專利名稱：微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮的菌株的制作方法
微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮的菌株技術(shù)領(lǐng)域用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)甾體藥物關(guān)鍵中間體雄甾二烯二酮，屬于生物 工程中發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景1949年，Hench等發(fā)現(xiàn)可的松對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有突出療效，而且證實(shí)可 的松和氫化可的松都屬于腎上腺皮質(zhì)激素，使甾體皮質(zhì)激素成為具有高療效和 高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的藥物。由于激素在動(dòng)物體內(nèi)含量極低，因而不能依靠直接從動(dòng)物 原料提取的方法大量制備。目前多用半合成的方法，即從動(dòng)植物體內(nèi)獲得具有 甾體母核環(huán)戊烷多氫菲的原料，然后通過酶轉(zhuǎn)化和化學(xué)法改造的方法制備。制 備甾體藥物的起始原料甾醇最初源自動(dòng)物，但來源少、成本高而遠(yuǎn)不能滿足人 們的需要。后來人們找到可供合成可的松和避孕藥的植物來源原料，加快了甾 體藥物工業(yè)的發(fā)展。如墨西哥從薯蕷和劍麻生產(chǎn)薯蕷皂甙配基和劍麻皂甙配基， 產(chǎn)量分別占世界第一和第二位。國(guó)際上目前主要依賴墨西哥薯蕷皂甙配基為原 料的西方國(guó)家的甾體生產(chǎn)，但由于受墨西哥政府采取的資源保護(hù)政策影響而使 成本大幅度增加。另外，自然界還有另外豐富的動(dòng)植物資源可供開發(fā)利用，如 洗羊毛廢水或魚油中所含膽固醇，大豆油、菜油、棉籽油的殘?jiān)?，甘蔗渣，?紙廢液中含有的谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等植物甾醇。過去人們?cè)没瘜W(xué)方 法切斷這些甾醇的邊鏈?zhǔn)怪蔀橹苽溏摅w藥物的中間體，但因收率低、成本高 而難以應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。國(guó)外八十年代以來，將微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用于甾體藥物中間體雄甾烯二酮 (androst畫4陽ene-3， 17-dione ， 4AD )和雄甾二烯二酮(androsta-1 ，4-diene畫3， 17國(guó)dione， ADD)的制備取得了突破性進(jìn)展。美國(guó)利用本國(guó)產(chǎn)的大豆農(nóng)副產(chǎn)品一豆甾醇為 原料，經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化獲得甾體藥物制備的關(guān)鍵中間體4AD和ADD，以此合成甾 體藥物，不僅解決了國(guó)內(nèi)薯蕷植物有限而造成的原料瓶頸問題，而且大大地降 低了制造成本并減少了環(huán)境污染，這是甾體藥物領(lǐng)域的一次重大革命。同樣， Upjohn公司以豆甾醇為原料，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化得到的關(guān)鍵中間體來生產(chǎn)皮質(zhì)激素， 其產(chǎn)量約占世界市場(chǎng)的50%。甾體藥物的生產(chǎn)取得突飛猛進(jìn)的發(fā)展，這一革命 性的變化歸功于篩選到了能夠?qū)⒐如薮?、豆甾醇和膽甾醇等?dòng)植物甾醇轉(zhuǎn)化為 關(guān)鍵中間體4AD和ADD的微生物菌種，以及研究開發(fā)了能用于大規(guī)模工業(yè)化 生產(chǎn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)。通過微生物轉(zhuǎn)化得到4AD和ADD，以此合成甾體藥物不僅可 以大大簡(jiǎn)化甾體藥物的生產(chǎn)工藝，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品收率和質(zhì)量，而且能進(jìn)行綜合利用，減少"三廢"污染。從已有的有關(guān)信息和資料分析，可 認(rèn)為世界先進(jìn)國(guó)家目前甾體藥物制備，大多以動(dòng)植物甾醇為起始原料進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到4AD和ADD后，再進(jìn)一步制備。在甾體激素的生產(chǎn)過程中AD (androst-4-ene-3，17-dione，雄甾烯二酮)禾口 ADD (androsta-l，4-diene-3，17-dione，雄甾二烯二酮)是重要的中間體，它們可用 于合成礦質(zhì)皮質(zhì)激素(螺內(nèi)酯)、氫化可的松、雄激素(睪酮、甲基睪酮)、 甲基雄甾烷醇酮、卵泡激素(乙炔雌二醇、乙炔雌二醇甲酯、雌二醇、雌三醇)、 蛋白同化激素、黃體激素等十幾種甾體藥物。本發(fā)明篩選到高效轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄甾二烯二酮的菌株，對(duì)該菌進(jìn)行了鑒 定，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，為微生物轉(zhuǎn)化甾體藥物工業(yè)化提供了基礎(chǔ)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供從自然界中篩選到轉(zhuǎn)化植物甾醇為甾體藥物中間體雄甾二烯二酮(androsta-l,4-diene-3， 17-dione， ADD)和雄甾烯二酮 (androst-4-ene-3，17-dione， 4AD)的菌株，經(jīng)紫外誘變后篩選得到主要生產(chǎn)雄 甾二烯二酮的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與遺傳學(xué)方面的鑒定，將該菌命名為 ^^7/wspST06-95。對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物雄甾二烯二酮進(jìn)行了鑒定。對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了 研究，得到了較高的轉(zhuǎn)化效率。為微生物甾體藥物轉(zhuǎn)化的工業(yè)化提供了有益的 指導(dǎo)。本發(fā)明的技術(shù)方案 一株轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮ADD的菌株， 其分類命名為解淀粉芽孢桿菌(5acz7/wsamy/oz々we/ac&ra.) ST 06-95，巳保藏于 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO: M208135。目的菌株的鑒定采用16S rDNA測(cè)序，與數(shù)據(jù)庫對(duì)照后將該菌命名為解 淀粉芽孢桿菌5"c/〃ws 咖c/e""轉(zhuǎn)化菌株的篩選從自然界采樣，分離進(jìn)行初步篩選，斜面保藏。把培養(yǎng) 好的斜面種子用適量無菌的0.5%吐溫80水溶液洗下，以2%的接種量接種于種子 培養(yǎng)基中，在30'C， 220rmin"的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)40h，然后以10%的接種量接于 發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵轉(zhuǎn)化7d。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析，將轉(zhuǎn)化率高的留下進(jìn)一步實(shí) 驗(yàn)。復(fù)篩得到轉(zhuǎn)化效果最好的菌株，進(jìn)一步經(jīng)紫外誘變篩選得到一株主要生產(chǎn) ADD的菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，確定該菌的分子水平的生物學(xué)地位。對(duì)其進(jìn)行 形態(tài)觀察與生理生化實(shí)驗(yàn)。所述菌株ST 06-95的誘變選育方法，步驟為(1) 轉(zhuǎn)化菌株的篩選從自然界采樣，分離進(jìn)行初步篩選，斜面保藏，以 此野生菌株ST 06作為出發(fā)菌株；(2) 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線與紫外致死率曲線的制定誘變培養(yǎng)菌懸液置于紫 外處照射0、 15s、 30s、 45s、 60s、 75s、 90s，制定致死率曲線，選擇致死率在70%-90%的時(shí)間誘變；(3) 出發(fā)菌株經(jīng)25W紫外燈下30cm處照射45s,誘變后涂布平板培養(yǎng)基 暗室內(nèi)培養(yǎng)48h，適當(dāng)稀釋涂布于以甾醇為唯一碳源的培養(yǎng)基SM1上暗室培養(yǎng) 48h;(4) 從平板中挑取單菌落克隆分別接種到以雄甾烯二酮AD唯一碳源的培 養(yǎng)基SM2、雄甾二烯二酮ADD唯一碳源的培養(yǎng)基SM3兩種固體培養(yǎng)基中，30°C 培養(yǎng)48h;選擇在SM2上長(zhǎng)勢(shì)良好，SM3上不長(zhǎng)或長(zhǎng)勢(shì)緩慢的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā) 酵復(fù)篩，挑選轉(zhuǎn)化率提高及產(chǎn)物中ADD所占比例提高的菌株；所述培養(yǎng)基組成基本培養(yǎng)基SM以g/L計(jì)為CH3COONH4 1.5g， MgS04'7H20 0.2g， K2HP04 0.4g， KH2PO40.8g， FeS04,7H20 5mg， ZnS04-7H20 2mg， MnCl2,4H20 0.5mg;以去離子水定容至1L;培養(yǎng)基SM1:在SM基礎(chǔ)上，以甾醇為唯一碳源，含量為lg/L;甾醇成分重量百分為豆甾醇28.70%、 B-谷甾醇42.26%、菜油甾醇24.48%、其它甾醇 4.56%;培養(yǎng)基SM2:在SM基礎(chǔ)上，以AD為唯一碳源，含量為1 g/L。 培養(yǎng)基SM3:在SM基礎(chǔ)上，以ADD為唯一碳源，含量為1 g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基在SM基礎(chǔ)上，添加10g/L的葡萄糖，lg/L的蛋白胨，5g/L 甾醇，助溶劑吐溫80 4mL/L;發(fā)酵條件初始pH7.0， 30°C， 220r/min發(fā)酵6-7天，接種量12%。 用所述ST06-95菌株發(fā)酵產(chǎn)雄甾二烯二酮的方法，ST06-95在固體培養(yǎng)基以 g/L計(jì)牛肉膏0.3，蛋白胨0.5， NaCl 1.5，瓊脂2.0， pH 7.0，培養(yǎng)48h，然后 轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)牛肉膏0.3，蛋白胨l.O， NaCl 1.5，甘油1.5，酵母 膏0.3， pH 7.0，培養(yǎng)45h，按12。/。接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基以g/L計(jì)植物甾 醇0.8，葡萄糖l，檸檬酸0.2，甘油0.25，檸檬酸亞鐵銨0.05， K2HPO4 0.05， MgSO40.05， (NH4)2HP04 1.0， Tween80 0.3， pH7.0，發(fā)酵6-7天。產(chǎn)物的分離提純?nèi)〕鲆欢ǖ陌l(fā)酵液，用3倍體積的乙酸乙酯萃取，劇烈振蕩2~3min后，3500 rmin"離心10min，取上層有機(jī)相。液質(zhì)聯(lián)用對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定將萃取處理后的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，確定產(chǎn)物 的分子量，確定產(chǎn)物為雄甾烯二酮及雄甾二烯二酮。薄層層析(TCL)定性分析用處理好的樣品點(diǎn)樣于GF254薄板，展開相 為石油醚乙酸乙酯=6 : 4，飽和30min，展層30min后，自然風(fēng)干薄板，噴 涂50X的H2SO4，在10(TC下烘烤20min，然后緩慢降至室溫。紫外比色定量將上述樣品用乙酸乙酯稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，用U3000型紫外 分光光度計(jì)測(cè)其吸光值，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm和298 nm。高效液相色譜定量采用高效液相對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測(cè)定，確定該菌的轉(zhuǎn)化 得率。本發(fā)明的有益效果從自然界采樣，分離進(jìn)行初步篩選，斜面保藏，以此 野生菌株ST 06作為出發(fā)菌株；經(jīng)紫外誘變后篩選得到主要產(chǎn)雄甾烯酮的菌株ST06-95，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)與遺傳學(xué)方面的鑒定，對(duì)該菌的生長(zhǎng)條件進(jìn)行了 摸索，結(jié)果顯示在溫度30'C、 pH7.0、 220r/min培養(yǎng)60h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將 生長(zhǎng)期的菌體以12。/。(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在3(TC、pH 7.0、220 r/min 發(fā)酵6-7d，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，產(chǎn)物ADD含量超過1500mg/L， ADD占 到AD與ADD總和的98%。為微生物轉(zhuǎn)化甾體藥物的工業(yè)化提供了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化所用底物為生產(chǎn)其它藥物的下腳料——混合甾醇(其主要含谷甾醇、 菜油甾醇和豆甾醇等)，或毛紡工業(yè)和油脂工業(yè)的廢水和下腳料，實(shí)現(xiàn)廢棄物 的綜合再利用，成本低廉。產(chǎn)品純度高，轉(zhuǎn)化率高，菌株穩(wěn)定性好，傳代五代 轉(zhuǎn)化率不下降。技術(shù)可移植性強(qiáng)，只要一般的發(fā)酵車間(如抗生素、維生素、 氨基酸生產(chǎn)車間)即可進(jìn)行生產(chǎn)，不需購置特殊設(shè)備和儀器，易于推廣應(yīng)用。 目前國(guó)內(nèi)眾多抗生素發(fā)酵車間因產(chǎn)品年需求或銷路問題，年開機(jī)生產(chǎn)時(shí)間不足 半年，在此間隙生產(chǎn)甾體激素關(guān)鍵性中間體，可提高設(shè)備的利用率，產(chǎn)生良好 的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1菌株Ba"7/ws^. ST 06-95細(xì)胞形態(tài)； 圖2ADD、 AD標(biāo)樣的HPLC圖譜； 圖3發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜； 生物材料樣品保藏一株轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮ADD的菌株，其分類命名為解淀粉 芽孢桿菌(5acz7/ws aw_y/oz々"e/ac/mO ST 06-95，巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏 中心，保藏日期2008年9月22日，保藏編號(hào)為CCTCCNO: M208135。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:有效轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄甾烯二酮和雄甾二烯二酮的菌株篩選在蚌埠一家煉油廠附近采集的土樣，稱10g土樣與100mL帶玻璃珠的三角 瓶中搖勻打散，靜置2h，取上清液過濾，吸取少量清液與以植物甾醇為唯一碳 源的液體培養(yǎng)基(加抑霉菌素)中富集能轉(zhuǎn)化植物甾醇的菌體。取少許富集液 適當(dāng)稀釋涂布于以植物甾醇為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的 單菌落200株斜面保存。培養(yǎng)基組成CH3COONH4l.5g， MgS04'7H20 0.2g， K2HP04 0.4g， KH2P04 0.8g， FeS04.7H20 5mg， ZnS04-7H20 2mg， MnCl2'4H20 0.5mg。底物豆甾醇28.70%、J3-谷甾醇42.26%、菜油甾醇24.48°/。、其它甾醇4.56%。把分離純化后的菌株分批次接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，用薄層層析法初步檢測(cè) 發(fā)酵液中產(chǎn)物ADD、 AD的生成情況，初步篩選20株能有效轉(zhuǎn)化植物甾醇生成 雄甾烯二酮和雄甾二烯二酮的菌株，進(jìn)一步搖瓶發(fā)酵，結(jié)合紫外與可見分光光 度計(jì)和高效液相色譜定量檢測(cè)發(fā)酵液中產(chǎn)物ADD、 AD的含量，選擇主要積累 ADD的菌株，并進(jìn)行傳代穩(wěn)定性驗(yàn)證確定目的菌株。實(shí)施例2:單產(chǎn)雄甾二烯二酮菌株的紫外誘變篩選以實(shí)施例l中得到的菌株為出發(fā)菌株，制定其生長(zhǎng)曲線、紫外致死率曲線， 誘變后稀釋適當(dāng)梯度涂布于以植物甾醇為唯一碳源的固體培養(yǎng)基中暗室48h。從 菌落生長(zhǎng)狀況差異較大的平板中挑取單菌落克隆接種到SM1 (SM+植物甾醇)、 SM2 (SM+AD)、 SM3 (SM+ADD)三種固體培養(yǎng)基中，30。C培養(yǎng)48h，進(jìn)行初 篩。選擇在SM1、 SM2上長(zhǎng)勢(shì)良好，SM3上不長(zhǎng)或長(zhǎng)勢(shì)緩慢的菌落進(jìn)行搖瓶發(fā) 酵復(fù)篩，挑選轉(zhuǎn)化率提高，ADD所占產(chǎn)物比例提高的菌株。菌落經(jīng)鑒定為解淀 粉芽孢桿菌Bacz7/w sp ST06-95。實(shí)施例3:突變菌株的轉(zhuǎn)化能力的研究將實(shí)施例2中篩選得到的菌株ST06-95在固體培養(yǎng)基(牛肉膏0.3，蛋白胨 0.5， NaCl 1.5，瓊月旨2.0， pH 7.0)上培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基(牛肉膏 0.3，蛋白胨l.O， NaC11.5，甘油1.5，酵母膏0.3， pH 7.0)培養(yǎng)45h，按12%接 種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(植物甾醇0.8，葡萄糖1，檸檬酸0.2，甘油0.25，檸 檬酸亞鐵銨0.05， K2HPO4 0.05， MgSO4 0.05， (NH^HPCU 1.0， Tween80 0.3， pH7.0)中發(fā)酵7天。乙酸乙酯抽提發(fā)酵液，用HPLC分析該溶液中AD、 ADD 的含量。如圖3所示，標(biāo)樣AD對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間為9.7min，標(biāo)樣ADD對(duì)應(yīng)的出 峰時(shí)間為ll.lmin，誘變后的菌株發(fā)酵后，發(fā)酵液中的AD含量明顯降低。從植 物甾醇到AD、 AD到ADD的過程均由摩爾生成率來表示。菌株ADD摩爾生成率ADD的產(chǎn)量ADD占AD與ADD總(%)mg/L和的比例野生菌株ST 061478575%ST 06-9522135095%由表中可以看出菌株誘變后轉(zhuǎn)化能力提高了 50%， ADD所占比例提高了 20%。 實(shí)施例4: 5L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)化用實(shí)施例3相同的方法制備在100mL/500mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)的種子按12% 的接種量接種于2L的無菌培養(yǎng)基(pH7.2)的5L發(fā)酵罐中，于1.2wm， 30°C， 300rpm震蕩培養(yǎng)7天，分析產(chǎn)物的生成情況，以摩爾生成率表示。菌株ADD摩爾生成率ADD的產(chǎn)量ADD占AD與ADD總(%)mg/L和的比例野生菌株ST 061580373%ST06-9520152996%從表中可看出ADD在兩產(chǎn)物AD與ADD中所占的比例明顯提高，同時(shí)其 菌株轉(zhuǎn)化能力也同時(shí)提高。
權(quán)利要求
1、一株轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮ADD的菌株，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloiquefaciens.)ST 06-95，巳保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 208135。
2、 權(quán)利要求l所述菌株ST 06-95的誘變選育方法，其特征是(1) 轉(zhuǎn)化菌株的篩選從自然界采樣，分離進(jìn)行初步篩選，斜面保藏，以 此野生菌株ST 06作為出發(fā)菌株；(2) 出發(fā)菌株生長(zhǎng)曲線與紫外致死率曲線的制定誘變培養(yǎng)菌懸液置于紫外處照射0、 15s、 30s、 45s、 60s、 75s、 90s,制定致死率曲線，選擇致死率在 70%-90°/。的時(shí)間誘變；(3) 出發(fā)菌株經(jīng)25W紫外燈下30cm處照射45s，誘變后涂布平板培養(yǎng)基 暗室培養(yǎng)48h，適當(dāng)稀釋涂布于以甾醇為唯一碳源的培養(yǎng)基SMI上暗室培養(yǎng) 48h;(4) 從平板中挑取單菌落克隆分別接種到以雄甾烯二酮AD為唯一碳源的 培養(yǎng)基SM2、雄甾二烯二酮ADD為唯一碳源的培養(yǎng)基SM3兩種固體培養(yǎng)基中， 3(TC培養(yǎng)48h;選擇在SM2上長(zhǎng)勢(shì)良好，SM3上不長(zhǎng)或長(zhǎng)勢(shì)緩慢的菌落進(jìn)行搖 瓶發(fā)酵復(fù)篩，挑選轉(zhuǎn)化率提高及產(chǎn)物中ADD所占比例提高的菌株；所述培養(yǎng)基組成基本培養(yǎng)基SM以g/L計(jì)為CH3COONH4 1.5g， MgS04-7H20 0.2g， K2HP04 0.4g， KH2PO40.8g， FeS04.7H20 5mg， ZnS04'7H20 2mg， MnCl2'4H20 0,5mg;培養(yǎng)基SM1:在SM基礎(chǔ)上，以甾醇為唯一碳源，含量為lg/L;甾醇成分重量百分為豆甾醇28.70%、 fi-谷甾醇42.26%、菜油甾醇24.48%、其它甾醇 4.56%;培養(yǎng)基SM2:在SM基礎(chǔ)上，以AD為唯一碳源，含量為1 g/L。 培養(yǎng)基SM3:在SM基礎(chǔ)上，以ADD為唯一碳源，含量為1 g/L。 發(fā)酵培養(yǎng)基在SM基礎(chǔ)上，添加10g/L的葡萄糖，lg/L的蛋白胨，5 g/L 甾醇，助溶劑吐溫80 4mL/L;發(fā)酵條件初始pH7.0， 30°C， 220r/min發(fā)酵6-7天，接種量12%。
3、 用權(quán)利要求l所述ST06-95菌株發(fā)酵產(chǎn)雄甾二烯二酮的方法，其特征是 ST06-95在固體培養(yǎng)基以g/L計(jì)牛肉膏0.3，蛋白胨0.5， NaCl 1.5，瓊脂2.0， pH7.0，培養(yǎng)48h，然后轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基以g/L計(jì)牛肉膏0.3，蛋白胨1.0， NaCl 1.5，甘油1.5，酵母膏0.3， pH7.0，培養(yǎng)45h，按12%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基 以g/L計(jì)植物甾醇0.8，葡萄糖l，檸檬酸0.2，甘油0.25，檸檬酸亞鐵銨0.05， K2HPO4 0.05， MgSO4 0.05， (NH4)2HP04 1.0， Tween80 0.3， pH7.0，發(fā)酵6-7天。
全文摘要
微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇為單產(chǎn)雄甾二烯二酮的菌株，屬于生物工程中發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明篩選的菌株，分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloiquefaciens.)ST 06-95，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NOM 208135。以從自然界采樣，分離進(jìn)行初步篩選，斜面保藏，以此野生菌株ST 06作為出發(fā)菌株；經(jīng)紫外誘變后篩選得到主要產(chǎn)雄甾烯酮的菌株ST06-95，顯示在溫度30℃、pH 7.0、220r/min培養(yǎng)60h達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將生長(zhǎng)期的菌體以12％(V/V)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃、pH 7.0、220r/min發(fā)酵6-7d，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)，產(chǎn)物ADD含量超過1500mg/l，ADD占到AD與ADD總和的98％。為微生物轉(zhuǎn)化甾體藥物的工業(yè)化提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12R1/07GK101402928SQ200810155130
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日
發(fā)明者周楠迪, 夏海峰, 許正宏, 趙有璽, 鐘傳圣, 饒志明 申請(qǐng)人:江南大學(xué)