專利名稱：：一種檢測牛x、y精子分離純度的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及核苷酸擴增技術(shù)，具體涉及一種檢測牛X、Y精子分離純度的引物，該引物能夠?qū)Ψ蛛x的牛X、Y精子進行純度鑒定，從而在牛繁殖過程中起到性別控制的作用。
背景技術(shù)：
：性別控制在生產(chǎn)實際中有著巨大的應(yīng)用價值，借助于性別控制技術(shù)，可選擇不同性別的家畜滿足生產(chǎn)需要，X、Y精子分離是性別控制最根本的技術(shù)手段，同時X、Y精子分離的準確程度直接關(guān)系到性別控制的效果，所以快速、準確的評價體系的建立有利于分離方法的優(yōu)化與提高。另外簡便快捷的評價方法直接關(guān)系到性別控制的可信程度，有助于性控精液的推廣，加快巿場普及速度。目前對于分離后精子純度鑒定主要采用流式細胞儀重分析評價法、熒光原位雜交評價法(FluorescentInSiteHybridization,FISH)。流式細胞儀重分析評價法流式細胞儀重分析評價法，將分離后的精子先超聲斷尾，僅留下精子頭部，以增加精子的定向效應(yīng)；然后用熒光染料Hoechst33342進行染色體染色，使染料定量地與DNA重新結(jié)合，精子以100200個/秒的速度通過流式細胞儀進行重分析。雖然流式細胞儀重分析評價法準確，但是受到專用儀器的限制，也犧牲了很多寶貴的機時，X精子和Y精子DNA含量差別很小時，流式細胞重分析不能保證準確性，釆用同一臺儀器進行分離結(jié)果的評價分析，也可能造成結(jié)果的偏差，同時流式細胞儀價格昂貴，很多實驗室不能夠配備。熒光原位雜交評價法(FISH評價法)FISH是在細胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)相結(jié)合的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種檢測技術(shù)，其原理是利用堿基的互補性，將標記上非放射性熒光物質(zhì)(如熒光素、DAPI等)的染色體特異核酸探針與細胞核中的染色體序列雜交。熒光原位雜交評價法由于使用了染色體特異探針等，可以得到高質(zhì)量的鑒定結(jié)果；同時探針穩(wěn)定，熒光試劑安全。但是FISH評價法要求在短時間內(nèi)制備很多樣品，無形中增加了勞動量，完成整個鑒定過程需要較長時間，同時熒光試劑價格昂貴，不利于此技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，建立一種準確、快速、經(jīng)濟的檢測X、Y精子分離純度的方法是非常必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種檢測X、Y精子分離純度的特異擴增引物。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測X、Y精子分離純度的方法。本發(fā)明針對牛Y染色體性別決定基因Sry序列(gi:4878004,序列報道長度為2751bp)設(shè)計了性別特異引物Y12,其核苷酸序列如序列表SEQIDN0.1&2所示，擴增產(chǎn)物長度為295bp。通過對單精子DNA模板擴增，檢測擴增產(chǎn)物，若擴增產(chǎn)物長度為295bp則表明該精子為Y精子。為避免假陽性的出現(xiàn)，可以設(shè)置內(nèi)標引物。本發(fā)明根據(jù)牛3號常染色體序列(gi:119890289,序列報道長度為83545bp)設(shè)計一對內(nèi)標引物C34,其核苷酸序列如序列表SEQIDN0.3&4所示，該引物擴增產(chǎn)物長度為208bp。使用兩對引物進行擴增避免了單重PCR法僅擴增Y染色體特異片斷而造成的假陰性實驗結(jié)果的出現(xiàn)，提高了檢測結(jié)果的準確性。本發(fā)明釆用兩對引物對單個牛精子進行雙重PCR擴增，在分離的X或Y精液中分別抽查大約100個單精子進行PCR擴增，具有擴增產(chǎn)物長度為208bp的單精子為X精子，具有擴增產(chǎn)物長度為295bp和208bp的單精子為Y精子，最后統(tǒng)計擴增結(jié)果對精子純度做出最終評價。本發(fā)明方法包括單精子的分離，單精子的裂解，PCR擴增，電泳檢測和結(jié)果統(tǒng)計五個環(huán)節(jié)。具體地說，本發(fā)明釆用高濃度的堿性裂解液(500mmol/LKOH，125mmol/LDTT)裂解精子，每管單精子加堿性裂解液，65'C裂解10-20min，同時中和液直接加入除模板以外的總反應(yīng)體系，通常釆用25iiLPCR反應(yīng)體系，其中Tag酶0.7U,dNTP濃度為200|miol/L，引物Y12濃度為180pmol/L,內(nèi)標引物C34濃度為180pmol/L。各離子濃度分別為96mmol/LTris-HCl、30mmol/LKCl和1.5mmol/LMgCl2。擴增產(chǎn)物釆用GoldViewnaTMII熒光染料(靈敏度比EB高10倍左右)染色觀察。由于Y12和C34的特異性擴增片斷在200-300bp，本發(fā)明同時通過改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)的擴增條件，而實現(xiàn)55分鐘左右完成PCR擴增。此外，利用現(xiàn)有常規(guī)儀器，使用國產(chǎn)化試劑，本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員即可實施本發(fā)明。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易將本發(fā)明的引物與相關(guān)的試劑制備成試劑盒，以方便適用。本發(fā)明方法成本低廉、操作簡單、快速、準確，為后續(xù)性控精液的推廣應(yīng)用及精子分離方法的優(yōu)化提供一個可靠的技術(shù)支持。圖1為公牛和母牛血液DNA的PCR擴增電泳圖，其中，1-6道為公牛血液PCR擴增結(jié)果，9-14道為母牛血液PCR擴增結(jié)果，7、8、15、16為陰性對照，M為MarkerI，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp;圖2為單精子PCR擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果，其中1-6道為單精子擴增結(jié)果(1、2為X精子，3~6為Y精子)，7道為陽性對照，8、9道為陰性對照，M為MarkerI，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。具體實施例方式實施例1:以牛血液DNA為模板進行PCR擴增堿性裂解法制備牛基因組DNA需要堿性裂解液和中和液兩個部分，堿性裂解液的成分包括KOH500mmol/L,DTT125mmol/L;中和液的成分包括Tris.HCl900mmol/L，pH=8.3。以一頭公牛和一頭母牛為材料，各取10抗凝血于0.2mL高壓滅菌PCR管中，加90pl雙蒸水，充分混勻。12000rpm離心2-3分鐘，棄去上層液體。加入lOfil堿性裂解液充分吸打混勻，65°。裂解10分鐘，加入25|^1中和液充分吸打混勻用于PCR檢測，或-20"C保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計依據(jù)GenBank中收錄的Y染色體性別決定基因Sry序列(gi:4878004,序列報道長度為2751bp)，設(shè)計引物Y12,依據(jù)牛3號常染色體序列(gi:119890289,序列報道長度為83545bp)，設(shè)計引物C34，引物序列及相關(guān)的信息見表l,所有引物均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。表1引物Y12,C34序列及相關(guān)信息<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage6<table>PCR反應(yīng)體系采用25ial反應(yīng)體系，由以下幾個部分組成:ddH208.2(ildNTP(lmmol/L)5単10xPCRbuffer1.5(ilY12(2,ol/L)2.25[ilC34(2,ol/L)2.25plMg2+(25mmol/L)0.6(ilTaq(2.5U/|iL)0.7|ilDNA模板4.5]Lil10xPCRbuffer的成分如下500mmol/LKC1，10Ommol/LTris.Cl,15mmol/LMgCl2，0.1%白明膠；Taq酶存儲緩沖液的成分如下20mmol/LTris.Cl，lmmol/LDTT,O.lmmol/LEDTA，10Ommol/LKCl，50%glycerol，0.5%NP-40。PCR反應(yīng)體系中各離子濃度為1.5mmol/LMgCl2,5mmol/LDTT，50mmol/LK+，96mmol/LTris.Cl。PCR反應(yīng)條件94。C4min;94°C2S，51°C2S,72°C2S,32次循環(huán)；72°C3min。在120V電壓下，釆用2%瓊脂糖電泳15min，凝膠成像系統(tǒng)檢測分析，PCR結(jié)果如圖l所示。其中，l-6道為公牛血液PCR擴增結(jié)果，9-14道為母牛血液PCR擴增結(jié)果，7、8、15、16為陰性對照，M為MarkerI，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。結(jié)果表明公牛血液PCR均出現(xiàn)了295bp以及208bp的條帶，母牛血液PCR結(jié)果則僅有208bp的條帶。陰性對照均不存在上述條帶。說明本發(fā)明方法可信度高，不存在非特異性擴增。實施例2:單精子PCR擴增1、瓊脂糖鋪片分離單個精子l.l使用蔗糖溶液(250mM蔗糖，5mMTris.堿)洗滌精子a.取一支高壓滅菌1.5ml離心管。b.從液氮中取出一支冷凍精液，放入40°C水中瞬間解凍。c.用剪刀剪去細管棉塞一端,將剪去棉塞管口對準1.5ml離心管口，用剪刀剪去另一端，精子順管口流入1.5ml離心管內(nèi)，剩余精子用10|il移液器吹入離心管內(nèi)。d.將5pl未稀釋精子加入495(il去離子水內(nèi)，用移液器充分吸打混勻。e.取約2(Hd混勻精子鋪滿整個細胞計數(shù)板，在普通光學(xué)顯微鏡10倍鏡下計數(shù)精子個數(shù)。f.將未稀釋精液15000g離心IO分鐘，棄去上層液體。g.加入lml蔗糖溶液充分吸打混勻，15000g離心10分鐘(重復(fù)3遍)。h.棄去上層液體，加入lmlddH20洗滌精子，15000g離心10分鐘。i.棄去上層液體，加入適量蔗糖溶液(調(diào)整精子為lxl07/mL)充分吸打混勻，-20"C保存?zhèn)溆谩?.2分離單個精子3.取0.^低熔點瓊脂糖溶于201111(1(11120,用微波爐加熱制成0.5%低熔點瓊脂糖溶液。b.低熔點瓊脂糖溶液37。C左右時加入經(jīng)洗滌并重懸精子1^1(約1000個精子)充分吸打混勻。c.將混有精子的低熔點瓊脂糖平鋪于直徑10cm培養(yǎng)皿。d.室溫凝固后放入37'C烘箱，烘干2小時。e.準備好放單精子高壓滅菌0.2mlPCR管，1ml注射器改制的挖膠勺。f.將鋪好平板放在倒置顯微鏡載物臺上，在10倍或20倍鏡下尋找單精子位置。g.使用自制挖膠勺挖取單個精子放入PCR管內(nèi)，-2(TC保存?zhèn)溆谩?、單精子PCR2.1單精子裂解a.取出放有單精子的0.2mlPCR管，3000g瞬時離心。b.向PCR管內(nèi)加入l(^堿性裂解液(500mmol/LKOH，125mmol/LDTT)，65'C裂解20分鐘，作為單精子PCR擴增的模板。注意精子中和液(900mmol/LTris.HCl，pH8.3)加入總反應(yīng)體系。2.2單精子PCR本實驗是利用單精子PCR對分離精液進行純度鑒定，以公牛血液DNA作為陽性對照，裂解的單精子作為模板。反應(yīng)體系見表2，其中10xPCRbuffer(500mMKCl、100mMTris'HCl、15mMMgCl2、0.1%明膠)，釆用EppendorfMastercyclergradientPCR儀(德國)進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件:94。C4min;94°C2S,51°C2S,72°C2S,35個循環(huán);72。C3min。2.3瓊脂糖凝膠電泳a.瓊脂糖凝膠制備準確稱取0.6g瓊脂糖溶入30mL的0.8xTBE中，置電爐上加熱并不時搖動至完全熔化，室溫冷至5060。C,力口4.5plGoldViewnaTMlI熒光染料(靈敏度比EB高10倍左右)立即搖勻，倒入電泳槽模具內(nèi)，室溫下放置20min以上，拔出梳子。b.樣品的制備在臘膜紙上點上1pl上樣緩沖液和10(ilPCR產(chǎn)物，充分混勻點樣，用DNAMarkerI作為分子量標準。c.電泳將凝膠浸入電泳緩沖液中，點樣后，接上電源，120V,電泳15min。d.觀察結(jié)果單精子PCR結(jié)果如圖2所示，其中l(wèi)-6道為單精子擴增結(jié)果(1、2為X精子，36為Y精子)，7道為陽性對照，8、9道為陰性對照，M為MarkerI，從下至上的條帶依次為100bp、200bp、300bp、400bp、500bp和600bp。<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>按照上述方法、對樣本中抽取的單精子進行檢測，計算出X、Y單精子所占的比例，從而判斷該樣本精子的分離純度。序列表<110〉中國農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所〈120〉一種檢測牛X、Y精子分離純度的引物〈130><160〉4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>21<212〉DNA<213>人工序列<400>1ctactagacatacaccgagac21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccgtgctgccaatgttacct20<210>3<211〉21〈212〉DNA<213〉人工序列<400>3ttgctgctcttgcctttgctt21<210>4〈211>21<212>DNA<213〉人工序列<400>4gtxcacctgccacaeicteiaEit2權(quán)利要求1、一種檢測分離X、Y精子純度的引物，其包括SEQIDNO.1和2所示的核苷酸序列。2、如權(quán)利要求l所述的引物，其還包括內(nèi)標引物。3、如權(quán)利要求2所述的引物，其中所述內(nèi)標引物具有SEQIDN0.3和4所示的核苷酸序列。4、權(quán)利要求13任一項所述引物在檢測分離X、Y精子純度中的應(yīng)用。5、一種檢測分離后X、Y精子純度的方法，其釆用權(quán)利要求13任一項所述的引物對牛單個精子DNA進行PCR擴增，并檢測其擴增產(chǎn)物，對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，判斷分離后X、Y精子純度。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，釆用權(quán)利要求3所述引物進行擴增時，具有擴增產(chǎn)物長度為208bp的單精子為X精子，具有擴增產(chǎn)物長度為295bp和208bp的單精子為Y精子。7、如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，PCR反應(yīng)條件為94。C4min;94°C2S，51°C2S，72°C2S，35個循環(huán);72。C3min。8、含有權(quán)利要求1~3任一項所述引物的試劑盒。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測X、Y精子分離純度的引物，該引物是針對牛Y染色體上性別決定基因Sry通過PCR錯配技術(shù)設(shè)計而成，通過該引物可擴增片段大小為295bp，為了防止假陽性出現(xiàn)，本發(fā)明根據(jù)牛3號常染色體報道序列設(shè)計了一對內(nèi)標引物C34，擴增片段大小為208bp，通過上述兩對引物對單個牛精子進行雙重PCR擴增，然后根據(jù)對檢測結(jié)果的統(tǒng)計分析，對分離精子純度做出最終評價。本發(fā)明提供了一種成本低廉，操作簡便、快速、準確的鑒定牛X、Y精子分離純度的技術(shù)，為后續(xù)性控精液的推廣應(yīng)用及精子分離方法的優(yōu)化提供一個可靠的技術(shù)支持。文檔編號C12N15/11GK101195842SQ200810055708公開日2008年6月11日申請日期2008年1月7日優(yōu)先權(quán)日2008年1月7日發(fā)明者張林波,朱化彬,杜衛(wèi)華,棟王,程金華,郝海生,郭家明申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所