專利名稱：一種需鈉弧菌及采用該菌生產(chǎn)瓊膠酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及保藏號(hào)為CGMCC No. 2428的新微生物，保藏日 期為2008年4月1日，分類命名為弧菌(W6n'o)，后鑒定為需鈉 弧菌(J^Wo"^n'ge"s)，本發(fā)明還涉及該菌株生產(chǎn)瓊膠酶的方法。
背景技術(shù)：
瓊膠是某些海藻細(xì)胞壁中的一種水溶性多糖，由瓊脂糖和瓊 脂膠組成。瓊脂膠主要由含硫酸基、甲基等取代基團(tuán)、結(jié)構(gòu)復(fù)雜 的多糖鏈構(gòu)成。瓊脂糖是由(1—3)-0-P -D-半乳糖和 (1—4)-0-3， 6-內(nèi)醚-a -L-半乳糖交替組成的線形鏈狀分子。
瓊膠酶是一種降解瓊脂糖的糖基水解酶，產(chǎn)酶菌多為海洋細(xì) 菌。通過查閱資料、文獻(xiàn)檢索所知，J/teracoccus、 J/femmo"as、 5ac/〃ws 、 Cytop/zaga、 Af/crascz7/a、 Afz'cro6w/6i/^"、尸seMfi oa/teA"owoMas、 /^ew^wowas、 S/re; towycas、 Zo&〃/a等屬中的某些菌株可產(chǎn)生瓊 膠酶，中國(guó)專利200410023656.1報(bào)道了一種從我國(guó)南海海域分離 的生產(chǎn)瓊膠酶的新菌種爿teramo"m sp. nov. SY 37-12 (CCTCC M204009)。
瓊膠酶水解海藻產(chǎn)生的寡糖往往具有抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng) 免疫等性質(zhì)，可作為手性藥物拆分劑應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，推動(dòng)生物催化和生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)業(yè)化工作。海洋中藻類含量極其豐富， 將是未來人類食品有效來源之一，瓊膠酶水解海藻產(chǎn)生的低聚糖 用于生物質(zhì)能源和食品，對(duì)于實(shí)現(xiàn)能源多樣化，緩解能源危機(jī)， 提高已有資源的利用價(jià)值，具有重大的作用，并將對(duì)傳統(tǒng)能源和 食品行業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。此外，瓊膠酶還可作為分子生物學(xué)的報(bào) 告基因和多糖結(jié)構(gòu)測(cè)定的工具酶、海產(chǎn)養(yǎng)殖的酶制劑等?？梢?， 瓊膠酶作為手性藥物拆分劑、生物活性物質(zhì)生產(chǎn)劑、風(fēng)味改進(jìn)劑， 可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品化工、海產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能生產(chǎn)具有高酶活性瓊膠酶的 菌株。
本發(fā)明的菌株是從自然環(huán)境中分離出來的新菌株，以往也沒
有需鈉弧菌(K6n'o""m'egem或簡(jiǎn)寫為生產(chǎn)瓊膠酶 的報(bào)道。制備瓊膠酶的需鈉弧菌(K "^n'egera)分離自東海沉積 物，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌 種保藏號(hào)為CGMCC No. 2428。
經(jīng)形態(tài)鑒定及生物學(xué)特性研究，保藏號(hào)為CGMCC No. 2428的 菌株具有以下特征
(1) 菌落形態(tài)菌落呈圓形，表面光滑，邊緣平整，凸起， 乳白色。
(2) 細(xì)胞形態(tài)革蘭氏陰性菌，細(xì)胞顯微鏡下(Olympus， BX40)呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性，形態(tài)為桿狀居多(2-3 [imx 0,4-0.6 pm)。
(3)生理生化特征好氧生長(zhǎng)，氧化酶、接觸酶陽性，吲哚 反應(yīng)陰性，不水解淀粉、酪素、纖維素，能利用酵母膏、葡萄糖、 阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山梨醇，對(duì) 慶大霉素、氯霉素敏感。
對(duì)保藏號(hào)為CGMCC No. 2428的菌株的16S rRNA基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定，發(fā)現(xiàn)16S rRNA基因部分片斷長(zhǎng)度為532 bp， 與已知需鈉弧菌(K"Wr/"em)的16S rRNA基因序列相似性為 99.4% 。菌株K ""Wegmy CGMCC No. 2428的16S rRNA序列具 體可見序列表。
因lt匕，參照《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》第二 版第二巻的內(nèi)容，根據(jù)菌株的限制因子特點(diǎn)、形態(tài)特征和生理生 化指標(biāo)，結(jié)合16SrRNA基因序列相似性，鑒定菌株CGMCC No. 2428為需鈉弧菌(K "aWegera )。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種采用CGMCC No. 2428生產(chǎn) 瓊膠酶的方法，包括以下步驟
(1) 將需鈉弧菌(CGMCC No. 2428)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中， 20 — 37t:培養(yǎng)5-10小時(shí)；
(2) 往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無菌瓊脂糖誘導(dǎo)培養(yǎng)15-25小時(shí)；
(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)高速離心，上清液經(jīng)過微孔濾膜后，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至干，即得瓊膠酶。
上述方法步驟(1)中，需鈉弧菌可接種于pH值為6.5-8.5 (優(yōu)選7.5)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20-37。C (優(yōu)選30-35"C)溫度下培養(yǎng) 5-10小時(shí)(優(yōu)選7小時(shí))，使菌株K CGMCC No. 2428
達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下氯化鈉5-10g/L， 水合氯化鎂2-6g/L，氯化鉀0.5-2.5 g/L，胰蛋白胨5-20 g/L，其余 為水，pH為6.5-8.5 (優(yōu)選7.5)。
上述方法步驟(2)中，需加入無菌瓊脂糖誘導(dǎo)菌株表達(dá)瓊脂 酶。往培養(yǎng)基中加入加入無菌瓊脂糖至終濃度0.05-5 g/L (優(yōu)選為 lg/L)， 150-250 (優(yōu)選180) rpm培養(yǎng)3-6 h后，轉(zhuǎn)速下調(diào)至50-100 rpm (優(yōu)選80rpm)再培養(yǎng)15-25 h (優(yōu)選18 h)，得到需鈉弧菌(K "afr/egera)的富集培養(yǎng)液。
上述方法步驟(3)中，將步驟(2)中的富集培養(yǎng)液高速離 心，例如5000-10000 rpm離心5-10 min，經(jīng)離心獲得的上清液中 含有瓊膠酶。上清液通過0.22pm孔徑的微孔濾膜后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至 干，即為KCGMCC No. 2428瓊膠酶，4"低溫保藏備 用。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的K CGMCC No. 2428生長(zhǎng)周期短，7 h
就達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該菌能誘導(dǎo)表達(dá)瓊膠酶，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為17-22 h。通過簡(jiǎn)單的分離方法，可從培養(yǎng)液中收集高活性的瓊膠酶。本 發(fā)明提供的瓊膠酶制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，大量快速，適合運(yùn) 用于工業(yè)生產(chǎn)或醫(yī)藥領(lǐng)域，以生產(chǎn)瓊膠低聚糖廣泛應(yīng)用于生物醫(yī) 藥、食品化工、海產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。


圖1為K "Wr/egmy CGMCC No. 2428生長(zhǎng)曲線圖； 圖2為不同瓊脂糖誘導(dǎo)條件下K m7W"my CGMCC No. 2428 瓊膠酶酶活力曲線圖3為不同培養(yǎng)時(shí)間條件下K CGMCC No. 2428瓊
膠酶酶活力曲線圖
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:需鈉弧菌CGMCC No. 2428的
分離篩選
將采自我國(guó)東海沉積物樣品2 g放在50 ml含玻璃珠的過濾除 菌陳海水中，振蕩打散，取上清液過濾除菌陳海水梯度稀釋后涂 布篩選培養(yǎng)基平板，37。C培養(yǎng)7天左右，觀察結(jié)果。菌落周圍形 成凹陷的菌株挑選保藏，經(jīng)盧戈氏碘液鑒定，菌落周圍形成透明 圈者為產(chǎn)酶菌株。將篩選獲得的菌株接種液體篩選培養(yǎng)基，測(cè)定 發(fā)酵液的瓊膠酶活力，篩選出一株產(chǎn)瓊膠酶菌株，保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No. 2428。菌株篩選培養(yǎng)基(g/L):氯化鈉19.45，氯化鎂8,8， 氯化鈣1.8，氯化鉀0.55，碳酸氫鈉0.16，檸檬酸鐵0.1，溴化 鉀0.08，氯化鍶0.034，硼酸0.022，磷酸氫鈉0.008，硅酸鈉 0.004，氟化鈉0.0024，硝酸銨0.0016，酵母抽提物5.0，蛋白胨 1.0， pH7.4，其余為水。實(shí)施例2:需鈉弧菌(K "a/n'ege/w) CGMCC No. 2428的形態(tài) 鑒定及生物學(xué)特性
K "Wn'egera CGMCC No. 2428接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(DSMZ medium 308)，培養(yǎng)基組成如下(g/L):氯化鈉5.0，水合氯化鎂4.0， 氯化鉀1.0，胰蛋白胨10.0， pH7.5，其余為水。制備固體培養(yǎng)基 可再加入20 g/L的瓊脂。12rC滅菌30分鐘。接種培養(yǎng)后，經(jīng)鑒 定，該菌具有以下特征(1)菌落形態(tài)菌落呈圓形，表面光滑，
邊緣平整，凸起，乳白色。(2)細(xì)胞形態(tài)革蘭氏陰性菌，細(xì)胞
顯微鏡下(Olympus, BX40)呈現(xiàn)運(yùn)動(dòng)性，形態(tài)為桿狀居多(2-3 pm x 0.4-0.6 pm)。 (3)生理生化特征好氧生長(zhǎng)，氧化酶、接觸酶陽 性，H引哚反應(yīng)陰性，不水解淀粉、酪素、纖維素，能利用酵母膏、 葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、麥芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山 梨醇，對(duì)慶大霉素、氯霉素敏感。
實(shí)施例3:需鈉弧菌(KCGMCC No. 2428的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定
K ""/;^取ra CGMCC No. 2428接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，從斜面 中直接挑取一環(huán)菌體，加入400 無菌水混勻，IO(TC水浴5分鐘， 12000rpm離心2分鐘，上清直接用于PCR。擴(kuò)增16SrRNA基因 的一對(duì)通用引物如下
正向引物5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3';
反向引物5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3';上述引物分別對(duì)應(yīng)大腸桿菌的16SrRNA基因的8—27和1510 —1492位堿基。PCR反應(yīng)體系(50juL)為10xbuffer 5 jliL， 10 mM dNTPs 1 )iL， 4 mM引物各1 (iL， ddH20 42 ^L， Taq酶0.5 ^L， 模板DNA0.5pL。 PCR反應(yīng)條件為94。C變性45s; 55。C退火45 s; 72t:延伸90 s， 30個(gè)循環(huán)后72。C延伸10 min。 PCR產(chǎn)物純化與 序列測(cè)定由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。完成測(cè)定的 16S rRNA基因部分片斷長(zhǎng)度為532 bp，與菌株K ATCC 14048T的相關(guān)序列相似性為99.4% 。菌株K m^/egms CGMCC No. 2428的16S rRNA序列具體可見序列表。
因lt匕，參照、《Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology》第二 版第二巻的內(nèi)容，根據(jù)菌株的限制因子特點(diǎn)、形態(tài)特征和生理生 化指標(biāo)，結(jié)合16SrRNA基因序列相似性，鑒定菌株CGMCC No. 2428為需鈉弧菌(K朋^7'egem)。
實(shí)施例4:需鈉弧菌(K"afr7'egera) CGMCC No. 2428瓊膠酶
發(fā)酵生產(chǎn)條件
K "Wn'ege似CGMCC No. 2428接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(DSMZ medium 308)，其生長(zhǎng)范圍與最佳生長(zhǎng)條件如下NaCl濃度范圍為 1-100 g/L，最適為5-10g/L;生長(zhǎng)pH值范圍為6.5 — 8.5，最適為 7.5;生長(zhǎng)溫度范圍為20 —37°C，最適為30 — 35。C。 K CGMCC No. 2428接種于DSMZ medium 308培養(yǎng)基35。C培養(yǎng)7小 時(shí)可至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(圖1)。瓊脂糖是瓊膠酶的誘導(dǎo)劑。將不同濃度的無菌瓊脂糖(0、 0.05、
0.1、 0.2、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0g/L)加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液中， 180rpm培養(yǎng)4h后，轉(zhuǎn)速下調(diào)至80 rpm繼續(xù)培養(yǎng)24 h。還原糖濃 度測(cè)定根據(jù)3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法，具體描述如下培 養(yǎng)液經(jīng)5000 rpm離心10min，直接取200 |il上清液加入等體積的 反應(yīng)底物溶液(瓊脂糖2.0g/L、氯化鈉5.0g/L、 Tris-HCl 50mM， pH7.5)，溶液充分混勻后55。C反應(yīng)30min，再加入300 fil DNS溶 液沸水浴顯色7 min。溶液2000 rpm離心5 min后取上清500 |il 稀釋至2.5ml，靜至lmin后測(cè)定光吸收值(OD54。)。定義酶活力 單位(U)為每分鐘釋放1 pmol還原糖所需要的酶量。K"a/Wege似 CGMCCNo. 2428在不同瓊脂糖誘導(dǎo)條件下的酶活力大小見圖2， 瓊脂糖濃度為5 g/L條件下，K "Wn'egem CGMCC No. 2428瓊膠酶 產(chǎn)量?jī)?yōu)于其他試驗(yàn)條件；瓊脂糖濃度為lg/L條件下，K"Wr/egew CGMCCNo. 2428瓊膠酶產(chǎn)量可達(dá)10.3 U/ml。
將無菌瓊脂糖加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液中，至瓊脂糖濃度為 1 g/L和5 g/L， 180 rpm培養(yǎng)4 h后，轉(zhuǎn)速下調(diào)至80 rpm繼續(xù)培養(yǎng)。 每隔4-8h取樣，測(cè)定上清液中瓊膠酶酶活大小(圖3)。瓊脂糖誘 導(dǎo)表達(dá)17-22 h， K CGMCC No. 2428瓊膠酶產(chǎn)量即可達(dá)
到最大值，為17-20 U/ml。
實(shí)施例5:需鈉弧菌冊(cè))CGMCC No. 2428瓊
膠酶制備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K waWege似CGMCC No. 2428菌液中加入無菌 瓊脂糖至終濃度1 g/L， 180 rpm培養(yǎng)4 h后，轉(zhuǎn)速下調(diào)至80 rpm 培養(yǎng)18 h。溶液5000 rpm離心10 min，上清液通過0.22 ^rni孔徑 的微孔濾膜后，40-45°。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，即為CGMCC No. 2428瓊膠酶，4。C低溫保藏備用。使用過程中，采用 Tris-HCl-NaCl溶液(氯化鈉5.0 g/L、 Tris-HCl 50 mM， pH=7.5) 溶解，加至瓊脂糖溶液混勻后55i:溫浴12-24 h，即可產(chǎn)生瓊膠低 聚糖。序列表
〈110>國(guó)家海洋局第二海洋研究所
<120〉 一種需鈉弧菌及采用該菌生產(chǎn)瓊膠酶的方法
〈160〉 1
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210〉 Seq ID No. 1
〈211〉 532
〈212〉 腿
〈213〉 附Wo "afn'egms 〈400〉 Seq ID No. 1
CCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATGATGCCTACGGGCC60
AAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGCCTAGGTGGGATTAGCTAGTTG120
GTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCAC180
ACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAA240
TGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGC300
ACTTTCAGTCGTGAGGAAGGTAGTGGGGTTAATAGCTGCTTTATTTGACGTTAGCGACAG360
AAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAA420
TCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCATGCAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAAGCCCG■
GGGCTCAACCTCGGAATAGCATTTGAAACTGGCAGACTAGAGTACTGTAGAG540
權(quán)利要求
1、一種需鈉弧菌Vibrio natriegens)，菌種保藏號(hào)為CGMCCNo.2428。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的需鈉弧菌(K/Z^io /7S^^'e^/^)， 其特征在于所述需鈉弧菌(h'^^'o朋triege77S)的16S rRNA 序列如SeqIDNO.l所示。
3、 一種利用權(quán)利要求1所述的需鈉弧菌(Kz'^7'o朋^i塔e/w) 制備瓊膠酶的方法，包括如下步驟(1) 將需鈉弧菌(CGMCCNo.2428)接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中， 20 — 37'C培養(yǎng)5-10小時(shí)；(2) 往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無菌瓊脂糖誘導(dǎo)培養(yǎng)15-25小時(shí)；(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)高速離心，上清液經(jīng)過微孔濾膜后，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至干，即得瓊膠酶。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1) 中的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下成分氯化鈉5-10g/L，水合氯化鎂2-6 g/L，氯化鉀0.5-2.5 g/L，胰蛋白胨5-20 g/L，其余為水，pH為 6.5-8.5。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下成分氯化鈉5g/L，水合氯化鎂4g/L， 氯化鉀lg/L，胰蛋白胨10g/L，其余為水，pH為7.5。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中的培養(yǎng)溫度為30-35°C。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(2) 中往發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無菌瓊脂糖至終濃度0.05-5 g/L 。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟(2) 的過程為培養(yǎng)基中加入無菌瓊脂糖至終濃度0.05-5 g/L， 150-250 rpm培養(yǎng)3-6h后，轉(zhuǎn)速下調(diào)至50-100 rpm，再培養(yǎng)15-2511，得到 需鈉弧菌(KwaWegew)的富集培養(yǎng)液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3) 中的離心速度為5000-10000 rpm。
10、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟(3) 中的微孔濾膜孔徑為0.22 ,。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種能生產(chǎn)瓊膠酶的新型微生物需鈉弧菌(Vibrionatriegens)CGMCC No.2428以及該菌生產(chǎn)瓊膠酶的方法。該菌分離自東海沉積物，屬于革蘭氏陰性菌，好氧生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)NaCl濃度為5-10g/L，最適生長(zhǎng)pH值為7.5，能利用酵母膏、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等多種糖類作為能源與碳源生長(zhǎng)，經(jīng)鑒定該菌屬于Vibrio natriegens。V.natriegens CGMCC No.2428生長(zhǎng)周期短，7h就達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，該菌能誘導(dǎo)表達(dá)瓊膠酶，通過簡(jiǎn)單的分離方法，可從培養(yǎng)液中收集瓊膠酶。本發(fā)明提供的瓊膠酶制備工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，大量快速，可運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)或醫(yī)藥領(lǐng)域，以產(chǎn)生瓊膠低聚糖。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101451113SQ20081012199
公開日2009年6月10日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者敏 吳, 楊俊毅, 王春生, 許學(xué)偉 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第二海洋研究所