專利名稱：牛x、y精子流動(dòng)分離法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牛X、Y精子流動(dòng)分離法，屬于動(dòng)物繁殖方面的性別控制方法。
資料報(bào)導(dǎo)，世界各國對家畜的性別控制已研究了近一個(gè)世紀(jì)。主要是用實(shí)驗(yàn)的方法區(qū)分X精子和Y精子間的微妙差異，諸如精子的形態(tài)、重量和比重、化學(xué)成份、對酸堿的反應(yīng)，所帶電荷的不同及抗原性等，其方法如電泳法、密度梯度離心法、酸堿法等。但是到目前為止，還沒有一種有效的方法能夠使數(shù)以億計(jì)的家畜精液樣本分成X和Y精子以供人工授精。
本發(fā)明的目的是提供一種設(shè)備方法簡單、操作方便有效，能在種公牛站廣泛使用的牛X、Y精子流動(dòng)分離法，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代遺傳學(xué)在理論和實(shí)踐上的重大突破。
牛的性別是由性染色體決定的，是雄性配子異型。含X、Y染色體的精子產(chǎn)生的數(shù)量相等，因此與卵子結(jié)合的概率也基本相同，從而后代的性比接近1∶1。據(jù)此，在牛人工授精的實(shí)踐中，若將牛的兩性精子分離，便可達(dá)到性別控制的目地。
利用含X、Y染色體的精子在流體中各自的運(yùn)動(dòng)特性將其分離，依據(jù)有二順、反旋轉(zhuǎn)性(自轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng))據(jù)觀察和實(shí)驗(yàn)，精子是沿其縱軸旋轉(zhuǎn)著向前運(yùn)動(dòng)的，從尾部望去，有順時(shí)針和反時(shí)針兩種。順時(shí)針旋轉(zhuǎn)者為Y精子；反時(shí)針旋轉(zhuǎn)者為X精子。
逆流而上性在流速為精子運(yùn)動(dòng)速度的1～2倍或略高一些的液流中，精子有逆流而上的特性。
產(chǎn)生順、反旋轉(zhuǎn)的機(jī)理家畜正常的精子是沿其縱軸旋轉(zhuǎn)著向前運(yùn)動(dòng)的，這在幾十年前就有報(bào)導(dǎo)。但是關(guān)于旋轉(zhuǎn)的方向問題，根據(jù)荷蘭E、M、BIOknuis的實(shí)驗(yàn)(第四屆國際家畜繁殖會(huì)議選譯1961)，他認(rèn)為“從后面看，精子的頭部以反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)(當(dāng)然尾部也旋轉(zhuǎn))，到目前為止尚未看到例外”。經(jīng)過發(fā)明人多次觀察和實(shí)驗(yàn)，證明這種看法只反映問題的一面，即除反時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)之外，還有順時(shí)針的。
如果我們用低倍鏡觀察牛精子的運(yùn)動(dòng)情況，便可發(fā)現(xiàn)其運(yùn)動(dòng)軌跡有四種特殊的現(xiàn)象其一，如果移動(dòng)視野，跟蹤一個(gè)精子，則可以發(fā)現(xiàn)精子的運(yùn)動(dòng)軌跡是園形的，并非當(dāng)前公認(rèn)的直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)。所有正常的具有活力的精子都是這樣(畸形、稀釋液配制不良造成運(yùn)動(dòng)失調(diào)者除外)，其運(yùn)動(dòng)軌跡和運(yùn)動(dòng)的直線方向(假想線)略有偏離，呈圓弧狀彎曲。如


圖1精子圓弧軌跡示意圖(虛線是假想線；圓圈表示視野)。
其二，正常精子的圓形運(yùn)動(dòng)軌跡的方向分為兩種，一種是順時(shí)針的，一種是反時(shí)針的。
其三，順時(shí)針和反時(shí)針圓形運(yùn)動(dòng)軌跡的精子數(shù)的比例為1∶1。
其四，正常精子沿圓形軌跡運(yùn)動(dòng)到一段時(shí)間后便向相反圓弧的方向運(yùn)動(dòng)，這是接觸到載玻片的結(jié)果。
精子的運(yùn)動(dòng)軌跡為什么有這些現(xiàn)象呢？根據(jù)發(fā)明人觀察，系由以下三種原因造成的精子的外形特殊，精子能旋轉(zhuǎn)(自轉(zhuǎn))運(yùn)動(dòng)及流體力學(xué)。
①精子的外形——分頭、頸、尾三部份。頭部呈扁卵圓形，中間凹陷；頸較短，細(xì)圓軸狀；尾部很長，約為頭長的10倍。值得注意的是活體的精子的頭部平面與尾部的擺動(dòng)平面之間有一個(gè)交角。
②旋轉(zhuǎn)(自轉(zhuǎn))運(yùn)動(dòng)根據(jù)觀察，牛精子的前進(jìn)運(yùn)動(dòng)是靠尾部的有節(jié)律的擺動(dòng)來實(shí)現(xiàn)的。擺動(dòng)呈波形，與其周圍液體相互作用與反作用形成推力，在前進(jìn)的同時(shí)，由于精子的頭部平面與尾部的擺動(dòng)平面有一個(gè)交角，而這個(gè)交角又非常巧妙的適宜，頭部的扁平面和側(cè)方的液體發(fā)生相對運(yùn)動(dòng)。和放風(fēng)箏相似，迎著液體運(yùn)動(dòng)的一面和相背的一面產(chǎn)生壓強(qiáng)差，并形成舉力。在此舉力的作用下，精子頭部便向側(cè)方上揚(yáng)或下抑。當(dāng)頭部達(dá)到新的位置時(shí)，由于尾部和頭部是一整體，被扭轉(zhuǎn)后也隨之達(dá)到新的位置，并繼續(xù)擺動(dòng)。循此下去，尾部的擺動(dòng)平面和頭部平面均在空間的不斷的依序變換位置，精子便旋轉(zhuǎn)前進(jìn)了。X、Y精子表現(xiàn)在尾部擺動(dòng)平面與頭部平面的相對位置是手征式的軸對稱，這樣旋轉(zhuǎn)方向從尾部望去便有順時(shí)針和反時(shí)針的不同。
③流體力學(xué)在靜止的三維空間的液體中，精子的運(yùn)動(dòng)軌跡如下(1)精子旋轉(zhuǎn)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的同時(shí)，也受到重力場的影響，因此它的運(yùn)動(dòng)軌跡是逐漸下降的。
(2)精子在旋轉(zhuǎn)前進(jìn)并下降的過程中，由于有順、反兩種旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，在兩種精子前進(jìn)方向一致的情況下，便會(huì)出現(xiàn)下面的運(yùn)動(dòng)軌跡；第一種介質(zhì)——鹽、糖類以含Y精子為例，精子下降的落點(diǎn)不是在自由落體的投影上，而是向左偏移。這是由于精子是順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)的，其左邊轉(zhuǎn)動(dòng)的速度向上，其右邊轉(zhuǎn)動(dòng)的速度向下，在受重力場影響下降的過程中，流體的運(yùn)動(dòng)速度(相對速度)的方向也是向上。這樣根據(jù)速度相加原理，左邊便成了兩個(gè)速度之和，右邊便成了兩個(gè)速度之差?！安睢钡膲簭?qiáng)要大于“和”的壓強(qiáng)，因此含Y的精子的運(yùn)動(dòng)軌跡在此“附加壓力”的作用下便脫離了自由落體的軌跡而向左偏移。同理，含X的精子的運(yùn)動(dòng)軌跡向右偏移。
第二種介質(zhì)——奶類奶類稀釋液和糖、鹽稀釋液不同，是乳濁液，充滿著球狀顆粒。在這種不勻質(zhì)的液體中，精子運(yùn)動(dòng)軌跡的偏移方向受兩個(gè)相反方向的力所左右一是“附加壓力”，一是“反作用力”。隨著顆粒質(zhì)量及濃度的改變，X、Y精子的偏移方向存在與第一種介質(zhì)相同或相反或不偏移的三種可能性。
(3)精子旋轉(zhuǎn)前進(jìn)的過程中，它的前進(jìn)方向不是直線而是曲線，這是由于精子受重力而下降，受“附加壓力”而偏移的過程中，精子本身的形狀不勻稱，頭部比尾部寬幾倍，頭部所受的力大。在此種持續(xù)力的作用下，其前進(jìn)方向的運(yùn)動(dòng)軌跡便逐漸彎曲，最后近似的形成一個(gè)圓圈。因?yàn)榫颖旧碛许?、反兩種自轉(zhuǎn)方式，所以圓圈也呈順、反不同的軌跡。
總結(jié)(1)(2)(3)各點(diǎn)，在靜止的三維空間的流體中，由于X、Y精子的外形構(gòu)造，決定了精子本身的順、反自轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。由于順、反的自轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)又決定了順、反兩種圓圈運(yùn)動(dòng)軌跡及其比例為1∶1。
精子逆流而上的運(yùn)動(dòng)特性正常的精子在適宜的溫度下，當(dāng)遇到自己運(yùn)動(dòng)速度1～2倍的液流時(shí)均毫無例外地頭朝向同一方向逆流而上。液流速度增加，精子的旋轉(zhuǎn)數(shù)及運(yùn)動(dòng)速度亦相應(yīng)加快。
根據(jù)上述理論和實(shí)踐，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是1、將牛精液用奶、糖稀釋液稀釋；2、將稀釋后的精液抽取在注射器中；3、將注射器水平放置用燈光照射；4、X、Y精子在注射器內(nèi)閉瑣循環(huán)中自動(dòng)分離為兩部分排列，由此將X、Y精子分離；5、X、Y精子分別用Tris稀釋液稀釋；6、常規(guī)液氮細(xì)管冷凍。
稀釋液配方第一液 第二液Tris稀釋液檸檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸餾水345ml 卵黃 100ml青霉素、鏈霉素各50萬單位附
圖1是精子圓弧軌跡示意圖，虛線是假想線，圓圈表示視野。
圖2是X、Y精子流動(dòng)分離裝置結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是圖2的左視圖。
圖4是X、Y精子占據(jù)部位示意圖。
圖中1-注射器，2-分離架，3-燈光下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的分離方法作進(jìn)一步描述。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的分離方法，選用如下設(shè)備和動(dòng)力；①動(dòng)力——電燈光。該動(dòng)力比較平穩(wěn)、勻速、易于控制。
②設(shè)備——注射器、分離架。
分離時(shí)將注射器抽取適量精液水平放置在帶有鋁制托片的一個(gè)垂直分離架上。在其對面的一定距離上安裝一光源進(jìn)行照射，光線和注射器呈直角。注射器受到光線照射后便將光能轉(zhuǎn)化成熱能。近光線的精液受熱較快，其體積增大密度變小而上升，其空出的位置被流來的較涼的密度較大的精液所填充。如此交替不止便產(chǎn)生了對流。近光線和遠(yuǎn)光線的精液總是存在溫差，因此對流便持續(xù)不停。這種對流現(xiàn)象在光線照射后的數(shù)秒鐘之內(nèi)便可啟動(dòng)。
注射器需水平放置，這樣液體流動(dòng)的方向才能與地面呈環(huán)形垂直。由于注射器裝滿一定量的精液，不留空隙，因此精液在注射器內(nèi)以管壁為外介作圓形閉瑣的循環(huán)流動(dòng)。
精液是粘滯液體，具有內(nèi)摩擦力，所以外層的流動(dòng)必然引起內(nèi)層相應(yīng)的流動(dòng)。精液的流速很小，其內(nèi)部的液流是層流狀態(tài)。最外層流速最大，中軸部分流速為零，中間有一個(gè)速度梯度。根據(jù)力學(xué)原理，液體流速大則動(dòng)量大；流速小則動(dòng)量也小。精子在運(yùn)動(dòng)中頭部前方形成喇叭口形，在逆流而上的過程中，喇叭口受到液流動(dòng)量之差的作用被逐漸沖到較慢的一層。循此下去，精子便被動(dòng)的向中軸方向移動(dòng)。與此同時(shí)，由于精子的旋轉(zhuǎn)而產(chǎn)生“附加壓力”，由于順、反時(shí)針旋轉(zhuǎn)的不同而向注射器兩端分離。
分離方法分離宜在18-25℃的暗室中進(jìn)行。
首先制作精液稀釋液第一液奶糖稀釋液將12g乳糖倒入250ml三角燒瓶里，再加入100ml蒸餾水，加溫，振蕩溶解后取出75ml。將10g奶粉倒入另一250ml三角燒瓶里，再加入100ml蒸餾水，振蕩，待充分溶解后取出25ml。將12％的乳糖溶液75ml和10％的奶粉溶液25ml混合在一起，蒸汽滅菌消毒10分鐘，冷卻過濾，并保持在37-40℃水浴中備用。
第二液 Tris稀釋液按配方準(zhǔn)確稱量檸檬酸6.768g，葡萄糖5.5g,Tris(三羥基甲基氨基甲烷)12.112g溶解在345ml的蒸鎦水中，振蕩溶解后再加入甘油32ml，卵黃100ml(不含蛋清和卵黃膜)，青、鏈霉素各50萬單位，充分振蕩備用。
分離裝置有一分離架，為一帶座的垂直木板，木板上安放三排鋁制的托片，其高度分別為7、13、19cm，放注射器用。
在分離架對面距43cm處，放一個(gè)300W的電燈泡，距桌面高度5.6cm。
精液處理牛精液采出后立即進(jìn)行精液質(zhì)量判定，包括一般性狀的檢查及活力、密度等檢查。對合格精液準(zhǔn)確計(jì)算出該份精液的稀釋量，其計(jì)算公式為稀釋量=(鮮精量×預(yù)估活力×密度)÷0.2根據(jù)牛流動(dòng)分離法的技術(shù)操作要求，每支100ml注射器分離后的稀釋量一般為60ml，每支0.5ml細(xì)管有效精子為0.1億，預(yù)估活力為0.35，那么在分離前應(yīng)該吸取使用的原精精子總數(shù)，即鮮精量×密度，按前式計(jì)算應(yīng)為鮮精量×密度=稀釋量×0.2÷預(yù)估活力=60×0.2÷0.35=34.28≈35(億)根據(jù)精子的密度即可算出每支100ml注射器分離時(shí)所需的鮮精量(鮮精量=35億÷密度)。將精液從集精管中倒入精液瓶(80ml帶刻度的灼杯，標(biāo)有品種、牛號(hào))35億的鮮精量，再用37-40℃的第一液稀至30ml，立即用100ml注射器將稀釋后的精液全部抽取出來。
精液內(nèi)留一小氣泡(以便取水平，相當(dāng)于水平儀中的汽泡)，其直徑3mm為宜。注射器口用消毒的火柴桿堵塞。將該注射器放置在分離架的托片上。調(diào)節(jié)注射器內(nèi)的氣泡，使之處在液面的中央。注射器要與光線垂直。打開電源開關(guān)，照射50分鐘。然后將火柴桿輕輕拔掉，在盡量保持注射器平穩(wěn)的情況下推送注射器柄，將前半部收集于精液瓶中(標(biāo)記有Y、品種、牛號(hào)的80ml灼杯)，余下半部收集于另一精液瓶中(標(biāo)記有X、品種、牛號(hào)的80ml灼杯)。被分離出的帶X、Y精液占據(jù)注射器的部位見圖4X、Y精子占據(jù)部位示意圖。
兩個(gè)精液瓶內(nèi)分別加入第二液(Tris稀釋液)14ml和甘油1ml。青、鏈霉素各1.5萬單位，使分離后的X、Y精液各為30ml。加入甘油1ml的依據(jù)是加第1液的量一般為26ml，原精約4ml，不含甘油。若甘油比例為6.5％，則計(jì)算比例為93.5∶6.5=26∶XX=1.8≈2每個(gè)精液瓶分別為2÷2=1(ml)根據(jù)細(xì)管冷凍精液制作工藝規(guī)程，立即將分離稀釋后的精液送入0-5℃冰柜內(nèi)平衡3-4小時(shí)。細(xì)管除印有品種、牛號(hào)、生產(chǎn)日期外，需另有X或Y的印字。分裝、計(jì)數(shù)后在冷凍箱內(nèi)深凍12-15分鐘。在40℃下行凍后活力檢查。
包裝時(shí)每個(gè)紗布袋標(biāo)有種公牛站產(chǎn)品標(biāo)記、品種、牛號(hào)、生產(chǎn)日期、活力及X或Y，放入液氮罐中長期貯存。
本發(fā)明人1998年內(nèi)部保密實(shí)施本發(fā)明分離方法成功的對X、Y精子進(jìn)行分離，產(chǎn)犢73頭，其中母犢60頭，其性別控制成功率82％。
實(shí)施例此發(fā)明宜在種公牛站進(jìn)行。
X、Y精子分離前應(yīng)先作好準(zhǔn)備工作，在室溫為18-25℃的條件下，主要是1、配好稀釋液，配方為第一液 二者混合為100ml，調(diào)正在37-40℃第二液Tris稀釋液檸檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸餾水 345ml 卵黃100ml青霉素、鏈霉素各50萬單位2、放置好分離裝置，使分離架和300W光源保持43cm，燈光高度5.6cm。3、牛精液采出后立即進(jìn)行精液質(zhì)量判定，包括一般性狀及活力，密度檢查。合格的精液準(zhǔn)確計(jì)算出精液的稀釋量。每個(gè)100ml注射器內(nèi)一般分離35億精子(密度×鮮精量)。從集精管中倒入標(biāo)記有牛號(hào)、品種的精液瓶中(80ml帶刻度的灼杯)35億精子的鮮精量，再用37-40℃的第一液進(jìn)行稀釋至30ml。用100ml注射器將稀釋后的精液全部抽取出來，精液內(nèi)留一小汽泡，其直徑3mm為宜。注射器口用消毒后的火柴桿堵塞，放置在帶鋁片托的分離架上(分離架上分三格7、13、19cm，每格均可)。調(diào)節(jié)注射器與光線垂直并保持水平。打開燈光開關(guān)，照射50分鐘后將火柴桿拔掉。輕推注射器柄，將前半部收集于標(biāo)有Y的精液瓶中，后半部收集于另一標(biāo)有X的精液瓶中。將這兩個(gè)精液瓶分別加入第二液14ml和甘油1ml及青、鏈霉素1.5萬單位，輕輕晃動(dòng)。總共分離后的精液各為30ml。將其送入0～5℃的冰柜內(nèi)平衡3-4小時(shí)。其后按細(xì)管冷凍精液制作工藝規(guī)程進(jìn)行分裝、深凍、鏡檢、包裝、貯存等。細(xì)管、紗布袋要特別標(biāo)記X或Y的字樣以免混淆。
權(quán)利要求
1.牛X、Y精子流動(dòng)分離法，利用X、Y精子有順、反旋轉(zhuǎn)的不同及逆流而上性，其特征在于分離方法是(1)將牛精液用奶、糖稀釋液稀釋；(2)將稀釋后的精液抽取在注射器中；(3)將注射器水平放置用燈光照射；(4)X、Y精子在注射器內(nèi)閉瑣循環(huán)中自動(dòng)分離為兩部分排列，由此將X、Y精子分離。(5)分離后的精液再用Tris稀釋液及甘油稀釋；(6)塑料細(xì)管凍精。
2.如權(quán)利要求1的牛X、Y精子流動(dòng)分離法，其特征在于稀釋液配方為第一液 第二液Tris稀釋液檸檬酸6.768g葡萄糖5.5gTris 12.112g 甘油 32ml蒸餾水345ml 卵黃 100ml青霉素、鏈霉素各50萬單位
3.根據(jù)權(quán)利要求1的牛X、Y精子流動(dòng)分離法，其特征在于按照下列方法分離(1)將牛精液用12％乳糖75毫升、10％奶粉25毫升混合稀釋液稀釋；(2)用100毫升注射器抽取30毫升稀釋后的精液；(3)將注射器水平放置，用300W電燈光，距注射器43厘米距離對注射器垂直照射；(4)照射50分鐘后，X、Y精子自動(dòng)分離；(5)分離后的精液再用Tris稀釋液及甘油稀釋；(6)塑料細(xì)管凍精。
全文摘要
牛X、Y精子流動(dòng)分離法屬于動(dòng)物繁殖方面的性別控制方法。是以全新的理論和全新的方法將X、Y精子分離。利用X、Y精子的不同旋轉(zhuǎn)性及逆流而上性,經(jīng)稀釋后裝入100cc注射器中,在一定距離一定光強(qiáng)的照射下,形成閉瑣循環(huán)對流,50分后將X、Y精子分離。制成塑料細(xì)管凍精。性別控制成功率達(dá)82%以上。
文檔編號(hào)A61D19/00GK1306805SQ0010148
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月1日
發(fā)明者楊承權(quán) 申請人:楊承權(quán)