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)向脂肪細(xì)胞的分 化(A)以及向骨細(xì)胞的分化(B)。圖20是表示實(shí)施例7中得到的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)的群體倍增數(shù)變 化的圖表。圖21是表示實(shí)施例7中得到的人骨髓源性間葉系干細(xì)胞(hMSC)向脂肪細(xì)胞的分 化(A)以及向骨細(xì)胞的分化(B)。
權(quán)利要求
哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基含有內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體。
2.權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基為無(wú)血清或低血清培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基,其中,內(nèi)皮細(xì)胞分化基因家族受體的上述配體在培養(yǎng) 基中的濃度為0. 01-100 μ Μ,血清素受體的上述配體在培養(yǎng)基中的濃度為0. 1-100 μ Μ。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,其中,內(nèi)皮細(xì)胞分化基因家族受體的上述配 體為選自溶血磷脂酸(LPA)及其鹽、鞘氨醇一磷酸(SlP)以及內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家 族受體的激動(dòng)劑的至少一種。
5.權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基,其中,內(nèi)皮細(xì)胞分化基因家族受體的上述配體為選自 溶血磷脂酸(LPA)及其鹽的至少一種,其在培養(yǎng)基中的濃度為0. 25-10 μ M ;血清素受體的 上述配體在培養(yǎng)基中的濃度為0. 25-20 μ Μ。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,其中,血清素受體的上述配體為選自血清素、 其鹽以及血清素受體的激動(dòng)劑的至少一種。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基進(jìn)一步含有抗氧化劑。
8.權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基,其中,上述抗氧化劑為選自N-乙酰半胱氨酸和L-半胱氨 酸的至少一種。
9.權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)基,其中,上述抗氧化劑在培養(yǎng)基中的濃度為 0. OlmM-lOmM。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基進(jìn)一步含有動(dòng)物血清白蛋白。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,其中,上述血清白蛋白在培養(yǎng)基中的濃度 為 0. 0001-10 重量 %。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基進(jìn)一步含有生長(zhǎng)因子。
13.權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)基,其中,上述生長(zhǎng)因子為選自血小板源性生長(zhǎng)因子 (PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的至少一種。
14.權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基,其中,培養(yǎng)基中所含的上述生長(zhǎng)因子是血小板源性生 長(zhǎng)因子(PDGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)兩種。
15.權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基,其中,上述生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中的濃度為 0.1-lOOng/mL。
16.哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基的添加劑,該添加劑含有內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族 受體的配體以及血清素受體的配體。
17.權(quán)利要求16所述的添加劑,其中,內(nèi)皮細(xì)胞分化基因家族受體的上述配體為選自 溶血磷脂酸(LPA)及其鹽、鞘氨醇一磷酸(SlP)以及內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族受體的 激動(dòng)劑的至少一種。
18.權(quán)利要求16或17所述的添加劑,其中,血清素受體的上述配體為選自血清素、其鹽 以及血清素受體的激動(dòng)劑的至少一種。
19.權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的添加劑,該添加劑進(jìn)一步含有抗氧化劑。
20.權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的添加劑,該添加劑進(jìn)一步含有動(dòng)物血清白蛋白。
21.權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)所述的添加劑,該添加劑進(jìn)一步含有生長(zhǎng)因子。
22.權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的添加劑,該添加劑具有通過(guò)溶解于水或基礎(chǔ)培養(yǎng)基而形成權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基的組成。
23.哺乳動(dòng)物體細(xì)胞的培養(yǎng)方法,該方法包括在權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞用培養(yǎng)基以及構(gòu)成該培養(yǎng)基的添加劑,所述培養(yǎng)基在培養(yǎng)哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞時(shí)在盡可能地抑制向培養(yǎng)基中添加血清或者是不添加血清的情況下可以使哺乳動(dòng)物體細(xì)胞有效增殖。通過(guò)在培養(yǎng)基中摻混內(nèi)皮細(xì)胞分化基因(Edg)家族受體的配體以及血清素受體的配體,即使在培養(yǎng)基完全不含或者只少量含有血清的情況下也可以使哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞有效增殖。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101918542SQ20088012398
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者堀田佳之, 山隈晴美, 杉村逸郎 申請(qǐng)人:富士瑞必歐株式會(huì)社