專利名稱：腫瘤血管靶向劑重組VEGF₁₂₁/RIP30融合毒素的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的腫瘤血管靶向劑，特別是涉及一種具有選擇性殺傷 腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL融合毒素及其編碼基因與 其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。自1996年以來，全球腫瘤新增病例 每年都在1000萬以上，死亡700多萬人；1999年底，全球腫瘤患者已逾4000萬人。 據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，在過去20年中，我國(guó)腫瘤發(fā)病率呈總體上升趨勢(shì)，近年來，每年新 增腫瘤病人200萬，死亡130多萬，目前，全國(guó)腫瘤患者總數(shù)估計(jì)約為450萬人。
特異、高效、低毒是抗癌藥研發(fā)的重要原則。傳統(tǒng)抗癌藥物的腫瘤特異性差，在 殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也對(duì)骨髓、消化道、肝、腎等正常組織和細(xì)胞帶來損害，因此治 療效果欠佳、毒副作用大。腫瘤靶向藥物則改變了傳統(tǒng)化療藥物全面殺傷所有快速分 裂細(xì)胞的治療方式，其只針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的特定標(biāo)志對(duì)腫瘤實(shí)施精確打擊，具有特 異性高、抗癌效果好、毒副作用低的優(yōu)勢(shì)，已成為未來抗癌藥物發(fā)展的主要方向。
通過選擇性地抑制腫瘤血管形成和/或破壞腫瘤血管而達(dá)到控制腫瘤生長(zhǎng)并治療 腫瘤的目的是腫瘤靶向治療的新思路，也一直是近年來抗癌藥物研發(fā)的熱點(diǎn)和亮點(diǎn)。 研究表明，腫瘤組織必須依賴其周圍血管獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣、并排出有害代謝產(chǎn) 物，才能迅速增長(zhǎng)，否則腫瘤生長(zhǎng)最多不超過2mm3。因此，只要有效抑制腫瘤血管的 形成，或者破壞腫瘤已有的血管網(wǎng)絡(luò)，腫瘤細(xì)胞就會(huì)因無法獲得足夠營(yíng)養(yǎng)而停止生長(zhǎng)， 并迅速萎縮、凋亡、壞死，最終被機(jī)體消除。
在腫瘤血管的形成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體家族發(fā)揮了 重要作用，其與腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是抗癌藥物設(shè)計(jì)的重要耙標(biāo)。人 類VEGF由于mRNA的剪接而產(chǎn)生幾種不同的異構(gòu)體，g卩VEGF121、 VEGF股、VEGF冊(cè)和VEGF208， 其中VEGFm和VEGF版為可溶性的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管生成、 增加血管通透性、加快血液流動(dòng)等功能。VEGF受體(VEGFR!和VEGFR2)具有酪氨酸激 酶活性，其中VEGFRyFltl表達(dá)于所有分化成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，VEGFR2/KDR則 只在腫瘤組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞表面幾乎無 法檢測(cè)出，是一種具有高度腫瘤血管特異性的靶標(biāo)。更有意義的是，VEGF^與
VEGFR2/KDR以高親和力特異結(jié)合，是一種理想的具有腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異靶向性的
細(xì)胞因子。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有II型VEGF受體(Flkl/KDR)特異性，可特異性殺傷腫瘤血 管內(nèi)皮細(xì)胞(抗腫瘤新生血管作用)的融合毒素。
本發(fā)明所提供的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素，名稱為 VEGF121/RIP30KDEL，是通過連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白R(shí)IP30的氨基端(N端) 連接VEGF^得到的融合蛋白。
所述苦瓜籽核糖體失活蛋白R(shí)IP30是本發(fā)明的發(fā)明人從苦瓜籽中獲得的一種分子 量為30kD的核糖體失活蛋白，其氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO: 3所示，其 編碼序列可如序列表中SEQ ID NO: 4所示。
所述人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF121是本發(fā)明的發(fā)明人從人卵巢癌組織中獲得 的，其氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO: l所示，其編碼序列可如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
所述連接肽的選擇是多種多樣的，其氨基酸殘基序列可如序列表中的SEQ ID NO: 7所示的多肽，其編碼序列可如序列表中的SEQ ID NO: 8所示的核苷酸序列。
為獲得更好的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位效果，所述融合毒素的c-末端還可攜帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定 位信號(hào)KDEL，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸殘基序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示， 其編碼序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
所述連接肽也可替換為其類似物，這些類似物與所述連接肽的差別可以是氨基酸 序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽 包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴 露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)。類 似物還包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天 然存在的或合成的氨基酸的類似物。
具體來講，所述融合毒素融合毒素VEGF121/RIP30KDEL，是下述氨基酸殘基序列之
1) 序列表中的SEQ ID NO: 5;
2) 將序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加并具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO: 5由393個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-121位氨基 酸殘基為VEGF121;自氨基端第122-126位氨基酸殘基為連接肽序列，自氨基端第
127-389 (263aa)位氨基酸殘基為苦瓜籽核糖體失活蛋白R(shí)IP30;自氨基端第390-393 (4aa)位氨基酸殘基為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL。
編碼上述具有特異性破壞腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL 的基因(M67^/W7y^T"5Z)，是下述核苷酸序列之一
1) 序列表中SEQ ID N0: 6的DNA序列；
2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 5的咖A序列；
3) 與序列表中SEQ ID NO: 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有選擇
性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的核苷酸序列；
4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0. 1XSSPE (或0. IXSSC)、 0.1% SDS的溶液在 65。C下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO: 6由1179個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5'端第1-1179 位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5'端第 卜363位堿基為VEGFm的編碼序列，自5，端第364-378位堿基為連接肽的編碼序列， 自5'端第379-1167位堿基為苦瓜籽核糖體失活蛋白R(shí)IP30的編碼序列，自5'端第 1168-1179位堿基為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL的編碼序列。
所述融合毒素VEGF121/RIP30KDEL的片段、衍生物和類似物也是本發(fā)明要保護(hù)的， 是指保持本發(fā)明的VEGF121/RIP30相同生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、 衍生物或類似物可定義為1)由一個(gè)或多個(gè)保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選為保守 性氨基酸殘基)所取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是，也可以不是由遺 傳密碼編碼的；2)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽；3)成熟多肽與 另一個(gè)化合物融合所形成的多肽；4)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的 多肽(如用來純化此多肽的序列，或是抗體片段或其它抗原配體序列的融合毒素)， 或是將編碼另一個(gè)多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融 合就可以獲得融合多肽的編碼序列，再使該融合多肽的編碼序列獲得表達(dá)，就可產(chǎn)生 融合多肽。所述產(chǎn)生融合多肽的技術(shù)為本領(lǐng)域內(nèi)公知的，包括連接編碼多肽的編碼序 列，從而使它們?cè)谕粋€(gè)讀碼框中，并且使融合多肽的表達(dá)受控于相同的啟動(dòng)子和終 止子。
所述VEGFm/RIP30KDEL的類似物與VEGFm/RIP30KDEL的差別可以是氨基酸序列上 的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天 然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘
變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其它已知的分子生物學(xué)技術(shù)。類似物還
包括具有不同于天然L-氨基酸殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在
的或合成的氨基酸的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明融合毒素的氨基酸殘基序列并不限于上 述例舉的具有代表性的序列。
所述VEGF121/RIP30KDEL融合毒素還可為經(jīng)過修飾的，或經(jīng)修飾提高了其抗蛋白水 解性能或優(yōu)化了溶解性能的VEGFm/RIP30KDEL多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形 式包括1)體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式，如乙?；螋然?；2)糖基化，如 那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽，這種 修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶) 而完成；3)具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸、磷酸蘇氨酸)的 序列。
編碼本發(fā)明VEGF121/RIP30KDEL融合毒素的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。 DNA形式包括cDNA或人工合成DNA，可以是單鏈的或是雙鏈的，也可以是編碼鏈或非 編碼鏈。
本發(fā)明還提供了所述融合毒素多核苷酸的變異體，其編碼與VEGF121/RIP30KDEL有 相同的氨基酸序列的多肽或多肽片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是 天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體，還可包括取代變異體、缺失變異體和 插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一 個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
含有本發(fā)明基因^^7^/7 77^ft^說的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增E67^/W7^^Z^Z中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種表達(dá)上述融合毒素VEGF121/RIP30KDEL的方法。 本發(fā)明所提供的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL的表達(dá)方法，是將所述融合毒素 VEGF121/RIP30KDEL基因、該基因變異體或含有融合毒素VEGF121/RIP30KDEL基因的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離純化蛋白， 得到融合毒素VEGF121/RIP30KDEL。
所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL 基因可插入到重組表達(dá)載體中。構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體，可為任意一種指 本領(lǐng)域熟知的可進(jìn)行外源基因表達(dá)的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、 哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒(如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體)。所述載體包括但不限于在 細(xì)菌中表達(dá)的基于T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(AH Rosenberg, et al. Vectors for selective expression of cloned DNAs by T7 RNA polymerase. Gene. 1987， 56(1): 125-135);在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的pMSXND表達(dá)載體(SJ Lee and D Nathans. Proliferin secreted by cultured cells binds to marmose 6—phosphate receptors. J. Biol. Chem. 1988; 263: 3521-3527)和在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的來源于桿狀病毒的載 體。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定表達(dá)，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體 的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
構(gòu)建所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體還可為包含有Thioredoxin (Trx)突變體編碼 序列的融合表達(dá)載體，可將該載體命名為pET32載體，其中Trx突變體在蛋白表達(dá)過 程中能更有效促進(jìn)細(xì)菌胞漿中目的蛋白二硫鍵的形成進(jìn)而促進(jìn)蛋白的可溶性表達(dá)。
其中，以pET32為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有所述具有抗腫瘤作用的融合毒素基因 VEGF121/RIP30KDEL的重組表達(dá)載體為pET32-VEGF121/RIP30KDEL。
可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法構(gòu)建含有所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi) 皮細(xì)胞作用的融合毒素基因VEGF121/RIP30KDEL的重組表達(dá)載體，如體外重組DNA技術(shù)， DNA合成技術(shù)禾口體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambrook， et al Molecular cloing， a Laboratory Manual. Cold spring harbor laboratory. New York, 1989)。所述所述具有選擇 性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因VEGF121/RIP30基因的DNA序列可以 有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA的合成。所述啟動(dòng)子可為大 腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子、噬菌體啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒和其它一些已知的可控制基 因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。所述表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核 糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，所述表達(dá)載體還可包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化 的宿主細(xì)胞的表型形狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶基因、新霉素抗性基因 以及綠色熒光蛋白(GFP)基因或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性基因等。
所述宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；高等 真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌；鼠傷寒沙門氏菌的 細(xì)菌細(xì)胞；真核細(xì)胞如酵母、植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9等昆蟲細(xì)胞；CH0、 COS、 293 細(xì)胞或Bowes黑色素瘤細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列，將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，長(zhǎng)度通常為10-300個(gè)堿基對(duì)， 作用于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的長(zhǎng)度約為100-270個(gè)堿 基對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子或腺病毒增強(qiáng)子等。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)，將重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，
誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，并對(duì)重組蛋白進(jìn)分離純化。
培養(yǎng)含有本發(fā)明具有抗腫瘤作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL編碼基因的宿主 細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
所述融合毒素VEGF121/RIP30KDEL及其編碼基因可用于制備抗腫瘤藥物，因而本發(fā) 明還提供了一種抗腫瘤藥物。
本發(fā)明所提供的抗腫瘤藥物，它的活性成分為上述具有抗腫瘤作用的融合毒素 VEGF121/RIP30KDEL或其編碼基因。
所述具有抗腫瘤作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL基因可存在于真核表達(dá)載體中。
需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載 體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促 進(jìn)劑、表面活性劑和吸附載體等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液或凍干粉劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可 以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
上述蛋白藥物和基因藥物的用量可采用藥學(xué)領(lǐng)域中蛋白藥物和基因藥物的常規(guī) 劑量，并可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。荷瘤裸鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的融合毒素 VEGF121/RIP30KDEL在注射劑量為15mg/kg體重時(shí)，可明顯延緩腫瘤的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供了一種具有抗腫瘤新生血管作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL及其 編碼基因。該蛋白是利用VEGFm與惡性腫瘤高表達(dá)的VEGF受體Flkl/KDR高度特異結(jié) 合的特點(diǎn)，與來源于苦瓜籽的核糖體失活蛋白R(shí)IP30通過連接肽連接而成的融合毒素。 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF^作為運(yùn)載工具，可使該融合毒素與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因 子受體Flkl/KDR特異結(jié)合并內(nèi)化進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后苦瓜籽核糖體失活蛋白 RIP30發(fā)揮其毒素效應(yīng)，殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞腫瘤組織的新生血管， 切斷腫瘤血液供應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤的目的。此外，融合毒素C-末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào) KDEL可增加游離RIP30毒素在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的富集，進(jìn)一步增強(qiáng)融合毒素的抗腫瘤效果 (RIP30毒素可使其中核糖體大亞基的28S rRNA發(fā)生脫腺嘌呤作用，抑制細(xì)胞蛋白質(zhì) 的翻譯，進(jìn)而殺死腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，破壞腫瘤新生血管)。此外，該融合毒素的表 達(dá)條件簡(jiǎn)單，易于純化，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因而，可以該融合毒素為活性成 分制備成抗腫瘤藥物。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。 說明書附圖


圖1為VEGF121G4S基因PCR產(chǎn)物的1%諒脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖2為RIP30KDEL基因PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 圖3為pET32-VEGF121/RIP30KDEL的酶切鑒定結(jié)果
圖4為在大腸桿菌中表達(dá)的Trx-VEGF121/RIP30KDEL融合蛋白的12%變性聚丙烯 酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖5為大腸桿菌中表達(dá)并經(jīng)純化的Trx-VEGF121/RIP30KDEL融合蛋白的12%變性聚 丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果
圖6為純化的VEGFm/RIP30KDEL融合蛋白的12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)
果
圖7為對(duì)照組和試驗(yàn)組給藥后不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)曲線
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell， David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物合成及測(cè)序工作均由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。
實(shí)施例1、融合蛋白Trx-VEGFm/RIP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建
用下述方法構(gòu)建具有破壞腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素 VEGF121/RIP30KDEL的編碼基因及其原核表達(dá)載體，具體方法包括以下步驟
一、VEGF^G4S基因的克隆
1、 引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增VEGF^與連接肽G4S的融合基因(VEGF121G4S)，并在正向引物的5， 端添加限制性內(nèi)切酶&w I的識(shí)別位點(diǎn)，在反向引物上添加連接肽G4S的編碼序列和 限制性內(nèi)切酶5朋W I的識(shí)別位點(diǎn)，引物序列如下
上游引物F: 5， -ggZ4(XgACgACgACgACAgggCACCgATggCAgAAggTggCggg，下游引物R: 5 ， -^7TCgCCACCgCCCCgCCTCggCTTgTCACATTTTTC 。
2、 人卵巢癌組織總RNA的提取
利用Invitrogen公司的Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，方法為取大約lOOrag組 織放入無菌玻璃研磨器中，加入ImL Trizol試劑，冰浴條件下迅速研磨，然后吸取 上清至無RNA酶的離心管中，4°C、 12，000g離心lOmin，吸取上清，加入0. 2mL氯仿 /ImL Trizol,充分混勻后靜置2-3min;將水相移至新的離心管中，加入等體積的異 丙醇，顛倒混勻后，室溫沉淀10min，再4。C、 7500g離心5min，重復(fù)漂洗一次，去 除乙醇后室溫干燥5-10min，加入DEPC水溶解RNA沉淀。
3、 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒并按照說明書進(jìn)行操作，方法為取總RNA5W， 加入隨機(jī)引物，70°C 5min，冰上冷卻5min;再加入AMV RT 5X緩沖液，2. dNTPs混合物，RNA抑制劑，7. DEPC處理水，25°C 10min，然后升溫至37°C 時(shí)加入314 AMV RT，最后37°C 60min， 60°C 3min， 37°C 30min。
4、 PCR擴(kuò)增VEGF^G4S基因
用下述方法PCR擴(kuò)增VEGF121G4S基因50Hl反應(yīng)體系為于39W H20中加入 lOXPyrobest PCR緩沖液，10mM dNTPs，步驟1的正、反向引物(F、 R)各1W，
步驟3的cDNA， 1^1 Pyrobest DNA Polymerase; PCR反應(yīng)條件為:94°C 3min， 94°C 30sec， 56°C 40sec， 72°C 60sec，共30個(gè)循環(huán)。
5、 目的基因的純化、回收
用天根公司的目的基因純化、回收試劑盒并按照說明書進(jìn)行操作，方法為首先 用500ul平衡液平衡離心柱；在裝有凝膠的離心管中加入3倍體積(約600)4)的溶 膠液，置6(TC水浴中，直至凝膠完全溶解；將溶液吸至離心柱中，12000g離心lmin， 棄流出液；加入500ul洗液，12000g離心lmin，棄流出液；重復(fù)洗滌一次；1300g離 心2min;置37°C 30分鐘，再更換EP管，加入30W去離子水，放置lmin，最后13000g 離心lmin，收集洗脫液。對(duì)回收、純化的目的基因進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢 測(cè)結(jié)果如圖l所示(泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))，結(jié)果PCR 擴(kuò)增的VEGF121G4S基因的大小約為400bp，與預(yù)期大小一致。
6、 VEGFmG4S基因與pEASY-B載體連接
向4ul純化的VEGF121G4S基因的PCR擴(kuò)增片段中加入lul pEASY-B連接混合物(包 含有pEASY-B載體和連接酶，購自北京全式金公司)，室溫放置5分鐘，然后將其轉(zhuǎn) 化大腸桿菌DH5d感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，提質(zhì)粒，得到攜帶有VEGF^G4S基因 的重組載體，命名為pEASY-B-VEGF121G4S。
7、 提質(zhì)粒
用天根公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒并參照試劑盒說明書提質(zhì)粒，方法為將測(cè)序 正確的攜帶有pEASY-B-VEGF121G4S的陽性單克隆接種于5mL含25ug/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，在37。C、 250rpm下振蕩培養(yǎng)過夜(16小時(shí))；6000rpm離心5分鐘， 收集菌體；每管加入250ulPl溶液(細(xì)菌懸浮液)，混勻；再加入250ul P2溶液(細(xì) 菌裂解液)，上下顛倒4-5次，直至透明；每管加入350ul P3溶液(中和液)，上 下顛倒4-5次，呈團(tuán)絮狀，12， OOOrpm離心30min;取2個(gè)離心柱，分別加入500ul 平衡液，12000rpm離心lmin，棄流出液;加入菌體裂解上清液，12000rpm離心lrain; 棄流出液，加入500ul PD (蛋白質(zhì)去除液)12000rpm離心lmin;棄流出液，加入700ul
PE (洗滌液)12000rpm離心lmin;棄流出液，加入500ul PE (洗滌液)12000rpm離 心lmin;棄流出液，13000rpm離心2min以去除殘留洗液，并置37。C干燥30分鐘； 將離心柱置于一新的1.5mL離心管中，加入100ul EB (DNA洗脫液)，靜置1分鐘， 最后13000rpm離心1分鐘，收集洗脫液。 二、 RIP30KDEL基因的克隆
1、 引物設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增RIP30與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL融合基因(RIP30KDEL)的引物，并 在上游引物添加限制性內(nèi)切酶5s威I識(shí)別位點(diǎn)，在下游引物添加#" I識(shí)別位點(diǎn)， 引物序列如下
上游引物BamH I—F: 5，-《^7TCgATgTTAACTTCgATTTgTCg，
下游引物Not I—R: 5， -gCggCCgCTCATTACAgTTCATCTTTATTCACAACAgATTCCCC。
2、 苦瓜籽總RNA提取
取市售苦瓜籽于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑 (Invitrogen公司)，4°C、 12000rpm離心10分鐘，取上清，每lmL TRIzol加入氯仿 200ul，劇烈振搖30秒，室溫放置3分鐘，4'C、 12000rpm離心15分鐘，取上層水相 溶液，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置10分鐘，4"C、 12000rpm離心10分鐘， 棄上清，加入預(yù)冷的75X乙醇(DEPC水配置)洗滌，放置至沉淀透明后加入適量DEPC 水溶解，-7(TC保存?zhèn)溆谩?br> 3、 反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增RIP30KDEL基因
用Superscript II (Introgen公司)試劑盒并按照說明書進(jìn)行操作取lug苦 瓜籽總RNA作模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后取5ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板參照下述PCR體系 擴(kuò)增RIP30KDEL基因lOXPyrobest緩沖液5ul，上、下游引物(BamH I—F、 Not I一R) 各50pmo1， 10mM dNTPs lul， Pyrobest DNA聚合酶lul，補(bǔ)水至50ul。 PCR反應(yīng)參 數(shù)為先94。C 30sec， 55°C 40sec， 72°C lmin，共30個(gè)循環(huán)；然后72。C延伸7分 鐘。反應(yīng)結(jié)束后，用天根公司的目的基因純化、回收試劑盒回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 方法與步驟一相同。然后，對(duì)回收、純么的目的基因進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)， 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(泳道1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn))，結(jié)果 PCR擴(kuò)增的RIP30KDEL基因的大小約為800bp，與預(yù)期大小一致。
4、 RIP30KDEL基因與pEASY-B載體連接
向4ul純化的RIP30KDEL基因的PCR擴(kuò)增片段中加入lul pEASY-B連接混合物， 室溫放置5分鐘，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，得到攜 帶有RIP30KDEL基因的重組載體，命名為pEASY-B-RIP30KDEL。
5、提質(zhì)粒 方法與步驟一相同。
三、pET32a(+)-VEGF121/RIP30KDEL融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 1 、 pET32a(+) -RIP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建
① 將載體pET32a (+)和pEASY-B-RIP30KDEL質(zhì)粒載體用限制性內(nèi)切酶5柳# I和 7fef I進(jìn)行雙酶切，20ul反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為5ul lOXBuffer 1， 10iU質(zhì)粒， 1 ix 1 Aa威I， 1 u 1I，水3ul，混勻，在37。C下酶切2小時(shí)。
② 將pET32載體和pEASY-B-RIP30KDEL酶切片段切膠混合一起回收，方法參照 天根公司說明書和步驟一。洗脫體積為30ul。
③ pET32a載體與RIP30KDEL片段的連接取26ul步驟②的洗脫產(chǎn)物，加3ul 10XT4 DNA連接酶緩沖液，lul連接酶，混勻，16。C連接過夜。
④ 取5ul步驟③連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
⑤ 對(duì)轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，方法為取單菌落懸于50ul水中， 99。C裂解10分鐘；5(M反應(yīng)體系為于3914 H20中加入lOXTaq緩沖液，10mM dNTPs，通用擴(kuò)增引物T7promoter (5， -TAATACgACTCACTATAg)和T7 terminator
(5， -:TgCTAgTTATTgCTCAgC)各1W， 模板，Taq酶;反應(yīng)條件為94°C 3min， 94°C 30sec， 56°C 40sec， 72°C 60sec，共30個(gè)循環(huán)?？蓴U(kuò)增出約900bp DNA片段 的為陽性克隆。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR鑒定為陽性克隆的進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，小量法提質(zhì)粒
(方法與步驟一相同)，用限制性內(nèi)切酶^aH和/fot I進(jìn)行雙酶切鑒定，方法同 步驟①，經(jīng)酶切得到約800bp DNA片段的為陽性克隆。 3、 pET32-VEGF121/RIP30KDEL表達(dá)載體的構(gòu)建
① 對(duì)質(zhì)粒載體pET32-RIP30KDEL和pEASY-B-VEGF121G4S用限制性內(nèi)切酶和 ^wl進(jìn)行雙酶切，20ul反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為5"1 lOXBuffer 2， 10yl質(zhì)粒， lul A^刀I， ^a;z^1，水3ul，混勻，在37。C下酶切2小時(shí)。
② 將經(jīng)酶切的pET32-RIP30KDEL和VEGF121G4S酶切片段切膠混合一起回收，方法 參照天根公司說明書和步驟一。洗脫體積為30ul。
③ pET32-RIP30KDEL和VEGFmG4S片段的連接取26ul步驟②的洗脫產(chǎn)物，加 入3ul 10XT4DNA連接酶緩沖液，lul連接酶，混勻，16。C連接過夜。
取5ul連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化菌落的雙酶切鑒定分別取4個(gè)單菌落接種于5mL含有200ug/mL羧芐青 霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37"C、 250rpm下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)結(jié)束后，提取質(zhì)粒，用 限制性內(nèi)切酶/rp力I和#W I進(jìn)行雙酶切鑒定。對(duì)酶切鑒定產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道l為酶切鑒定產(chǎn)物，泳道M為DNA Marker)， 經(jīng)《p/2 I和tV" I雙酶切后獲得了大小約為1.2kb的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，再 對(duì)經(jīng)酶切鑒定正確的陽性克隆質(zhì)粒用測(cè)序的方法做進(jìn)一步鑒定，測(cè)序結(jié)果表明所攜帶 的目的基因具有序列表中SEQ ID N0: 6的核苷酸序列，由1179個(gè)堿基組成，其編碼 序列為自5'端第1-1179位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO: 5的氨基酸殘基序 列的蛋白質(zhì)，自5'端第1-363位堿基為VEGFm的編碼序列，自5，端第364-378位 堿基為連接肽的編碼序列，自5'端第379-1167位堿基為苦瓜籽核糖體失活蛋白 RIP30的編碼序列，自5'端第1168-1179位堿基為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL的編碼序列。 上述檢測(cè)結(jié)果證明獲得了序列及插入位置均正確的攜帶有本發(fā)明具有破壞腫瘤新生 血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素VEGF121/RIP30KDEL編碼基因的原核表達(dá)載體，命名為 pET32-VEGF121/RIP30KDEL 。
實(shí)施例2、融合蛋白VEGF121/RIP30KDEL的制備
一、 融合蛋白Trx-VEGF^/RIP30KDEL在大腸桿菌中的表達(dá)
1. 將pET32-VEGF121/RIP30KDEL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami (DE3)，在37。C下培 養(yǎng)30小時(shí)，篩選陽性克隆。
2. 將陽性單菌落接種于10mL LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200ug/mL，卡那霉 素30ug/mL和四環(huán)素25ug/mL)中，在37。C、 250rpm條件下培養(yǎng)過夜。
3. 將10mL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至1L LB液體培養(yǎng)基(含羧芐青霉素200ug/mL，卡那 霉素30ug/mL和四環(huán)素25ug/mL)中，在37°C、 250rpm條件下培養(yǎng)至0D6。。"0. 6 (約 4小時(shí))。
4. 加入IPTG至終濃度為0. lraM (加入1M IPTG溶液100ul)，在23°C、 250rpm 條件下繼續(xù)培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)結(jié)束后，6000rmp離心5分鐘收獲細(xì)菌。
5. 將細(xì)菌沉淀重懸于40mL lOmM Tris* HC1 (pH 8.0)中，冰浴中超聲破碎(功 率300W，每次5秒，間隔5秒，共50次)，在4。C、 12000rpm下離心30分鐘，收集 上清。取離心前、后樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳，鑒定蛋白可溶性。檢測(cè)結(jié)果如圖 4所示(泳道M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，泳道l為誘導(dǎo)前的菌體蛋白，泳道2為誘導(dǎo) 后的菌體蛋白，泳道3為裂解上清)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，獲得了分子量為62KD的 重組蛋白，與預(yù)期結(jié)果一致，并主要以可溶的形式表達(dá)。
二、 融合蛋白Trx-VEGF121/RIP30KDEL的純化
1 、用Ni-NTA親和柱純化Trx-VEGF121/RIP30KDEL融合蛋白
①用5倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(lOmM Tris' HC1， pH8.0， 300mM NaCl， 10mM
咪唑)平衡鎳柱(購自Qiagen公司)。
② 將細(xì)胞粗提液緩慢上柱，流速約0.5mL/min;用10倍柱床體積的洗液(lOraM Tris* HC1， pH8. 0， 300mM NaCl， 20mM咪唑)洗脫雜蛋白。
③ 用含有300mM NaCl， 250mM咪唑的lOmM Tris* HC1 (pH8.0)洗脫目的蛋白， 收集3倍柱床體積的洗脫液。同時(shí)取樣，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢湖"檢測(cè)結(jié)果如 圖5所示(泳道M為低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為經(jīng)Ni-NTA親和柱純化的 Trx-VEGFw/RIP30KDEL融合蛋白)，經(jīng)Ni-NTA純化的融合蛋白仍有雜蛋白污染，但 分子量均小于35KD。然后，采用孔徑為MWC050000的透析袋4'C透析過夜去除雜蛋白。
三、 融合蛋白的切割及Trx標(biāo)簽的去除
按每100單位腸激酶(rEK)裂解10毫克步驟二純化的Trx-VEGF121/RIP30KDEL融 合蛋白，室溫消化過夜。
四、 VEGF121/RIP30KDEL的進(jìn)一步純化
用Blue S印harose 6 Fast Flow親和層析純化VEGF121/RIP30KDEL蛋白，具體方 法包括以下步驟
① 上柱用5倍柱床體積的20mM Tris' HC1 (pH7. 4) ， 50mM NaCl緩沖液平衡 凝膠柱，將步驟4酶切產(chǎn)物緩慢上柱，流速約為0. 5mL/min。
② 洗柱用10倍柱床體積的20raM Tris* HC1 (pH7. 4) ， 150mM NaCl緩沖液洗 脫雜蛋白。
③ 洗脫洗脫液為20mM Tris* HC1 (pH7. 4) ， 2M NaCl，收集2個(gè)柱床體積。
透析或凝膠過濾置換緩沖液lOmM Tris' HC1 (pH7. 4) ， 150mM NaCl。
用腸激酶消化去除組氨酸標(biāo)簽，并經(jīng)Blue S印harose 6 FF柱(購自GE公司) 純化。對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示(泳道M為低分子 量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為經(jīng)純化的VEGF^/RIP30KDEL融合蛋白)，得到了高純度的分 子量為43KD的目的蛋白VEGF121/RIP30KDEL。
實(shí)施例3、 VEGF121/RIP30KDEL的抑瘤實(shí)驗(yàn)
取5周齡Balb/c裸鼠，雌性，體重為18-20g，隨機(jī)分為2組，每組5只。體外 培養(yǎng)A375M細(xì)胞(購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心)，每只裸鼠注射5X105人黑色素瘤 A375M癌細(xì)胞，以接種腫瘤當(dāng)天為第一天，第三天給藥，劑量為15mg VEGF^/RIP30KDEL/kg體重，以注射相同體積的生理鹽水(saline)為對(duì)照。在不同 時(shí)間測(cè)量對(duì)照組和試驗(yàn)組(VEGFm/RIP30KDEL)小鼠腫瘤的大小。對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行一個(gè) 重復(fù)測(cè)量的兩因素設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果較對(duì)照組(saline) ， VEGF121/RIP30KDEL組
的P〈0.05，表明兩組間的差別具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)每組小鼠腫瘤大小的平均值
繪出對(duì)照組(saline)和試驗(yàn)組(VEGF121/RIP30KDEL)給藥后不同時(shí)間的腫瘤生長(zhǎng)曲線， 生長(zhǎng)曲線如圖7所示，表明本發(fā)明的融合毒素VEGF^/RIP30KDEL對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有顯 著的抑制作用。
序列表
〈160〉 10
〈210〉 1 <211〉 121 <212> PRT
<213〉 人屬人(/fo歷。sa/w'e/750 〈400〉 1
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys
15 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gin Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp lie Phe Gin Glu Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie 65 70 75 80
Met Arg lie Lys Pro His Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gin Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 115 120
〈210〉 2
〈211〉 363
<212〉 腿
〈213> 人屬人(j￥o/ho
<400〉 2
gcaccgatgg
gatg卿tcg tgcaatgacg atgcggatca
cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaaatgtga caagccgagg
60 120 180 240 300 360
cgg 363
<210〉 3 <211> 263 〈212〉 PRT
<213> 葫聲科苦瓜(Jfo/z ora7cs c力ar朋Wa) 〈400> 3
Asp Val Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys
15 10 15
Phe 'lie Glu Asp Phe Arg Ala Thr Leu Pro Phe Ser His Lys Val Tyr
20 25 30
Asp lie Pro Leu Leu Tyr Ser Thr lie Ser Asp Ser Arg Arg Phe lie
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Thr Ser Tyr Ala Tyr Glu Thr lie Ser Val Ala lie
50 55 60
Asp Val Thr Asn Val Tyr Val Val Ala Tyr Arg Thr Arg Asp Val Ser 65 70 75 80
Tyr Phe Phe Lys Glu Ser Pro Pro Glu Ala Tyr Asn lie Leu Phe Lys
85 90 95
Gly Thr Arg Lys lie Thr Leu Pro Tyr Thr Gly Asn Tyr Glu Asn Leu
100 105 110
Gin Thr Ala Ala His Lys lie Arg Glu Asn lie Asp Leu Gly Leu Pro
115 120 125
Ala Leu Ser Ser Ala lie Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala Gin Ser
130
Ala Pro Ser Ala Leu 145
Arg Phe Lys
Tyr
Phe Lys Pro Asn 180 Gin
Leu Gly Glu Ser 260
135
Leu Val Leu lie 150
Glu Arg His Val
lie 165
Leu Ala lie
Leu Ser Lys 195
Asn Pro Val Asp Leu lie 210
Asn Val Asp Ser Asp Val 225 230 Ser Arg Ala Ser Thr Ala
lie Ser 185
lie Phe Leu Ala Gin Asn Gin Gly 200
Pro Thr
140
Gin Thr Thr Ala Glu Ala 155
Ala Lys Tyr Val Ala 170
Leu Glu Asn
Gin
Thr 175 Ser
Ala 160 Asn
Ala
Trp 190
Lys Phe Arg
Lys 215
Val Lys Gly
Gly 205
Phe Gin Val Thr
Thr 245 Val Val Asn
Gly Glu Arg 220
Asn lie Lys Leu Leu Leu Asn 235 240 Asp Glu Asn Phe lie Thr Thr Met Thr Leu 250 255
〈210〉 4
〈211〉 789
<212> DNA
〈213〉 葫戸科苦瓜(Momordica charantia)
<400> 4
gatgttaact tcgatttgtc gactgccact gcaaaaacct acacaaaatt tatcgaagat 60
ttcagggcga ctcttccatt tagccataaa gtgtatgata tacctctact gtattccact 120
atttccgact ccagacgttt catactcctc aatctcacaa gttatgcata tgaaaccatc 180
tcggtggcca tagatgtgac gaacgtttat gttgtggcct atcgcacccg cgatgtatcc 240
tactttttta aagaatctcc tcctgaagct tataacatcc tattcaaagg tacgcggaaa 300
attacactgc catataccgg taattatgaa aatcttcaaa ctgctgcaca caaaataaga 360
gagaatattg atcttggact ccctgccttg agtagtgcca ttaccacatt gttttattac 420
aatgcccaat ctgctxcttc tgcattgctt gtactaatcc agacgactgc agaagctgca 480
agatttaagt atatcgagcg acacgttgct aagtatgttg ccactaactt taagccaaat 540
ctagccatca taagcttgga aaatcaatgg tctgctctct ccaaacaaat atttttggcg 600
cagaatcaag tttcaagtaa tccagagcta
gaggaaaatt tagaaatcct gtcgacctta taaaacctac cggggaacgg ccaatgttga ttcagatgtt gtaaaaggta atatcaaact cctgctgaac gcactgctga tgaaaacttt atcacaacca tgactctact tggggaatct
660 720 780
gttgtgaat 789
<210> 5 <211〉 393 〈212〉 PRT <213〉人工序列
〈220〉 <223〉
<400> 5
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys
15 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gin Arg Ser Tyr Cys His Pro lie Glu Thr Leu
20 25 30
Val Asp lie Phe Gin Glu Tyr Pro Asp Glu lie Glu Tyr lie Phe Lys
35 40 45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
50 55 60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn lie Thr Met Gin lie 65 70 75 80
Met Arg lie Lys Pro His Gin Gly Gin His lie Gly Glu Met Ser Phe
85 90 95
Leu Gin His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
100 105 110
Gin Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val
115 120 125
Asn Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Ala Lys Thr Tyr Thr Lys Phe lie 130 135 140
Glu Asp Phe Arg Ala 145
Pro Leu
Leu
Arg Tyr
Thr Leu Pro Phe Ser His Lys 150 155 Thr lie Ser Asp Ser Arg Arg
Ser 165
Tyr Ala Tyr Glu
Asn Leu Thr Ser 180
Tyr Val Val Ala
Ser 170
lie Ser Val Ala
Thr Asn Val 195
Glu Ser Pro Pro
Phe Lys 210
Arg Lys lie Thr Leu 225
Ala Ala His Lys
Tyr 200 Ala
Thr 185
Arg Thr Arg Asp
Val Tyr Asp lie 160
Phe lie Leu Leu 175
Asp Val
Glu 215
Tyr Thr Gly Asn
Pro 230
Arg Glu Asn lie
Tyr Asn lie Gly
Val 205 Phe
lie 190
Ser
Lys
lie 245
Thr Thr Leu Phe
Tyr 235 Leu
Leu 220
Glu Asn Leu
Tyr Phe Gly Thr
Ser Ser Ala lie 260
Leu Val Leu lie
Asp 250
Tyr Asn Ala Gin
Ser Ala Leu 275
lie Glu Arg His
Tyr 265
Thr Thr Ala Glu
Gin Thr 240
Gly Leu Pro Ala Leu 255
Ala Pro
Lys Tyr 290
Pro Asn Leu Ala lie 305
Lys Gin lie Phe
Gin 280
Ala Lys Tyr Val
Val 295
Ser Leu Glu Asn
Ala 285 Thr
Ser 270 Ala
Asn
lie 310
Ala Gin Asn Gin
Ala 300
Trp Ser Ala
Vsl Asp Asp Ser
Leu
Leu 325
Lys Pro Thr Gly
Gin 315
Gly Lys Phe Arg
lie 340
Val Val Lys Gly
Gly 330
Arg Phe Gin Val
Asp 355
Thr Ala Asp Glu
Ala Ser 370
Glu Ser Val Val Asn 385
Asn 360 Phe
Glu 345
lie Lys Leu Leu
Lys 390
Asn 375 Asp Glu Leu
lie Thr Thr Met 380
Leu 365 Thr
Thr 350 Asn
Leu
Arg Phe
Phe Lys
Leu Ser 320 Asn Pro 335
Asn Val Ser Arg Leu Gly<210> 6
<211〉 1179
<212〉 腿 〈213〉人工序列
〈220〉 〈223〉
<400> 6
gcaccgatgg cagaaggagg agggcagaat catcacgaag tggtgaagtt catggatgtc 60
tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca ggagtaccct 120
gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg cgggggctgc 180
tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac catgcagatt 240
atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct acagcacaac 300
aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaaatgtga caagccgagg 360
cggggcggtg gcggatccga tgttaacttc gatttgtcga ctgccactgc aaaaacctac 化0
acaaaattta tcgaagattt cagggcgact cttccattta gccataaagt gtatgatata 480
cctctactgt attccactat ttccgactcc agacgtttca tactcctcaa tctcacaagt 540
tatgcatatg aaaccatctc ggtggccata gatgtgacga acgtttatgt tgtggcctat 600
cgcacccgcg atgtatccta cttttttaaa gaatctcctc ctgaagctta taacatccta 660
ttcaaaggta cgcggaaaat tacactgcca tataccggta attatgaaaa tcttcaaact 720
gctgcacaca aaataagaga gaatattgat cttggactcc ctgccttgag tagtgccatt 780
accacattgt tttattacaa tgcccaatct gctccttctg cattgcttgt actaatccag 840
acgactgcag aagctgcaag atttaagtat atcgagcgac acgttgctaa gtatgttgcc 900
actaacttta agccaaatct agccatcata agcttggaaa atcaatggtc tgctctctcc 960
aaacaaatst ttttggcgcs gaatca^gga gg肌犯tt1:a g肌3tcctgt cga^cctt3t3 1020
aaacctaccg gggaacggtt tcaagtaacc aatgttgatt cagatgttgt aaaaggtaat 1080
atcaaactcc tgctgaactc cagagctagc actgctgatg aaaactttat cacaaccatg 1140
actctacttg gggaatctgt tgtgaataaa gatgaactg 1179
〈210〉 7
〈211〉 5
〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220> 〈223〉
〈400〉 7
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5
<210> 8
<211> 15
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉 〈223〉
〈400〉 8
ggcggtggcg gatcc 15
<210> 9
<211〉 4
〈212> PRT
<213〉 人屬人(/fo/z o 5"邵ie/J50
<400〉 9
Lys Asp Glu Leu
1
〈210〉 10
<211> 12
<212> DNA
〈213〉 人屬人(〃cvz o
〈400〉 10
a_aaga_tg8￡ic tg 1權(quán)利要求
1、具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素，是通過連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白R(shí)IP30的氨基端連接VEGF121得到的融合蛋白。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合毒素，其特征在于所述連接肽的氨基酸殘基序 列如序列表中SEQ ID NO: 7所示。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合毒素，其特征在于所述融合毒素是下述氨基酸 殘基序列之一—1)序列表中的SEQ ID NO: 5;2)將序列表中SEQIDNO: 5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、 缺失或添加且具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的蛋白質(zhì)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的融合毒素，其特征在于所述融合毒素的C-末端還攜帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)的氨基酸殘基序列如序列表中 SEQ ID NO: 9所示，其編碼序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
5、 編碼權(quán)利要求1或2或3或4所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞 作用的融合毒素的基因。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1) 序列表中SEQ ID NO: 6的DNA序列；2) 編碼序列表中SEQ ID NO: 5的DNA序列；3) 與序列表中SEQ ID NO: 6限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有選擇 性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的核苷酸序列；4) 在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO: 6限定的DNA序列雜交的核苷酸 序列。
7、 含有權(quán)利要求5或6所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合 毒素基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
8、 一種表達(dá)權(quán)利要求1所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合 毒素的表達(dá)方法，是將權(quán)利要求5或6所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作 用的融合毒素基因、該基因變異體或含有所述具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞 作用的融合毒素基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)基 或細(xì)胞中分離純化蛋白，得到具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒 素；所述含有具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素基因的重組表達(dá) 載體為pET32-VEGF121/RIP30KDEL。
9、 權(quán)利要求l-4任一項(xiàng)所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10、 權(quán)利要求5或6所述的具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒 素的編碼基因在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有選擇性殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的融合毒素與應(yīng)用。該融合毒素是通過連接肽在苦瓜籽的核糖體失活蛋白R(shí)IP30的氨基端連接VEGF₁₂₁得到的融合蛋白。VEGF₁₂₁作為運(yùn)載工具，可使該融合毒素與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體F1k1/KDR特異結(jié)合并內(nèi)化進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，然后RIP30發(fā)揮其毒素效應(yīng)，殺傷腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞腫瘤組織的新生血管，切斷腫瘤血液供應(yīng)，達(dá)到抑制腫瘤的目的。此外，該融合毒素的表達(dá)條件簡(jiǎn)單，易于純化，可進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，因而，可以該融合毒素為活性成分制備成抗腫瘤藥物。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)及生物制藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101357947SQ20081022344
公開日2009年2月4日 申請(qǐng)日期2008年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日
發(fā)明者周滿祥, 孫紅琰, 申云飛 申請(qǐng)人:山西康寶生物制品股份有限公司;周滿祥;孫紅琰