專利名稱：CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞高效擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種Poly-D-Lysine黏附小鼠抗人CD137單抗anti-CD137 mAb及重組人 細(xì)胞因子IL-15組成的能用于治療腫瘤疾病的CD3—CD56 K細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建 方法，屬于一種生物制品的擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
NK細(xì)胞1975年被發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)上屬于大顆粒淋巴細(xì)胞，來(lái)源于骨髓，占外周血淋 巴細(xì)胞總數(shù)的5%_10%。它具有廣譜抗腫瘤細(xì)胞作用，特別是對(duì)淋巴瘤和白血病細(xì)胞 作用更為明顯，是抗腫瘤免疫的第一道防線，針對(duì)CD3—CD56^fK敏感靶細(xì)胞(如K562細(xì) 胞)的殺傷效應(yīng)，該殺傷功能不受靶細(xì)胞是否表達(dá)MHC的影響；CD3—CD56 K細(xì)胞還是 連接天然免疫和獲得性免疫的重要環(huán)節(jié)。在DC激發(fā)CTL反應(yīng)的過(guò)程中，CD3—CD56^NK 細(xì)胞能發(fā)揮類似TH細(xì)胞的輔助功能(Mailliard RB， et al. J. Immunol, 2003， 171:2366)。近期的 研究表明，CD3'CD56^細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)相互作用，能夠提高0(:激發(fā)004+TH1 反應(yīng)及CTL反應(yīng)的能力(Adam C， et al. Blood, 2005， 106: 338)。甚至CD3—CD56""NK細(xì)胞還有直 接激活T細(xì)胞的能力。
由于CD3X:D56t細(xì)胞在免疫應(yīng)答中的獨(dú)特作用，其在腫瘤細(xì)胞治療中應(yīng)用越來(lái) 越受到重視。然而，CD3-CD56 K細(xì)胞在體內(nèi)的數(shù)量較少，如何獲得足夠數(shù)量的 CD3'CD56 K細(xì)胞成為制約其臨床應(yīng)用的瓶頸，而且目前的方法擴(kuò)增的CD3—CD56^NK 對(duì)實(shí)體瘤的殺傷作用仍非常有限。另外，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤患者體內(nèi)CD3—CD56"NK細(xì)胞 數(shù)量增多其功能反而下降，CD3'CD56^K細(xì)胞最多的人往往正是易患癌癥的人，這說(shuō) 明腫瘤患者體內(nèi)的CD3—CD56 K細(xì)胞可能存在缺陷。因此，如何提高CD3'CD56"^NK 細(xì)胞的數(shù)量及增強(qiáng)其功能成為困擾醫(yī)療界的難題。
最近的研究表明，共刺激分子CD137在NK細(xì)胞增殖及功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮了極其重要 的作用。人CD137為TNF受體(TNFR)超家族成員，分子量為30kD的I型跨膜糖蛋白。 在存TCR信號(hào)的條件下，CD137信號(hào)可提供協(xié)同CD28的共刺激信號(hào)，維持細(xì)胞的活化狀 態(tài)，抑制AICD的發(fā)生。近年的研究表明，CD137也表達(dá)在NK細(xì)胞的表面并且參與了NK 細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。Wilcox等發(fā)現(xiàn)，激發(fā)CD3—CD56^K細(xì)胞上的CD137分子，能促進(jìn)NK 細(xì)胞增殖和IFN-Y的分泌，并且這種激活的CD3—CD56 K細(xì)胞通過(guò)和CTL的相互作用增
強(qiáng)CTL的殺傷活性(WilcoxRA, et al. J Immunol, 2002, 169: 4230)。另有研究報(bào)道，CD137激活的 NK細(xì)胞在白血病治療中的應(yīng)用，他們將轉(zhuǎn)染了人4-lBB Ligand (4-lBBL)和IL-15基因并 表達(dá)膜型4-lBBL和IL-15分子的K562人白血病細(xì)胞和人外周血培養(yǎng)，獲得了 CD3X:D56"NK細(xì)胞的富集，這種CD3—CD56 K細(xì)胞對(duì)各類血液系統(tǒng)細(xì)胞株具有很強(qiáng)的 殺傷作用(Shi J， et al. Blood, 2005， 106: 3392)。上述結(jié)果提示，CD137激動(dòng)劑協(xié)同IL-15激活 CD3'CD56"KK細(xì)胞(CD137-IL-15-NK)的途徑可能有助于解決CD3—CD56 K細(xì)胞在腫 瘤細(xì)胞治療中應(yīng)用的難題。但CD137-IL-15-NK細(xì)胞如何從實(shí)驗(yàn)室走向臨床應(yīng)用還需要解 決一系列理論及技術(shù)問(wèn)題。首先CD137和IL-15的作用方式需要改進(jìn)，目前采用逆轉(zhuǎn)錄病 毒將4-lBBL和IL-15同時(shí)轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞株的方法，雖然可以提高擴(kuò)增效率但是方法較 為繁瑣，不利于推廣，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒有一定風(fēng)險(xiǎn)且在培養(yǎng)體系中引入的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞也 制約了CD3'CD56 K細(xì)胞的分離純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服上述使用逆轉(zhuǎn)錄病毒的方法培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的不足之 處，利用anti-CD137mAb協(xié)同IL-15激活CD3'CD56"NK細(xì)胞的途徑，提供一種構(gòu)造簡(jiǎn)單、 易于操作，擴(kuò)增效率高，對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549的殺傷率明顯提高，對(duì)CD3'CD56 K細(xì) 胞應(yīng)用于臨床免疫治療具有重要意義的CD3—CD56"NK細(xì)胞高效擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方 法。
本發(fā)明的CD3—CD56"NK細(xì)胞高效擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，主要是提供一種由 Poly-D-Lysine作為黏附劑，黏附anti-CD137 mAb和IL-15構(gòu)成的體外大量擴(kuò)增
CD3-CD56"NK細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，其主要步驟包括
(1) 取適量的黏附劑Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine用蒸餾水稀釋至10W，加入塑料培
養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，孵育5-10min后吸掉黏附劑稀釋液，使黏附劑黏附在塑料培養(yǎng) 板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上；
(2) 取適量的anti-CD137 mAb或CD137L重組蛋白和IL-15同時(shí)加入緩沖液中，稀 釋至濃度分別為l-10ix g/ml和10-100ng/ml，將anti-CD137 mAb和IL-15混合稀釋液加 入上述步驟(l)中制備的黏附有Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine的塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或 培養(yǎng)瓶中，4'C過(guò)夜，使黏附劑處理過(guò)的塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上包被anti-CD137
mAb和IL-15，吸去塑料板的稀釋液，待用；
(3) 采自健康志愿者的外周血經(jīng)Ficoll分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用無(wú)血清培
養(yǎng)基調(diào)整PBMC的濃度至3X106/1111，加入6孔塑料培養(yǎng)板培養(yǎng)2-3h，吸取懸浮細(xì)胞，上述
懸浮細(xì)胞或從其中分選獲得的高純度NK細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1 X 106/ml,加 入Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine處理過(guò)并包被aBti-CD137mAb和IL-15的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿 或培養(yǎng)瓶上，并同時(shí)加入IL-2，培養(yǎng)3-6天后，收集細(xì)胞得擴(kuò)增后的CD3-CD56 K細(xì)胞。
用本發(fā)明的方法擴(kuò)增培養(yǎng)的CD3—CD56 K細(xì)胞與現(xiàn)有的用其它方法擴(kuò)增培養(yǎng)的 CD3—CD56 K細(xì)胞相比，明顯具有以下優(yōu)點(diǎn)及效果
(1) 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于推廣。采用逆轉(zhuǎn)錄病毒將4-lBBL和IL-15同時(shí)轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞 株，然后用這種細(xì)胞株刺激NK細(xì)胞，雖然可以提高擴(kuò)增效率，但是這種方法較為繁瑣， 且獲得穩(wěn)定表達(dá)4-1BBL和IL-15的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株周期較長(zhǎng)，而本發(fā)明所需原材料少， 成本低，制備方法簡(jiǎn)單，周期也較短。
(2) 逆轉(zhuǎn)錄病毒有潛在的致病危險(xiǎn),且擴(kuò)增的CD3—CD56、[K細(xì)胞中混入了轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞也導(dǎo)致了這種方法擴(kuò)增的CD3TD56*細(xì)胞無(wú)法直接投入臨床使用。而本發(fā)明克服 了上述缺陷。
(3) 擴(kuò)增效率高。和其他已知的細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合擴(kuò)增效果相比，本發(fā)明具有 更高的擴(kuò)增效率。
(4) 殺傷效率高。和其他已知的細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合擴(kuò)增的CD3'CD56+NK細(xì)胞 相比，在相同的細(xì)胞濃度下，本發(fā)明擴(kuò)增的CD3-CD56*細(xì)胞對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549 的殺傷效率提高一倍以上。


圖1是采用8種方法培養(yǎng)的人外周血PBMC增殖的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析圖； PBMC采用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整至濃度為2Xl()S/ml，并添加500IU/ml IL-2，然后加
入Poly-D-Lysine處理后包再包被anti-CD137 mAb和IL-15的培養(yǎng)板中(Poly-D-Lysine +
immobilizedanti-CD137mAb +immobilizedIL-15+ IL-2)，培養(yǎng)3天，細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)
胞的增殖。Poly-D-Lysine處理后包被同型對(duì)照小鼠IgGl(Poly-D-Lysine + IgGl)， IL-2，
anti-CD137mAb， IL-15, anti-CDl37 mAb和IL-15 (anti-CD137 mAb+IL-15)，直接包
被anti-CD137 mAb和IL-15 (immobilized anti-CD137 mAb + immobilized IL-15)以及直
接包被anti-CD137 mAb和IL-15再加IL-2 (immobilized anti-CD137 mAb + immobilized
IL-15+ 11^.2)作為對(duì)照組。
圖2是采用8種方法培養(yǎng)人外周血PBMC 3天后CD3—CD56卞K細(xì)胞含量的流式細(xì)
胞術(shù)分析收集不同方法培養(yǎng)3天的細(xì)胞，標(biāo)記anti-CD3-ECD和anti-CD56-PC5熒光抗體。然
后采用流式細(xì)胞術(shù)分析CD3—CD56 K細(xì)胞的百分含量。不同的處理組分別為 Poly-D-Lysine + IgGl (1), anti-CD137 mAb (2), IL-2 (3), IL-15 (4), anti-CD137 mAb+IL-15(5), immobilized anti-CD 137 mAb + immobilized IL-15 (6), immobilized anti-CD137 mAb + immobilized IL-15 + IL-2 (7)， Poly-D-Lysine + immobilized anti-CD137 mAb + immobilized IL-15 + IL-2 (8)。
圖3是采用8種方法培養(yǎng)純化的CD3—CD56 K細(xì)胞增殖的細(xì)胞計(jì)數(shù)分析圖； 采用磁珠陰性選擇或流式細(xì)胞儀分選獲得CD3—CD56"NK細(xì)胞。用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào) 整至濃度為2X 1()S/ml,并添加500IU/ml IL-2,然后加入實(shí)施例2中制備的培養(yǎng)板中,培養(yǎng)3 天,細(xì)胞計(jì)數(shù)分析細(xì)胞的增殖。Poly-D-Lysine + IgGl, anti-CD137 mAb , IL-2 , IL-15, anti-CD 137 mAb+IL-15, immobilized anti-CD 137 mAb + immobilized IL-15, immobilized anti-CD137 mAb + immobilized IL-15 + IL-2作為對(duì)照組。
圖4是采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定CIK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性分析圖。 依照CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity試劑盒說(shuō)明書，取培養(yǎng)3天的NK細(xì) 胞，每組效靶比均設(shè)為10:1，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞胰酶消化，苔盼藍(lán)拒染法 計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)>95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入96孔板，每孔50W，按照不同效靶比加入 效應(yīng)細(xì)胞，每孔50nl，同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞自然釋放孔，培養(yǎng)基自然釋放孔，靶細(xì) 胞最大釋放孔，體積校正對(duì)照孔，每孔體積100ji1，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，在加速度為250g的 條件下離心4min，再置于37°C 、濃度為5%的C02中孵育4h，在反應(yīng)結(jié)束前45min時(shí)， 向耙細(xì)胞最大釋放孔的每孔中加入10pl裂解液。反應(yīng)結(jié)束后，每孔吸取50jil上清與50jU LDH酶反應(yīng)液置于另一新的96孔板，室溫避光反應(yīng)30min，加入反應(yīng)終止液50nl，酶 標(biāo)儀檢測(cè)其OD值。殺傷活性％=(測(cè)定管OD值一靶細(xì)胞自然釋放管OD值一效應(yīng)細(xì)胞 自然釋放管OD值)/ (靶細(xì)胞最大釋放管OD值一靶細(xì)胞自然釋放管OD值)xl00% (具 體細(xì)節(jié)參照美國(guó)Promega公司的cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay kit說(shuō)明 書)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明涉及腫瘤壞死因子超家族成員的結(jié)合蛋白質(zhì)或多肽以及細(xì)胞因子，更具體地 說(shuō)，本發(fā)明涉及anti-CD137 mAb及IL-15組成的NK細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建方法。
本說(shuō)明書中所說(shuō)的"CD137受體"是指抗原活化的T細(xì)胞表面上表達(dá)的蛋白質(zhì)； CD137配體是某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)的可與CD137受體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)"抗CD137抗體"可以是CD137特異性單克隆或多克隆抗體或它們的免疫學(xué) 活性部分。術(shù)語(yǔ)"CD137L"包括完整的CD137配體、可溶性CD137配體及包括CD137 配體之功能活性部分的融合蛋白。本發(fā)明中，優(yōu)選的是單克隆抗體，特別是anti-CD137 mAb。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，采用商品化anti-CD137mAb， IL-15， IL-2,24孔塑料 培養(yǎng)板及黏合劑Poly-D-Lysine。
滅菌蒸餾水稀釋的Poly-D-Lysine溶液處理塑料培養(yǎng)板,然后將包被anti-CD137 mAb 及IL-15。然后用該處理過(guò)的培養(yǎng)板培養(yǎng)PBMC,擴(kuò)增并富集CD3X:D56l細(xì)胞。實(shí)驗(yàn) 證明，本發(fā)明培養(yǎng)的PBMC不僅細(xì)胞數(shù)量有明顯提高,而且其中CD3—CD56^細(xì)胞的百 分含量也明顯上升。如果需要獲得高純度的CD3'CD56 K細(xì)胞則直接擴(kuò)增純化過(guò)的 CD3'CD56"KK細(xì)胞。
為了鑒定本發(fā)明的擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增的CD3—CD56^K細(xì)胞的生物學(xué)功能，本發(fā)明進(jìn)行 了擴(kuò)增的CD3'CD56"NK細(xì)胞對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549體外殺傷實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證明，采用 本發(fā)明的方法擴(kuò)增的CD3—CD56^NK細(xì)胞與用其他已知的細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合擴(kuò)增 的CD3—CD56*細(xì)胞相比，在相同的細(xì)胞濃度下,對(duì)A549的殺傷能力提高一倍以上。
以下借助非限制性實(shí)施例舉例詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不背離本發(fā) 明的基本精神和原則前提下，改變或改動(dòng)本說(shuō)明書中描述的某些技術(shù)內(nèi)容或技術(shù)環(huán)節(jié)。 但人們可以理解到，這些平行的改變或改動(dòng)均將包括在本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之 內(nèi)。
實(shí)施例l:高黏附性的塑料培養(yǎng)板的制備
1. Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine溶液采用滅菌蒸餾水ddH20 1:10稀釋該多聚賴氨 酸溶液。
2. Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine稀釋液(300 n l)加入塑料培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿或培養(yǎng) 瓶中，室溫放置5-10分鐘。
3. 吸去塑料板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine稀釋液，室溫 過(guò)夜干燥待用。
實(shí)施例2: anti-CD137 mAb和IL-15的包被
1. Anti-CD137 mAb和IL-15同時(shí)加入磷酸緩沖液(PBS),稀釋稀釋至濃度分別為1-10 u g/ml禾口 10-100ng/ml。
2. 將上述anti-CD137 mAb和IL-15混合稀釋液(300 u l)加入實(shí)施例1中制備的塑料
培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，4-C過(guò)夜。
3.吸去塑料板或培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶的稀釋液，待用。 實(shí)施例3: NK細(xì)胞的培養(yǎng)
1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)、 CD3'CD56 K細(xì)胞的制備取正常志愿者外周血 100ml (得自南京紅十字血站)，分離(Ficoll)得到PBMC。洗細(xì)胞后，用含10%小牛 血清的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至3xl06/ml。置于6孔培養(yǎng)板(2ml/孔)中培養(yǎng)2小時(shí)
(5%C02， 37°C)輕輕吸出懸浮細(xì)胞，即得到PBMC。 CD3—CD56 K細(xì)胞采用磁珠陰 性選擇或流式細(xì)胞儀分選從PBMC中獲得(純度>95%)。
2. NK細(xì)胞的擴(kuò)增及富集
PBMC采用含10%小牛血清的RPMI1640調(diào)整至濃度為1Xl()S/ml,并添加500IU/ml IL-2,然后加入實(shí)施例2中制備的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3-6天，收集細(xì)胞即為擴(kuò)增后的 CD3—CD56 K細(xì)胞。收集細(xì)胞計(jì)數(shù)并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞的表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 l所示，圖中的縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組，其前7條立柱圖表示對(duì)照組 結(jié)果，第8條立柱圖為本發(fā)明的結(jié)果，可見(jiàn)本發(fā)明的擴(kuò)增系統(tǒng)能促進(jìn)細(xì)胞總量明顯增加， 且其中CD3'CD56"NK細(xì)胞的百分含量顯著增加,而對(duì)照組均不能達(dá)到上述擴(kuò)增效果(如 圖2所示)。圖2中的1 ~ 8表示不同的處理組分別為Poly-D-Lysine + IgGl (2-1)， anti-CD137 mAb (2-2)， IL-2 (2-3)， IL-15 (2-4)， anti-CD137 mAb+IL-15(2-5)， immobilized anti-CD 137 mAb + immobilized IL-15 (2-6)， immobilized anti-CD 137 mAb + immobilized IL-15 + IL-2 (2-7)， Poly-D-Lysine + immobilized anti-CD137 mAb + immobilized IL-15 + IL-2 (2-8即本發(fā)明的效果圖)。這表明本發(fā)明的擴(kuò)增系統(tǒng)不僅能促進(jìn)PBMC中的 CD3—CD56 K細(xì)胞增殖，還能提高CD3'CD56^NK細(xì)胞的含量，達(dá)到富集CD3TD56^K 細(xì)胞的效果。
3. 擴(kuò)增高純度的CD3'CD56^細(xì)胞
采用磁珠陰性選擇或流式細(xì)胞儀分選獲得高純度的CD3—CD56 K細(xì)胞，然后采用 實(shí)施例2中制備的培養(yǎng)板擴(kuò)增CD3TD56 K細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加500IU/ml IL-2，養(yǎng)3-6 天，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)并采用流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞的表型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖中的 縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組，其前7條立柱圖表示對(duì)照組結(jié)果，第8條立 柱圖為本發(fā)明的結(jié)果，可見(jiàn)本發(fā)明的擴(kuò)增系統(tǒng)能促進(jìn)CD3—CD56 K細(xì)胞總量明顯增加。 實(shí)施例4: CD3—CD56 K細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)
依照CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity試劑盒說(shuō)明書，取培養(yǎng)6天的NK細(xì)
胞,每組效靶比均設(shè)為10:1，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞胰酶消化，苔盼藍(lán)拒染法計(jì) 數(shù)(活細(xì)胞數(shù)>95%)，調(diào)整細(xì)胞濃度，加入96孔板，每孔50W，每孔50^1，同時(shí)設(shè)效應(yīng) 細(xì)胞和靶細(xì)胞自然釋放孔，培養(yǎng)基自然釋放孔，靶細(xì)胞最大釋放孔，體積校正對(duì)照孔， 每孔體積10(Hil，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，250g離心4min,置于37'C、濃度為5%的(:02中孵育 4h,在反應(yīng)結(jié)束前45min靶細(xì)胞最大釋放孔每孔加入10nl裂解液。反應(yīng)結(jié)束后，每孔吸 取50nl上清與50nl LDH酶反應(yīng)液置于另一新的96孔板，室溫避光反應(yīng)30min,加入反 應(yīng)終止液50W,，酶標(biāo)儀檢測(cè)其OD值。殺傷活性％=(測(cè)定管OD值一耙細(xì)胞自然釋放管 OD值一效應(yīng)細(xì)胞自然釋放管OD值)/ (靶細(xì)胞最大釋放管OD值一靶細(xì)胞自然釋放管 OD值)xl00% (具體細(xì)節(jié)參照美國(guó)Promega公司的cytotox 96 non-radioactive cytotoxicity assay kit說(shuō)明書)。結(jié)果如圖4所示顯示，圖中的縱坐標(biāo)為殺傷率，橫坐標(biāo)為不同反應(yīng)組， 其前7條立柱圖表示對(duì)照組結(jié)果，第8條立柱圖為本發(fā)明的結(jié)果，可見(jiàn)使用本發(fā)明的方 法擴(kuò)增的CD3.CD56*細(xì)胞對(duì)A549的殺傷率明顯高于其他實(shí)驗(yàn)組。
權(quán)利要求
1. 一種CD3-CD56+NK細(xì)胞高效擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的建立方法，其特征在于包括下述步驟(1)取適量的黏附劑Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine用蒸餾水稀釋至10％，加入塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶，孵育5-10min后吸掉黏附劑稀釋液，使黏附劑黏附在塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上；(2)取適量的anti-CD137mAb或CD137L重組蛋白和IL-15同時(shí)加入緩沖液中，稀釋至濃度分別為1-10μg/ml和10-100ng/ml，將anti-CD137mAb和IL-15混合稀釋液加入上述步驟(1)中制備的黏附有Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine的塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中，4℃過(guò)夜，使黏附劑處理過(guò)的塑料培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上包被anti-CD137mAb和IL-15，吸去塑料板的稀釋液，待用；(3)采自健康志愿者的外周血經(jīng)Ficoll分離獲得單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整PBMC的濃度至3×106/ml，加入6孔塑料培養(yǎng)板培養(yǎng)2-3h，吸取懸浮細(xì)胞，上述懸浮細(xì)胞或從其中分選獲得的高純度NK細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基調(diào)整濃度至1×106/ml，加入Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine處理過(guò)并包被anti-CD137mAb和IL-15的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上，并同時(shí)加入IL-2，培養(yǎng)3-6天后，收集細(xì)胞得擴(kuò)增后的CD3-CD56+NK細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞高效擴(kuò)增培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建方法，主要是提供一種由Poly-D-Lysine或Poly-L-Lysine作為黏附劑，黏附anti-CD137 mAb和IL-15構(gòu)成的體外大量擴(kuò)增CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，與現(xiàn)有的用其它方法相比，明顯具有方法簡(jiǎn)單合理，易于推廣，所需原材料少，成本低，制備周期較短，擴(kuò)增效率高和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效率高等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的方法擴(kuò)增的CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞與用其他已知的細(xì)胞因子或細(xì)胞因子組合擴(kuò)增的CD3^-CD56⁺NK細(xì)胞相比，在相同的細(xì)胞濃度下，對(duì)A549的殺傷能力提高一倍以上。
文檔編號(hào)C12N5/08GK101386840SQ20081015507
公開(kāi)日2009年3月18日 申請(qǐng)日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者居頌文, 束永前 申請(qǐng)人:江蘇省人民醫(yī)院