專利名稱：以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以睪丸激素受體3(Testicular orphan nuclear receptor-3, TR3)為靶點(diǎn)的化合物(包 括激動(dòng)劑和拮抗劑)篩選方法，其中涉及到一種應(yīng)用于該篩選方法的檢測TR3轉(zhuǎn)錄激活水平 的報(bào)告質(zhì)粒(pNurRE-Luc)，此外，還涉及利用所述方法篩選獲得的抗腫瘤和調(diào)節(jié)血糖化合物。
背景技術(shù)：
細(xì)胞核受體組成了一個(gè)受體超家族(nuclear receptor superfamily)，包括類固醇激素受體 (steroid receptor)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone rec印tor, TR)、維生素D3受體(vitamin D receptor, VDR)、視黃酸受體(retinoic acid receptor, RAR)以及近幾年發(fā)現(xiàn)的數(shù)目眾多的孤兒受 體(orphan receptor)。這些受體的共同特征是都具有在序列上高度保守的、由兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組 成的DNA結(jié)合區(qū)及一個(gè)配體結(jié)合區(qū)。它們能夠與特定DNA上的應(yīng)答元件結(jié)合，調(diào)控特定基 因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而在細(xì)胞的生長、分化和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用 (Mangelsdorf D J , Thummel C ， Beato M ， et al . The nuclear receptor superfamily: the second decade [J]. Ce〃， 1995, 83 (6): 835-839)。
孤兒受體是指一類目前尚未發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)配體的核受體?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的孤兒受體已達(dá)百種以 上，它們能夠相互作用或者與其它轉(zhuǎn)錄因子相互作用，以調(diào)控不同基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 TR3(Testicular orphan皿clear receptor-3)也稱Nur77、 NGFI-B和NAK1 ，也是一種孤兒受體，它是 由立早基因(immediate early gene)NR4Al編碼的蛋白，屬于類固醇/甲狀腺受體超家族。TR3 家族包括三個(gè)成員，分別為TR3、 Nurrl禾BNor-l，它們可以被血清及各種生長因子如表皮生 長因子(EGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血小板生長因子(PDGF)或 者佛波酯等誘導(dǎo)表達(dá)，具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，參與了細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育和凋亡過程。
1985年，Lau等人(Hazel T. Q Nathans D. & Lau L. F.. A gene inducible by serum growth factors encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor superfamily.尸roc. iVl^/. 爿cad Sd. t/.S.A, 1988， 85: 8444-8448)發(fā)現(xiàn)處于靜息狀態(tài)的小鼠細(xì)胞經(jīng)血清和生長因子處理 后，在幾分鐘內(nèi)有一批基因被誘導(dǎo)表達(dá)。他們?cè)谟蛇@些立早基因構(gòu)成的cDNA文庫中克隆鑒定 出nur77基因。1989年，Chang等(Chang C., Kokontis J.， Liao S.S. & Chang Y. Isolation and
characterization of human TR3 receptor: a member of steroid receptor superfamily. J! <Stera/t/ 歷oc&肌，1989,34:391-395)用針對(duì)類固醇激素受體超家族成員共有DNA結(jié)合序列為探針，在 人前列腺細(xì)胞的cDNA文庫中分離到一個(gè)新的基因并命名為TR3。同年，Matson等(WatsonM.A. & Milbrandt J. The NGFI-B gene, a transcriptionally inducible member of the steroid receptor gene superfamily:genomic structure and expression in rat brain after seizure induction. Mo/. Ce// 5/o/.， 1989,9:4213-4219)在大鼠中發(fā)現(xiàn)了nur77的另一個(gè)同源物NGFI-B。
TR3家族成員在結(jié)構(gòu)上具有核受體的典型特征，包括N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(N-terminal transactivation domain)、中部DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, DBD)和C末端配體結(jié)合 結(jié)豐勾域(ligand binding domain, LBD) (Eells JB, Witta J, Otridge JB， et al. Structure and function of the nur77 receptor subfamily, a unique class of hormone nuclear receptors [J].Cewf Ge"ow/cs， 2000， 1(2): 135-152.)。氨基末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)含有AF-l (activation function 1)功能激活域，其作用與啟動(dòng) 子的特殊序列相關(guān)；DNA結(jié)合區(qū)為高度保守的區(qū)域，其中含有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger domain)和C端延長區(qū)(carboxy-terminal extension, CTE)，可與耙基因啟動(dòng)子內(nèi)的特異性DNA 序列(即激素應(yīng)答元件)結(jié)合；配體結(jié)合區(qū)包含一個(gè)核定位信號(hào)(nuclear localization signal,NLS) 序列和三個(gè)核輸出信號(hào)(nuclearexportsignal,NES)序列，決定了TR3的二聚化、與熱休克蛋 白的結(jié)合、轉(zhuǎn)錄激活能力以及亞細(xì)胞定位等。序列分析表明，TR3蛋白的DNA結(jié)合區(qū)和配體 結(jié)合區(qū)與類固醇激素受體超家族成員同源，其配體結(jié)合區(qū)氨基酸序列與雌激素受體有20%的 同源性，而其DNA結(jié)合區(qū)則有55n/。的氨基酸序列與巳知類固醇受體同源。此外，TR3家族成 員具有高度同源的DBD和LBD的氨基酸序列，但N-末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的氨基酸同源性相對(duì) 較〈氐(Davis I.J， Hazel T.Q Chen R.H, " a/. Functional domains and phosphorylation of the orphan receptor Nur77 [J]. Mo/五mfocn"o/, 1993, 7(8): 953-964)。
許多核受體能夠識(shí)別位于靶基因啟動(dòng)子內(nèi)的特異性DNA序列，這些特異性DNA序列稱為 激素應(yīng)答元件。TR3的DNA結(jié)合區(qū)能介導(dǎo)其與應(yīng)答元件的結(jié)合，從而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄。 TR3能夠以單體形式結(jié)合到其應(yīng)答元件(Nur77 binding response element, NBRE)上，NBRE 的序列為AAAGGTCA (Wilson T. E.,Fahmer T. J.， Johnston M. & Milbrandt J. Identification of the DNA binding site for NGFI-B by genetic selection in yeast. 1991, 252: 1296-1300)。
TR3還能夠以同源二聚體形式結(jié)合NBRE相關(guān)序列的反向重復(fù)序列 -TGATATTTnmmnnAAATGCCA (n代表任意堿基)上，這個(gè)序列稱為Nur77應(yīng)答元件(nur77 response element, NurRE)。此外，TR3還能與其它蛋白形成異源二聚體結(jié)合到應(yīng)答元件上， 激活基因的轉(zhuǎn)錄。TR3通過對(duì)下游基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，可以實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)血糖，抗腫瘤等方面的生物學(xué)功能。最 新研究成果表明，TR3及其另兩個(gè)家族成員Nurrl和Nor-l在糖異生過程中具有關(guān)鍵作用。外源 表達(dá)TR3能夠上調(diào)糖異生途徑中幾個(gè)重要基因的表達(dá)，包括葡萄糖-6-磷酸酶
(glucose-6-phosphatase, G6PC),果糖1,6-二磷酸酯酶1 (fructose-1,6國bisphosphatase l,FBPl ), 果糖l,6-二磷酸酯酶2 (fructose-1,6-bisphosphatase 2， FBP2)，以及烯醇化酶3 (enolase3, EN03)，從而提高禾幾體血糖tK平(Pei， L. et al. NR4A orphan nuclear receptors are transcriptional regulatorsofhepaticglucosemetabolism. A^.A/ed 2006， 12:1048-1055)。此外，也有研究表明 TR3在激動(dòng)劑或配體作用下可以通過受體依賴途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TR3能特異性結(jié)合在 E2F1 (transcriptionfactor 1)基因的啟動(dòng)子上，TPA(12-0-tetradecanoylphorbol-13-acetate)處理 后TR3上調(diào)了對(duì)E2F1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并誘導(dǎo)了前列腺癌細(xì)胞LNcP的凋亡(Xiaomin Mu and Chawnshang Chang. TR3 Orphan Nuclear Receptor Mediates Apoptosis through Up-regulating E2F1 in Human Prostate Cancer LNCaP Cells. J5.C" 2003， 278:42840-42845); Stephen等人
(Sung Dae Cho, Kyungsil Yoon, Sudhakar Chintharlapalli, Maen Abdelrahim, Ping Lei, Stanley Hamilton, Shaheen Khan , Shashi K. Ramaiah， and Stephen Safe. Nur77 agonists induce proapoptotic genes and responses in colon cancer cells through nuclear receptor-dependent and nuclear receptor-independent pathways. Ca"cw Wes. 2007,67(2):674-683)研究發(fā)現(xiàn)用命名為 C-DIM的化合物及其結(jié)構(gòu)類似物處理人結(jié)腸腺癌細(xì)胞RKO后，TR3的蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)錄激活水 平都得到顯著提高，抑制了RKO細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，建立以TR3為靶點(diǎn)的系 統(tǒng),檢測系列化合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響，篩選所得的激動(dòng)劑或拮抗劑有可能是抗腫瘤， 調(diào)節(jié)血糖的潛在藥物。
在真核細(xì)胞中檢測核受體對(duì)下游基因表達(dá)的調(diào)控，可以采用熒光素酶(firefly luciferase) 報(bào)告體系。熒光酶基因(luc)是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，1986 年螢火蟲熒光素酶基因被用以測定基因表達(dá)的報(bào)告基因，并廣泛使用。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞和組 織中無任何內(nèi)源性的熒光素酶活力，因此它可以作為特異的、非常靈敏的遺傳報(bào)告基因。在 熒光素酶的催化下，熒光素被氧化并釋放一個(gè)光子，通過熒光分光光度計(jì)及液閃計(jì)數(shù)儀能夠 對(duì)熒光作定量分析。熒光素酶基因作為報(bào)告基因，具有檢測速度快、靈敏度高(比其它報(bào)告 基因高30-1000倍)、費(fèi)用低、不需使用放射性同位素等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛地應(yīng)用在生物學(xué)和生 物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。本發(fā)明所述的篩選系統(tǒng)中將孤兒受體TR3的應(yīng)答元件NurRE序列插入熒光 素酶報(bào)告基因的啟動(dòng)子上游，由此檢測的熒光素酶表達(dá)水平即反映了TR3應(yīng)答元件(NurRE)的 轉(zhuǎn)錄激活水平。該篩選系統(tǒng)特異性地以TR3為靶點(diǎn)，并具備反應(yīng)靈敏，無須瞬時(shí)轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)，
可以實(shí)現(xiàn)高通量的以TR3為靶點(diǎn)初步篩選和評(píng)價(jià)抗腫瘤及調(diào)節(jié)血糖等化合物的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法中報(bào)告質(zhì)粒 pNurRE-Luc的構(gòu)建方法以及細(xì)胞株的篩選方法，篩選出的化合物可應(yīng)用于血糖調(diào)節(jié)和抗腫瘤 藥物的相關(guān)研究。
本發(fā)明所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法包括以下步驟
1) 構(gòu)建一種含TR3應(yīng)答元件(Nur77 response element, NurRE)及熒光素酶(luciferase, Luc) 報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc;
2) 篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株；
3) 篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。
所述構(gòu)建一種含TR3應(yīng)答元件及熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的具體步驟 如下
1) 合成具備酶切識(shí)別位點(diǎn)的含TR3應(yīng)答元件序列的片段；
2) 將含TR3應(yīng)答元件序列的片段克隆至質(zhì)粒pGL3-promoter的熒光素酶基因前的多克隆 位點(diǎn)內(nèi)，獲得質(zhì)粒pGL3-NurRE;
3) 以質(zhì)粒pGL3-NurRE為模板，PCR擴(kuò)增出含fl復(fù)制起始位點(diǎn)(fl復(fù)制起始位點(diǎn)，簡稱 為fl W7')、 TR3應(yīng)答元件、SV40啟動(dòng)子(SV40 promoter)、熒光素酶報(bào)告基因(luc gene)和終止 子(polyA)的片段，并將該片段插入到質(zhì)粒pEGFP-C3內(nèi)，獲得含TR3應(yīng)答元件及報(bào)告基因的 報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc。
在步驟l)中，含TR3應(yīng)答元件序列的片段序列如下3,。
在步驟3)中，PCR擴(kuò)增所用的引物對(duì)的堿基序列如下
正向引物5，隱GATCGTGCACGCCCAAGCTACCATGATAAG - 3'(下劃線標(biāo)注的序列為限 制性內(nèi)切酶々^Z I的酶切位點(diǎn))；
反向引物5，陽CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC - 3，(下劃線標(biāo)注的序列為限 制性內(nèi)切酶^7a丄I的酶切位點(diǎn))。
報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的核心序列為熒光素酶(Luc)報(bào)告基因、綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因、新霉素抗性(NeoR, Neomycin-resistance)基因和TR3應(yīng)答元件
序列組成的重組DNA序列，或者通過所述含TR3應(yīng)答元件序列的片段序列中的核苷酸的缺 失、取代或增加而得到的核苷酸序列。上述報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的核心序列的連接順序?yàn)?TR3應(yīng)答元件序列一熒光素酶報(bào)告基因一綠色熒光蛋白基因一新霉素抗性基因，其中新霉素 抗性基因可應(yīng)用于轉(zhuǎn)染后的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選，綠色熒光蛋白基因可作為檢驗(yàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 內(nèi)參以平衡轉(zhuǎn)染效率。報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc中，熒光素酶基因表達(dá)受TR3應(yīng)答元件調(diào)控， 因此，熒光素酶基因的表達(dá)水平即反映了 TR3應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄激活水平。 所述篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株的具體步驟如下
1) 以脂質(zhì)體方法將報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞；
2) 通過檢測表皮生長因子(EGF)對(duì)細(xì)胞克隆株的熒光素酶表達(dá)影響程度，在含終濃度 200 500 jag/ml新霉素(geneticin G418)的抗性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的
細(xì)胞克隆株。
所述細(xì)胞克隆株包括人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、鼠肝AML-12細(xì)胞，以及人 胃腺癌BGC-823細(xì)胞，肝癌HepG2細(xì)胞等。
所述篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物可采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的方法， 包括以下步驟
(1) 將細(xì)胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；
(2) 以磷酸鈣沉淀法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc;
(3) 去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；
(4) 處理細(xì)胞后，去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；
(5) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平 的化合物。
所述篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物還可采用應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc
的細(xì)胞株的方法，包括以下步驟
(1) 將細(xì)胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；
(2) 去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；
(3) 處理細(xì)胞后，去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；
(4) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平 的化合物。
本發(fā)明所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，構(gòu)建了一種應(yīng)用于檢測TR3 轉(zhuǎn)錄激活水平的報(bào)告質(zhì)粒(pNurRE-Luc)，并包含細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性分析等內(nèi)容。
運(yùn)用該篩選方法可以檢測不同化合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響，以及不同濃度的化合物對(duì) TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響，從而篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)。 由于TR3可以通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)對(duì)血糖調(diào)節(jié)、抗腫瘤方面的生物學(xué)功能，因此該 化合物篩選方法可用于篩選及評(píng)價(jià)以睪丸激素受體3(TR3)為耙點(diǎn)的調(diào)節(jié)血糖化合物，以及以 睪丸激素受體3(TR3)為靶點(diǎn)的抗腫瘤化合物，不僅特異性好，反應(yīng)靈敏，還具有簡便、快速、 高通量、高效及評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc結(jié)構(gòu)圖。在圖1中，(PCMV-IE:巨細(xì)胞病毒即早期啟動(dòng)子， 是一種常用病毒來源的啟動(dòng)子；fl on': fl復(fù)制起始位點(diǎn)；SV40promoter: SV40啟動(dòng)子；SV40 polyA:來自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信號(hào)；Kanr/Neor:新霉素抗性基因；Luciferase gene:熒光素酶報(bào)告基因；EGFP:綠色熒光蛋白基因；酶切位點(diǎn)5am/H， I4pa/I)。
圖2為報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc酶切鑒定圖。在圖2中，M: GeneRulerTMDNALader Mix; 1: v4; a丄I單酶切質(zhì)粒pNurRE-Luc; 2: Sac I單酶切質(zhì)粒pNurRE-Luc;圖右側(cè)數(shù)字代表其所 對(duì)應(yīng)DNA片段的大小，單位為bp，從上到下依次代表IO， 000bp， 8000bp， 6000bp， 5000bp， 4000bp， 3500bp， 3000bp。
圖3為激動(dòng)劑對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響。在圖3中，橫坐標(biāo)為不同實(shí)驗(yàn)組中激動(dòng)劑的 濃度(agonist) /M，縱坐標(biāo)為相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性(RLU); BGC LUC指BGC細(xì)胞中進(jìn)行的熒光 素酶報(bào)告基因表達(dá)水平檢測實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)也稱為螢火蟲反應(yīng)。
圖4為系列化合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響。在圖4中，橫坐標(biāo)為系列化合物的種類， 每個(gè)化合物有兩個(gè)濃度，口為10—7M，國為10—6M，單位為M;縱坐標(biāo)為相對(duì)轉(zhuǎn)錄活性(RLU); BGC LUC指BGC細(xì)胞中進(jìn)行的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)水平檢測實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)也稱為螢火蟲 反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例1:構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc (a)構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc
(1) 合成兩端分別帶@ I和5g/ II酶切識(shí)別位點(diǎn)的含NurRE序列的片段，合成的NurRE 片段的堿基序列如下
(2) 將上述含NurRE序列的片段克隆至質(zhì)粒pGL3-promoter熒光素酶基因前的多克隆位 點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGL3-NurRE，具體步驟為
/Qw I和SgZ II雙酶切載體質(zhì)粒pGL3-promoter，純化回收所得酶切片段，按1:3比例與 含NurRE序列的片段用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5，篩選重組質(zhì)粒 pGL3-NurRE。
(3)以上述重組質(zhì)粒pGL3-NurRE為模板，PCR克隆出含fl復(fù)制起始位點(diǎn)(簡稱為fl on')、 TR3應(yīng)答元件(NurRE)、 SV40啟動(dòng)子(SV40 promoter)、熒光素酶報(bào)告基因(luc gene)和終止子 (polyA)的總長約3.5 Kb的片段，PCR產(chǎn)物膠回收后用^ a￡ I酶切，同時(shí)用^; a丄I酶切載體 質(zhì)粒pEGFP-C3，獲得約4.7Kb的載體片段。將上述3.5 Kb以及4.7 Kb的酶切片段兩者純化 回收后，以1:8的比例用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a，篩選報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc (參見圖1所示的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc結(jié)構(gòu)圖)。
PCR擴(kuò)增引物對(duì)的堿基序列如下
正向引物5 ， -GATCGTGC ACGCCC AAGCTACC ATG ATAAG-3 ，(下劃線標(biāo)注的序歹ij為限 制性內(nèi)切酶々"丄I的酶切位點(diǎn))；
反向引物5，-CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC-3，(下戈j線標(biāo)注的序列為限制 性內(nèi)切酶^ a丄/的酶切位點(diǎn))。
(b)酶切鑒定報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc (參見圖2所示的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc酶切鑒定圖)。
(1) /單酶切質(zhì)粒pNurRE-Luc，得到總長約8.2 Kb的酶切片段；
(2) 々7"丄I單酶切酶切質(zhì)粒pNurRE-Luc，得到兩條酶切片段分別約為4.7 Kb和3.5 Kb。 實(shí)施例2:篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc細(xì)胞株
細(xì)胞株包括人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞，鼠肝AML-12細(xì)胞，以及人胃腺癌 BGC-823細(xì)胞，肝癌HepG2細(xì)胞等。以人胃腺癌細(xì)胞BGC-823為例，篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì) 粒pNurRE-Luc的細(xì)胞克隆株的具體方法如下
(1) 以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Lnc轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)基；
(2) 轉(zhuǎn)染48h后，消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)接到60mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng) 基(含10%FBS);
(3) 在培養(yǎng)液中加入G418(終濃度為300 pg/ml)進(jìn)行細(xì)胞篩選，每間隔3 d更換一次培養(yǎng)液， 培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% FBS， G418終濃度為300 pg/ml);
(4) 大約2 w后，單克隆細(xì)胞形成,挑取單克隆細(xì)胞至24孔培養(yǎng)板(l個(gè)克隆/ L)， 37 °C、 5%<:02培養(yǎng)數(shù)天，待細(xì)胞長滿后再分批傳代；
(5) 細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入EGF (終濃度為100ng/mD，對(duì)照組不加EGF， 3h后裂解細(xì) 胞，測定裂解液的熒光素酶活性，EGF剌激時(shí)的熒光素酶表達(dá)量比未刺激時(shí)的熒光素酶表 達(dá)量大幅增強(qiáng)的克隆細(xì)胞株則為陽性細(xì)胞株；
(6) 將陽性細(xì)胞株按步驟(4)和(5)再重復(fù)兩次篩選，其中熒光素酶表達(dá)量增強(qiáng)最明顯 的克隆細(xì)胞株即為陽性細(xì)胞株，獲得的陽性細(xì)胞株進(jìn)一步培養(yǎng)、擴(kuò)種后， 一部分凍存于液氮， 一部分用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3:篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物
A.通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc，檢測不同因素(包括化合物、生長因子等)對(duì)真核 細(xì)胞內(nèi)TR3的轉(zhuǎn)錄激活水平的影響，篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。以不同濃度的化 合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平影響的檢測為例(參見圖3所示的激動(dòng)劑對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影 響)，具體步驟如下
(1) 將細(xì)胞株接種在96孔培養(yǎng)板，RPMI-1640培養(yǎng)基(含10% FBS)、 37。C和5% 032條件 下培養(yǎng)；
(2) 24 h后以磷酸鈣沉淀法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc;
(3) 繼續(xù)培養(yǎng)18 h后，去除培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入含不同濃度化合物的新鮮RPMI-1640 培養(yǎng)基(不含F(xiàn)BS)，每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)平行樣；
(4) 根據(jù)需要處理細(xì)胞數(shù)小時(shí)后，去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；
(5) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性，該活性即代表TR3轉(zhuǎn)錄激活水平。
B應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株，測定系列化合物對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)TR3的 轉(zhuǎn)錄激活水平的影響，從而篩選TR3的激動(dòng)劑或拮抗劑。
以胃癌BGC-823細(xì)胞為例，檢測化合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響(參見圖4所示的系 列化合物對(duì)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的影響)，具體步驟如下
(1) 將穩(wěn)定表達(dá)pNurRE-Luc報(bào)告基因的細(xì)胞株接種至96孔板培養(yǎng)，培養(yǎng)液為RPMI-1640 培養(yǎng)基(含10%FBS);
(2) 培養(yǎng)18h后，吸掉培養(yǎng)基，根據(jù)需要加入含不同濃度化合物的RPMI-1640培養(yǎng)基(不 含F(xiàn)BS)。每個(gè)濃度設(shè)定3個(gè)平行樣；
(3) 根據(jù)需要處理細(xì)胞數(shù)小時(shí)后，洗掉培養(yǎng)液，并加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；
(4) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解物的熒光素酶活性，該活性代表TR3轉(zhuǎn)錄激活的水平。
權(quán)利要求
1.以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于包括以下步驟1)構(gòu)建一種含TR3應(yīng)答元件及熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc；2)篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株；3)篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述構(gòu) 建一種含TR3應(yīng)答元件及熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的具體步驟如下1) 合成具備酶切識(shí)別位點(diǎn)的含TR3應(yīng)答元件序列的片段；2) 將含TR3應(yīng)答元件序列的片段克隆至質(zhì)粒pGL3-promoter的熒光素酶基因前的多克隆 位點(diǎn)內(nèi)，獲得質(zhì)粒pGL3-NurRE;3) 以質(zhì)粒pGL3-NurRE為模板，PCR擴(kuò)增出含fl復(fù)制起始位點(diǎn)、TR3應(yīng)答元件、SV40 啟動(dòng)子、熒光素酶報(bào)告基因和終止子的片段，再插入到質(zhì)粒pEGFP-C3內(nèi)，獲得含TR3應(yīng)答 元件及報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc。
3. 如權(quán)利要求2所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于在步驟 1)中，含TR3應(yīng)答元件序列的片段序列如下3,。
4. 如權(quán)利要求2所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于在步驟 3)中，PCR擴(kuò)增所用的引物對(duì)的堿基序列如下正向引物5，-GATCGTGCACGCCCAAGCTACCATGATAAG - 3,，下劃線標(biāo)注的序列為 限制性內(nèi)切酶^ a￡ I的酶切位點(diǎn)；反向引物5，-CTGAGTGCACAGATCGCTGAGATAGGTGC - 3，，下劃線標(biāo)注的序列為 限制性內(nèi)切酶々7"丄I的酶切位點(diǎn)。
5. 如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于報(bào)告質(zhì) 粒pNurRE-Luc的核心序列為熒光素酶報(bào)告基因、綠色熒光蛋白基因、新霉素抗性基因和TR3 應(yīng)答元件序列組成的重組DNA序列；或通過所述含TR3應(yīng)答元件序列的片段序列中的核苷酸的缺失、取代或增加而得到的核苷 酸序列。
6. 如權(quán)利要求5所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述報(bào) 告質(zhì)粒pNurRE-Luc的核心序列的連接順序?yàn)門R3應(yīng)答元件序列一熒光素酶報(bào)告基因一綠色 熒光蛋白基因一新霉素抗性基因。
7. 如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述篩 選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株的具體步驟如下1) 以脂質(zhì)體方法將報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞；2) 通過檢測表皮生長因子對(duì)細(xì)胞克隆株的熒光素酶表達(dá)影響程度，在含終濃度200 500 Hg/ml新霉素的抗性培養(yǎng)基篩選出穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞克隆株。
8. 如權(quán)利要求7所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述細(xì) 胞克隆株包括人胚腎293細(xì)胞、人胚腎293T細(xì)胞、鼠肝AML-12細(xì)胞，以及人胃腺癌BGC-823 細(xì)胞，肝癌HepG2細(xì)胞。
9. 如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述篩 選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的方法，包括以下步 驟(1) 將細(xì)胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；(2) 以磷酸鈣沉淀法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc;(3) 去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；(4) 處理細(xì)胞后，去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；(5) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平 的化合物；
10. 如權(quán)利要求1所述的以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，其特征在于所述 篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物采用應(yīng)用穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株的方 法，包括以下步驟(1) 將細(xì)胞株接種在培養(yǎng)板培養(yǎng)；(2) 去除培養(yǎng)基，加入含待測化合物的培養(yǎng)基；(3) 處理細(xì)胞后，去除培養(yǎng)液，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解；(4) 用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性，即篩選出調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平 的化合物。
全文摘要
以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法，涉及一種以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的化合物篩選方法。構(gòu)建一種含TR3應(yīng)答元件及熒光素酶報(bào)告基因的報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc，篩選穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告質(zhì)粒pNurRE-Luc的細(xì)胞株，篩選調(diào)節(jié)TR3轉(zhuǎn)錄激活水平的化合物。由于TR3可以通過調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)對(duì)血糖調(diào)節(jié)、抗腫瘤方面的生物學(xué)功能，因此該化合物篩選方法可用于篩選及評(píng)價(jià)以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)血糖化合物，以及以睪丸激素受體3為靶點(diǎn)的抗腫瘤化合物，不僅特異性好，反應(yīng)靈敏，還具有簡便、快速、高通量、高效及評(píng)價(jià)指標(biāo)直觀等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/66GK101372708SQ20081007195
公開日2009年2月25日 申請(qǐng)日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者劉晶晶, 喬 吳, 沈月毛, 鄭忠輝 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)