專利名稱：：推定的細(xì)胞激動(dòng)素受體和其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物中性狀表達(dá)，所述性狀諸如植株高度、植物生物量(biomass)、頂芽發(fā)育、發(fā)枝、能育性、開花、葉面積、衰老、種子萌發(fā)、種子產(chǎn)量、種子重量、莖發(fā)育、糧食產(chǎn)量(grainyield)、分蘗數(shù)、花分生組織發(fā)育和根發(fā)育。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)植物中性狀表達(dá)的方法和材料。背景已知傳統(tǒng)植物育種技術(shù)導(dǎo)致了農(nóng)作物的改良。這些技術(shù)諸如選擇性育種和雜交，包括將來自植物的基因與不同遺傳背景雜交以產(chǎn)生各種特征的后代。選擇這些后代以獲得表達(dá)期望的性狀的植物，且經(jīng)過多次回交或自交消除有害的性狀以最終產(chǎn)生具有期望的特征的后代。盡管已經(jīng)證明傳統(tǒng)育種方法可用于增強(qiáng)或改善多種作物的特征，但是這些方法包括使數(shù)百或數(shù)千個(gè)基因雜交，而其中為改進(jìn)的特征或性狀僅選擇了數(shù)個(gè)基因。而且，這些方法花費(fèi)許多年來雜交、從大量后代群體選擇大量林系并將其回交數(shù)代以獲得期望的性狀。一些不期望的性狀也可能出現(xiàn)在植物中，因?yàn)槭褂脗鹘y(tǒng)育種方法通常難以選"l奪一種性狀而不影響其它性狀。傳統(tǒng)植物選擇的另一缺點(diǎn)是育種局限于性相容(sexuallycompatible)的植物，且因此傳統(tǒng)育種方法通常由于特定物種的種質(zhì)中缺少遺傳多樣性而受限。而且，已經(jīng)證明傳統(tǒng)育種方法在改良許多多基因性狀諸如增加的疾病4元性時(shí)相當(dāng)無歲文。盡管近年來作物產(chǎn)量有相當(dāng)可觀的進(jìn)展，但仍需要實(shí)現(xiàn)主要糧食作物的顯著改良以滿足全球的需求。包括在作物中表達(dá)單個(gè)轉(zhuǎn)基因的植物生物技術(shù)的最新進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致成功地商業(yè)上引入新的植物性狀諸如除草劑抗性、昆蟲抗性和病毒抗性。然而，有顯著價(jià)值的單基因性狀的名單相對車交少，因此作物中單個(gè)轉(zhuǎn)基因表達(dá)對于改良作物不實(shí)用。近年來，已經(jīng)嘗試分離各種植物物種中的一些已知化學(xué)地修飾植物中的DNA序列的基因，從而可表征在植物形態(tài)學(xué)中的作用。一種已知的方法包括分離S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)基因，該酶是已知調(diào)節(jié)DNA曱基化的關(guān)鍵酶。盡管在植物中觀察到一些形態(tài)學(xué)變化，但這些表型性狀都被證明不能對改進(jìn)不同植物中作物產(chǎn)量有顯著益處。由于SAHH基因和下游分子之間相互作用的復(fù)雜性，對涉及DNA曱基化和基因表達(dá)的機(jī)制了解匱乏，并因此限制了改良作物的現(xiàn)有方法。因此，需要提供新方法來克服或至少改善上述缺點(diǎn)中的一種或多種。需要產(chǎn)生具有可用于改良作物和其它商業(yè)和科學(xué)應(yīng)用的性狀的植物的新方法。概述本發(fā)明人鑒定了包括根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽，其參與植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細(xì)胞激動(dòng)素是在響應(yīng)性植物細(xì)胞中發(fā)揮作用以提供特殊生物化學(xué)和生理作用的植物激素(或植物的激素)。植物激素首先被特殊受體識(shí)別，所述受體開始激素信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以刺激對植物生長和發(fā)育重要的細(xì)胞響應(yīng)。盡管激素受體在從開花植物到人類的許多真核生物中已經(jīng)廣泛研究，但仍缺少對植物激素受體的詳盡理解。已懷疑植物激素結(jié)合蛋白提供了這種受體的候選物。本發(fā)明人鑒定了當(dāng)減少包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽表達(dá)時(shí)，單子葉和雙子葉物種中植物生物量和作物產(chǎn)量的顯著增加。相反，增加包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽的表達(dá)在一些植物提供提早的開花。因此，可操縱包括根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽的表達(dá)以獲得對于改良作物和其它商業(yè)和科學(xué)應(yīng)用重要的期望的性狀。因此根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一種調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀表達(dá)的方法，該方法包括調(diào)節(jié)植物對至少一種多肽的表達(dá)的步驟，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58,乂人氨基酸77至氨基酸485，從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了植物中至少一種性狀的表達(dá)。在一實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)植物對所述多肽的表達(dá)是通過將調(diào)節(jié)所述多肽表達(dá)的至少一種多核苷酸引入所述植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，提供如上限定的方法，其中調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的步驟包括減少所述多肽的表達(dá)。減少植物對多肽的表達(dá)的步驟可包括將減少所述多肽表達(dá)的多核苷酸引入植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，該多核苷酸選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自#4居SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸；iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；iv)包括含有至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苦酸，所述至少9個(gè)相鄰核酸殘基選自與由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的多核苷酸互補(bǔ)的核酸序列；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸。在一實(shí)施方案中，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一實(shí)施方案中，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在又另一實(shí)施方案中，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸序列具有至少卯％序列同一性的氨基S臾序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在又進(jìn)一步實(shí)施方案中，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一實(shí)施方案中，提供如上限定的方法，其中調(diào)節(jié)所述多肽表達(dá)的步驟包括增加所述多肽表達(dá)。增加植物對所述多肽的表達(dá)的步驟可包括將增加所述多肽表達(dá)的多核香酸引入所述植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在一實(shí)施方案中，該多核苷酸選自以下組成的組i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核S吏序列的多核苷酸，ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7,從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485，從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；和iii)編碼包括與沖艮據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苦酸。在某些實(shí)施方案中，部分ii)的多核苷酸編碼的多肽包括胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域。在某些實(shí)施方案中，部分ii)的多核苷酸編碼的多肽包括胞外細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合域。在一實(shí)施方案中，植物中至少一種性狀選自植，f朱高度、植物生物量、頂芽發(fā)育、發(fā)枝、能育性、開花、葉面積、衰老、種子萌發(fā)、種子產(chǎn)量、種子重量、莖發(fā)育、糧食產(chǎn)量、分蘗數(shù)、花分生組織發(fā)育和根發(fā)育的任何一種或多種組成的組。在一實(shí)施方案中，如上限定的減少多肽表達(dá)導(dǎo)致植物中性狀表達(dá)改變，包括但不限于與其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物相比時(shí)，所述植物中增加的發(fā)枝、提高的種子產(chǎn)量、提高的植物生物量、提高的糧食產(chǎn)量、增加的分蘗數(shù)、增加的葉面積、延遲的種子萌發(fā)、減少的頂端優(yōu)勢和延遲的開花的任何一種或多種或其組合。在另一實(shí)施方案中，多肽表達(dá)增加調(diào)節(jié)至少一種性狀，所述性狀選自相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，所述植物中提早的開花、矮小、減少的葉數(shù)目、早衰、提早的種子萌發(fā)、延遲和減少的蓮座葉形成、增加的幼苗根生長的任何一種或多種或其組合組成的組。植物生物量增加可有用于增加葉類蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。增加的發(fā)枝和生物量累積還可有用于生產(chǎn)牧草和各種谷類作物。植物生物量增加可導(dǎo)致豐富的可用作生物燃料的來源的纖維素乙醇(諸如生物乙醇)。也預(yù)期植物生物量的增加促進(jìn)更有效地施用植物肥料。因此，植物生物量增加可防止諸如肥料流失等環(huán)境問題，肥料流失會(huì)導(dǎo)致多種環(huán)境問題諸如藻華。而且，多肽的表達(dá)增加可導(dǎo)致植物諸如甘蔗提早開花。由于在常規(guī)ii物育種實(shí)踐中可幫助植物育種者，這可有用于商業(yè)栽培品種。類似地，多肽的表達(dá)增加造成的矮小表型在產(chǎn)生觀賞植物方面也可為期望的。在第二方面，提供一種分離的多核苷酸，其選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自4艮據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸；和iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核香酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70°/。序列同一性的氨基酸序列；iv)包括包含選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸；其中所述多核苷酸能夠降低調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或vi)與i)至v)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，或vii)在嚴(yán)格性條件下與i)至v)的任一種多核苷酸雜交的多核苷酸。根據(jù)第三方面，提供一種分離的多核苷酸，其選自以下組成的組i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列的多核苷酸；ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405,和從氨基酸406至氨基酸438,或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)編碼包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苦酸；和iv)由編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列組成的多核苷酸；其中所述多核苷酸能夠增加調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或v)與i)至iv)的任一種多核芬酸互補(bǔ)的多核苷酸；或vi)在嚴(yán)格性條件下與i)至iv)的任一種多核苷酸雜交的多核苷酸。根據(jù)第四方面，提供包括根據(jù)第二方面或第三方面的多核苷酸的載體。根據(jù)第五方面，提供以根據(jù)第二方面或第三方面的多核苷酸或根據(jù)第四方面的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)月包。根據(jù)第六方面，提供包括根據(jù)第五方面的宿主細(xì)胞的植物。根據(jù)第七方面，提供一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括如下步驟(a)提供調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)的多核苷酸，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:l的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191,從氨基酸231至氨基酸405,和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽；(b)以步驟(a)的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物、植物部分或植物細(xì)胞，并(c)栽培所轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。在一實(shí)施方案中，第七方面的步驟(a)中的多核苷酸包括選自以下組成的組的分離的多核苷酸i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸；和iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苦酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核普酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；iv)包括包含選自4艮據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸；其中所述多核普酸能夠調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或vi)與i)至v)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，或vii)在嚴(yán)格性條件下與i)至v)的任一種多核苷酸雜交的多核苷酸。在另一實(shí)施方案中，第七方面的步驟(a)中的多核苷酸包括選自以下組成的組的分離的多核苷酸i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列的多核苷酸，ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58,從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438,或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)編碼包括與才艮據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸；和iv)由編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列組成的多核普酸，其中所述多核苷酸能夠增加調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或v)與i)至iv)的任一種多核苦酸互補(bǔ)的多核苷酸，或vi)在嚴(yán)格性條件下與i)至iv)的任一種多核苷酸雜交的多核苷酸。在根據(jù)第七方面的方法的一實(shí)施方案中，步驟(c)中所述栽培是通過在允許轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述植物部分選自根、莖、葉、芽、花、莖干(shoot)、種子和枝的任何一種或多種組成的組。在一實(shí)施方案中，提供根據(jù)第六方面的植物，其中所述植物是單子葉植物。在另一實(shí)施方案中，提供根據(jù)第六方面的植物，其中所述植物是雙子葉植物。在某些實(shí)施方案中，所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、水稻、高粱、黍(millet)、莧菜、聲葦、甜茅(sweetgrass)、甘蔗、竹子、牧草(foddergrass)、拂子茅(diamondgrass)和草皮草(turfgrass)的任何一種或多種組成的組。根據(jù)第八方面，提供根據(jù)第七方面的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、水稻、高粱、黍、莧菜、蘆草、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草的任何一種或多種組成的組。在一實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)基因植物能夠產(chǎn)生能育的植物。根據(jù)第九方面，提供如上限定的植物的部分或種子。所述部分可選自根、莖、葉、芽、花、莖干、種子和枝的任何一種或多種組成的組。根據(jù)第十方面，提供從如上限定的植物或如上限定的部分或種子再生的植物或其繁殖材料。根據(jù)第十一方面，提供以如上限定的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物用于植物生物量生產(chǎn)的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、水稻、高粱、黍、莧菜、蘆葦、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草的任何一種或多種組成的組。根據(jù)第十二方面，提供根據(jù)第十一方面的應(yīng)用，其中所述植物生物量生產(chǎn)是為了生產(chǎn)生物燃料。根據(jù)第十三方面，提供一種分離的多肽，其選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58,從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191,從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了植物中至少一種性狀的表達(dá)。定義本文所用的以下詞和術(shù)語應(yīng)具有所示的含義本文所用的術(shù)語"相鄰"指分別存在于多肽或多核苷酸中的連續(xù)或不間斷的一系列氨基酸殘基或核酸殘基。例如，"相鄰氨基酸殘基"應(yīng)理解為包括至少約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約12、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約75、約100、約150、約200、約250、約300、約350或約400、約450或約485個(gè)氨基酸左右的相鄰氨基酸序列。類似地，"相鄰核酸殘基"應(yīng)理解為包括至少約12、約15、約18、約21、約24、約27、約30、約36、約45、約60、約75、約卯、約120、約150、約225、約300、約450、約600、約750、約900、約1050、約1200、約1350、約1450、約1550、約1650或約1775個(gè)核苷酸左右的相鄰核酸序列。術(shù)語"細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"指分子跨細(xì)胞膜傳播胞外信號(hào)到變成胞內(nèi)信號(hào)。隨后該信號(hào)可刺激細(xì)胞響應(yīng)。參與細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的多肽分子通常是受體和非受體蛋白激酶、受體和非受體蛋白磷酸酶、以及轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性可通過測量植物中表達(dá)的細(xì)胞激動(dòng)素水平或通過測量細(xì)胞激動(dòng)素和參與細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的多肽分子之間的結(jié)合活性來測量。術(shù)語"雜交"當(dāng)提到核酸時(shí)指其中兩條單鏈多核苷酸非共價(jià)地結(jié)合以形成穩(wěn)定雙鏈多核苷酸的過程。術(shù)語"雜交"還可指三鏈雜交。所得的雙鏈或三鏈多核苷酸是"雜合體(hybrid)"。多核苷酸群體中形成穩(wěn)定雜合體的比例本文稱為"雜交程度"。雜交和雜交強(qiáng)度(即核酸之間締合的強(qiáng)度)取決于一些因素，諸如核酸之間互補(bǔ)程度、涉及的條件的嚴(yán)格性、形成的雜合體的熱熔點(diǎn)(thermalmeltingpoint,Tm)、和核酸中G:C比，如下文進(jìn)一步詳細(xì)討論的。本文所用的術(shù)語"引物"指在開始合成引物延伸產(chǎn)物的條件下，即，存在溶于合適的緩沖液(通常包括pH緩沖劑和輔因子)中的四種不同核苷酸三磷酸酯和聚合酶并在合適的溫度，當(dāng)與核酸才莫;仗退火時(shí)能夠作為開始DNA合成的點(diǎn)的核苦酸聚合物。本發(fā)明擴(kuò)增步驟中使用的SI物可與靶序列完全互補(bǔ)或大ft互外卜。術(shù)語"性狀"和"表型"互換地使用并包含任何特征，尤其是可使一種植物區(qū)別于另一種的特征。示例性性狀包括植林高度、植物生物量、頂芽發(fā)育程度、發(fā)枝程度、植物、種子或花粉能育性、開花數(shù)或開始開花、葉面積、衰老開始、種子萌發(fā)開始、種子產(chǎn)量、總種子重量或單個(gè)種子重量、莖發(fā)育程度、糧食產(chǎn)量、分蘗數(shù)、花分生組織發(fā)育程度和根發(fā)育程度的任何一種或多種。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"當(dāng)使用涉及組織或植物時(shí)分別指包括含有轉(zhuǎn)基因或通過引入轉(zhuǎn)基因而改變其基因組的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的組織或植物。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織和植物可通過多種方法產(chǎn)生，包括通過人類干涉的方式(諸如以本文所述的方法)引入包含核酸(DNA或RNA)的"轉(zhuǎn)基因"到耙細(xì)胞中或?qū)⑥D(zhuǎn)基因整合到靶細(xì)胞的染色體。詞"大致地"不排除"完全地"，如"大致地不含"Y的組合物可完全不含Y。必要時(shí)，詞"大致地"可從本發(fā)明定義中省略。除非另外指明，否則術(shù)語"包括(comprising)"和"包括(comprise)"和其語法變體意為代表"開放"或"內(nèi)含"的說法，以使其包括所指出的元素但也允許含有其它未指出的元素。本文所用的術(shù)語"約"在制劑成分的濃度情況中通常指所示值的+/-5%,更通常所示值的+/-4%，更通常所示值的+/-3%,更通常所示值的+/-2%,甚至更通常所示值的+/-1%,且甚至更通常所示值的+/-0.5%。在本公開中，某些實(shí)施方案可以一定范圍的形式公開。應(yīng)理解的是，范圍形式中的描述僅是為了方便和簡潔，不應(yīng)被解釋為對所公開范圍的固定限制。因此，范圍的描述應(yīng)認(rèn)為具有具體公開的所有可能子范圍以及該范圍中的單獨(dú)數(shù)值。例如，范圍的描述諸如1到6應(yīng)認(rèn)為具有具體公開的子范圍，諸如,人1到3、從1到4、從1到5、從2到4、,人2到6、從3到6等，以及該范圍中的單獨(dú)數(shù)值，例如l、2、3、4、5和6。這適用于所有范圍而不論范圍的寬度如何。在范圍描述多肽中的氨基酸殘基或多核苷酸中的核酸殘基的情況中，應(yīng)理解的是，范圍的描述包括范圍的第一數(shù)值和最后數(shù)值。此外在該情況中，范圍的描述不意為包含落入該范圍的單獨(dú)氨基酸或核酸殘基。例如，范圍的描述諸如"從氨基酸1至氨基酸7"應(yīng)認(rèn)為是指跨越并包括位置1、2、3、4、5、6和7的氨基酸的氨基酸序列，而不是指位于該范圍內(nèi)的任何一個(gè)或多個(gè)單獨(dú)氨基酸，例如僅氨基酸1、僅氨基酸2、氨基酸1和2或等等。實(shí)施方案的詳細(xì)公開下面將公開調(diào)節(jié)植物中性狀表達(dá)的新方法以及用于該新方法和該新方法產(chǎn)生的材料的示例性、非限制性實(shí)施方案。本發(fā)明是基于鑒定到包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽參與植物中的細(xì)胞激動(dòng)素-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細(xì)胞激動(dòng)素是一類以多種方式調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的植物激素。它們積極地促進(jìn)植物中細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長和分化和其它生長調(diào)節(jié)功能。認(rèn)為細(xì)胞激動(dòng)素在從細(xì)胞分裂和擴(kuò)大到形成花和果實(shí)的植物發(fā)育的所有階段起重要作用。例如，細(xì)胞激動(dòng)素能夠促進(jìn)芽伸長和葉生長，并抑制衰老，累積氨基酸和開放氣孔。細(xì)胞激動(dòng)素的基本結(jié)構(gòu)包括6-氨基。票呤，其氨基被通常攜帶5個(gè)碳原子的取代基修飾。高等植物中天然產(chǎn)生的活性細(xì)胞激動(dòng)素主要是從生物合成的前體產(chǎn)生的玉米素和異戊烯基腺噪呤。細(xì)胞激動(dòng)素水平升高與高等植物中種子的發(fā)育相關(guān)，因?yàn)橐炎C明這些與發(fā)育中的玉米粒和其它谷物的胚乳中的最大有絲分裂活性一致。細(xì)胞激動(dòng)素生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本分子機(jī)制最近才變得清楚。細(xì)胞激動(dòng)素受體家族的三個(gè)成員，其為傳感組氨酸激酶(sensorhistidinekinase),已被鑒定并具有類似于包含磷酸中繼機(jī)制的細(xì)菌兩成分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能。這三種細(xì)胞激動(dòng)素受體AHK2、AHK3和CRE1/AHK4顯示高程度的序列同一性，但各具有獨(dú)特的特征并對正常細(xì)胞激動(dòng)素感知和植物生長是需要的。盡管對這三種受體已經(jīng)進(jìn)行突變分析，但是這三種受體的任何一種的突變都沒有導(dǎo)致植物表型的顯著變化。相反，所有三種受體的突變(即三突變體)造成矮化和不育植物。這些表型未見于本發(fā)明的反義突變體，如下文所述的。在擬南芥(v4ra&Wo;wi力細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，組氨酸蛋白激酶(AHK)作為細(xì)胞激動(dòng)素受體并經(jīng)由組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(AHP)從AHK傳遞信號(hào)到核響應(yīng)調(diào)節(jié)子(ARR)。AHP以細(xì)胞激動(dòng)素依賴性方式從細(xì)胞質(zhì)穿梭到細(xì)胞核并發(fā)送信號(hào)到細(xì)胞核中的ARR,ARR可活化或抑制植物細(xì)胞中參與植物生長和發(fā)育的基因的轉(zhuǎn)錄。本文公開了從擬南齊046/<^戸&^//"朋)植抹純化的分離的多肽H0G1(包括列于SEQIDNO:1的氨基酸序列)，其以高親合力結(jié)合于細(xì)胞激動(dòng)素。而且，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定調(diào)節(jié)根據(jù)SEQIDNO:l的多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)單子葉和雙子葉植物二者中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致植物中不同性狀的表達(dá)，盡管缺少組氨酸激酶域。在一些實(shí)施方案中，公開的多肽還缺少SAHH活性。在某些實(shí)施方案中，公開的多肽包括跨膜域。因此本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀表達(dá)的方法，該方法包括調(diào)節(jié)植物對至少一種多肽的表達(dá)的步驟，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485，從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基S交序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了植物中至少一種性狀的表達(dá)。使用本發(fā)明方法可調(diào)節(jié)任何細(xì)胞激動(dòng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。目前已知有超過200種天然和合成的細(xì)胞激動(dòng)素(http:〃www.plant-hormones.info/cytokinins.htm;Arteca,PlantGrowthSubstances:PrinciplesandApplications(才直4勿生長4勿質(zhì)原J里牙口應(yīng)用)，NewYork:Chapman&Hall(1996);Salisbury禾口Ross,/Vawf/V^w'o/ogypp.357-407,531-548(1992))。示例性天然產(chǎn)生的細(xì)胞激動(dòng)素包括玉米素、激動(dòng)素、異戊烯基腺嘌呤和6-千基氨基嘌呤，而苯基脲類諸如二苯基脲代表示例性合成的細(xì)胞激動(dòng)素類型?？梢远喾N方式產(chǎn)生的細(xì)胞激動(dòng)素的軛合形式也是已知的并包括在本發(fā)明范圍中。例如，可通過連接葡萄糖的碳1到玉米素側(cè)鏈上的羥基而形成糖苷，或碳1可連接到腺噤呤環(huán)上位置7或9的C-N鍵的N原子。此外公開的方法可應(yīng)用于期望在其中調(diào)節(jié)一種或多種性狀的任何植物。本文所用的術(shù)語"植物"還包括全植抹、植物的祖先和后代以及植物部分，包括種子、莖干、莖、葉、根(包括塊莖)、花以及組織和器官，其中前述的每種包括本發(fā)明的多核苦酸或多肽。術(shù)語"植物"還包括植物細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)物、愈傷組織、胚、分生組織區(qū)、配子體、孢子體、花粉和小孢子，同樣其中前述的每種包括目標(biāo)多核苷酸。尤其可用于本發(fā)明方法的植物包括所有單子葉和雙子葉植物，諸如糧食作物、草、草料或飼料豆類、觀賞植物、樹木或灌木以及用于生產(chǎn)乙醇(生物燃料)的纖維素生物量的植物，選自包括如下的名單槭屬G4cwspp.)、獼lf吳才兆屬(v4"/w/c/iflspp.)、冰草屬(jgra;yra"spp.)、蔥屬(^〃z'm附spp.)、莧屬(^柳ara"Z/zw51spp.)、菠蘿(」"朋oscoms)、番篇枝屬(^4""o"aspp.)、芽屬(j;^'wawspp.)、扣乂南芥、落花生屬(Jrafc/z/sspp)、-菠蘿蜜屬(^rtocarpusspp.)、蘆,(J^aragwsoJ^c/wafo)、燕麥(』vewasa"Va)、楊沖兆(Jve/r/zo"caraw6o/a)、冬瓜(5ew/"cosa/n^//(ia)、巴西果C6eW/o〃W/aexce/sea)、話計(jì)菜(8etovw/gan'51)、蕓苔屬(5ra肌'caspp.)、CW"6ay^r/wosa、茶(Ca,〃/as/we服、)、美人蕉(C"ww/"<i/ca)、l束祐又屬(Ca/w/cwwspp.)、番木瓜(Can'ca/a/>a_ya)、大花4艮虎刺(Can'wamacTocarpa)、纟工花(CaW/zaww51W"cton'ws)、山才亥才兆屬(G377aspp.)、栗屬(Coyto"e"spp.)、菊花(chrysanthemum)、苦苣(0'c/zo,i"wewd/v/")、樟屬(C7"wamomwwspp.)、西瓜(C7/w/〃ws/awa似s)、沖計(jì)橘屬(C^n^spp.)、扭卩子屬(Cocosspp.)、咖啡屬(。*"spp.)、可樂果屬(Co/aspp.)、芋(Cb/oc"s/aescw/e"to)、才秦屬(Cc^y/wsspp.)、山才査屬(Cratoegwsspp.)、黃瓜屬(Cwct/w/sspp.)、南瓜屬(Cwcw6/tospp.)、菜薊屬(Cy"araspp.)、胡蘿卜(Z)awcwscarato)、山蟲馬蟲皇屬(Deswcxiz'i/附spp.)、龍目艮(Z)/附ocar/ws/cwga")、薯蕷屬(Z)/asco/^3rspp.)、神屬(Z)/ospymsspp.)、-皁屬(￡c/z/woc/z/oaspp.)、禾參子(￡/eww>ecorarca"a)、才比杷(EWo6o^ya)a/ow/ca)、纟工果Y子(5Wgem.aMwi/7orar)、蕎麥屬CFagc;piyramspp.)、水青岡屬(Fagt^spp.)、無花果(F/cwca〃'ca)、金橘屬(Fo由we〃aspp.)、草蕃屬(Fragar/aspp.)、銀杏(G7"&goMo6a)、大豆屬(G7_yc/"espp.)、陸i也沖帛(Gowy//ww/z/rsWw附)、向曰葵屬{7/^//""^1spp.)、木槿屬(歷tocwsspp.)、大麥屬(7/oAie謂spp.)、番薯(爾o,ea6atotos)、胡才兆屬(Jwg/a"sspp.)、萵苣(丄""wcofsa,/va)、山黧豆屬(丄a^yrwsspp.)、浮萍屬(丄e顏crspp.)、兵豆(丄ms(^//"0^)、亞麻(Ziw謂,'to"咖'mww)、篇枝(Zj7c/h'c/z/"e似zX)、黑麥草(丄。//1/附^6/^"脫)、百脈根屬(丄o^sspp.)、廣東絲瓜(丄w加"CMto"gw/a)、習(xí)習(xí)扇豆屬(丄m//"wsspp.)、石更皮豆屬(Afocroiy/o附"spp.)、凹纟彖金虎尾(Afa/Z/g/"'aew"rg/w"to;)、蘋果屬(Afa/wsspp.)、美沐l曼密蘋果(Afamweaawen'c朋a)、芒果(Ma"g^ra/wc//ca)、木薯屬(Mam'/zoZspp.)、人心果(Ma"/儀arazopoto)、紫苜蓿(MWcago、草木犀屬(Me/Z/o加spp.)、薄荷屬(Afewf/7aspp.)、苦瓜屬(Afowwvi/caspp.)、黑桑(Afon^w/graf)、芭蕉屬(A/wsaspp.)、》因草屬(7Wco^3waspp.)、木厚才覽屬(0/easpp.)、寸山人掌屬(0/MW/aspp.)、0附"/zo/^spp.、稻屬((9，aspp.)、黍(尸am'c謂脂7zV2ce謹(jǐn))、西番蓮(尸a肌y/orae(iw//51)、歐防風(fēng)(尸os""acara"'ra)、垮梨屬CPe匿"spp.)、歐芽(T^/ms^//"^cr&pww)、矮牽牛(尸"w"/a/^6nV/a)、菜豆屬(尸/w"o/船spp.)、刺葵屬(戶/wew/xspp.)、酸漿屬CP/7j^a/^spp.)、+>屬(戶/""《spp.)、阿月渾子(P/加c/awra)、豌豆屬(化謂spp.)、早熟禾屬(尸oospp.)、楊屬(尸opw/t/sspp.)、斗t豆樹屬CfVoso/^spp.)、李屬(尸n/mwspp.)、番石一留屬(尸^W/Mmspp.)、石碎留(Pw"/c"grar""Zw附)、西洋梨(/yn^sccwww"&)、沖樂屬(;2"en:"^spp.)、蘿卜saaVMS)、波葉大黃(i/^M附Ma6aAaraw)、醋栗屬(i/6esspp.)、;i:鉤子屬C^M6wsspp.)、甘蔑屬(Sacc/zan/wspp.)、4妄骨木屬0Saw6Mcwsspp.)、黑麥(Seca/ecerea/e)、胡麻屬(Ses畫膽spp.)、癡屬(So/aw廳spp.)、高粱(6brg/mw6/co/w)、'菠菜屬(5^/"a"'"spp.)、'蒲^^屬(^Sy2yg/M附spp.)、酉臾豆(T^wan'M(iz^/"d/ca)、可可(77zeo6rawacacao)、車軸草屬(7>7>//"附spp.)、7W&coseca/en>w/m'、小麥屬(7HWcwwspp.)、越橘屬(Kzcc/"/wwspp.)、野S宛豆屬(Fc/aspp.)、i工豆屬(Wg"aspp.)、葡萄屬(W他spp.)、玉米(Zeawap)、沼生恭(Z/z"m."/7"/"Wn^)、棗屬(Z/z—附spp.)以及其它植物。在一實(shí)施方案中，所述植物是谷物作物諸如水稻、小麥、玉米、大豆、黍、大麥、黑麥、燕麥或高粱。在另一實(shí)施方案中，所述植物是草諸如蘆蘋、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草。在又另一實(shí)施方案中，所述植物是蔬菜諸如芥藍(lán)(Sra肌'caa/6og/Wra)、朝鮮薊(artichoke)、天門冬(asparagus)、西蘭花(broccoli)、抱子甘藍(lán)(Brusselssprouts)、巻心菜、卡諾拉油菜(canola)、胡蘿卜、花椰菜、芽菜、綠羽衣甘藍(lán)(collardgreens)、亞麻、羽衣甘藍(lán)(kale)和扁豆，或具有商業(yè)或科學(xué)價(jià)值的其它植物(諸如擬南芥、矮牽牛、菊花等)。如以下在實(shí)施例1和2中討論的，公開的方法已經(jīng)在單子葉和雙子葉植物中得到證實(shí)。因此，由于SEQIDNO:1的多肽序列在植物物種之間高度保守，預(yù)期公開的方法將可應(yīng)用于單子葉和雙子葉植物。例如，如在以下實(shí)施例2中描述的，由于已經(jīng)在水稻(O3^aM"wz)中證實(shí)公開的方法，預(yù)期其可用于其它單子葉植物，諸如與水稻(SEQIDNO:5)具有95%氨基酸序列同一性的小麥(7h'"cwmaas"vwm)(SEQIDNO:7)。類似地，如在以下實(shí)施例l中描述的，由于已經(jīng)在擬南芥中證實(shí)公開的方法，預(yù)期其可用于其它雙子葉植物，諸如與擬南芥(SEQIDNO:l)具有88%氨基酸序列同一性的矮牽牛(SEQIDNO:13),和與擬南芥(SEQIDNO:l)具有92%氨基酸序列同一性的菊花(SEQIDNO:9)。本文所用的術(shù)語"表達(dá)，，可指性狀、基因、或包括編碼的多肽的基因產(chǎn)物在植物中的表達(dá)。可由公開的方法調(diào)節(jié)的植物性狀包括但不限于，植抹高度、植物生物量、頂芽發(fā)育、發(fā)枝、能育性、開花、葉面積、衰老、種子萌發(fā)、種子產(chǎn)量、種子重量、莖發(fā)育、糧食產(chǎn)量、分蘗數(shù)、花分生組織發(fā)育和根發(fā)育。根據(jù)一實(shí)施方案，相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，植物中的性狀表達(dá)可被調(diào)節(jié)以展現(xiàn)增加的發(fā)枝、提高的種子產(chǎn)量、提高的植物生物量、提高的糧食產(chǎn)量、增加的分蘗數(shù)、增加的葉面積、延遲的種子萌發(fā)、減少的頂端優(yōu)勢、延遲的開花或其組合。在另一實(shí)施方案中，相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，植物中的性狀表達(dá)可被調(diào)節(jié)以展現(xiàn)提早的開花、矮小、減少的葉數(shù)目、早衰、提早的種子萌發(fā)、延遲和減少的蓮座葉形成、增加的幼苗根生長或其組合。尤其是，相對于根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)未降低的相同類型植物，所述多肽的表達(dá)已經(jīng)降低的植物的種子產(chǎn)量和植物生物量顯著提高約2至約5倍。取決于植物類型、對根據(jù)SEQIDNO:l的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)、和調(diào)節(jié)程度，預(yù)期種子產(chǎn)量和植物生物量可分別地提高約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍或約5倍。類似地，相對于根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)未降低的相同類型植物，所述多肽的表達(dá)已經(jīng)降低的植物的糧食產(chǎn)量和分蘗數(shù)增加約2至約4倍。取決于植物類型、對根據(jù)SEQIDNO:l的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)、和調(diào)節(jié)程度，預(yù)期糧食產(chǎn)量和分蘗數(shù)可分別地增加約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍或約44咅。在具體實(shí)施方案中，相對于根據(jù)SEQIDNO:l的多肽表達(dá)未降低的相同類型植物，所述多肽的表達(dá)已經(jīng)降低的植物的葉面積也顯著增加約2至約6倍。取決于植物類型、對根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)、和調(diào)節(jié)程度，預(yù)期葉面積可增加約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約5.5倍或約6倍。相對于根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)未提高的相同類型植物，對于所述多肽的表達(dá)已經(jīng)提高的植物，開花提早約5至約15天。如上討論的，開花時(shí)間的調(diào)節(jié)將取決于植物類型、對根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)、和調(diào)節(jié)程度，但通常將提早約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天或約15天。在某些實(shí)施方案中，植物的能育性不被調(diào)節(jié)且轉(zhuǎn)化的植物能夠產(chǎn)生能育的植物。性狀的表達(dá)可使用本領(lǐng)域已知的各種方法確定。例如，葉面積可通過分別地使用以下等式以葉面積比率(LAR)、葉面積指數(shù)(LAI)或比葉面積(SLA)測量總?cè)~面積來確定LAR(m2^或m2kg")=(總?cè)~面積)/(總干重量)LAI=(作物的總?cè)~面積)(其所投射(stand)的總地面面積)SLA(mi1)=(葉面積)/(葉干質(zhì)量)或者，葉面積可使用基于計(jì)算機(jī)的圖像分析來測量。還可以多種方式測量種子產(chǎn)量，例如以千粒重量的增加或減少，以飽滿種子數(shù)目的增加或減少，以總種子重量，以種子大小，或以收獲指數(shù)。植抹高度的差異可通過直接測量并與未修飾的對照植物高度比較來測量。植物生物量可通過稱重新收獲的植物(鮮重量或濕重量)或恒定的干重量而確定。干重量可在設(shè)定為約8(TC的干燥烘箱中干燥收獲的目標(biāo)植物或植物部分(如葉、種子)2天至7天后直到記錄恒定重量(千重量)而確定。類似地，可確定每抹植物或每單位耕作面積(如每平方米、英畝或公項(xiàng))的種子或谷粒重量(grainweight)和總種子或糧食產(chǎn)量。頂芽發(fā)育和發(fā)枝以及能育性、開花和衰老的變化可通過比較修飾的植物(如，如本公開描述的遺傳修飾)的發(fā)育與在相同生長階段的未修飾的植物的外表而評估。每抹植物的分蘗數(shù)(或枝數(shù)目)可通過計(jì)數(shù)生長到已發(fā)育所有分蘗的植物的代表性樣品而確定(如，在水稻栽培品種中，分蘗達(dá)到最大數(shù)目之前可花費(fèi)約2個(gè)月)。這些可與未修飾的植物每抹植物的分蘗數(shù)比較?；ǚ稚M織發(fā)育和根發(fā)育可在宏觀水平(例如通過在發(fā)育的相當(dāng)階段肉眼觀察)以及通過顯微鏡檢查(例如以光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡檢查)細(xì)胞排列的差異等而檢查。基因的表達(dá)可例如通過測量所產(chǎn)生的信使RNA(mRNA)轉(zhuǎn)錄物水平而確定。多肽基因產(chǎn)物的表達(dá)可例如通過使用與多肽結(jié)合的抗體的免疫測定而確定。術(shù)語"調(diào)節(jié)"指植物中性狀、基因或基因產(chǎn)物(包括編碼的多肽)的表達(dá)的改變。通常，改變是相對于性狀、基因或多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物。例如，當(dāng)使用涉及性狀表達(dá)時(shí)，術(shù)語"調(diào)節(jié)"可指相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，在已使用公開的方法調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的植物中植抹高度增加或減少、植物生物量增加或減少、頂芽發(fā)育增加或減少、發(fā)枝增加或減少、能育性增加或減少、開花增加或減少、葉面積增加或減少、提早或延遲衰老、提早或延遲種子萌發(fā)、種子數(shù)目增加或減少、種子產(chǎn)量增加或減少、種子重量增加或減少、4是早或延遲莖發(fā)育、莖發(fā)育增加或減少、糧食產(chǎn)量增加或減少、分蘗數(shù)增加或減少、花分生組織發(fā)育增加或減少、提早或延遲花分生組織發(fā)育、根發(fā)育增加或減少、提早或延遲根發(fā)育和類似性狀。在一實(shí)施方案中，相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，調(diào)節(jié)的性狀可為在已使用公開的方法調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的植物中增加發(fā)枝、提高種子產(chǎn)量、提高植物生物量、提高糧食產(chǎn)量、增加分蘗數(shù)、增加葉面積、延遲種子萌發(fā)、減少頂端優(yōu)勢、延遲開花或其組合。在其它實(shí)施方案中，相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，調(diào)節(jié)的性狀可為在已使用公開的方法調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的植物中提早開花、矮小、減少葉數(shù)目、早衰、提早種子萌發(fā)、延遲和減少蓮座葉形成、增加幼苗根生長或其組合。"發(fā)育"是指植物或植物部分經(jīng)由細(xì)胞生長和分化而生長以達(dá)到成熟的過程。當(dāng)使用涉及表達(dá)基因或基因產(chǎn)物時(shí)，術(shù)語"調(diào)節(jié)"通常是指表達(dá)水平增加或減少。在一些實(shí)施方案中，基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平減少包括完全抑制所述基因或基因產(chǎn)物的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，基因或基因產(chǎn)物表在一些實(shí)施方案中，當(dāng)HOG1多肽(SEQIDNO:l)表達(dá)水平與野生型相比增加約3至約20倍時(shí)，細(xì)胞激動(dòng)素水平減少約20至約85%、約30至約75%、約40至約65%、或約50至約55%。細(xì)胞激動(dòng)素水平的這種減少可導(dǎo)致性狀表達(dá)的調(diào)節(jié)，諸如提前種子萌發(fā)約4至約5天、生長遲緩和延遲新蓮座葉形成和展開。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)HOG1多肽(SEQIDNO:l)表達(dá)水平與野生型相比減少約2至約10倍時(shí)，細(xì)胞激動(dòng)素水平增加約20至約85%、約30至約75°/。、約40至約65%或約50至約55%。細(xì)胞激動(dòng)素水平的這種增加可導(dǎo)致性狀表達(dá)的調(diào)節(jié)，諸如延遲種子萌發(fā)約5天。如可從以下實(shí)施例看到的，性狀的表達(dá)與細(xì)胞激動(dòng)素的表達(dá)水平相關(guān)。增加或減少基因或基因產(chǎn)物表達(dá)水平的方法也在以下進(jìn)一步討論?？蛇x地，術(shù)語"調(diào)節(jié)"可指植物中基因或基因產(chǎn)物(包括編碼的多肽)的生物或功能特征改變。例如，調(diào)節(jié)可導(dǎo)致編碼的多肽的結(jié)合親合力改變。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)不導(dǎo)致基因的核酸序列或編碼的多肽的氨基酸序列改變。通常，植物中一種或多種性狀的表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽的表達(dá)。"多肽"、"肽"和"蛋白"在本文可交換地使用以指經(jīng)由肽鍵或修飾的肽鍵連接的根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸殘基聚合物(二肽或更大的肽)和相同物質(zhì)的變體和合成的類似物。因此，這些術(shù)語包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸聚合物，其中一種或多種氨基酸殘基是合成的非天然產(chǎn)生氨基酸，諸如相應(yīng)的天然產(chǎn)生的氨基酸的化學(xué)類似物以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。本發(fā)明的多肽包括但不限于天然純化產(chǎn)物、化學(xué)合成程序的產(chǎn)物、和通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)產(chǎn)生的產(chǎn)物。本發(fā)明的多肽可包括非肽成分，諸如糖基。糖和其它非肽取代基可由多肽在其中產(chǎn)生的細(xì)胞加至多肽，并將隨細(xì)胞類型變化。對于重組制備的多肽，修飾的性質(zhì)和程度很大程度上將由具體宿主細(xì)胞的翻譯后修飾能力和相關(guān)多肽的氨基S臾序列中存在的修飾信號(hào)確定。例如，不同類型宿主細(xì)胞之間的糖基化方式不同。多肽在本文中以其氨基酸骨架結(jié)構(gòu)來限定；取代基諸如糖基通常不指定，但仍可存在。此外，本發(fā)明的多肽還可包括開始的修飾的曱硫氨酸殘基，在一些情形中是宿主介導(dǎo)的過程的結(jié)果。蛋白可以單體或以多聚蛋白如以二聚體(同或異二聚體)或三聚體存在。通常，本發(fā)明中待調(diào)節(jié)表達(dá)的多肽在其范圍中包括其變體或片段，其中所述變體或片段具有與SEQIDNO:1限定的多肽功能上相同的生物活性。在某些實(shí)施方案中，生物活性是細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合和受體活性。受體活性包括跨細(xì)胞膜傳播胞外信號(hào)以變成胞內(nèi)信號(hào)，在細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合受體后該信號(hào)可開始一種或多種細(xì)胞響應(yīng)。鑒定細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合和受體活性的方法是本領(lǐng)域熟知的并描述于以下的實(shí)施例1和2。片段可包含從多肽任一末端或從最初氨基酸序列的內(nèi)部段(intemalstretches)的單個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失。片段優(yōu)選地包括母體序列的至少n個(gè)連續(xù)氨基酸，并且取決于具體序列，n優(yōu)選地是7或更大(例如7、8、9、10、12、15、17、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400或更大)。'在一實(shí)施方案中，n是7。在一實(shí)施方案中，n是18。在一實(shí)施方案中，n是33。在一實(shí)施方案中，n是42。在一實(shí)施方案中，n是58。在一實(shí)施方案中，n是175。在一實(shí)施方案中，n是222。在一實(shí)施方案中，n是409。這種片段可為"獨(dú)立的"，即不是其它氨基酸或多肽的部分或融合至其它氨基酸或多肽，或可被包括在更大的多肽中，在其中它們形成部分或區(qū)域。當(dāng)被包括在更大的多肽中時(shí)，本發(fā)明的片段最優(yōu)選地形成單個(gè)連續(xù)區(qū)域。此外，多個(gè)片段可被包括在單個(gè)更大的多肽中。本發(fā)明還包括包含根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽的功能等價(jià)物。本發(fā)明的多肽片段和功能等價(jià)物保持母體多肽的生物活性，即細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合和受體活性。鑒定細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合和受體活性的方法是本領(lǐng)域熟知的并描述于以下的實(shí)施例1和2。本發(fā)明的功能等價(jià)的多肽包括與列于SEQIDNO:1的多肽同源的多肽。如果一條多肽的序列與另一多肽的序列具有足夠高程度的同一性，則認(rèn)為這兩條多肽是"同源"的。短語"同一性百分比"、"％同一性"、"蛋白同一性"、"序列同一性"等當(dāng)應(yīng)用于多肽序列時(shí)，是指使用標(biāo)準(zhǔn)化算法比對的至少兩條多狀序列之間匹配的相同殘基的百分比。這種算法可以標(biāo)準(zhǔn)化和可再現(xiàn)的方式在4皮比序列中插入缺口以優(yōu)化兩條序列之間的比對，并因此實(shí)現(xiàn)兩條序列的更有意義的比較。同一性百分比可使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的一種或多種計(jì)算機(jī)算法或程序確定。同一性程度可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地計(jì)算(參見例如ComputationalMolecularBiology(計(jì)算分子生物學(xué))，Lesk,A.M.編輯，OxfordUniversityPress,NewYork,1988;Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects(生物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)信息學(xué)和基因組計(jì)劃)，Smith,D.W.編輯，AcademicPress,NewYork,1993;ComputerAnalysisofSequenceData(序歹廿數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析)，第1部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯，HumanaPress,NewJersey,1994;SequenceAnalysisinMolecularBiology(分子生物學(xué)中的序歹'J分析)，vonHeinje,G"AcademicPress,1987;和SequenceAnalysisPrimer(序列分析引物)，Gribskov,M.禾口Devereux,J.編輯，MStocktonPress,NewYork,1991)。測量蛋白序列同一性的方法是本領(lǐng)域熟知的且本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文中序列同一性是基于氨基酸同一性(有時(shí)稱為"硬同源性(hardhomology)")計(jì)算的。例如，UWGCG軟件包提供BESTFIT程序，其可用于計(jì)算序列同一性(例如以其默認(rèn)設(shè)置使用)(Devereux等人(1984)NucleicAcidsResearch12,p387-395)。PILEUP和BLAST(基本局部比對搜索工具)算法可用于計(jì)算序列同一性或排列序列(通常以其默認(rèn)設(shè)置)，例如在AltschulS.F.(1993)JMolEvol36:290-300和Altschul,S，F(xiàn)等人(1990)JMolBiol215:403中所述。進(jìn)行BLAST分析的軟件從多種來源可得，包括美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI),Bethesda，MD和因特網(wǎng)上例如"西w.ncbi.nlm.nih.gov/"。該算法包括首先通過鑒定詢問序列中長度W的短字來鑒定高得分的序列對(HSP),當(dāng)與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字比對時(shí)，所述短字匹配或滿足一些正值的閾值得分T。T是指相鄰字得分閾值(Altschul等人,同上)。這些初始相鄰匹配字串(wordhits)作為種子用于開始搜索以發(fā)現(xiàn)含有它們的HSP。只要累積的比對得分可增加，匹配字串就沿著每條序列以兩個(gè)方向一直延伸。因此本文所稱的序列同一性可例如使用BLAST2丄3版本(或其其它版本)確定，使用NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心；http:〃www.ncbi,nlm.nih.gov/)4旨定的默認(rèn)參數(shù)[Blosum62矩陣；空位開放罰分=11且空位延伸罰分=1]。在某些實(shí)施方案中，使用前述算法/程序的默認(rèn)設(shè)置。通常，認(rèn)為兩條多肽之間大于50%的同一性表示功能等價(jià)，只要保留參考多肽的活性。更優(yōu)選的多肽與SEQIDNO:1代表的氨基酸具有大于61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%總序列同一性的同一性程度。使用http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST，顯示本發(fā)明的擬南芥HOG1多肽(SEQIDNO:l)通常與其在水稻(即OsCBP)(SEQIDNO:5)、小麥(SEQIDNO:7)、菊花(SEQIDNO:9)和矮牽牛(即PETCBP)(SEQIDNO:13)中的同系物共有約80至95%的氨基酸序列同一性。更具體地，擬南芥HOG1多肽(SEQIDNO:l)與其在水稻中的同系物(SEQIDNO:5)共有約90%的氨基酸序列同一性，與其在小麥中的同系物(SEQIDNO:7)共有約91%的氨基酸序列同一性，與其在菊花中的同系物(SEQIDNO:9)共有約92%的氨基酸序列同一性，與其在矮牽牛中的同系物(SEQIDNO:13)共有約88%的氨基酸序列同一性，與其在芥藍(lán)中的同系物(SEQIDNO:ll)共有約99%的氨基酸序列同一性，與其在馬鈴薯(5b/朋wwrt^emsww)中的同系物(SEQIDNO:29)共有約90%的氨基酸序列同一性，和與其在番茄(Z^copera/co"eMM/eWww)中的同系物(SEQIDNO:27)共有約89%的氨基酸序列同一性。根據(jù)本發(fā)明的功能等價(jià)的多肽意為包括其中在一個(gè)或多個(gè)位置有保守的或非保守的氨基酸插入、缺失或取代的多肽，只要這種改變造成保留母體多肽的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合和受體活性的蛋白。這些類型改變的每種可單獨(dú)或聯(lián)同其它改變在給定序列發(fā)生一次或多次。這種變體可例如使用蛋白工程和位點(diǎn)定向誘變的方法制備。還可制造融合蛋白以改進(jìn)HOG1蛋白和其同系物、或它們的變體或片段的特征。例如，一段其它氨基酸尤其是帶電荷的氨基酸可加至H0G1蛋白和其同系物、或它們的變體或片段的N-末端，以改進(jìn)從宿主細(xì)胞純化過程中的穩(wěn)定性?？蛇x地，肽部分可加至所述多肽以便于純化。在最后制備所述多肽之前可除去這種區(qū)域。加入肽部分以便于操縱多肽是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明多肽可由多種方法制備，諸如從植物純化和通過重組方法。本發(fā)明的多肽，尤其是短的肽片段，還可通過化學(xué)合成制備，諸如通過常規(guī)液相或固相合成4支術(shù)(參見例如描述于SolidPhasePeptideSynthesis(固相肽合成)，第2版，1984ThePierceChemicalCo.,Rockford,111的方法)?？蛇x地，肽可通過以蛋白酶類諸如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發(fā)明的多肽而制備。純化本發(fā)明多肽可通過諸如尺寸排阻色語、離子交換色譜和反相高效液相色譜的技術(shù)的任何一種或組合來實(shí)現(xiàn)。體外檢測本發(fā)明的多肽或其變體或片段可使用多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、蛋白質(zhì)印跡法、免疫沉淀、免疫熒光、薄層色譜、反相高效液相色鐠、酸水解后的氨基酸分析和通過快原子轟擊(FAB)質(zhì)譜分析。這種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的技術(shù)。使用本領(lǐng)域已知的方法，顯示本發(fā)明的多肽(SEQIDNO:l)包括兩個(gè)保守的SAHH標(biāo)志。在第二個(gè)SAHH標(biāo)志，鑒定了表示二核苷酸結(jié)合域的三個(gè)保守的甘氨酸殘基。由于細(xì)胞激動(dòng)素是核苦酸衍生物，預(yù)測這些殘基可形成細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合域。還在SEQIDNO:1的氨基S吏位置1至7(在N-末端)，位置150至191和位置59至76鑒定了推定的跨膜域。在氨基酸位置9至230(在N-末端)、位置77至485和位置406至438(在C-末端)鑒定了其它推定的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合域。在氨基酸位置231至405鑒定了推定的NAD、結(jié)合域。在氨基g吏位置1-58鑒定了N-末端胞內(nèi)域。在某些實(shí)施方案中，植物中多肽表達(dá)的調(diào)節(jié)是通過將調(diào)節(jié)多肽表達(dá)的多核香酸引入植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸可以RNA的形式，諸如mRNA,或以DNA的形式，包括例如可通過克隆獲得或可合成地制備的cDNA和基因組DNA。DNA可為雙鏈或單鏈的。單鏈DNA或RNA可為編碼鏈，也稱為有義鏈，或可為非編碼鏈，也稱為反義鏈，如以下進(jìn)一步討論的。適合用于公開的方法的多核苷酸可包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或肽核酸(PNA)等核苦酸，其包括噪呤和嘧啶堿基，或其它天然、化學(xué)或生物化學(xué)修飾的非天然或衍生化的核苷酸堿基。多核苷酸的骨架可包括如可通常見于RNA或DNA的糖和磷酸基團(tuán)，或修飾的或取代的糖或磷酸基團(tuán)。多核苦酸還可包括修飾的核苷酸，諸如曱基化核苷酸和核苷酸類似物。核苦酸的序列可被非核苦酸成分中斷。因此，術(shù)語核苷、核苷酸、脫氧核構(gòu)特征的類似物，以使當(dāng)它們并入多核苷酸序列時(shí)，允許與溶液中天然產(chǎn)生的多核苷酸序列雜交。通常，這些類似物通過替代和/或修飾堿基、核糖或磷酸二酯部分衍生自天然產(chǎn)生的核苷和核普酸?？啥ㄖ聘淖円匀缙谕氖闺s合體形成穩(wěn)定或不穩(wěn)定或增強(qiáng)與互補(bǔ)多核苷酸序列雜交的特異性。本發(fā)明的多核苷酸在其范圍中還包括多核苷酸序列的變體或片段，其中所述變體或片段編碼與本發(fā)明多核苷酸(尤其是SEQIDNO:2限定的多核苷酸序列)編碼的多肽(或其片段)功能上相同的具有生活性的多肽，其中所述變體可使用分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來定位和分離，而不需要過度試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)。兩條多核苷酸序列之間的同源性程度可通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序手段確定，諸如GCG程序包(Wisconsin軟件包的程序手冊，版本8,1996年8月，GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.，(1970),JournalofMolecularBiology,48,443-453)中提供的GAP,使用例如，GAP產(chǎn)生罰分為5和GAP寬度罰分為0.3的默認(rèn)設(shè)置。多核苷酸分子的同系物是在不同物種中編碼具有大致相同功能和類似特征的多肽的多核苷酸分子，其中所述編碼的多肽可在至少區(qū)域中共有至少50%氨基酸同一性，且對編碼的總氨基酸序列具有至少約30%氨基酸同一性、至少約40%氨基酸同一性、至少約50%氨基酸同一性、至少約60%氨基酸同一性、至少約70%氨基酸同一性、至少約80%氨基酸同一性、至少約90%氨基酸同一性或至少約95%同一性。以上已經(jīng)描述了HOG1多肽(SEQIDNO:l)與其在水稻(SEQIDNO:5)、小麥(SEQIDNO:7)、菊花(SEQIDNO:9)和矮牽牛(SEQIDNO:13)中的同系物的示例性序列同一性水平。由于遺傳密碼的簡并性，和不同植物屬和種之間優(yōu)先密碼子使用的差異，相應(yīng)的多核苷酸同系物可共有顯著地小于50%的同一性。例如，使用CLUSTALW(1.83),顯示編碼本發(fā)明的H0G1多肽(SEQIDNO:l)的多核普酸與其在水稻中的同系物(SEQIDNO:6)具有82%序列同一性，與其在小麥中的同系物(SEQIDNO:8)具有83%序列同一性，與其在菊花中的同系物(SEQIDNO:IO)具有82%序列同一性，與其在矮牽牛中的同系物(SEQIDNO:14)具有78%序列同一性，與其在芥藍(lán)中的同系物(SEQIDNO:12)具有98%序列同一性，與其在番茄中的同系物(SEQIDNO:28)具有79%序列同一性，與其在馬鈴薯中的同系物(SEQIDNO:30)具有80%序列同一性，和與編碼煙草品種Xanthi(Mco"朋ato6acw附cv.Z朋f/z/)的SAHH1多肽的多核香酸(SEQIDNO:4)具有78%序列同一性。多核普酸分子在其范圍中還可包括在低嚴(yán)格性，更優(yōu)選地中嚴(yán)格性和還更優(yōu)選地高嚴(yán)格性條件下，能夠雜合于本發(fā)明多核苷酸分子尤其是SEQIDNO:4、6、8、10、12、14和15限定的多核苷酸序列的變體。低嚴(yán)格性雜交條件可對應(yīng)于在5(TC在2xSSC中進(jìn)行雜交。用于確定給定多核苷酸分子是否雜交于指定多核苷酸的合適的實(shí)驗(yàn)條件可包括將含有待檢查的多核苷酸相關(guān)樣品的濾膜(filter)預(yù)浸漬在5xSSC10min，并在5xSSC、5xDenhardt溶液、0.5%SDS和100|ig/ml變性的超聲處理的鮭精DNA的溶液中將濾膜預(yù)雜交，隨后在含有濃度為10ng/ml的"P-dCTP-標(biāo)記的探針的相同溶液中在大約45。C雜交12小時(shí)，根據(jù)Sambrook等人所述的雜交方法(1989;MolecularCloning,ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，第2版，ColdSpringHarbour,NewYork)。隨后在至少M(fèi)t:(低嚴(yán)格性)、至少^。C(中嚴(yán)格性)、至少6^C(中/高嚴(yán)格性)、至少70。C(高嚴(yán)格性)或至少75。C(非常高嚴(yán)格性)，將濾膜在2xSSC、0.5%SDS中洗滌30分鐘兩次。通過將濾膜暴露于x-射線膠片可檢測雜交。進(jìn)一步地，有本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種條件和因素可用來改變雜交的嚴(yán)格性。例如，待雜交于指定多核苷酸的多核苦酸的長度和性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成)；鹽和其它成分的濃度，諸如曱酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇等的存在或不存在；和改變雜交和/或洗滌步驟的溫度。進(jìn)一步地，還可能理論地預(yù)測兩條給定多核香酸序列在某些指定條件下是否將雜交。因此，作為上述經(jīng)驗(yàn)方法的代替，確定變體多核苷酸序列是否將雜交于根據(jù)第二方面或第三方面限定的多核苷酸分子或更具體地SEQIDNO:2或15的多核普酸，可基于理論計(jì)算具有已知序列的兩條異源多核苷酸序列在指定條件諸如鹽濃度和溫度下將雜交的Tm(解鏈溫度)。確定異源多核普酸序列的解鏈溫度(Tm(異源))時(shí)，必須首先確定同源多核苷酸序列的解鏈溫度(Tm(隨))。兩條完全互補(bǔ)多核苷酸鏈(同源雙鏈體形成)之間的解鏈溫度(Tm(同源))可根據(jù)下式確定，如CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案)，JohnWileyandSons,1995中概述的T叫同源)=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(%曱酰胺)-500/LM=表示單價(jià)陽離子的摩爾濃度，%GC-鳥噤呤(G)和胞嘧啶(C)占序列中總堿基數(shù)目的％，%曱酰胺=雜交緩沖液中的％曱酰胺，且L=多核苷酸序列的長度。上式確定的Tm是兩條完全互補(bǔ)多核苷酸序列之間的同源雙鏈體形成的Tm(TV,)。為了使Tm值適于兩條異源多核苷酸序列，假定兩條異源序列之間核苷s吏序列的1%差異等于Tm減少rc。因此，異源雙鏈體形成的Tm(異源)通過從T嶺源)減去所討論的類似序列與上述核苷酸探針之間的同源性°/。差異而獲得。通常SEQIDNO:2或15限定的多核苦酸分子在其范圍中還包括為其寡核苷酸片段的多核苷酸分子。通常，寡核苷酸片段長度為約15至約1775核苷酸。更通常地，寡核苷酸片段長度為約15至約1200核苷酸。甚至更通常地，寡核香酸片段長度為約15至約700核苷酸。還甚至更通常地，寡核苷酸片段長度為約15至約200核苷酸。而仍更通常地，寡核苷酸片段長度為約15至約75核苷酸。通常，寡核苷酸片段長度為約15至約1775核苷酸。更通常地，寡核苷酸片段長度為約100至約1775核香酸。甚至更通常地，寡核苷酸片段長度為約500至約1775核苷酸。還甚至更通常地，寡核苷酸片段長度為約1000至約1775核香酸。而仍更通常地，寡核香酸片段長度為約1200至約1775核普酸。術(shù)語"互補(bǔ)"是指核苷酸或核酸之間的雜交或堿基配對，諸如例如，雙鏈DNA分子的兩條鏈之間或寡核苦酸引物與待測序或擴(kuò)增的單鏈核酸上引物結(jié)合位點(diǎn)之間?；パa(bǔ)核苷酸通常是A和T(或A和U),或C和G。當(dāng)最佳地比對和比較并帶有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔У囊粭l鏈的核苷酸與另一鏈的核苷酸的至少約80%,通常為另一鏈的核香酸的至少約90%至95%、和更優(yōu)選地約98至100%匹配時(shí)，兩條單鏈RNA或DNA分子被稱為互補(bǔ)?？蛇x地，當(dāng)RNA或DNA鏈將在選擇性雜交條件下雜交于其互補(bǔ)物(complement)時(shí)，存在互補(bǔ)性。通常，當(dāng)對至少14至25核苷酸的整段序列有至少約65%互#卜l"生，優(yōu)選地至少約75%,和更優(yōu)選地至少約90%互補(bǔ)性時(shí)，將發(fā)生選擇性雜交。本發(fā)明的多肽和多核苷酸分子是"分離的"。本文所用的術(shù)語"分離如，本文所用的"分離的多核苦酸"是指一種多核苷酸，其已經(jīng)從在天然產(chǎn)生的狀態(tài)在其側(cè)翼的序列純化。"分離的"物質(zhì)以比在自然中或以其天然產(chǎn)生的狀態(tài)中所見的物質(zhì)濃度高的濃度存在于制劑中或該物質(zhì)在含有在自然中不伴隨該物質(zhì)的其它材料的制劑中存在。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽和多核苷酸分子是外源分子。術(shù)語"外源"當(dāng)使用涉及多核苷酸或多肽分子時(shí)是指多核苷酸或多肽分離和/或衍生自所述多核苷酸或多肽將被引入的靶細(xì)胞物種以外的物種。在一實(shí)施方案中，減少根據(jù)SEQIDNO:1的多肽表達(dá)的多核苷酸被引入目標(biāo)植物。多核苦酸可為抑制性多核苷酸，例如反義多核苷酸(諸如反義RNA)、RNA干擾的構(gòu)建體(諸如siRNA)和催化性反義核酸構(gòu)建體(諸如核酶)。多核苷酸可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如通過化學(xué)合成、重組DNA程序，或在反義RNA的情形中，通過體外或體內(nèi)(當(dāng)連接至啟動(dòng)子時(shí))轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸是反義多核苷酸。"反義多核苷酸"是與本發(fā)明的編碼序列的任何一種或所有(包括其部分序列)互補(bǔ)的多核苷酸序列，并因此可與其雜交。全長反義分子可用于該目的?？蛇x地，可使用靶向編碼HOG1的RNA的特定區(qū)域的雙鏈寡核苷酸、有義和/或反義寡核苷酸或其組合。使用寡核苷酸分子來減少預(yù)先確定的基因的表達(dá)水平是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Hamilton,A.J.和Baulcombe,D.C.(1999),"AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants(植物中轉(zhuǎn)錄后基因沉默中的一類小反義RNA)"，Science286:950-952;WaterhouseP.M.等人(1998)，"VirusresistanceandgenesilencinginplantscanbeinducedbysimultaneousexpressionofsenseandantisenseRNA(植物中的病毒抗性和基因沉默可被同時(shí)表達(dá)有義和反義RNA誘導(dǎo))"，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:13959-13964;和國際專利/>布WO99/53050、WO99/49029、WO99/32619)。寡核香酸分子可通過以DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞而原位提供，該DNA構(gòu)建體在轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生可為全長或部分序列的雙鏈和/或反義RNA序列。基因沉默效應(yīng)可通過過量產(chǎn)生(over-producing)有義和/或反義序列(可為全長或部分的)而增強(qiáng)，從而產(chǎn)生高量的雙鏈RNA。如上討論的，反義構(gòu)建體的序列可衍生自HOG1基因的不同區(qū)域。例如，反義序列可包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15、至少20或至少25個(gè)相鄰核酸殘基，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。反義序列可包括約20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800或850個(gè)相鄰核酸殘基?？墒褂冒ㄆ谕麛?shù)目的殘基的任何相鄰序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法和算法設(shè)計(jì)相鄰序列。作為一個(gè)實(shí)例，當(dāng)期望反義多核苷酸包括15個(gè)相鄰核酸殘基時(shí)，第一多核苷酸可包括開始于多核苦酸序列的位置301并結(jié)束于多核苷S臾序列的位置315的15個(gè)相鄰核酸殘基，第二多核苦酸可包括開始于多核苷酸序列的位置302并結(jié)束于多核普酸序列的位置316的15個(gè)相鄰核酸殘基，第三多核苦酸可包括開始于多核香酸序列的位置303并結(jié)束于多核苷酸序列的位置317的15個(gè)相鄰核酸殘基，且第四多核香酸可包括開始于多核苷酸序列的位置304并結(jié)束于多核苷酸序列的位置318的15個(gè)相鄰核酸殘基。通過沿著多核芬酸鏈順序地鑒定15個(gè)相鄰核酸殘基的段可獲得包括15個(gè)相鄰核酸殘基的另外多核苷酸。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，使用類似策略可制備其它長度的相鄰序列。在一實(shí)施方案中，包括開始于SEQIDNO:2的多核苷酸序列的位置271并結(jié)束于位置286的15個(gè)相鄰核酸殘基的第一反義多核苷酸具有以下核酸序列CTCGGCGCGGAAGTC(SEQIDNO:16)。使用上述策略，包括開始于SEQIDNO:2的多核苷S臾序列的位置272并結(jié)束于位置287的15個(gè)相鄰核酸殘基的第二反義多核香酸具有以下核酸序列TCGGCGCGGAAGTCA(SEQIDNO:17)。第三和第四反義多核苷酸分別地具有以下核酸序列CGGCGCGGAAGTCAG(SEQIDNO:18)和GGCGCGGAAGTCAGA(SEQIDNO:19)?？扇缟纤霁@得包括15個(gè)相鄰核酸殘基的另外的反義多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，反義多核苷酸包括15個(gè)相鄰核酸殘基。在特定實(shí)施方案中，反義多核普酸包括至少100個(gè)相鄰核酸殘基。反義構(gòu)建體可設(shè)計(jì)為靶向并結(jié)合于核苷酸序列的調(diào)節(jié)區(qū)域諸如啟動(dòng)子，或于編碼(外顯子)或非編碼(內(nèi)含子)序列。在一實(shí)施方案中，使用靶向SEQIDNO:2的反義多核苷酸，其導(dǎo)致根據(jù)SEQIDNO:l的多肽表達(dá)減少。在一實(shí)施方案中，使用根據(jù)SEQIDNO:15(SEQIDNO:2的跨兩個(gè)SAHH標(biāo)志域的850bp片段)的反義多核普酸?？僧a(chǎn)生沿著其長度與所討論的HOG1基因(SEQIDNO:2)的區(qū)域至少大致地互補(bǔ)的本發(fā)明的反義構(gòu)建體。反義構(gòu)建體與其互補(bǔ)細(xì)胞序列的結(jié)合可干擾轉(zhuǎn)錄、RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性。合適的反義多核苷酸可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備。通常，反義多核苷酸將在自動(dòng)合成儀上合成。合適的反義多核香酸可包括設(shè)計(jì)以改善它們向細(xì)胞的遞送、它們進(jìn)入細(xì)胞后的穩(wěn)定性和/或它們與適當(dāng)?shù)陌薪Y(jié)合的修飾。例如，反義多核苷酸可通過在骨架中添加一種或多種石危代磷酸酯4建或并入一個(gè)或嗎啉環(huán)而修飾。可選地，根據(jù)本領(lǐng)域已知方法RNAi構(gòu)建體可用于減少編碼包括SEQIDNO:1的多肽的多核苷酸的表達(dá)(例如Fire等人(1998)Nature391:806-811;Hammond等人(2001)NatureRev,Genet2:110-1119;Hammond等人(2000)Nature404:293-2%;Bernstein等人(2001)Nature409:363-366;Elbashir等人(2001)Nature411:494-498;WO99/49029和WO01/70949,其公開通過引用并入本文)。RNAi是指由小干擾RNA分子(siRNA)破壞具體mRNA的選擇性轉(zhuǎn)錄后基因沉默手段。siRNA通常通過裂解雙鏈RNA產(chǎn)生，其中一條鏈與待失活的信息相同?？珊铣刹⒅苯右腚p鏈RNA分子，其中一條鏈與mRNA轉(zhuǎn)錄物的特異區(qū)域相同?？蛇x地，可采用相應(yīng)的雙鏈DNA,其在胞內(nèi)呈遞后被轉(zhuǎn)化為雙鏈RNA。合成合適的用于RNAi領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，基于所討論的基因的序列知識(shí)，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序而不需過多的實(shí)驗(yàn)，即可鑒定和產(chǎn)生能夠減少包括SEQIDNO:2的多核苷酸的表達(dá)的各種合適的siRNA構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，靶序列與siRNA序列之間不必需要100%的核苷酸序列匹配。錯(cuò)配的能力很大程度上取決于錯(cuò)配在序列中的位置。在一些情形中，2或3個(gè)核苷酸的錯(cuò)配是可接受的但在其它情形中，單個(gè)核香酸錯(cuò)配足以否定siRNA的有效性。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)程序而不需過多的實(shí)驗(yàn)，即可確定具體siRNA分子的適合性。例如，可使用包括含有至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA千擾的多核苷酸，所述至少9個(gè)相鄰核酸殘基選自與由根據(jù)SEQIDNO:2的核酸序列組成的多核普酸互補(bǔ)的核酸序列。在一些實(shí)施方案中，可使用包括含有約9、10、11或12個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸?？墒褂冒ㄆ谕臄?shù)目的殘基的任何相鄰序列?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法和算法設(shè)計(jì)相鄰序列。作為一個(gè)實(shí)例，當(dāng)期望RNA干擾的多核苷酸包括9個(gè)相鄰核酸殘基時(shí)，第一多核苷酸可包括開始于多核苷酸序列的位置61并結(jié)束于多核苷酸序列的位置69的9個(gè)相鄰核酸殘基，第二多核苷酸可包括開始于多核苷酸序列的位置62并結(jié)束于多核苷酸序列的位置70的9個(gè)相鄰核酸殘基，第三多核苷酸可包括開始于多核香酸序列的位置63并結(jié)束于多核苷酸序列的位置71的9個(gè)相鄰核酸殘基，且第四多核苷酸可包括開始于多核苷酸序列的位置64并結(jié)束于多核苷酸序列的位置72的9個(gè)相鄰核酸殘基。通過沿著多核苷酸鏈順序地鑒定9個(gè)相鄰核酸殘基的段可獲得包括9個(gè)相鄰核酸殘基的另外多核苷酸。對本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，使用類似策略可制備其它長度的相鄰序列。在一實(shí)施方案中，包括開始于SEQIDNO:2的多核苷酸序列的位置42并結(jié)束于位置50的9個(gè)相鄰核酸殘基的第一RNA干擾的多核苷酸具有如下序列AGATCCGAA(SEQIDNO:20)。使用上述策略，包括開始于SEQIDNO:2的多核苷酸序列的位置43并結(jié)束于位置51的9個(gè)相鄰核酸殘基的第二RNA干擾的多核苷酸具有如下序列GATCCGAAA(SEQIDNO:21)。第三和第四RNA千擾的多核苷酸分別地具有如下序列ATCCGAAAA(SEQIDNO:22)和TCCGAAAAA(SEQIDNO:23)。可如上所述獲得包括9個(gè)相鄰核酸殘基的另外的RNA干擾的多核苷酸。關(guān)于設(shè)計(jì)和4吏用siRNA的進(jìn)一步信息還可見于在www.mpibpc.gwdg.de/abteilungen/10-0/105/sima.html可得的"ThesiRNAUserGuide(siRNA使用者指南)"。減少編碼包括SEQIDNO:1的多肽的多核苷酸表達(dá)的進(jìn)一步手段可通過引入催化性反義核酸構(gòu)建體諸如核酶來實(shí)現(xiàn)，其能夠裂解RNA轉(zhuǎn)錄物并從而阻止野生型蛋白產(chǎn)生。借助于和核酶催化位點(diǎn)側(cè)翼的靶具有序列互補(bǔ)性的兩個(gè)區(qū)域，核酶靶向于特定序列并與之退火。結(jié)合后，核酶以位點(diǎn)特異性方式裂解耙。特異性識(shí)別并裂解目標(biāo)序列的核酶的設(shè)計(jì)和測試可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)(例如Lieber和Strauss,(1995)Mol.Cell.Biol.15:540-551,其/>開通過引用的方式并入本文)。在某些實(shí)施方案中，編碼包括SEQIDNO:l的多肽的多核苷酸的表達(dá)的減少是共抑制的結(jié)果。共抑制是指由引入轉(zhuǎn)基因?qū)е碌膬?nèi)源基因的抑制。通常，共抑制在以與內(nèi)源基因相同或共有核苷酸序列同源性的基因構(gòu)建體的一個(gè)或多個(gè)拷貝轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物中觀察到。在一些這種轉(zhuǎn)化的植物中，對引入的轉(zhuǎn)基因以及內(nèi)源同系物都可發(fā)生抑制，例如由于偶然地產(chǎn)生反義RNA,或由于引入的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源同系物之間反常的染色體相互作用(Hooper,77e/e細(xì)/aparafiforcopiesZaw戸zz/Z"g^fecto/"p/朋to(矮牽?；ㄗ韵嗝茉黾拥幕蚩截愒谥参镏芯哂辛钊嗣曰蟮淖饔?，J.N1HRes.3:49-54，(1991)。因此，不是導(dǎo)致引入的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平增加，共抑制導(dǎo)致根據(jù)SEQIDNO:l的多肽的表達(dá)水平減少。如以下的實(shí)施例2、圖9c、lla、llb、lld和llg以及表8所述的，以過表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的一些轉(zhuǎn)基因水稻植物表現(xiàn)出在以反義構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物中觀察到的性狀，作為共抑制的結(jié)果。例如，與WT相比時(shí)，這些共抑制植物表現(xiàn)出從主分蘗的地上節(jié)發(fā)枝(這導(dǎo)致每抹植物的圓錐花序數(shù)目顯著總體增加)，以及種子平均數(shù)和植物生物量2至超過3倍的增加。還考慮了引入包括單個(gè)或多個(gè)核苷酸插入、缺失或取代的突變以減少根據(jù)SEQIDNO:1的多肽的表達(dá)的多核芬酸。單個(gè)或多個(gè)核香酸插入、缺失或取代可經(jīng)由靶突變位點(diǎn)與引入的靶核苷酸序列之間的重組而引入。這種引入的核苦酸序列可例如包括待引入基因組中的核苦酸序列，其任一側(cè)的側(cè)翼為與相鄰于或位于期望的突變插入點(diǎn)任一側(cè)的耙序列同源的核苷酸序列。與靶序列同源的核苷S交序列可與把序列等基因從而提高同源重組的頻率。還可使用不是嚴(yán)格地與靶序列等基因的同源核苷酸序列。盡管同源核香酸序列與靶序列之間的錯(cuò)配可不利地影響同源重組頻率，但是等基因性不是嚴(yán)格地需要的，大致的同源性即可足夠。為了本發(fā)明目的，同源序列與靶序列之間的同源性水平可為至少約90%同一性、至少約95%同一性、至少約99%同一性或100%同一性。突變可通過化學(xué)或物理誘變技術(shù)，或使用插入突變手段諸如轉(zhuǎn)座子或T-DNA引入，且外源核酸可通過重組手段引入，采取例如，化學(xué)輔助的細(xì)胞滲透(使用例如鈣、鋰、PEG)、電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、微粒轟擊(生物彈法)、農(nóng)桿菌04grato"^7^m)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、病毒感染、原生質(zhì)體融合或本領(lǐng)域已知的任何其它適當(dāng)?shù)氖侄?。編碼根據(jù)SEQIDNO:1的多肽的多核苷酸的表達(dá)的減少或增加可為穩(wěn)定或瞬時(shí)的(例如，在一代或兩代中僅在特定發(fā)育階段或組織)，取決于植物是穩(wěn)定地還是瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化的。"穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化的"是指引入并整合一種或多種轉(zhuǎn)基因到細(xì)胞基因組。細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)檢測，例如通過細(xì)胞的基因組DNA與能夠結(jié)合至一種或多種轉(zhuǎn)基因的核酸序列的Southern印跡雜交，或通過對細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因序列。相反，術(shù)語"瞬時(shí)地轉(zhuǎn)化的"是指引入一種或多種轉(zhuǎn)基因到細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)基因不整合入轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的基因組?？蓹z測瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，例如，通過使用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測一種或多種轉(zhuǎn)基因編碼的多肽的存在或通過檢測轉(zhuǎn)基因編碼的蛋白(如(3-葡糖醛酸糖香酶)的活性。因此，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體可區(qū)別于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體，因?yàn)楸M管穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體的基因組DNA含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體的基因組DNA不含有轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明的多核普酸可以棵DNA質(zhì)?；蛞暂d體形式施用?？肈NA質(zhì)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知方法引入宿主細(xì)胞，例如，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯孩i注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、使用基因槍、或使用DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)物(transporter)。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以載體施用。載體可為質(zhì)粒載體、病毒載體、或適于插入外源序列并引入到真核細(xì)胞中的任何其它合適的運(yùn)載體(諸如粘粒)。在某些實(shí)施方案中，載體是能夠指導(dǎo)本發(fā)明的抑制性多核苷酸分子的DNA序列轉(zhuǎn)錄為RNA的表達(dá)載體。病毒表達(dá)載體包括，例如基于埃巴病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和腺伴隨病毒的載體。在一實(shí)施方案中，載體是附加型的。使用合適的附加型載體提供了在靶細(xì)胞中以高拷貝數(shù)染色體外維持抑制性核酸分子的手段從而消除了染色體整合的可能效應(yīng)。載體還可包括包含表達(dá)控制元件的核酸，所述表達(dá)控制元件諸如轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等，其中所述控制元件可操作地與編碼基因產(chǎn)物的核酸連接。例如，編碼區(qū)與啟動(dòng)子的可操作連接使得由特異性地識(shí)別、結(jié)合并轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)的RNA聚合酶從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)。在某些實(shí)施方案中，編碼區(qū)置于強(qiáng)有力的組成型啟動(dòng)子之下，諸如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子或玄參花葉病毒35S啟動(dòng)子。預(yù)期用于本發(fā)明的其它組成型啟動(dòng)子包括但不限于T-DNA甘露堿合成酶、胭脂堿合酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動(dòng)子。可選地，可使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(如，高度光照、干旱、鹽度或溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子)。示例性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括用于在轉(zhuǎn)化的植物的光合組織中表達(dá)的核酮糖二磷酸羧化酶(RuBisCo)小亞基基因啟動(dòng)子或葉綠素a/b結(jié)合蛋白(CAB)基因啟動(dòng)子、用于在轉(zhuǎn)化的植物的種子中表達(dá)的各種種子儲(chǔ)藏蛋白基因啟動(dòng)子和用于在轉(zhuǎn)化的植物的根系中表達(dá)的根特異性谷氨酰胺合成酶基因啟動(dòng)子。載體可為雙元載體。例如，可使用農(nóng)桿菌雙元載體系統(tǒng)，其包括置于如上所述的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的選擇的編碼區(qū)，并連接至核藥物抗性標(biāo)記，諸如卡那霉素抗性。其它有用的選^H"生標(biāo)記系統(tǒng)包括但不限于賦予抗生素抗性(如對潮霉素或雙丙氨膦(bialaphos)的抗性)或除草劑抗性(如對磺酰脲、草丁膦(phosphinothricin)或草甘膦的抗性)的其它基因。常用的雙元載體包括pBIN19、pPVP和pGreen。在一些實(shí)施方案中，除去、添加或改變克隆的5'未翻譯部分以消除額外的、可能不適當(dāng)?shù)奶娲g開始(即起始)密碼子或在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平可干擾或減少表達(dá)的其它序列也可為有益的?？蛇x地，共有核糖體結(jié)合位點(diǎn)(參見如，Kozak，JBiol.Chem.,266:19867-19870(1991))可緊密插入到起始密碼子的5'以增強(qiáng)表達(dá)。可經(jīng)驗(yàn)地確定對這種修飾的需求(或需要)，且選^l奪這些和其它常用的載體元件是常規(guī)的。許多這種序列還可從商業(yè)可得的載體衍生。(參見例如，Sambrook，J.等人，MolecularCloning(分子克隆)，ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001),"A/o/ecM/arC7o"/wg..」丄or6oratoo;Afam/a/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)"，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress和其中引用的參考文獻(xiàn)、以及Ausubel等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案)，JohnWiley&Sons(2000))。本發(fā)明的載體可使用本領(lǐng)域已知的用于將DNA引入細(xì)胞的任何合適的方法引入靶細(xì)胞，包括但不限于顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體介導(dǎo)的遞送、病毒感染、原生質(zhì)體融合和顆粒介導(dǎo)的攝取。任選地，本發(fā)明的多核苷酸與重組酶例如recA共同施用于輩巴細(xì)胞，從而增強(qiáng)同源重組率。如果需要，靶細(xì)胞可已經(jīng)包括合適的重組酶靶序列，或已被轉(zhuǎn)化以包括合適的重組酶耙序列。例如，可將重組酶蛋白負(fù)栽到耙向DNA上，如美國專利第6,255,113號(hào)所述的。為了強(qiáng)化負(fù)載過程，本發(fā)明的多核苷酸可含有一種或多種重組發(fā)生的成核序列，或通過以重組酶預(yù)培養(yǎng)多核苷酸而包被有重組酶蛋白，從而重組酶非共價(jià)地結(jié)合于多核苷酸(參見例如，A.Vergunst等人(1998),NucleicAcidsRes.26:2729和A.Vergunst和P.Hooykaas(1998)，PlantMolec.Biol.38:393406，國際專利7>布WO99/25821、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25854,和美國專利第5,780,296、6,255,113和6,686,515號(hào))。帶有本發(fā)明多核苷酸之一的轉(zhuǎn)基因植物可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)植物轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生，包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、陽離子或聚乙二醇處理原生質(zhì)體、電穿孔、微粒子轟擊、以包被有轉(zhuǎn)化DNA的微珠或微粒在溶液中攪動(dòng)細(xì)胞懸浮液、直接DNA攝取、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取和類似方法，如在大范圍的公眾可得教科書中描述的，諸如"MethodsforPlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué)的方法)"(Weissbach&Weissbach編輯，1988);Clough,S.J.禾口Bent,A.R(1998)"Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana(浸花法農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化擬南芥的簡化方法)"PlantJ.16,735-743;"MethodsinPlantMolecularBiology(植物分子生物學(xué)方法)"(Schuler&Zielinski編輯，1989);"PlantMolecularBiologyManual(植物分子生物學(xué)手冊)"(Gelvin，Schilperoort,Verma，編輯，1993);和"MethodsinPlantMolecularBiology-ALaboratoryManual(植物分子生物學(xué)方法-實(shí)驗(yàn)室手冊)"(Maliga，Klessig,Cashmore,Gmissem&Varner，編輯，1994)。還參見Sambrook,J.等人，MolecularCloning(分子克隆)，ColdSpringHarborLaboratory(1989)，Sambrook,J.andRussell,D.W.(2001)，"Mo/efM/arC/ow力g:爿丄Worafc^M朋wa/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)"，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress和其中引用的參考文獻(xiàn)，和Ausubel等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案)，JohnWiley&Sons(2000)，這些參考文獻(xiàn)通過交叉引用的方式并入本文。優(yōu)選的轉(zhuǎn)化方法可取決于待轉(zhuǎn)化的植物。農(nóng)桿菌載體通常用于轉(zhuǎn)化雙子葉物種。為了轉(zhuǎn)化單子葉物種，以包被有轉(zhuǎn)化DNA的顆粒和包被有轉(zhuǎn)化DNA的硅纖維生物彈轟擊通常可用于核轉(zhuǎn)化。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的包括小麥的單子葉物種的轉(zhuǎn)化也是已知的(參見例如，國際專利公布WO97/48814;還參見Hiei，Y.等人(1994),PlantJ.6(2):271-282和國際專利公布WO92/06205)。物、植物細(xì)胞、植物組織、種子及類似物。根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，已經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可生長為植抹(參見例如，McCormick,S.等人(1986),PlantCellReports5:81-84))。所得的植物可自花授粉、以相同的轉(zhuǎn)化抹系或不同林系授粉或雜交，且鑒定具有與SEQIDNO:l或其同系物相關(guān)的期望的性狀的所得植物?？稍耘鄡纱蚋啻源_保該表型特征被穩(wěn)定地保持?？蛇x地，在無性繁殖作物中，成熟突變體/轉(zhuǎn)基因植物可通過切割或通過組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖以產(chǎn)生相同植物。為了商業(yè)應(yīng)用，可進(jìn)行突變體/轉(zhuǎn)基因植物的選擇且可獲得新品種并無性繁殖。還提供了從由本發(fā)明方法獲得的植物獲得的植物部分，包括但不限于根、莖、葉、芽、花、莖干、種子、塊莖、果實(shí)和枝。選地，使用分子分析鑒定轉(zhuǎn)化的植物或植物部分，所述分子分析采用了靶基因的特異性寡核香酸探針和/或靶基因的擴(kuò)增。來自待分析的主題植物或植物部分的DNA或RNA可由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多合適的方法提取，諸如大范圍的熟知教科書中描述的，包括(但不限于)Sambrook,J.等人，MolecularCloning(分子克隆),ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001),"Mo/ecw/arC7畫'"g:丄a6orato^yM""船/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)"，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress和其中引用的參考文獻(xiàn)，和Ausubd等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案)，JohnWiley&Sons(2000),通過交叉引用并入本文。還參見以下描述的方法Lukowitz,W.,Gillmor,C.S.和Scheble,W-R.(2000)"PositionalCloninginArabidopsis:WhyItFeelsGoodtoHaveaGenomeInitiativeWorkingforYou(擬南芥中的位置克隆為什么對你來i)L具有基因組創(chuàng)始工作很好)"P/aWP/7"/0/0gv123，795-805和其中引用的參考文獻(xiàn)?？捎杀绢I(lǐng)域中已知的任何合適方法分析提取的DNA或RNA中是否存在轉(zhuǎn)基因，且采用何種方法/策略可取決于期望的特異性、和合適的序列和/或酶的可獲得性。例如，可使用TRIzol方法分析提取的RNA，并在進(jìn)行定量PCR之前以無RNA酶的DNA酶I處理提取的RNA。用于擴(kuò)增HOG1部分的合適的引物對包括PET1:5'-A(AG)和PET2:5'-TC(AG)AACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3'(SEQIDNO:25。用于分析HOGl基因或其同系物的其它合適的引物或引物對可基于SEQIDNO:1設(shè)計(jì)。用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的方法和試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。合適的方案和試劑將很大程度上取決于具體的情況?？蓮亩喾N來源獲得指導(dǎo)，諸如侈J"^口Sambrook,J.等人,MolecularCloning(分子克隆),ColdSpringHarborLaboratory(1989)，Sambrook，J.和Russell,D.W.(2001),"Mo/ecwAarC7om"g:」Z^wratoo^Ma""a/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)"，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress和其中引用的參考文獻(xiàn)，和Ausubel等人(編輯)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新方案)，JohnWiley&Sons(2000)，通過交叉引用并入本文。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將易于理解，可改變PCR反應(yīng)的各種參數(shù)而不影響擴(kuò)增期望的產(chǎn)物的能力。例如可改變采用的Mg"濃度和溫度。類似地，還可改變用作模板的基因組DNA的量，取決于可得的DNA的量。其它分析方法包括電泳，諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員基于大小分離DNA片段的常用技術(shù)。凝膠中瓊脂糖或聚丙烯酰胺的濃度很大程度上決定了凝膠的分辨能力，且瓊脂糖或聚丙烯酰胺的適當(dāng)濃度因此將取決于待分辨的DNA片段的大小。檢測和/或確定轉(zhuǎn)基因或其同系物的存在可輔助以使用任何適當(dāng)?shù)能浖挠?jì)算機(jī)分析。用于比較確定的核苷酸序列的合適的軟件包是本領(lǐng)域熟知的并易于獲得?？s寫2iP-2-異戊烯基腺嘌呤AHK-擬南芥組氨酸激酶AHP-擬南芥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白AMM-天冬酰胺最低限度培養(yǎng)基ARR-擬南芥響應(yīng)調(diào)節(jié)子AS-反義抑制A-腺苷BA-千基腺噤呤BLAST-基本局部比對搜索工具CAB-葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因CaMV-花椰菜花葉病毒CRE-細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)cDNA-互補(bǔ)脫氧核纟唐核酸DNA-脫氧核糖核酸ELISA-酶Jf關(guān)免疫吸附測定ETR1、ERS2、ETR2和EIN4隱乙烯受體FAB-快原子轟擊G-鳥嘌呤GFP-綠色熒光蛋白HOG1-同源性依賴性基因沉默1HSP-高得分序列對ITC-等溫滴定量熱法KD-解離常數(shù)KNAT1-擬南芥打結(jié)同系物1LAI-葉面積指數(shù)LAR-葉面積比率mRNA-信使RNANCBI-美國國家生物技術(shù)信息中心NOS-胭脂》威合酶OCS-章魚堿合酶OE畫過表達(dá)OsCBP-水稻細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合蛋白PCR-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PNA-肽核酸PETCBP-矮牽牛細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合蛋白R(shí)NA-核糖核酸RNAi-RNA干擾RuBisCo-核酮糖二磷酸羧化酶SAH-S-腺苷高半胱氨酸SAM-S-腺香甲硫氨酸siRNA-小干擾RNASSC-1-2X氯化鈉和檸檬酸鈉SAHH-S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶SLA-比葉面積STM-無莖干分生組織(ShootMeristemless)轉(zhuǎn)錄因子T-胸腺嘧啶TDNA-轉(zhuǎn)移的DNATm-熱熔點(diǎn)U-尿嘧咬WT-野生型ZR-玉米素核苷附圖簡述附圖示意公開的實(shí)施方案并用于解釋公開的實(shí)施方案的原理。然而應(yīng)理解的是，設(shè)計(jì)這些圖只是為了示意，不作為對本發(fā)明范圍的限定。圖1顯示等溫滴定量熱法、HOGl定位和表達(dá)分析的結(jié)果。A)以ITC進(jìn)行細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合測定。上圖顯示將原始熱數(shù)據(jù)對從注射0.1玉米素到含有2純化TAP-HOG1的樣品細(xì)胞獲得的基線漂移校正。下圖顯示將熱峰面積對加至HOGl的玉米素摩爾比繪圖產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。插圖顯示從轉(zhuǎn)基因植物純化的TAP-HOG1蛋白(60kDa)。B)對尿素衍生的合成細(xì)胞激動(dòng)素噻苯隆的測定的執(zhí)行同玉米素。C)HOGl-細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合是吸熱的，具有2:1的化學(xué)計(jì)量。對所測試的三種細(xì)胞激動(dòng)素即玉米素、爺基腺嘌呤(BA)和2-異戊烯基腺嘌呤(2iP)的KD值的范圍為從16.9nM至20.6nM。對腺嘌呤和NAD+的KD值分別為2.1和39.5^M,顯示HOG1的細(xì)胞激動(dòng)素特異性。D)表達(dá)GFP-HOGl融合蛋白的轉(zhuǎn)基因抹系展現(xiàn)與35S:HOGl抹系相同的表型，顯示融合蛋白保留其功能。E)GFP-HOG1融合蛋白定位在質(zhì)膜中。以488nm氬激光連同505-至530-nm帶通的過濾設(shè)置使用共聚焦激光掃描顯微鏡(ZeissCLSM510)進(jìn)行活幼苗根細(xì)胞成像。插圖顯示在單個(gè)細(xì)胞中，蛋白定位于質(zhì)膜。F)定量實(shí)時(shí)PCR分析H0G1的表達(dá)顯示基因在檢查的所有植物部分中組成型地表達(dá)。圖2顯示通過定量實(shí)時(shí)PCR分析HOGl在擬南芥的過表達(dá)和反義抑制抹系中的表達(dá)。A)與野生型相比，八個(gè)獨(dú)立的過表達(dá)林系顯示HOGl轉(zhuǎn)錄物水平增加3至20倍。B)和C)用于實(shí)時(shí)PCR分析的過表達(dá)抹系的表型一致，盡管轉(zhuǎn)錄物水平有差異。D)與野生型相比，HOGl反義抑制抹系顯示轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平減少2至10倍。E)和F)用于表達(dá)分析的八個(gè)反義抹系的開花時(shí)間表型與HOGl轉(zhuǎn)錄物的抑制水平直接相關(guān)。G)、H)、I)和J)對OE抹系6的三抹單獨(dú)幼苗和兩抹WT植物以玉米素(0.01iiM)隔天噴灑持續(xù)四周時(shí)間，以觀察外源施加的細(xì)胞激動(dòng)素是否可在OE抹系中延遲開花到與WT相同的階段。G)與對照OE抹系(無玉米素)相比，以玉米素噴灑的OE植物顯示抽墨延遲，而I)對照OE抹系在4蓮座葉階段抽薹。H)以玉米素噴灑的OE植物在到達(dá)6至7葉階段后才顯示抽薹，與WT植物幾乎在相同階段，顯示外源施加細(xì)胞激動(dòng)素拯救OE抹系。J)OE抹系的對照個(gè)體(未噴灑玉米素)在此階段已經(jīng)完全開花并生長到其最大生產(chǎn)量。圖3顯示HOGl過表達(dá)(OE)、反義抑制(AS)和野生型(WT)植物的表型。A)HOGlOE抹系當(dāng)其發(fā)育了僅四片蓮座葉時(shí)就顯示開花，此時(shí)WT還未開始開花。B)HOGl的AS抹系顯示延遲開花(抽薹時(shí)為14葉階段)，此時(shí)51WT已經(jīng)充分發(fā)育花序。C)比較OE、WT和AS抹系成熟時(shí)的表型。當(dāng)與WT相比時(shí)，觀察到萌發(fā)30天后OE抹系的總生長延遲和AS抹系的大量發(fā)枝的表型。D)與WT和OE抹系相比，AS株系中蓮座葉大小增加。E)與WT相比，AS林系中長角果大小增加，而OE抹系中的顯著減少(比例尺=1cm)。F)在生長素吲哚丁酸(0.2嗎/ml)存在下，愈傷組織對各種濃度的外源細(xì)胞激動(dòng)素(玉米素)的響應(yīng)。AS抹系的愈傷組織展現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞激動(dòng)素不敏感表型，即，培養(yǎng)3周后的弱細(xì)胞增殖刺激和缺失不定芽(adventitiousshoot)誘導(dǎo)。OE4朱系的愈傷組織的響應(yīng)與WT類似，即，都展現(xiàn)正常愈傷組織發(fā)育和不定芽誘導(dǎo)，顯示HOG1是細(xì)胞激動(dòng)素的正調(diào)節(jié)子。G)定量OE、WT和AS抹系中的細(xì)胞激動(dòng)素水平。使用異戊烯基腺苷和玉米素核普檢測試劑盒(Sigma),以單克隆抗體iPA和ZR通過免疫測定方法定量內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素。給出的值代表三次獨(dú)立提取的三次重復(fù)的平均值士SD。測量的細(xì)胞激動(dòng)素是異戊烯基腺噤呤(iP)、異戊烯基腺苷(iPA)、玉米素(Z)和玉米素核苷(ZR)。H)分光光度測定各抹系和純化的TAP-HOG1蛋白的S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)活性。WT、OE和AS抹系的粗蛋白提取物未觀察到顯著的活性差異，而純化的TAP-HOG1蛋白不具有可測的SAHH活性。圖4顯示所選的細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)基因和HOG1-AHP1相互作用的定量實(shí)時(shí)PCR分析。在用千基腺嘌呤(BA)以0pM、0.01pM、0.1pM、1|iM或5|iM脈沖處理數(shù)個(gè)時(shí)間間隔(5min、15min、30min和lh)之前和之后從三個(gè)獨(dú)立的反義抑制(AS1、AS8、AS21)和過表達(dá)(OEl、OE12、OE18)抹系收獲幼苗以進(jìn)行RNA提取。施加BA導(dǎo)致KNAT1和STM轉(zhuǎn)錄物劑量依賴性增加。A)在不存在外源BA下，AS抹系顯示上調(diào)KNAT1和STM(參與分生組織功能的同源異型框基因)，而OE抹系顯示下調(diào)這兩種基因。以5|iMBA處理lh后，KNAT1和STM的表達(dá)顯示少于兩倍的改變，與WT相比不顯著。B)ARR4和ARR6(細(xì)胞激動(dòng)素誘導(dǎo)的A型響應(yīng)調(diào)節(jié)子)也顯示表達(dá)水平的類似趨勢。C)純化TAP-HOG1復(fù)合體。從35S:TAP-HOG1植物提取總蛋白(泳道l)且使用ProtA和CBP標(biāo)簽的親合柱純化后導(dǎo)致鑒定大約24kDa的條帶(星號(hào))，由N-末端測序證實(shí)該條帶為AHP1(泳道2)。以針對ProtA標(biāo)簽的抗體為探針的總蛋白的蛋白質(zhì)印跡顯示存在對應(yīng)于TAP-HOGl的71kDa條帶。D)重組AHP1純化的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。在大腸桿菌中表達(dá)AHP1為帶有6-His和石克氧還蛋白標(biāo)簽。泳道l是總細(xì)胞裂解物，且?guī)в袠?biāo)簽的純化的AHPl在泳道2中。E)以ITC進(jìn)行的TAP-HOGl和AHPl相互作用。E)的上圖顯示將原始熱數(shù)據(jù)對從注射0.1純化的AHPl進(jìn)入含有2(iM純化的TAP-HOGl的樣品細(xì)胞獲得的基線漂移校正。下圖顯示將熱峰面積對加至HOGl的AHPl的摩爾比繪圖產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。TAP-HOGl和AHPl結(jié)合是吸熱的，KD值為23.8nM。圖5是經(jīng)由HOG1的細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的圖示。細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)由HOG1在質(zhì)膜感知。HOGl二聚體經(jīng)由AHPl開始信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，AHPl可與B型ARR(如ARR1、ARR2)和A型ARR(如ARR4、ARR5)相互作用。圖6顯示HOGl與同系物的多序列比對。將HOGl的推論的氨基酸序列(SEQIDNO:l)與來自矮牽牛(SEQIDNO:13)、煙草(SEQIDNO:3)、水稻(SEQIDNO:5)、小麥(SEQIDNO:7)和人類(SEQIDNO:26)的SAHH序列比對。SAHH的兩個(gè)保守的標(biāo)志標(biāo)為粗體。在SAHH的第2個(gè)標(biāo)志中，代表二核苷酸結(jié)合域的三個(gè)保守的甘氨酸殘基標(biāo)有下劃線。7(HOGl的位置l-7)氨基酸的N-末端段和41氨基S吏(HOGl的位置150-191)的另外段以及螺旋跨膜區(qū)(HOGl的位置59-76)標(biāo)為斜體。圖7顯示外源施加細(xì)胞激動(dòng)素對HOG1的野生型(WT)、過表達(dá)(OE)和反義抑制(AS)林系的效應(yīng)。對OE抹系6和AS抹系12的三抹單獨(dú)幼苗以玉米素或激動(dòng)素(0.01pM)隔天噴灑持續(xù)四周時(shí)間。類似地處理兩抹WT植物以比較。A)和C)在生長的4葉階段，當(dāng)與對照OE林系相比時(shí)，以玉米素和激動(dòng)素噴灑的三抹單獨(dú)OE抹系6不顯示任何抽薹。E)對照OE抹系在4葉階段抽墨。B)和D)分別地以玉米素和激動(dòng)素噴灑的三抹單獨(dú)OE抹系6顯示僅在達(dá)到6-7葉階段后抽墨。這顯示外源施加的細(xì)胞激動(dòng)素部分地拯救OE林系。F)OE抹系6的對照個(gè)體在此階段已經(jīng)成熟。G)、H)、1)、J)和K)當(dāng)與對照AS抹系相比時(shí)，接受細(xì)胞激動(dòng)素噴灑的AS抹系未顯示表型的任何顯著差異。這顯示過表達(dá)HOGl導(dǎo)致?lián)p耗內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素含量(如表l中所示)并因此影響表型。(注意圖A、B、E和F為主圖2中的圖G、H、I和J,它們包括在此處僅為了便于比較)。圖8顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。(a)與野生型(WT)對照相比，在約3周時(shí)，過表達(dá)(OE)HOGl的擬南芥幼苗顯示提早抽薹，但H0G1的反義抑制(AS)導(dǎo)致延遲開花。(b)在萌發(fā)30天后，對與野生型(WT)相比的各為OE(OE8、OE12)和AS(AS8、AS21)的兩林單獨(dú)轉(zhuǎn)基因抹系的成熟植物拍照。與OE和WT植物相比，AS抹系的花序大量分枝且生物量顯著更高。(c)AS林系的葉面積和(d)長角果長度以及種子(圖f的插圖)顯著高于OE和WT的。(e)定量實(shí)時(shí)PCR分析(d)中的植物中的HOG1轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平。(f)定量葉面積、種子重量、每個(gè)長角果的種子數(shù)目和細(xì)胞激動(dòng)素異戊烯基腺嘌呤的內(nèi)源濃度顯示AS中的值最高，隨后分別是WT和OE抹系。圖9顯示以過表達(dá)(OE)或反義抑制(AS)含有擬南芥HOGlcDNA的轉(zhuǎn)基因7K牙舀(4更牙舀品種曰本晴(Oryz"s""'v"m/.y'a/ow'c"cv7V^;owZwrre))才直4勿導(dǎo)致OsCBP水平改變。(a)萌發(fā)約四周后分蘗開始時(shí)OE和AS林系的幼苗。(b)萌發(fā)后約90天時(shí)OE和AS抹系的成熟植物。與WT相比，AS林系展現(xiàn)大量分蘗和生物量增加，而OE植物保持矮小。(c)連根拔起的OE、WT、AS和共抑制(CS)成熟植物顯示AS和CS植物具有相當(dāng)?shù)母叩拿恐参锏姆痔Y數(shù)。(d)CS植物顯示從地上節(jié)的發(fā)枝，導(dǎo)致每植物的圓錐花序數(shù)目總體增加。(e)與其它抹系相比，OE林系的圓錐花序顯著更小。(f)定量實(shí)時(shí)PCR分析WT中OsCBP轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平、OE株系(S-2L、S-9T)中引入的擬南芥HOG1轉(zhuǎn)錄物水平、CS抹系(CS-4T、CS-1)和AS抹系(AS-lS-2、AS-4S-2)中內(nèi)源OsCBP轉(zhuǎn)錄物水平減少。(g)定量每植物的分蘗數(shù)目、圓錐花序、葉面積、鮮重和種子總數(shù)顯示，與WT相比，AS和CS抹系中測量的參數(shù)顯著較高，這與在擬南芥中的觀察結(jié)果一致。圖10顯示(a)HOG1(SEQIDNO:1)、PETCBP(SEQIDNO:13)和OsCBP(SEQIDNO:5)的多比對。PETCBP(SEQIDNO:13)和OsCBP(SEQIDNO:5)顯示88%同一性。與PETCBP(SEQIDNO:13)和HOG1(SEQIDNO:l)的88%同一性相比，HOG1(SEQIDNO:l)和OsCBP(SEQIDNO:5)顯示90%同一性。(b)OsCBP的基因組blast顯示其存在于染色體11(Osllg0455500),說明其在水稻基因組中為單拷貝54(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。圖11顯示以ITC進(jìn)行的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合測定結(jié)果。上圖顯示將原始熱數(shù)據(jù)對從注射O.l(iM千基腺嘌呤進(jìn)入含有2pM純化的TAP-HOGl的樣品細(xì)胞獲得的基線漂移校正。下圖顯示將熱峰面積對加至HOGl的芐基腺噤呤的摩爾比繪圖產(chǎn)生的結(jié)合等溫線。圖12顯示具有過表達(dá)(OE)擬南芥HOGl或由擬南芥HOGl誘導(dǎo)的反義抑制(AS)OsCBP的轉(zhuǎn)基因水稻(粳稻品種日本晴)植物的表型。(a)具有共抑制效應(yīng)的OE抹系(圖右邊，對照在左邊)顯示每植物的分蘗數(shù)目增力口。(b)成熟的AS、野生型(WT)和共抑制(CS)抹系。與雜交(hybrid)母體林系(WT)相比，AS和CS抹系表現(xiàn)每植物的更多分蘗(發(fā)枝)數(shù)目。(c)WT和AS抹系的種子大小無顯著差異。當(dāng)與WT相比時(shí)，在OE觀察到種子大小的一些減少。(d)和(e)OE和AS抹系在Tl代的Southern印跡。(d)第1泳道是標(biāo)記物。泳道2至11是獨(dú)立的OE林系。泳道2(OE抹系Sl)、泳道5(OE株系4)和泳道8(OE林系"顯示單個(gè)插入。泳道4(OE林系3)、泳道7(OE抹系6)、泳道9(OE林系9)、泳道10(OE抹系10)和泳道11(OE林系11)顯示雙插入，而泳道3(OE抹系"和泳道6(OE林系"各顯示三插入。(e)泳道2(林系A(chǔ)S1)、泳道3(抹系A(chǔ)S2)、泳道4(抹系A(chǔ)S3)和泳道6(林系A(chǔ)S5)顯示單插入。泳道5(抹系A(chǔ)S4)顯示雙插入。對各泳道，使用從葉提取，以EcoRI酶消化的基因組DNA(6嗎)。使用的探針是DIG標(biāo)記的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。在信號(hào)顯現(xiàn)之前，以高嚴(yán)格性洗滌印跡。最佳方式包括最佳方式和對比實(shí)例的本發(fā)明的非限制性實(shí)例將通過參考具體實(shí)施例而進(jìn)一步更詳細(xì)地描述，具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式解釋為限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1擬南芥同源性^性基因沉默l(HOGl)是推定的細(xì)胞激動(dòng)素受體材料和方法植物材料和生長M本研究中使用擬南芥哥倫比亞生態(tài)型。植物在22。C、16h光/8h暗下生長。對于幼苗測定，將種子表面滅菌并在4。C黑暗中層化2天，隨后暴露于白光(75pE.m-ls-Y幼苗在22。C下在含有3%蔗糖和0.9%瓊脂的Murashige-Skoog(MS)培養(yǎng)基上生長。對于萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，將特定批次的種子播種在無蔗糖的MS培養(yǎng)基。質(zhì)粒構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥以5'和3'RACE策略擴(kuò)增全長擬南齊H0G1cDNA(SEQIDNO:2)。SMARTTMRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(ClontechLaboratories)用于鑒定cDNA的5'-和3'-cDNA(5V3'-RACE)末端序列。對這些PCR產(chǎn)物測序。將部分序列和RACEPCR產(chǎn)物一起比對以獲得擬南芥HOG1的全長cDNA序列(SEQIDNO:2)。pGreen0229雙元載體(Yu等人Prac.7V^/.&/.101:7827-7832,2004)用于所有轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。對于反義抑制，使用HOG1的5,兩個(gè)SAHH標(biāo)志的850bp片)殳(SEQIDNO:15)。HOG1cDNA的完整開放讀碼框用于過表達(dá)構(gòu)建體和用于GFP-HOG1構(gòu)建體。以ProtA和4丐調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)簽制備TAP-標(biāo)簽化的HOG1,兩個(gè)標(biāo)簽之間有TEV裂解位點(diǎn)(Forler等人7Va&re21:89-92，2003)。通過根癌農(nóng)桿菌C4gra6acten'ww^附e/ac/em)介導(dǎo)的真空滲透方法(Hiei等人，同上)將構(gòu)建體引入擬南芥。實(shí)時(shí)PCR分4斤以TRIzol方法(Invitrogen)從幼苗提取總RNA。以無RNA酶的DNA酶I處理的總RNA(0.5嗎)用于每個(gè)定量PCR反應(yīng)，根據(jù)制造商的說明書以一步RT試劑盒(Qiagen)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。使用SYBRgreen進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。將Ct值對微管蛋白2Ct值標(biāo)準(zhǔn)化以根據(jù)制造商的方案計(jì)算變化倍數(shù)。等溫滴定量熱法(ITC)以ITC(MCSITC,Microcal，Northampton,USA)沖企查HOG1與細(xì)胞激動(dòng)素的相互作用的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合親合力和熱力學(xué)分析。使用三種天然產(chǎn)生的細(xì)胞激動(dòng)素(玉米素、千基腺噤呤和異戊烯基腺噪呤)和噻苯隆(一種尿素衍生的合成的細(xì)胞激動(dòng)素)。此外，腺苷和NAD用作對照分子以證實(shí)H0G1對細(xì)胞激動(dòng)素的結(jié)合特異性。由MICROCALORIGIN2.9版本分析數(shù)據(jù)，使用用于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的最佳擬合的非線性最小平方方法。爿t人擬合的曲線計(jì)算結(jié)合化學(xué)計(jì)量(n)和締合常數(shù)(KA)。隨后，計(jì)算KD為1/KA。將原始熱數(shù)據(jù)對從注射o.l純化的AHP1進(jìn)入含有2純化的TAP-HOG1的樣品細(xì)胞獲得的基線漂移校正。將熱峰面積對加至HOGl的AHP1的摩爾比繪圖而產(chǎn)生結(jié)合等溫線。亞細(xì)胞定位GFP-HOG1融合蛋白根據(jù)其表型選擇表達(dá)單個(gè)35S:GFP-HOGl融合構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。切下5天幼苗的根并放入強(qiáng)度減半的MS培養(yǎng)基，緊接著以488nm氬激光連同505-至530-nm帶通的過濾設(shè)置進(jìn)行共聚焦激光掃描顯孩"竟檢(ZeissCLSM510)。愈傷組織的細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)測定幼苗根段在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)充0.5(ig/ml2,4-二氯苯氧乙酸和0.05^g/ml激動(dòng)素的MS培養(yǎng)基)培養(yǎng)4天。所得的愈傷組織在莖干誘導(dǎo)培養(yǎng)基(補(bǔ)充0.2pg/ml吲哚丁酸和各種濃度玉米素的MS培養(yǎng)基)培養(yǎng)30天，每10天間隔將其繼代培養(yǎng)到新鮮培養(yǎng)基，根據(jù)Inoue等人(A/^w409:1060-1063,2001)的方法。細(xì)胞激動(dòng)素含量和SAHH酶測定以100%曱醇從全植抹提取細(xì)胞激動(dòng)素并使用異戊烯基腺苷和玉米素核香檢測試劑盒(Sigma)定量，如Yang等人(fE^S555:291-296,2003)所述的。對抽薹植物的粗蛋白提取物進(jìn)行SAHH分光光度測定，如Rocha等人CP/"WCe〃17:404-417,2005)所述的。細(xì)胞激動(dòng)素初級(jí)響應(yīng)基因的表達(dá)對于細(xì)胞激動(dòng)素可誘導(dǎo)的基因表達(dá)的定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)分析，種子在含有3%(w/v)蔗糖的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長6天。通過在補(bǔ)充0、0.01、0.1、1或5|liM[溶解于0.1。/。二曱亞砜(DMSO)并以MS培養(yǎng)基稀釋]的相同MS+嚴(yán)糖液體培養(yǎng)基(無瓊月旨)培養(yǎng)幼苗5min、15min、30min或1h進(jìn)行細(xì)胞激動(dòng)素處理。以DMSO(0.1%,用于溶解用于處理的細(xì)胞激動(dòng)素的濃度)培養(yǎng)對照幼苗相應(yīng)的時(shí)間并用于表達(dá)分析。在制備RNA之前，將WT、OE和AS幼苗集中在一起并儲(chǔ)存在RNAlater溶液(Qiagen,Valencia,CA)。使用RneasyPlantMini試劑盒(Qiagen)提取總RNA。SYBRgreenRT-PCR試劑(AppliedBiosystems)用于合成雙鏈cDNA。從三次獨(dú)立重復(fù)確定有或沒有BA和DMSO的WT、OE和AS幼苗各自的生物重復(fù)中存在的轉(zhuǎn)錄物數(shù)目。根據(jù)制造商的說明(ABIPrism7700SequenceDetectionSystem,UserBulletin#2)計(jì)算轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)倍數(shù)。TAP-HOG1和AHP1對目互作用研究使用ProtA和CBP標(biāo)簽純化TAP-HOG1蛋白復(fù)合體，如之前在Forler等人(同上)中所述的。對于ProtA下拉(pulldown),使用IgG瓊脂糖珠(AmershamBiosciences#17-0969-0l)和對于CBP下拉，使用4丐調(diào)蛋白親合樹脂(Stratagene#214303-52)。對純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并使用標(biāo)準(zhǔn)方案印跡于PVDF膜，以用于蛋白質(zhì)印跡分析。而且，對下拉的HOGl-復(fù)合體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并進(jìn)行N-末端測序以鑒定獲得的主要條帶。由于AHP1是主要的推定的相互作用蛋白條帶，從擬南芥克隆AHP1的cDNA且將重組AHP1在大腸桿菌BL21中表達(dá)為帶有6-fflS標(biāo)簽和-琉氧還蛋白標(biāo)簽(在表達(dá)載體PET32EK/LIC中，Novagen)。使用HIS-標(biāo)簽親合柱(BioRad)純化帶有標(biāo)簽的重組AHP1。如上所述的由ITC(MCS-ITC,Microcal,Northampton,USA)進(jìn)行蛋白相互作用(HOG1-AHP1)研究。結(jié)果和討論本發(fā)明人使用反義抑制和過表達(dá)策略來分析HOG1牽涉在細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)植物發(fā)育中。HOG1的cDNA克隆(SEQIDNO:2)與多個(gè)物種的植物和動(dòng)物的S-腺普-L-高半胱氨酸水解酶(SAHH)展現(xiàn)顯著的序列相似性。與從多個(gè)植物物種分離的同系物的比較表示HOG1在不同植物物種中是保守的(圖6)。尤其是，矮牽牛中的同系物(SEQIDNO:14)與HOG1共有78%的序列相似性，煙草中的同系物(SEQIDNO:4)與HOGl共有78%的序列相似性，水稻中的同系物(SEQIDNO:6)與HOGl共有82%的序列相似性，和小麥中的同系物(SEQIDNO:4)與HOGl共有83%的序列相似性。為了檢查HOGl的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合親合力，從轉(zhuǎn)基因擬南芥(含有35S:TAP-HOGl)純化TAP-HOGl蛋白，該植物也用于蛋白-蛋白相互作用研究。標(biāo)簽化的蛋白是功能性的，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物顯示與HOGl過表達(dá)抹系相同的表型。使用蛋白A(Prot-A)和CBP(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)標(biāo)簽純化蛋白。純化后，蛋白保留TAP標(biāo)簽的CBP部分，產(chǎn)生60kDa的大小(圖IA插圖)，而無TAP標(biāo)簽的CBP部分的單獨(dú)HOGl應(yīng)為56kDa。(a)HOGl以高親合力結(jié)合細(xì)胞激動(dòng)素細(xì)胞激動(dòng)素分子有效地結(jié)合純化的蛋白，如純化的TAP-HOG1與各種細(xì)胞激動(dòng)素的等溫滴定量熱法(ITC)所指示的。ITC是一種用于研究配體-受體結(jié)合動(dòng)力學(xué)的生物物理技術(shù)，其產(chǎn)生相互作用的重要熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括結(jié)合親合力(KA)、和因此的解離常數(shù)(KD)、以及結(jié)合化學(xué)計(jì)量(n)。細(xì)胞激動(dòng)素分子(玉米素、千基腺噤呤和異戊烯基腺噪呤)和噻苯隆(一種合成的尿素衍生的分子，具有細(xì)胞激動(dòng)素活性)用于結(jié)合研究。腺噤呤和NAD用作對照來確定HOGl的結(jié)合特異性。ITC確定的結(jié)合化學(xué)計(jì)量顯示兩個(gè)HOGl單體結(jié)合一個(gè)細(xì)胞激動(dòng)素分子(化學(xué)計(jì)量為2:l)(圖1A-1C),但不結(jié)合噻苯隆(圖IB和1C)。這顯示HOGl結(jié)合細(xì)胞激動(dòng)素的特異性。如從圖1C可見的，所測試的不同細(xì)胞激動(dòng)素的解離常數(shù)(KD)為從16.9到20.6nM。而且，腺。票呤的KD為2.1|iM,這暗示HOGl對腺噪呤的親合力比對細(xì)胞激動(dòng)素分子的顯著較低。這與腺噤呤當(dāng)在一些組織培養(yǎng)物中以相當(dāng)高濃度使用時(shí)僅引起弱的細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)的事實(shí)一致。由于NAD+是SAHH的已知輔因子，由ITC測量HOGl和NAD+復(fù)合體的KD值，為39.5pM(圖1C)，這進(jìn)一步暗示HOGl是細(xì)胞激動(dòng)素受體，而不太可能是功能性的SAHH酶。(b)HOGl定位于質(zhì)膜上使用哥倫比亞大學(xué)的PHDhtm網(wǎng)纟各資源(www.cubic.bioc.columbia.edu)進(jìn)行對HOG1蛋白的結(jié)構(gòu)域搜索。搜索顯示HOG1蛋白具有典型的受體樣結(jié)構(gòu)。H0G1蛋白具有預(yù)測的跨膜螺旋(跨SEQIDNO:1的殘基59到76的18個(gè)氨基酸)，和位于膜外的預(yù)測的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合域(跨SEQIDNO:1的殘基77到485的409個(gè)氨基酸)。所述蛋白還具有推定的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的位點(diǎn)，用于與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間物相互作用，其包括在N-末端的58個(gè)氨基酸(從SEQIDNO:1的殘基1到58)。為了物理地確定HOGl蛋白的亞細(xì)胞定位，產(chǎn)生表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)-HOGl融合體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物。在分離的七種獨(dú)立GFP林系中，選擇三種用于分析。表達(dá)GFP-HOG1融合蛋白的T3代轉(zhuǎn)基因植物顯示與HOG1過表達(dá)抹系相同的表型(圖1D),這表示融合蛋白保留了其功能。共聚焦激光掃描顯微鏡檢從所選抹系新鮮切下并置于強(qiáng)度減半的MS培養(yǎng)基的根顯示，GFP-HOGl位于質(zhì)膜上(圖1E)，這暗示HOGl是細(xì)胞激動(dòng)素的膜受體。作為對照，使用對擬南芥的較早研究報(bào)告，其中顯示35S:GFP在細(xì)胞質(zhì)和核中相當(dāng)均勻地表達(dá)(ZhangCe〃17:1306-1316，2005)?；谛蛄蟹治?，螺旋跨膜域(跨18個(gè)氨基酸)存在于HOG1和其它植物同系物，但不存在于人類和大鼠SAHH(圖6),后兩者是細(xì)胞質(zhì)蛋白(Shu等人尸rac.A^/.103:19788-19793)。而且，預(yù)期活性SAHH酶是可溶性蛋白，而不是保持結(jié)合于質(zhì)膜，因?yàn)樵撁概c發(fā)生在各細(xì)胞區(qū)室的甲基化反應(yīng)密切相關(guān)。因此，以GFP-HOG1的本實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示HOG1蛋白是膜受體。(c)HOGl過表達(dá)和反義抑制植物顯示相反表型定量實(shí)時(shí)PCR分析指出HOG1在擬南芥中組成型地表達(dá)，在葉和花序莖中有相對較高水平(圖1F)。這暗示HOGl可在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起基本作用。為了檢查調(diào)節(jié)HOG1表達(dá)水平對植物生長和發(fā)育的效應(yīng)，產(chǎn)生了各種HOG1過表達(dá)和反義抑制抹系。與野生型相比時(shí)，各種HOGl過表達(dá)林系顯示HOG1轉(zhuǎn)錄物水平增加3至20倍(圖2A)，而反義抹系顯示2至10倍的抑制(圖2B)。60轉(zhuǎn)基因表達(dá)影響植物發(fā)育的所有階段并在多種獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系中展現(xiàn)一致的表型(圖2C、2D、2E和2F)。記錄28抹獨(dú)立轉(zhuǎn)基因過表達(dá)抹系和21株反義抑制株系的表型以提供對改變是由引入的基因產(chǎn)物所導(dǎo)致的進(jìn)一步的支持。與野生型相比，過表達(dá)林系中種子萌發(fā)發(fā)生早4至5天，而與野生型相比，反義抑制林系中晚大約5天(表1)。不過，在過表達(dá)林系萌發(fā)后很快觀察到顯著的生長延遲。在過表達(dá)林系的營養(yǎng)生長期間，新蓮座葉的形成和展開也受到延遲和限制。表1.種子萌發(fā)、開花開始和衰老每種觀察使用五抹獨(dú)立株系。對每種抹系，數(shù)據(jù)是三次獨(dú)立重復(fù)的平均值。反義株系顯示晚萌發(fā)、晚抽薹和延遲衰老。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>反義抑制抹系顯示莖干生長無延遲，盡管種子萌發(fā)延遲。當(dāng)與野生型擬南芥和反義林系相比時(shí)，在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物觀察到更早開始開花，其在4蓮座葉階段抽薹(圖3A、表l),野生型擬南芥和反義株系在抽薹時(shí)分別地具有至少8和14葉(圖3B、表1)。開始開花后，過表達(dá)抹系未顯示葉生物量的任何進(jìn)一步增加，且甚至在生長30天后當(dāng)這些抹系開始衰老時(shí)還無葉腋花序枝形成(圖3C)。相反，此期間反義抹系顯示大量發(fā)育葉腋花序枝且在這些林系衰老不明顯(圖3C)。反義抹系還具有最大的葉面積(每葉2.94±0.15cm2)。過表達(dá)抹系(0.38±0.06cm、和野生型植物(1.00士0.06cm、中葉面積顯著較低(圖3D、表2和3)。過表達(dá)株系中總植物高度、長角果大小以及作為結(jié)果的每長角果的種子數(shù)目和重量(表2和3)顯著減少，而反義抑制抹系中長角果長度顯著地高于野生型的(圖3E)。轉(zhuǎn)基因林系中葉面積和每長角果的種子重量以及葉面積和每長角果的種子數(shù)目之間有正相關(guān)性(表3)。表2.葉面積、每長角果的種子重量和種子數(shù)目數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立重復(fù)的平均值士SD。每種情形使用五株獨(dú)立抹系。與野生型相比，反義抹系的葉生物量有三倍增加，且種子產(chǎn)量有兩倍增加。植物基因型葉面積(cm2)每長角果的種子重量(mg)每長角果的種子數(shù)目野生型(WT)擬南齊11.04±0.021.13±0.0135±0.0121.01±0.011.01±0.0230±0.0230.90±0.020.90±0.0226±0.0141.07±0.02l.l肚O.Ol32±0.010.98±0011.10±0.0129±0.01平均值士SD1.00±0.071.06±0.1130.40±0.36反義抹系A(chǔ)S12.86±0.011.79±0.0154±0.02AS83.12±0.012眉±0.0263±0.02AS"3.01±0.021.96±0.0159±0.02AS212.79±0.021.96±0.0157±0.01AS192.99±0.022.00±0.0260±0.01平均值土SD2.95±0.132.02±0.2258.60±0.37過表達(dá)林系OE10.33±0.020.68±0.0215±0.01OE80.40±0.020.72±0.0117±0.01OE120.49±0.020.81±0.0119±0.02OE180.33±0.020.70±0.0214±0.02OE"0.40±0.010.83±0.0117±0.02平均值士SD0.39±0.060.75±0.0716.40±0.14表3.對生物量和種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)的參數(shù)的皮爾遜氏(Pearson's)相關(guān)系數(shù)(r):檢驗(yàn)以下之間的相關(guān)系數(shù)葉面積(cm2)x每長角果的種子重量(mg)(A);葉面積(cm2)x每長角果的種子數(shù)目(B);和每長角果的種子重量(mg)x每長角果的種子數(shù)目(C)。相關(guān)性分析后，進(jìn)行學(xué)生t-一企驗(yàn)(Student'st-test)。t-檢驗(yàn)值在括號(hào)中給出。'r，值顯示所有檢驗(yàn)中的正相關(guān)性?；诖?，預(yù)測HOGl的反義抑制導(dǎo)致對葉生物量和種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)的關(guān)鍵參數(shù)增力口<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>當(dāng)與野生型植物相比時(shí)，過表達(dá)抹系成熟較早，過表達(dá)抹系成熟早于野生型植物大約一周(圖3A),而反義抑制抹系成熟晚于野生型兩周。而且,當(dāng)與野生型擬南芥相比時(shí)，HOG1反義抑制抹系中衰老延遲兩周(圖3C、表l)。為了研究H0G1作為細(xì)胞激動(dòng)素受體的作用，檢查轉(zhuǎn)基因HOG1植物的愈傷組織培養(yǎng)物對外源細(xì)胞激動(dòng)素的敏感性，類似于對CRE1的研究(Inoue等人，同上)。不同于全植抹中的莖干頂端分生組織，愈傷組織培養(yǎng)物具有響應(yīng)于營養(yǎng)培養(yǎng)基中提供的外源細(xì)胞激動(dòng)素的潛力并不取決于如在完整植物中的激素長途運(yùn)輸。來自HOG1過表達(dá)抹系和野生型的愈傷組織培養(yǎng)物展現(xiàn)正常的細(xì)胞增殖和不定芽誘導(dǎo)(圖3F)。相反，來自反義H0G1抹系的愈傷組織展現(xiàn)強(qiáng)的細(xì)胞激動(dòng)素不敏感表型，即，在提供的所有濃度玉米素下不存在細(xì)胞增殖和缺乏不定芽誘導(dǎo)(圖3F)。這些數(shù)據(jù)顯示HOG1的作用為細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)的正調(diào)節(jié)子。(d)轉(zhuǎn)基因植物的對比表型與內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素水平相關(guān)AHK-型細(xì)胞激動(dòng)素受體的功能喪失三突變體導(dǎo)致(Higuchi等人7Vaf/.Jcad101:8821-8826,2004)與本HOGl反義抑制觀察到的相反的表型。這種相反表型可由在過表達(dá)抹系中HOG1蛋白可能阻礙細(xì)胞激動(dòng)素運(yùn)輸而解釋。對三抹獨(dú)立抹系(各為野生型、過表達(dá)和反義抑制抹系)確定內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素含量。與野生型相比，過表達(dá)抹系中測量的不同細(xì)胞激動(dòng)素濃度顯著減少(圖3G)。異戊烯基腺。票呤是擬南芥的主要細(xì)胞激動(dòng)素，且與野生型相比，過表達(dá)抹系中其濃度減少約60%(圖3G)。過表達(dá)抹系中蛋白的更高可得性可造成對細(xì)胞激動(dòng)素跨質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)恼系K，尤其是因?yàn)榧?xì)胞激動(dòng)素必須被從根運(yùn)輸?shù)角o干頂端分生組織。這將導(dǎo)致明顯的功能喪失表型，即，觀察到植物高度減少和缺乏營養(yǎng)生物量(圖3A)。相反，與野生型相比，在反義抹系中異戊烯基腺噤呤濃度增加超過60%,這對應(yīng)于比過表達(dá)林系增加多于四倍(圖3G)。這導(dǎo)致大量發(fā)枝和生物量顯著增加的相反表型。為了對此進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測，研究了外源施加細(xì)胞激動(dòng)素對轉(zhuǎn)基因抹系表型的效應(yīng)。當(dāng)與未處理的過表達(dá)抹系相比時(shí)，從幼苗階段隔天接受0.01|iM玉米素或0.01|iM激動(dòng)素噴灑的過表達(dá)抹系在6至7葉階段顯示抽薹，未處理的過表達(dá)抹系在4葉階段抽薹(圖2G、2H、21、2J和圖7)。野生型擬南芥在大約8葉階段抽薹，表示過表達(dá)抹系被外源施加細(xì)胞激動(dòng)素"部分地拯救"。而且，反義抑制抹系未顯示響應(yīng)于外源施加的細(xì)胞激動(dòng)素的顯著改變(圖7),支持觀點(diǎn)對細(xì)胞激動(dòng)素運(yùn)輸?shù)淖璧K很可能造成我們研究中觀察到的相反表型。(e)純化的HOG1缺少SAHH酶活性野生型(2.92±0.15nmol/min/mg蛋白)、反義(2.84±0.21nmol/min/mg蛋白)和過表達(dá)抹系(3.02±0.19nmol/min/mg蛋白)的粗蛋白提取物中SAHH活性無顯著差異(圖3H),盡管之前報(bào)道hogl點(diǎn)突變體的粗蛋白提取物與野生型的相比具有略低的SAHH活性(Rocha等人尸/aw,CW/17:404-417,2005)。更重要地，本研究數(shù)據(jù)顯示，純化的TAP-HOG1蛋白缺少SAHH酶活性(圖3H)。這些結(jié)果暗示本研究的H0G1蛋白可為細(xì)胞激動(dòng)素受體。而且，Rocha等人(同上)中強(qiáng)調(diào)，點(diǎn)突變體(hogl-l)的粗蛋白提取物中測量的SAHH活性的微小差異可取決于一些其它位點(diǎn)。此外，SAHH活性減少應(yīng)導(dǎo)致SAH水平增加和SAM:SAH比率減少。然而，顯示hogl-l64純合子顯示SAH水平可忽略的增加，且SAM:SAH比率的變化相對小。這些突變體中顯示的基因組廣泛甲基化不足也與(S)-9-(2,3-二羥丙基)腺噪呤誘導(dǎo)的懸浮培養(yǎng)物中煙草基因組的甲基化不足不同，后者僅當(dāng)相對于未處理材料SAM:SAH比率減少300倍時(shí)發(fā)生。這些結(jié)果暗示，與植物中SAHH具有序列相似性的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合蛋白可能不是活性SAHH酶，但相反可為細(xì)胞激動(dòng)素受體。(f)HOGl影響細(xì)胞激動(dòng)素初級(jí)響應(yīng)基因的表達(dá)點(diǎn)，但組織培養(yǎng)包括超過6周的體外生長，在此期間其它過程也可對表型起作用。因此，還檢查了已知在相對短的時(shí)間內(nèi)被細(xì)胞激動(dòng)素直接誘導(dǎo)的選擇基因的表達(dá)(圖4A、4B和表4)。這些基因包括KNATl和STM(參與分生組織功能的同源異型框基因，在施加外源細(xì)胞激動(dòng)素后5分鐘內(nèi)被誘導(dǎo))以及ARR4、ARR5和ARR6(為細(xì)胞激動(dòng)素誘導(dǎo)的A型響應(yīng)調(diào)節(jié)子)。使用來自在以細(xì)胞激動(dòng)素(千基腺。票呤BA，以0pM、0.01pM、0.1|iM、1或5(iM)脈沖處理之前和之后的野生型、H0G1過表達(dá)和H0G1反義抑制抹系的幼苗RNA進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR分析。對經(jīng)數(shù)個(gè)時(shí)間間隔(5min、15min、30min和1h)收獲的組織進(jìn)行RNA提取。施加BA導(dǎo)致KNAT1和STM轉(zhuǎn)錄物的劑量依賴性增加，這與抹系中HOG1的表達(dá)水平和內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素濃度相稱(圖4A、4B、表4)。當(dāng)與未處理的野生型相比時(shí)，在H0G1反義抑制抹系中甚至無BA處理時(shí)KNAT1和STM的轉(zhuǎn)錄物水平顯著上調(diào)6至8倍，而未處理的過表達(dá)抹系顯示這些轉(zhuǎn)錄物的4至7倍減少(圖4A)。然而，與未處理的野生型植物相比，在施加5jxMBA后lh內(nèi)，過表達(dá)抹系(如0E1和OE12)的KNAT1和STM轉(zhuǎn)錄物水平未顯示顯著差異(圖4A、表4)。這與此抹系的內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素水平減少的觀察結(jié)果一致。表4.定量實(shí)時(shí)PCR分析選擇的細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)基因來自以細(xì)胞激動(dòng)素(芐基腺嘌呤BA,以0pM、0.01ixM、0.1(iM、1(iM或5pM)脈沖處理之前和之后的野生型、HOG1過表達(dá)和反義抑制抹系幼苗的RNA。使用從三抹獨(dú)立反義抑制(AS1、AS8、AS21)和過表達(dá)(OEl、OE12、OE18)抹系經(jīng)數(shù)個(gè)時(shí)間間隔(5min、15min、30min和1h)收獲的組織進(jìn)行RNA提取。分析的基因包括KNATl、STM(參與分生組織功能的同源異型框基因)、ARR4、ARR5和ARR6(細(xì)胞激動(dòng)素誘導(dǎo)的A型響應(yīng)調(diào)節(jié)子)。施加BA導(dǎo)致KNAT1和STM轉(zhuǎn)錄物劑量依賴性增加(變化倍數(shù)值后的箭頭表示上調(diào)卞或下調(diào)丄)。還分析了ARR1、ARR2(B型響應(yīng)調(diào)節(jié)子)、AHK2、AHK3、AHK4(組氨酸激酶細(xì)胞激動(dòng)素受體)。然而，其數(shù)據(jù)未顯示在該表中，因?yàn)檫@些基因的表達(dá)展現(xiàn)少于兩倍的改變。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>在具有約4倍更高的細(xì)胞激動(dòng)素內(nèi)源濃度的反義抹系中，所檢查的基因的表達(dá)水平高3至6倍。因此，顯示HOGl表達(dá)與這些植物中的細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)相關(guān)。這與之前報(bào)道具有過表達(dá)細(xì)菌,W基因?qū)е碌募?xì)胞激動(dòng)素生物合成增加的擬南芥植物中STM和KNAT1表達(dá)顯著增加類似(Rupp等人戶/朋〃18:557-563,1999)。這些觀察結(jié)果表示HOGl直接參與在植物發(fā)育期間調(diào)節(jié)細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)。此外，為了確定HOGl轉(zhuǎn)基因林系的表型是否與細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，研究了細(xì)胞激動(dòng)素誘導(dǎo)的極早期基因的最熟知類型，即，A型ARR基因-ARR4、ARR5和ARR6(圖4B)。本數(shù)據(jù)顯示這些基因在單次細(xì)胞激動(dòng)素脈沖處理后數(shù)分鐘內(nèi)被上調(diào)，這與之前在擬南芥的觀察結(jié)果一致(Brandstatter和Kieber尸/a"fCe〃10:1009-1020，1998;D'Agostino等人P/am尸/^w'o/124:1706-1717，2000;Taniguchi等人429:259-262,1998;To等人Ce〃16:658-671,2004)。發(fā)現(xiàn)內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素水平顯著減少(圖3G)的HOG1過表達(dá)抹系(如OE12),顯示研究的三種A型ARR基因表達(dá)水平的3至9倍減少。這很大程度上可由BA處理克服(圖4B)，與經(jīng)由主要細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的流量減少一致。類似地，具有更高內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素水平的反義HOGl株系(如AS8)具有相應(yīng)更高水平(4至9倍增加)的ARR表達(dá)(圖4B和表4)。這些數(shù)據(jù)顯示A型ARR基因是新細(xì)胞激動(dòng)素受體HOGl的下游。類似地，此前顯示ARR6在CRE1過表達(dá)抹系中響應(yīng)于外源細(xì)胞激動(dòng)素而被誘導(dǎo)，這證實(shí)ARR6為細(xì)胞激動(dòng)素受體(Hwang和Sheen7Vawe413:383-389,2001)。而且，研究這些轉(zhuǎn)基因抹系中兩種B型ARR(ARR1和ARR2)的轉(zhuǎn)錄物水平以確保對A型ARR的觀察結(jié)果是特異性的響應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn)條件下ARR1和ARR2不被BA處理顯著影響(表4),這與此前的結(jié)果一致(Imamura等人Prac.A^/.爿cadSc/."&495:2691-2696，1998;Kiba等人尸/朋？Ce〃尸/^Wo/.40:767-771，1999;Hutchison等人P/a"Ce〃18:3073-3087，2006)。為了排除AHK-類型細(xì)胞激動(dòng)素受體即AHK2、AHK3和CRE1/AHK4的參與，確定它們在不同轉(zhuǎn)基因林系中的轉(zhuǎn)錄物水平。與野生型的相比，在HOGl過表達(dá)和反義抑制抹系中未觀察到顯著差異(數(shù)據(jù)未顯示)，顯示HOG1獨(dú)立于這三種已知細(xì)胞激動(dòng)素受體起作用。(g)TAP-HOGl與AHP1相互作用為了確定HOGl蛋白形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體和進(jìn)一步支持其作為細(xì)胞激動(dòng)素受體的作用，分離和鑒定與HOG1相互作用的蛋白。產(chǎn)生表達(dá)帶有N-末端TAP標(biāo)簽的H0G1(TAP-HOGl)的六林獨(dú)立轉(zhuǎn)基因擬南芥抹系。這些植物與H0G1過表達(dá)抹系具有相同表型，顯示融合蛋白在植物中是功能性的。下拉測定以從3周大的TAP-HOG1轉(zhuǎn)基因植物提取的總蛋白進(jìn)行。當(dāng)使用PAP抗體進(jìn)行免疫印跡分析以檢測這些植物中TAP-HOG1融合蛋白的存在時(shí)，檢測到71kDa的蛋白條帶(圖4C)。預(yù)測H0G1的分子量為56kDa且標(biāo)簽為15kDa,從而造成71kDa的融合蛋白條帶。具有TAP-HOG1的蛋白復(fù)合體從總蛋白提取物洗脫，使用標(biāo)簽和IgG珠，使用Forler等人(同上)的方法。對蛋白復(fù)合體進(jìn)行SDS-PAGE,且主要蛋白條帶的N-末端測序揭示其為AHP1。隨后，從擬南芥由PCR克隆AHP1的cDNA并將重組AHP1表達(dá)于大腸桿菌(圖4D)。使用ITC顯示，AHP1與純化的TAP-HOG1蛋白直接相互作用(圖4E)。ITC中，這兩種純化蛋白形成的復(fù)合體的解離常數(shù)KD值為23.8nM。擬南芥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白(AHP1、AHP2、AHP3、AHP4和AHP5)是細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵中間物，因?yàn)樗鼈冏饔脼槟な荏w和核響應(yīng)調(diào)節(jié)子之間的細(xì)胞質(zhì)核穿梭體。證實(shí)HOG1與細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵中間物AHP1相互作用，進(jìn)一步確認(rèn)了HOG1蛋白的受體功能。本數(shù)據(jù)顯示，HOG1是此前描述的AHK-家族受體之外的新細(xì)胞激動(dòng)素受體。從芥藍(lán)、菊花、莧屬和水稻分離多種同系物。這顯示，HOGl存在于不同植物物種并對調(diào)節(jié)植物發(fā)育重要。上述的細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是類似于細(xì)菌兩成分響應(yīng)系統(tǒng)的磷酸中繼途徑。這與細(xì)胞激動(dòng)素在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起多種作用和多于一種類型的細(xì)胞激動(dòng)素受體的存在可促進(jìn)這種多效性功能的事實(shí)一致。這種現(xiàn)象已在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中觀察到，其中牽涉多于一種受體(如ETR1、ERS2、ETR2和EIN4)。而且，HOG1在所有植物部分組成型表達(dá)暗示該蛋白在植物發(fā)育中的關(guān)鍵作用?；诮M氨酸激酶細(xì)胞激動(dòng)素受體的三突變體(crel-12ahk3-3ahk2-2(Col))產(chǎn)生植物(雖然具有嚴(yán)重矮小和不育表型)的觀察結(jié)果，對于細(xì)胞激動(dòng)素可存在其它受體的可能性是突出的。與本研究的反義抑制HOG1基因觀察到的相比，這三種AHK-類型細(xì)胞激動(dòng)素受體的功能喪失突變體導(dǎo)致相反的表型。本研究中觀察到的相反表型表現(xiàn)為是莖干中內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素水平改變的結(jié)果。HOGl蛋白對細(xì)胞激動(dòng)素分子的高親合力結(jié)合由低KD值表示。當(dāng)本研究中使用兩拷貝的強(qiáng)啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)顯著地過表達(dá)基因時(shí)，所得到的蛋白增加以及異位表達(dá)導(dǎo)致可得的游離細(xì)胞激動(dòng)素顯著減少(圖3G)。這可能是由于該蛋白作用為細(xì)胞激動(dòng)素跨質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)恼系K。這是重要的，因?yàn)榍o尖(shootapex)必須接受來自根尖(為細(xì)胞激動(dòng)素生物合成的主要位置)的細(xì)胞激動(dòng)素。這導(dǎo)致明顯的功能喪失表型，即，植物高度減少和缺乏營養(yǎng)生物量。相反，在反義植物中，在莖干頂端分生組織可得的游離細(xì)胞激動(dòng)素分子顯著增加，導(dǎo)致大量發(fā)枝和生物量增加顯著的相反表型(圖3G)。在植物中應(yīng)用純化的TAP標(biāo)簽蛋白允許表征多種蛋白復(fù)合體，包括煙草中的抗性蛋白Cf9和擬南齊中的CTR1蛋白。本研究鑒定擬南芥組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移(AHP1)為與HOG1相互作用的蛋白，顯示AHP1是HOGl的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中間物。表達(dá)重組AHP1并顯示與純化的TAP-HOG1蛋白直接相互作用。ITC中，兩種純化蛋白形成的復(fù)合體的解離常數(shù)值為23.8nM，這提供對HOGl的受體功能的重要支持。(h)HOG1是細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的新受體為了更好地理解新細(xì)胞激動(dòng)素受體HOGl在介導(dǎo)細(xì)胞激動(dòng)素響應(yīng)中的作用，分析細(xì)胞激動(dòng)素誘導(dǎo)的初級(jí)響應(yīng)基因，即，A型ARR基因(即ARR4、ARR5和ARR6)。ARR表達(dá)水平的改變見于圖4B和表4，其在HOG1反義和過表達(dá)抹系中測量的細(xì)胞激動(dòng)素含量之外暗示對內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素的響應(yīng)被HOG1影響。這證實(shí)HOG1蛋白為新受體且ARR與AHP1—起為HOG1細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)元件。因此，本數(shù)據(jù)提供除了此前描述的兩成分系統(tǒng)以外，擬南芥中經(jīng)由HOG1的細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(圖5)。重要的是注意以前報(bào)道的組氨酸激酶受體的遺傳修飾未顯示影響營養(yǎng)和生殖生長，這不同于反義抑制HOGl。本數(shù)據(jù)顯示該受體將作為生物技術(shù)改良作物植物的關(guān)鍵靶以增加生物量和谷粒的產(chǎn)量。實(shí)施例2通過反義抑制推定的細(xì)胞激動(dòng)素受體的基因增加水稻中生物量和糧食產(chǎn)量材料和方法植物材料對于水稻粳稻，使用栽培品種日本晴。這是源自日本的商業(yè)栽培品種。還可以其它水稻栽培品種(秈稻0&ca)亞種)進(jìn)行類似研究。從LEHLESEEDS(1102SouthIndustrialBlvd.,SuiteD，RoundRockTX78681USA)獲得野生型擬南芥種子。細(xì)菌菌林除非另外指出，用于本研究中DNA克隆的細(xì)菌菌抹是大腸桿菌DH5a，其在37。C生長于液體LB培養(yǎng)基(Sambrook等人，1989)。使用的根癌農(nóng)桿菌菌株是GV3101(Koncz和Schell，1986)。以簡并引物進(jìn)行PCR以克隆基因提取RNA后，使用AMV(禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒)反轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT,Promega)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)。cDNA產(chǎn)物用于PCR,使用簡并引物PETl:5'-A(AG)ATGCC(CT)GG(ACT)CT(ACT)ATG(GT)C(ACT)T-3'(SEQIDNO:24)和PET2:5'畫TC(AG)AACTTGCTCTTGGT(AG)AC(AG)-3'(SEQIDNO:25)以從擬南芥和水稻分離部分片段?？寺『蜏y序PCR片段?？焖贁U(kuò)增5'-和3，-cDNA末端SMARTTMRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒(ClontechLaboratories)用于鑒定cDNA的5'-和3'-cDNA(5'/3'-RACE)末端序列。對這些PCR產(chǎn)物測序。將部分序列和RACEPCR產(chǎn)物一起比對以獲得擬南芥(HOGl)和水稻(OsCBP)的全長cDNA序列。用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化的基因構(gòu)建體是反義基因抑制(35S:asHOGl)構(gòu)建體。使用的啟動(dòng)子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。水稻的^Mf菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化使用Hiei等人CP/a"〃owma/UK第6巻，第271-282頁，1994)的方法。1.水稻愈傷組織的誘導(dǎo)將成熟水稻種子以70%乙醇表面滅菌1.5min。在100ml無菌燒瓶中加入漂白劑(20%)和一滴Tween-20,在搖床上以120rpm搖動(dòng)45min。隨后把處理的種子用無菌蒸餾水徹底漂洗。將無菌的種子置于無菌9cm深的塑料皮氏培養(yǎng)皿中30ml含有2.0mg/12,4-D的固化NBO培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)的表面。將培養(yǎng)皿包上帶子并置于組織培養(yǎng)室的盒子里并允許水稻種子在25。C在黑暗中萌發(fā)。10天后，切下衍生自盾片的愈傷組織并繼代培養(yǎng)到新鮮愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每4周進(jìn)行繼代培養(yǎng)，直到獲得旺盛生長、淺黃色、胚發(fā)生的愈傷組織。2.共培養(yǎng)農(nóng)桿菌和水稻愈傷組織將含有反義構(gòu)建體的雙元質(zhì)粒(基于pCAMBIA1301,R.Jefferson,CAMBIA,Australia)引入根癌農(nóng)桿菌菌抹AGL1。根癌農(nóng)桿菌在28'C在含有10mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素的固化YEP培養(yǎng)基上儲(chǔ)存生長48-73小時(shí)。在28。C將1ml細(xì)菌培養(yǎng)物加入250ml燒瓶中100ml含有相同選擇性抗生素的AB培養(yǎng)基。使細(xì)菌生長達(dá)到OD595為0.8-1.0的密度。通過在室溫在4,000rpm離心10min來收集細(xì)菌。隨后除去上清液和以相同體積AMM培養(yǎng)基重懸小團(tuán)而洗滌一次細(xì)菌，并在室溫以4,000pm再次離心10分鐘。丟棄上清液。以AMM培養(yǎng)基稀釋細(xì)菌到OD595為0.4的密度(約每ml109個(gè)細(xì)胞)。約20-25ml稀釋的細(xì)菌用于在無菌9cm塑料皮氏培養(yǎng)皿中的農(nóng)桿菌接種。選擇大小為直徑約5mm的旺盛生長、淺黃色、胚發(fā)生的愈傷組織并置入細(xì)菌懸液和浸泡30分鐘，在無菌層流罩中偶爾搖動(dòng)。通過將愈傷組織置于干燥無菌綿紙(tissuepaper)墊上除去愈傷組織的過量細(xì)菌懸液。將接種的愈傷組織轉(zhuǎn)移到(不漂洗)無菌9cm塑料皮氏培養(yǎng)皿中的2N6-AS培養(yǎng)基，并在25。C黑暗中培養(yǎng)2-3天。3.選擇和再生轉(zhuǎn)化體收集100ml無菌燒瓶中共培養(yǎng)的愈傷組織并使用50-75ml無菌蒸餾水伴隨輕搖洗滌至少10次。愈傷組織在無菌綿紙墊上干燥以除去多余的表面的水。將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到含有500mg/1頭孢噻肟和200mg/1氨芐青霉素的100ml無菌蒸餾水，并在25。C以120rpm搖動(dòng)兩小時(shí)。除去水并將愈傷組織塊在無菌紙墊上印干。將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到無菌9cm皮氏培養(yǎng)皿中的含有2mg/L2.4-D、250mg/1頭孢瘞肝、200mg/1氨千青霉素和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基(選擇培養(yǎng)基)用于選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在25。C黑暗中培養(yǎng)密封的培養(yǎng)皿。在4周選擇后，從共培養(yǎng)的愈傷組織提取推定的潮霉素抗性微愈傷組織，轉(zhuǎn)移到相同的新鮮選擇培養(yǎng)基以證實(shí)抗性和組織增殖，并培養(yǎng)3周。將旺盛生長的潮霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有1.0mg/16-BA、2.0mg/1NAA、5.0mg/1ABA和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基(預(yù)再生培養(yǎng)基)并在25。C黑暗中培養(yǎng)3周。將白色密實(shí)的潮霉素抗性胚發(fā)生的愈傷組織從預(yù)再生培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有2.0mg/16-BA、1.0mg/1IAA、1.0mg/1NAA、1.0mg/1KT和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基(再生培養(yǎng)基)，并在25。C以14小時(shí)光照(約2000lux)和8小時(shí)黑暗培養(yǎng)。三周后將再生的潮霉素抗性小植林轉(zhuǎn)移到Phytacon瓶中100ml含有50mg/l潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基(小植林生長培養(yǎng)基)用于莖干誘導(dǎo)和根伸長。繼續(xù)所述培養(yǎng)條件直到小植抹達(dá)到容器頂端。從培養(yǎng)瓶移出發(fā)育良好的潮霉素抗性小植抹并立即置于塑料盤的自來水中以除去附帶的培養(yǎng)基。將小植抹轉(zhuǎn)移到含有1/2MS培養(yǎng)基(溶液)的54孔(直徑約5cm)的塑料盤。將小植抹的每個(gè)給定簇(推定的轉(zhuǎn)基因林系)置入單獨(dú)孔。在生長室中以90%濕度在20。C以14小時(shí)光照(約400lux)和8小時(shí)黑暗訓(xùn)練小植抹7-10天。將植物移植到小盆中的土壤里并在溫室培養(yǎng)(同非轉(zhuǎn)基因植物)，持續(xù)三代以獲得純合的轉(zhuǎn)基因植物。補(bǔ)充方法植物材料和生長M對于擬南芥，使用哥倫比亞生態(tài)型并將植物在22。C生長室中以16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗培養(yǎng)。粳稻栽培品種日本晴用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥全長HOG1cDNA由5'和3'RACE策略擴(kuò)增。pGreen0229雙元載體(Yu等人，同上)用于所有轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體。對于反義抑制，使用跨兩個(gè)SAHH標(biāo)志的H0G1的850bp片,爻(SEQIDNO:15)。HOGlcDNA的完整開放讀碼框用于過表達(dá)構(gòu)建體(SEQIDNO:2)。TAP-標(biāo)簽化的HOGl帶有ProtA和4丐調(diào)蛋白結(jié)合肽標(biāo)簽，兩個(gè)標(biāo)簽之間有TEV裂解位點(diǎn)。通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花方法(Clough,S.和Bent,A.P/""ZJowr"a/16(6):735-743(1"8))將構(gòu)建體引入擬南芥。定量實(shí)時(shí)PCR分析以TRIzol方法(Invitrogen)從擬南齊幼苗或水稻葉提取總RNA。以無RNA酶的DNA酶I處理的總RNA(0.5嗎)用于每個(gè)定量PCR反應(yīng)，根據(jù)制造商的說明書以一步RT試劑盒(Qiagen)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。使用SYBRgreen(AppliedBiosystemsInc.)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR。將Ct值對微管蛋白2Ct值標(biāo)準(zhǔn)化以才艮據(jù)制造商的方案計(jì)算變化倍數(shù)。等溫滴定量熱法(ITC)以ITC(MCSITC，Microcal,Northampton,USA)4企查HOGl與細(xì)胞激動(dòng)素的相互作用的細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合親合力和熱力學(xué)分析。使用公開的方案(Forler等人，同上)從具有35S::TAP-HOG1構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物純化TAP-HOGl融合蛋白。0.01nM千基腺噤呤(一種天然產(chǎn)生的細(xì)胞激動(dòng)素)和0.1純化的TAP-HOG1蛋白用于25次注射的每次ITC測定(在37。C每次注射2pl，以3s間隔)。由MICROCALORIGIN2.9版本分析數(shù)據(jù)，使用用于一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的最佳擬合的非線性最小平方方法。從擬合的曲線計(jì)算結(jié)合化學(xué)計(jì)量(n)和締合常數(shù)(KA)。隨后，計(jì)算KD為1/KA。細(xì)胞激動(dòng)素^J:以100%曱醇從全植林提取細(xì)胞激動(dòng)素并使用異戊烯基腺苷檢測試劑盒(Sigma)定量，如Yang等人(同上)所述的。水稻愈傷組織誘導(dǎo)誘導(dǎo)表面滅菌和剝殼的水稻種子產(chǎn)生愈傷組織，通過將其置于補(bǔ)充2mg/L2，4-D的NBO培養(yǎng)基(愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)和隨后在25°C黑暗中培養(yǎng)30天。30天后，進(jìn)一步繼代培養(yǎng)出現(xiàn)的愈傷組織，直到獲得脆的胚愈傷組織。共培養(yǎng)農(nóng)桿菌與g愈傷組織使用GIBCO-BRLCell-Porator通過電穿孔，將含有全長HOGl(分別為根癌農(nóng)桿菌AGL1。通過限制性酶切消化證實(shí)轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。在含有10mg/1羧千青霉素、50mg/1卡那霉素和50mg/1潮霉素的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有質(zhì)粒構(gòu)建體的農(nóng)桿菌并在25"C培養(yǎng)48h。將lml這種小規(guī)模培養(yǎng)物接種到100ml含有相同的選擇抗生素的AB液體培養(yǎng)基，并在25。C培養(yǎng)直到培養(yǎng)物達(dá)到OD595為0.8至0.9。在4000rpm離心培養(yǎng)物10min。將細(xì)菌小團(tuán)以AMM培養(yǎng)基懸浮到OD595為0.4的密度。將20-25ml該細(xì)菌懸液倒入9cm深皮氏培養(yǎng)皿，并將旺盛生長的淺黃色脆的胚發(fā)生的愈傷組織(大小約5mm)浸泡30min,偶爾搖動(dòng)。通過將愈傷組織置于無菌干燥綿紙墊上而從愈傷組織除去多余細(xì)菌懸液。隨后，將接種的愈傷組織在無菌9cm深皮氏培養(yǎng)皿的2N6-AS培養(yǎng)基中培養(yǎng)并在25。C黑暗中培養(yǎng)2-3天。選#^再生水稻轉(zhuǎn)化體使用50-75ml無菌水伴隨輕搖洗滌共培養(yǎng)的愈傷組織至少10次，并通過放在無菌綿紙上而干燥。將愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到無菌皮氏培養(yǎng)皿中的含有2mg/12，4-D、250mg/1頭孢噻肟、和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基用于選擇。在4周選擇后，將潮霉素抗性的微愈傷組織選擇為推定的轉(zhuǎn)基因愈傷組織，從共培養(yǎng)的愈傷組織切下，轉(zhuǎn)移到新鮮的選4奪培養(yǎng)基以進(jìn)一步增殖，并培養(yǎng)3周。將旺盛生長的潮霉素抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有1mg/lBA、2mg/1NAA、5mg/1ABA和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基(預(yù)再生培養(yǎng)基)并在25°C黑暗中培養(yǎng)3周。將白色密實(shí)的潮霉素抗性愈傷組織從預(yù)再生培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有2mg/lBA、lmg/lIAA、lmg/lNAA、1mg/1激動(dòng)素和50mg/1潮霉素的NBO培養(yǎng)基(再生培養(yǎng)基)，并在25。C以14小時(shí)光照(25200880008901.Hmol/m"s)的光周期培養(yǎng)。3周后，將包括附帶的愈傷組織的再生的潮霉素抗性小植抹轉(zhuǎn)移到Phytacon瓶中100ml含有50mg/l潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基(小植抹培養(yǎng)基)用于莖干生長和根伸長。培養(yǎng)小植抹直到它們達(dá)到容器頂端。將小植抹的每個(gè)簇轉(zhuǎn)移到含有1/2MS溶液的54孔塑料盤中的單個(gè)孑L。在生長室中以90%相對濕度在20。C以14h光照(25!imol/m"s)的光周期馴化小植林7-10天。隨后將植物轉(zhuǎn)移到小盆中的土壤里。從愈傷組織獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植物稱為TO代，從單獨(dú)植物獲得的種子在潮霉素存在下萌發(fā)且存活的植物稱為Tl代。來自Tl植物的種子再次經(jīng)受潮霉素選擇并在本研究中稱為T2代。結(jié)果和討論定量實(shí)時(shí)PCR分析指出，H0G1在擬南芥中組成型地表達(dá)，在葉和花序莖中具有相對較高水平，如在實(shí)施例1(c)中所述的，暗示HOGl可在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中起基本作用。純化的H0G1顯示對細(xì)胞激動(dòng)素分子(玉米素、千基腺嘌呤和異戊烯基腺。票呤)結(jié)合的高親合力，如在實(shí)施例1(a)中所述的。對千基腺噤呤的解離常數(shù)(KD)為20.6nM(圖11),暗示與H0G1蛋白結(jié)合的高親合力。當(dāng)與野生型相比時(shí)，各種H0G1擬南芥OE抹系顯示H0G1轉(zhuǎn)錄物水平的5至8倍增加(圖8e),而擬南芥AS抹系顯示6至10倍抑制(圖8e)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)顯著地影響植物發(fā)育并在許多獨(dú)立轉(zhuǎn)基因抹系中展現(xiàn)一致的表型。記錄28林獨(dú)立OE轉(zhuǎn)基因林系和21抹AS抹系的表型，說明改變是由引入的基因產(chǎn)物導(dǎo)致的。與野生型(WT)相比，OE抹系中種子萌發(fā)發(fā)生早4至5天，而在AS抹系中晚大約5天(表5)。然而，OE抹系萌發(fā)后不久即觀察到顯著的生長延遲，而AS抹系盡管種子萌發(fā)延遲，卻未顯示莖干生長延遲。在OE抹系的營養(yǎng)生長期間新蓮座葉的形成和展開受到延遲和限制。在OE植物觀察到提早開始開花和在4蓮座葉階段抽薹(圖8a和表5)，與之相比WT和AS^^朱系在抽薹時(shí)分別具有至少8和14葉(圖8b和表5)。表5.種子萌發(fā)、開花開始和衰老對每次觀察使用五抹獨(dú)立抹系。對每種抹系，數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立重復(fù)的平均值。反義抹系顯示晚萌發(fā)、晚抽薹和延遲的衰老。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>開始開花后，OE抹系未顯示葉生物量的任何進(jìn)一步增加，且甚至在生長30天后當(dāng)這些抹系開始衰老時(shí)還未形成葉腋花序枝(圖8b)。然而，AS株系顯示花序莖的大量發(fā)枝(圖8b)和延遲的衰老。AS林系具有最高葉面積(每葉2.9±0.1cm2),而OE才朱系(0.4±0.1cm2)和WT(1.0士0.1cm2)中的顯著減少(圖8c和表7)。與WT相比，在OE抹系中總植物生物量、長角果大小以及作為結(jié)果的每長角果的種子數(shù)目和重量(圖8c、8d、8f和表6)顯著減少，而AS抹系中顯著提高(圖8c、8d、8f)。OE林系比WT早約IO天開始衰老，而AS林系比WT晚兩周開始衰老(圖8a、8b和表6)。表6.葉面積、每長角果的種子重量和種子數(shù)目數(shù)據(jù)代表三次獨(dú)立重復(fù)的平均值士SD。每種情形使用五抹獨(dú)立株系。與野生型相比，反義株系顯示葉生物量的三倍增加和種子產(chǎn)量的兩倍增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>由于已確立植物中發(fā)枝和衰老與細(xì)胞激動(dòng)素水平之間的關(guān)聯(lián)，對WT、OE和AS株系各三林獨(dú)立抹系確定內(nèi)源細(xì)胞激動(dòng)素含量。異戊烯基腺嘌呤是主要細(xì)胞激動(dòng)素，且OE抹中與WT相比其濃度減少約60%(圖8f)。這可能是圖8b和8a中觀察到OE抹系中植物高度和生物量減少的主要原因。相反，AS林系中與WT相比異戊烯基腺嘌呤濃度增加超過60。/0,或比OE^^朱系增加約四倍(圖8f)。這導(dǎo)致相反表型，即，大量發(fā)枝和生物量顯著增加。本擬南芥研究的結(jié)果暗示，在作物物種中遺傳操縱HOGl或其直系同源物可提供3是高產(chǎn)量的手段。在多種其它物種中進(jìn)行HOGl直系同源物的篩選。從水稻、齊藍(lán)、菊花和莧屬成功地鑒定和獲得cDNA。通過反轉(zhuǎn)錄-PCR從水稻(粳稻栽培品種日本晴)分離OsCBP(水稻細(xì)胞激動(dòng)素結(jié)合蛋白；Osllg0455500)的全長cDNA。得到的OsCBP氨基酸序列(SEQIDNO:5)與HOGl(SEQIDNO:1)顯示卯％序列同一性，且水稻中該基因表現(xiàn)為只有一個(gè)拷貝(圖10)。由于H0G1(SEQIDNO:l)和OsCBP(SEQIDNO:5)之間的高序列相似性，使用HOG1cDNA產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因水稻抹系以檢測產(chǎn)量提高性狀是否可在水稻中實(shí)現(xiàn)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，獲得多種獨(dú)立水稻抹系并通過定量實(shí)時(shí)PCR和Tl代基因組Southern印跡證實(shí)為轉(zhuǎn)基因的(圖9、12d和12e)。T2代OE株系和AS林系的表型一致地隨轉(zhuǎn)基因分離(分離株系不能幸免于潮霉素選擇)。選擇培養(yǎng)基中T3種子萌發(fā)顯示多種所選抹系對轉(zhuǎn)基因是純合的(數(shù)據(jù)未顯示)。在OE和AS抹系和雜交母體(WT)抹系中進(jìn)行OsCBP的表達(dá)分析。當(dāng)與WT中內(nèi)源OsCBP表達(dá)水平相比時(shí)，過表達(dá)林系(圖9f)顯示HOG1表達(dá)水平增加幾乎5倍。此外，一些OE林系中OsCBP表達(dá)減少6倍(圖9f)，證實(shí)這些是共抑制抹系。基因共抑制的現(xiàn)象是植物中熟知的。因此，觀察到的表型是由于引入的基因的功能而不是轉(zhuǎn)化的任何非特異性效應(yīng)。轉(zhuǎn)基因植物的表型與擬南芥的結(jié)果一致。OE抹系中，與WT相比時(shí)每林植物的分蘗數(shù)沒有顯著改變(表8),但許多OE林系在高度和總生物量增加上顯著減少(圖9a、9b、9c和表8)。當(dāng)與WT相比時(shí)，水稻OE抹系顯示早開花7-10天。相反，與雜交母體抹系相比，AS林系顯示內(nèi)源OsCBP表達(dá)水平的高達(dá)6倍的減少并展現(xiàn)每抹植物分蘗數(shù)的顯著增加(圖9b、9c和12b)。WT具有7至9個(gè)分蘗，而AS株系顯示每林植物18至28個(gè)分蘗(表8)。共抑制林系的表型與AS抹系的相同(圖9c、9e、12a、12b和表8)。此外，共抑制和AS林系顯示從主分蘗的地上節(jié)發(fā)枝(圖12d),導(dǎo)致每抹植物圓錐花序數(shù)目顯著總增加(表8)。當(dāng)與WT相比時(shí)，AS和共抑制林系中平均種子數(shù)和植物生物量增加2至超過3倍(表8)。與WT植物相比，AS和共抑制抹系的表型沒有其它大的改變。在溫室生長條件下，每抹植物糧食產(chǎn)量的最大增加為比WT高出超過兩倍(從1.5至2.7倍)。通常，水稻的溫室生長條件的產(chǎn)量數(shù)據(jù)低于理想田間條件的。因此，清楚的是如果使用本文所述策略，可導(dǎo)致田間條件下產(chǎn)量顯著增加。表7.對生物量和種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)的參數(shù)的皮爾遜氏相關(guān)系數(shù)(r):檢驗(yàn)以下之間的相關(guān)系數(shù)葉面積(cm^x每長角果的種子重量(mg)(A);葉面積(cm2)x每長角果的種子數(shù)目(B);和每長角果的種子重量(mg)x每長角果的種子數(shù)目(C)。相關(guān)性分析后，進(jìn)行學(xué)生t-檢驗(yàn)。t-檢驗(yàn)值在括號(hào)中給出。'r，值顯示所有檢驗(yàn)中的正相關(guān)性?；诖耍A(yù)測HOGl的反義抑制導(dǎo)致對葉生物量和種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)的關(guān)鍵參數(shù)增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表8.定量含有以有義(過表達(dá)和共抑制)或反義方向(由水稻泛素啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))導(dǎo)致操縱內(nèi)源OsCBP基因的表達(dá)的全長擬南芥HOGlcDNA的T2代轉(zhuǎn)基因水稻植物中產(chǎn)量參數(shù)?；诿苛种参锓痔Y數(shù)將每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的植物分組為'高，、'中，和'低，。每抹植物的分蘗總數(shù)、圓錐花序數(shù)和種子數(shù)表示為平均值±SD。每抹植物中僅計(jì)數(shù)完全飽滿的谷粒。葉面積值表示單個(gè)葉的面積。測量每抹植物第二分蘗的完全張開的第二葉作為指示參數(shù)。對全林連根拔起的植物確定鮮重并僅測量不同株系的選擇的植物。<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>用途的性狀的植物。尤其是，生物量產(chǎn)生是不斷增長的工業(yè)，由于對可持續(xù)的燃料來源的興趣在不斷增長。不受理論束縛，推測由本文公開的方法產(chǎn)生的豐富生物量可轉(zhuǎn)化為生物燃料諸如木煤氣(woodgas)、生物曱醇或生物乙醇燃料。例如，通過已知的水解、發(fā)酵和蒸餾方法可從纖維素材料產(chǎn)生醇。因此，使用生物量燃料被視為可恢復(fù)的能源，被一些人認(rèn)為是減少溫室氣體排放和提供石油燃料的替代品的手段。明顯的是，在閱讀前述公開后，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，對本發(fā)明的各種其它修飾和改編將是明顯的，并不偏離本發(fā)明的主旨和范圍，并且預(yù)期所有這種修飾和改編在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀表達(dá)的方法，所述方法包括調(diào)節(jié)所述植物對至少一種多肽的表達(dá)的步驟，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485，從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了所述植物中至少一種性狀的表達(dá)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中調(diào)節(jié)所述植物對至少一種多肽的表達(dá)的所述步驟包括將調(diào)節(jié)所述多肽表達(dá)的多核香酸引入所述植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)的所述步驟包括減少所迷多肽的表達(dá)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中減少植物對所述多肽的表達(dá)的所述步驟包括將減少所述多肽表達(dá)的多核苷酸引入所述植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多核苷酸選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苦酸；iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；iv)包括含有至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸，所述至少9個(gè)相鄰核酸殘基選自與由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的多核香酸互補(bǔ)的核酸序列；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少80%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少85%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。9.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中調(diào)節(jié)所述多肽表達(dá)的所述步驟包括增加所述多肽的表達(dá)。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中增加植物對所述多肽的表達(dá)的所述步驟包括將增加所述多肽表達(dá)的多核苷酸引入所述植物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述多核苷酸選自以下組成的組i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列的多核苷酸，ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191,從氨基酸231至氨基酸405,和從氨基酸406至氨基酸438,或在其同系物的相當(dāng)位置；和iii)編碼包括與才艮據(jù)SEQIDNO:1的氨基S臾序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苦酸。13.根據(jù)權(quán)利要求1至12任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物中至少一種性狀選自植抹高度、植物生物量、頂芽發(fā)育、發(fā)枝、能育性、開花、葉面積、衰老、種子萌發(fā)、種子產(chǎn)量、種子重量、莖發(fā)育、糧食產(chǎn)量、分蘗數(shù)、花分生組織發(fā)育和根發(fā)育的任一種組成的組。14.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)至少一種性狀選自相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，所述植物中增加的發(fā)枝、提高的種子產(chǎn)量、提高的植物生物量、提高的糧食產(chǎn)量、增加的分蘗數(shù)、增加的葉面積、延遲的種子萌發(fā)、減少的頂端優(yōu)勢、延遲的開花的任一項(xiàng)或其組合組成的組。15.根據(jù)權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)至少一種性狀選自相對于其中所述多肽的表達(dá)未被調(diào)節(jié)的相同類型植物，所述植物中提早開花、矮小、減少的葉數(shù)目、早衰、提早種子萌發(fā)、延遲和減少的蓮座葉形成、增加的幼苗根生長的任一項(xiàng)或其組合組成的組。16.—種分離的多核苷酸，其選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸；和iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核香酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；iv)包括包含選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸；其中所述多核苷酸能夠降低調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或vi)與i)至v)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核香酸，或vii)在嚴(yán)^f各性條件下與i)至v)的任一種多核苷酸雜交的多核苦酸。17.—種分離的多核苷酸，其選自以下組成的組i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列的多核苦酸；ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苦酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7,從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191,從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)編碼包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苦酸；和iv)由編碼SEQIDNO:1的多肽的核S臾序列組成的多核香酸；其中所述多核苷酸能夠增加調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或v)與i)至iv)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核苦酸；或vi)在嚴(yán)格性條件下與i)至iv)的任一種多核苦酸雜交的多核苦酸。18.—種載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求16或17任一項(xiàng)所述的多核香酸。19.一種宿主細(xì)胞，其以根據(jù)權(quán)利要求18所述的載體轉(zhuǎn)化。20.—種植物，其包括根據(jù)權(quán)利要求19所述的宿主細(xì)胞。21.—種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括如下步驟(a)提供調(diào)節(jié)多肽的表達(dá)的多核苷酸，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7,從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58,從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191,從氨基酸231至氨基酸405,和從氨基酸406至氨基酸438,或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽；(b)以步驟(a)中的所述多核苦酸轉(zhuǎn)化植物、植物部分或植物細(xì)胞，并(c)栽培所轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(a)中的所述多核苷酸包括選自以下組成的組的分離的多核苷酸i)包括根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的反義多核苷酸；ii)包括選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸；和iii)包括來自與編碼一種多肽的核酸序列互補(bǔ)的多核苷酸的至少15個(gè)相鄰核酸殘基的反義多核苷酸，所述多肽包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列；iv)包括包含選自根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列的至少9個(gè)相鄰核酸殘基的核酸序列的RNA干擾的多核苷酸；和v)由根據(jù)SEQIDNO:15的核酸序列組成的反義多核苷酸；其中所述多核苷酸能夠調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或vi)與i)至v)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，或vii)在嚴(yán)格性條件下與i)至v)的任一種多核苦酸雜交的多核苷酸。23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中步驟(a)中的所述多核苷酸包括選自以下組成的組的分離的多核芬酸i)包括編碼SEQIDNO:1的多肽的核S臾序列的多核苷酸，ii)編碼包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7,從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58,從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405,和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)編碼包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽的多核苷酸；和iv)由編碼SEQIDNO:1的多肽的核酸序列組成的多核普酸，其中所述多核苷酸能夠增加調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀的多肽的表達(dá)，或v)與i)至iv)的任一種多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸，或vi)在嚴(yán)格性條件下與i)至iv)的任一種多核芬酸雜交的多核苷酸。24.根據(jù)權(quán)利要求21-23任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟(c)中的所述栽培是通過在允許所述轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞生長的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的植物、植物部分或植物細(xì)胞。25.根據(jù)權(quán)利要求21-24任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物部分選自根、莖、葉、芽、花、莖干、種子和枝組成的組。26.根據(jù)權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物是單子葉植物或雙子葉才直物。27.根據(jù)權(quán)利要求20或26所述的植物，其中所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、7jc稻、高粱、黍、莧菜、蘆葦、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草組成的組。28.—種轉(zhuǎn)基因植物，其由權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生，其中所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、水稻、高粱、黍、莧菜、蘆蘋、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草組成的組。29.—種轉(zhuǎn)基因植物，其由權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生，其中所述植物能夠產(chǎn)生能育的植物。30.根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)所述的植物的部分或種子。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的部分，其中所述部分選自根、莖、葉、芽、花、莖千、種子、塊莖、果實(shí)和枝組成的組。32.—種植物或其繁殖材料，其從根據(jù)權(quán)利要求26-29任一項(xiàng)所述的植物或從根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的部分或種子再生。33.以根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化的植物用于植物生物量生產(chǎn)的應(yīng)用。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的應(yīng)用，其中所述植物選自燕麥、大麥、小麥、黑麥、玉米、水稻、高粱、黍、莧菜、蘆葦、甜茅、甘蔗、竹子、牧草、拂子茅和草皮草組成的組。35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的應(yīng)用，其中所述植物生物量生產(chǎn)是為了生產(chǎn)生物燃料。36.—種分離的多肽，其選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO:1的氨基酸1至氨基酸7,從氨基酸9至氨基酸230,從氨基酸1至氨基酸58,從氨基酸77至氨基酸485,從氨基酸59至氨基酸76,從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438,或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO:1的氨基S臾序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了所述植物中至少一種性狀的表達(dá)。全文摘要一種調(diào)節(jié)植物中至少一種性狀表達(dá)的方法，該方法包括調(diào)節(jié)植物對至少一種多肽的表達(dá)的步驟，其中所述多肽選自以下組成的組i)包括根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列的多肽；ii)包括選自以下任何一種或多種氨基酸序列組成的組的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽從SEQIDNO1的氨基酸1至氨基酸7，從氨基酸9至氨基酸230，從氨基酸1至氨基酸58，從氨基酸77至氨基酸485，從氨基酸59至氨基酸76，從氨基酸150至氨基酸191，從氨基酸231至氨基酸405，和從氨基酸406至氨基酸438，或在其同系物的相當(dāng)位置；iii)包括與根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的氨基酸序列并能夠調(diào)節(jié)植物中細(xì)胞激動(dòng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多肽；和iv)由根據(jù)SEQIDNO1的氨基酸序列組成的多肽，其中調(diào)節(jié)所述多肽的表達(dá)調(diào)節(jié)了植物中至少一種性狀的表達(dá)。文檔編號(hào)C12N15/29GK101686641SQ200880008901公開日2010年3月31日申請日期2008年2月5日優(yōu)先權(quán)日2007年2月5日發(fā)明者普拉卡什·帕拉薩德卡·庫瑪爾,曼達(dá)爾·拉哈基薩恩·高德格申請人:新加坡國立大學(xué)