專利名稱：：一種用于奶牛精子分離的熒光染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于細胞及生殖生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。適用于利用流式細胞儀進行奶牛精子分離、生產(chǎn)性控凍精。
背景技術(shù)：
：目前，基于流式細胞儀的精子分離是奶?；蛉馀５男詣e控制的有效技術(shù)和手段，而精子的熒光染色是分離過程的必要和關(guān)鍵步驟。哺乳動物性別控制是人們一直以來感興趣并進行了大量、廣泛研究的課題，經(jīng)過長期的研究現(xiàn)已證明，基于流式細胞儀的精子分離是最成功并且最具實用性的性別控制技術(shù)。這項技術(shù)在多種哺乳動物獲得成功，在包括中國在內(nèi)的多個國家進行了推廣使用，在奶牛的性別控制中已經(jīng)或正在發(fā)揮著巨大的作用。使用熒光染料對精子進行染色，是利用流式細胞儀分離牛X/Y精子的關(guān)鍵性步驟，染色效果的好壞不僅極大地影響精子分離效果、效率，而且決定了種公牛的利用率。現(xiàn)在包括該技術(shù)的發(fā)源地美國在內(nèi)的其它國家利用該技術(shù)種公牛的利用率僅為30%左右。我們的研究證實原精里的精漿對染色有很大的影響，適當去除部分精漿能夠十分有效地提高染色效果。生產(chǎn)實踐中使用去除部分精漿的染色方法不但可以提高分離效果、分離速度，并且使種公牛的利用率從30%提高到90%以上。文獻檢索和資料查詢未發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外有相同或類似的任何技術(shù)報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于奶牛精子分離的熒光染色方法，該方法提高了精子的分離效果和分離速度。本發(fā)明的用于奶牛精子分離的熒光染色方法，包括以下步驟(1)通過離心去除奶牛精液中的精漿；(2)牛精子的熒光染色將去除部分精漿的奶牛精子按一定比例與熒光染料混合，34。C水浴45分鐘;(3)通過流式細胞儀分離染色的奶牛精子。分離操作過程如下a)分離機型號為SX-Moflo或XDP，產(chǎn)地為美國；b)分離模式選擇Purify1;c)把樣品置于加樣站中，打開加樣器上的壓力和樣品開關(guān)，按boost使樣品從tip流出，調(diào)整樣品壓力使triggerrate保持在30000以下；d)精細調(diào)整圖形達到最清晰，一旦開始分離不可以移動影響dropdelay的旋鈕；e)Summit4.0軟件上選擇分離，R2選取X區(qū)域；f)約15分鐘搖動收集管，保證精子活力，每管樣品分離時間不超過l小時，并記錄機器狀態(tài)和分離情況。所述去除奶牛精液中的精漿的步驟可以是將奶牛原精直接離心后吸棄上層的精漿或者先用緩沖液稀釋奶牛原精，然后進行離心并吸棄上層的精漿。所述稀釋奶牛原精的步驟包括將4億奶牛原精添加到15ml離心管中，用緩沖液至3.0ml，1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml，1ml，1.5ml和2ml上清液。所述緩沖液組成為<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>所述熒光染料是Hochest33342(產(chǎn)地美國)，濃度5mg/ml(摩爾濃度8.898rnM)。所述奶牛精子與熒光染料的比例為1億個精子45微升熒光染料。本發(fā)明的新型熒光染色方法的優(yōu)點是由于奶牛精液在染色前去掉部分精漿，減少了精漿及其所包含的其它成份對染色的干擾，提高了熒光染料對精子的染色效果，染色后X/Y精子熒光強度差別大，精子易于分選分離等優(yōu)點，同時，能夠一定程度降低熒光染料的使用量，提高分離精子的質(zhì)量。以下附圖僅旨在于對本發(fā)明做示意性說明和解釋，并不限定本發(fā)明的范圍。其中，圖la是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖lb是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖2a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖2b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖3a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖3b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1.5ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖4a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄2ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖4b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄2ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖5a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖5b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離速度比較圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖5c是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖6a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖6b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1ml上清液，再進行染色和分離得到的分離速度比較圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖6c是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖7a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖7b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1.5ml上清液，再進行染色和分離得到的分離速度比較圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖7c是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄1.5ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)；圖8a是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄2ml上清液，再進行染色和分離得到的分離效果圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖8b是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄2ml上清液，再進行染色和分離得到的分離速度比較圖；橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示熒光強度；圖8c是顯示1600rpm離心5分鐘，分別吸棄2ml上清液，再進行染色和分離得到的染色效果圖。橫坐標表示熒光強度，縱坐標表示精子細胞數(shù)。具體實施例方式為了對本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和效果有更加清楚的理解，現(xiàn)對照本發(fā)明的具體實施方式。實施例1:材料1.4億奶牛原精(牛號11105825，原精濃度7.3億/ml)2.緩沖液組成HEPES，分子式<:61112^045，濃度9.52X10—3g/ml，摩爾濃度40.OOmM;氯化鎂六水合物結(jié)晶，分子式MgCl26H20，濃度0.08X10—3g/ml，摩爾濃度0.40mM;氯化鈉，分子式NaCl，濃度5.518X10—^/ml，摩爾濃度95.OOmM;氯化鉀，分子式KC1，濃度0.224X10—3g/ml，摩爾濃度3.OOmM;磷酸氫二鈉/無水，分子式Na2HP04，濃度0.04X10—3g/ml，摩爾濃度0.30mM;碳酸氫鈉，分子式NaHC03，濃度0.84X10—Vgml，摩爾濃度10.OmM;丙酮酸，分子式NaPyruvate，濃度0.22X10—3g/ml，摩爾濃度2.OOmM;葡萄糖，分子式(^1206，濃度0.90X10—^/ml，摩爾濃度5.OOmM;乳酸，60%Syrupml，分子式NaLactate，濃度3.61X10—3g/ml，摩爾濃度25.OOmM;牛血清白蛋白，分子式BSA，濃度3.0X10—3g/ml;0.25ml的濃度為10mg/ml的慶大霉素溶液。3.分離機型號XDP，產(chǎn)自美國步驟如下(1)將奶牛原精添加到15ml離心管中，用緩沖液稀釋奶牛原精至3.Oml，1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml，1ml，1.5ml和2ml上清液，完成離心去除奶牛精液中的精漿的步驟；(2)奶牛精子的熒光染色將去除部分精漿的牛精子按1億個精子4微升熒光染料hochest33342混合，34。C水浴45分鐘；(3)通過流式細胞儀分離染色的牛精子，分離操作過程如下a)選擇分離模式Purify1;b)把樣品置于加樣站中，打開加樣器上的壓力和樣品開關(guān)，按boost使樣品從tip流出，調(diào)整樣品壓力使triggerrate保持在25000;c)精細調(diào)整圖形達到最清晰，一旦開始分離不可以移動影響dropdelay的旋鈕；d)Summit4.0軟件上選擇分離，R2選取X區(qū)域；e)約15分鐘搖動收集管，保證精子活力，每管樣品分離時間不超過l小時，并記錄機器狀態(tài)和分離情況。結(jié)果顯示精漿去除的越多X/Y精子的熒光強度差異越大，分離效果越好，如圖la至圖4b所示，紅色圖形上邊群體為X精子，下邊為Y精子，這兩個群體分開越明顯說明染色效果越好，分離效果也越好、效率越高。綠色圖形開叉越大說明染色效果越好。實施例2:材料61.4億奶牛原精(牛號11103411，原精濃度9.2億/ml)2.分離機型號SX-Moflo，產(chǎn)自美國步驟如下(1)將奶牛原精添加到15ml離心管中，離心5分鐘，分別吸棄0.5ml，lml，1.5ml和2ml上清液，完成離心去除奶牛精液中的精漿的步驟；(2)奶牛精子的熒光染色將去除部分精漿的牛精子按1億個精子5微升熒光染料hochest33342混合，34。C水浴45分鐘；(3)通過流式細胞儀分離染色的牛精子，分離操作過程如下a)選擇分離模式Purify1;b)把樣品置于加樣站中，打開加樣器上的壓力和樣品開關(guān)，按boost使樣品從tip流出，調(diào)整樣品壓力使triggerrate保持在30000;c)精細調(diào)整圖形達到最清晰，一旦開始分離不可以移動影響dropdelay的旋鈕；d)Summit4.0軟件上選擇分離，R2選取X區(qū)域；e)約15分鐘搖動收集管，保證精子活力，每管樣品分離時間不超過l小時，并記錄機器狀態(tài)和分離情況。結(jié)果顯示精漿去除的越多X精子的分離效果越好，分離速度越快，如圖5a至圖8c所示。以上實施例中的緩沖液還可以用stainingTALP代替，(Tyrode'salbuminlactatepyruvatemedium)，由Tyrode液添力口白蛋白、乳酸禾口丙嗣酸組成，再選擇添加肝素、?；撬?、腎上腺素、青霉素、咖啡因，(1onophore)A23187等。熒光染料也可使用hochest33258，但由于hochest33258穿透能力較hochest3334弱，染活細胞時容易被〃泵出〃，也就是拒染。故這里選擇熒光染料hochest33342。權(quán)利要求一種用于奶牛精子分離的熒光染色方法，包括以下步驟(1)通過離心去除奶牛精液中的精漿；(2)奶牛精子的熒光染色將去除部分精漿的牛精子按一定比例與熒光染料混合，34℃水浴45分鐘；(3)通過流式細胞儀分離染色的牛精子。2.如權(quán)利要求l的染色方法，其中，所述步驟(1)是將奶牛原精直接離心后吸棄上層的精漿或者先用緩沖液稀釋奶牛原精，然后進行離心并吸棄上層的精漿。3.如權(quán)利要求2的染色方法，其中，所述稀釋奶牛原精的步驟包括將4億奶牛原精添加到15ml離心管中，用緩沖液稀釋至3.0ml，1600rpm離心5分鐘，分別吸棄0.5ml，lml，1.5ml和2ml上清液。4.如權(quán)利要求1的染色方法，其中，所述分離操作過程如下a)分離機型號為SX-Moflo或XDP，產(chǎn)地為美國；b)分離模式選擇Purify1;c)把樣品置于加樣站中，打開加樣器上的壓力和樣品開關(guān)，按boost使樣品從tip流出，調(diào)整樣品壓力使triggerrate保持在30000以下；d)精細調(diào)整圖形達到最清晰，一旦開始分離不可以移動影響dropdelay的旋鈕；e)Summit4.0軟件上選擇分離，R2選取X區(qū)域；f)約15分鐘搖動收集管，保證精子活力，每管樣品分離時間不超過1小時，并記錄機器狀態(tài)和分離情況。5.如權(quán)利要求3的染色方法，其中，所述緩沖液的組分為HEPES，分子式(^12^045，濃度9.52X10—^/ml，摩爾濃度40.OOrnM;氯化鎂六水合物結(jié)晶，分子式MgCl26H20，濃度0.08X10—3g/ml，摩爾濃度0.40mM;氯化鈉，分子式NaCl，濃度5.518X10—^/ml，摩爾濃度95.OOrnM;氯化鉀，分子式KCl，濃度0.224X10—^/ml，摩爾濃度3.OOrnM;磷酸氫二鈉/無水，分子式Na2HP04，濃度0.04X10—3g/ml，摩爾濃度0.30mM;碳酸氫鈉，分子式NaHC03，濃度0.84X10—^/ml，摩爾濃度10.OmM;丙酮酸，分子式NaPyruvate，濃度0.22X10—3g/ml，摩爾濃度2.OOmM;葡萄糖，分子式C6H1206，濃度0.90X10—3g/ml，摩爾濃度5.OOmM;乳酸，60%Syrupml，分子式NaLactate，濃度3.61X10—3g/ml，摩爾濃度25.OOmM;牛血清白蛋白，分子式BSA，濃度3.0X10—3g/ml;0.25ml的濃度為10mg/ml的慶大霉素溶液。6.如權(quán)利要求l的染色方法，其中，所述熒光染料是Hochest33342。7.如權(quán)利要求l的染色方法，其中，所述奶牛精子與熒光染料的比例為l億個精子45微升熒光染料。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于奶牛精子分離的熒光染色方法，包括奶牛精液在染色前通過離心去除部分精漿，將去除部分精漿的精子按一定比例與熒光染料混合進行染色。這種新型熒光染色方法具有染色效果好、染色后X/Y精子熒光強度差別大、精子易于分選分離等優(yōu)點，不但提高了精子分離效果、效率，而且提高了種公牛的利用率。文檔編號G01N1/30GK101793641SQ201010146370公開日2010年8月4日申請日期2010年4月14日優(yōu)先權(quán)日2010年4月14日發(fā)明者周文忠,李喜和,王建國,錢松晉申請人:內(nèi)蒙古蒙牛繁育生物技術(shù)股份有限公司