專利名稱：精子的保藏和處理系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及精子的保藏和精子的處理。本發(fā)明可應(yīng)用于人工授精、體外受精、超數(shù)排卵、哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)、精子樣品和精子的處理，所述處理包括收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精等特征。
背景技術(shù)：
為了試圖提高牲畜的生育率，已通過(guò)諸如人工授精或體外受精等技術(shù)來(lái)使哺乳動(dòng)物的卵(有時(shí)指卵母細(xì)胞)受精。而且，隨著安全而可靠的分選方法的發(fā)展，如普通或?qū)ｉT將精子分離成富含X染色體群體或Y染色體群體的方法的發(fā)展，已在許多種牲畜中有效地實(shí)現(xiàn)了性別的預(yù)先選擇。通常，可以由本文和以下多個(gè)專利申請(qǐng)或?qū)＠_的內(nèi)容實(shí)現(xiàn)富含Y染色體精子與富含X染色體精子的分離，以及收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精等技術(shù)，這些技術(shù)統(tǒng)稱精子和精液的處理；所述專利申請(qǐng)或?qū)＠鏟CT/US99/17165、PCT/US01/45023、PCT/US01/15150、PCT/US98/27909、PCT/US01/45237、PCT/US01/18879、PCT/US00/30155、PCT/US01/02304、美國(guó)專利號(hào)6,071,689和專利號(hào)6,372,422、美國(guó)分案申請(qǐng)?zhí)?0/081,955、美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/400,486和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/400,971，在此將其以參考的方式引入本文。
盡管過(guò)去幾年中，在精子的收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精(統(tǒng)稱精子的處理)中所用的各種各樣的設(shè)備和方法有了很大的改進(jìn)，但在保持精子的質(zhì)量、精子的保藏性和刺激性方面，特別是在人工授精(體內(nèi))和體外受精(IVF)過(guò)程中，仍存在很大的問(wèn)題，所述精子的質(zhì)量例如生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性。一個(gè)可能的結(jié)果是受精率的降低?？梢灾苯釉隗w外(例如，在IVF過(guò)程中)和體內(nèi)(例如人工授精過(guò)程中)比較精子質(zhì)量，例如分成富含X染色體和Y染色體的精子的生存力，而在傳統(tǒng)的精子處理中，精子質(zhì)量通常都降低。更籠統(tǒng)一些，用于精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性、保藏、刺激、受精和授精的傳統(tǒng)處理技術(shù)可能沒(méi)有產(chǎn)生較好的或足夠的例如受精率或精子質(zhì)量。
作為傳統(tǒng)精子處理的一個(gè)例子，例如，在諸如精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性等精子質(zhì)量、受精率以及可能其它的有限特性或特征方面，用于繁殖哺乳動(dòng)物的精子分選技術(shù)是受到限制的。例如，如果分選儀器與雄性個(gè)體，或者與需要用處理后的精子進(jìn)行處理的待授精雌性受體或者待受精的卵距離較遠(yuǎn)時(shí)，精子的質(zhì)量、受精率及其它特性或特征可能會(huì)受到負(fù)面影響。例如，當(dāng)在將精子運(yùn)輸?shù)椒诌x儀器時(shí)可以使用一些以參考的方式引入本文的技術(shù)以及一些傳統(tǒng)的技術(shù)進(jìn)行保藏，這可以一定程度上獲得精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性以及理想的受精率。然而，特別是在任何一個(gè)精子的處理步驟中或多個(gè)步驟的組合中，很好地獲得精子質(zhì)量和其他特征的技術(shù)，可能是比較理想的，所述精子質(zhì)量例如生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性，其他特征例如精子的刺激性、保藏性、保持或提高的受精率。所述處理特征可能包括例如收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精，特別是從分選儀器到受精地點(diǎn)(可能通過(guò)收集的個(gè)別樣品或“授精管(straw)”)對(duì)分選出的精子進(jìn)行保藏，或在任何其他精子處理階段中對(duì)精子進(jìn)行保藏。
傳統(tǒng)精子處理的另一個(gè)局限性的例子是，由于處理相關(guān)的類型和程度，傳統(tǒng)的處理技術(shù)在例如以下方面有些局限性統(tǒng)稱為精子質(zhì)量的精子生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性等、精子刺激性、精子保藏性和受精率。已知的諸如保藏或分選這些處理技術(shù)會(huì)降低精子的質(zhì)量、進(jìn)而降低受精率。在有些需要進(jìn)一步采取精子的保藏措施的情況下，已證明有精子質(zhì)量和受精率降低的問(wèn)題，所述情況例如在分選儀器與雄性個(gè)體或者與需要用處理后的精子進(jìn)行處理的待授精或者待受精的雌性受體較遠(yuǎn)時(shí)。盡管人們或許已經(jīng)認(rèn)識(shí)到傳統(tǒng)的保藏技術(shù)是給精子質(zhì)量、受精率或其它相關(guān)特性或結(jié)果帶來(lái)負(fù)面影響的因素，但是，迄今為止在精子保藏的過(guò)程中，或經(jīng)確定為與精子保藏相關(guān)的過(guò)程中，或者總體上的精子處理過(guò)程中，沒(méi)有克服可能確定的精子質(zhì)量的降低和受精率的降低。
通常認(rèn)為在對(duì)精子和富含精子的精液進(jìn)行處理過(guò)程中，一些附加步驟會(huì)導(dǎo)致精子質(zhì)量的降低和授精率的下降，以至于通常應(yīng)避免附加的處理步驟。具體地，通常還認(rèn)為處理過(guò)程例如保藏，特別是深低溫保藏和分選可能會(huì)給精子帶來(lái)過(guò)大破壞，特別是在既涉及深低溫保藏，以及涉及分選的連續(xù)處理過(guò)程中。而且，傳統(tǒng)的方法建議并教導(dǎo)精子保藏，例如在前處理步驟后進(jìn)行深低溫保藏，以便保藏用于后續(xù)處理例如體內(nèi)或體外技術(shù)的精子，在精子和技術(shù)本身沒(méi)有損害到使后續(xù)處理的結(jié)果也受到負(fù)面影響的程度的情況下，則不能實(shí)施保藏。相應(yīng)地，這些觀點(diǎn)甚至已在傳統(tǒng)的處理過(guò)程得到證明，并教導(dǎo)了不進(jìn)行后續(xù)的處理步驟如分選和深低溫保藏、或具有多步深低溫保藏的處理步驟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了與降低精子的特性或特征有關(guān)的多種以前已經(jīng)明確的和可能未描述的問(wèn)題，所述特性或特征為精子的質(zhì)量(包括生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性)、刺激性、保藏性及精子的其他特性。并進(jìn)一步研究了可能已經(jīng)過(guò)或?qū)⒔?jīng)過(guò)收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精中的一個(gè)步驟或一個(gè)以上的步驟處理的精子以及可能的受精率降低。本發(fā)明還可以解決與精子質(zhì)量有關(guān)的問(wèn)題和可能造成的受精率的降低，所述精子為被分離成富含X染色體和Y染色體群體的精子，其可能為通過(guò)流體分選等技術(shù)分選出來(lái)的精子。更廣泛地，本發(fā)明可解決在體內(nèi)人工授精和體外受精中通常出現(xiàn)的授精率低問(wèn)題，和精子的質(zhì)量問(wèn)題如精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性等問(wèn)題。本發(fā)明還解決了以下問(wèn)題并得到了本領(lǐng)域技術(shù)人員預(yù)料不到的結(jié)果，所述問(wèn)題如刺激性、保藏性、受精率以及提高或保持的生育力特征如胚泡發(fā)育率、在體內(nèi)的發(fā)育能力、妊娠率和和細(xì)胞分裂。而且，本發(fā)明也描述了為獲得期望的妊娠率所必須的經(jīng)處理的精子的數(shù)量，以及進(jìn)一步考慮分別由經(jīng)分選保藏的精子和未經(jīng)分選保藏的精子所獲得的妊娠率。
自然的，在后續(xù)的描述中將會(huì)公開本發(fā)明的另一些重要目的和目標(biāo)。
因此，為了達(dá)到本發(fā)明的多種目的和目標(biāo)，在一些實(shí)施方式中本發(fā)明可包括一種處理精子樣品的方法，其步驟包括獲取精子，將精子深低溫保藏、將精子解凍、將精子進(jìn)行處理、將精子深低溫保藏。還公開了相應(yīng)的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法和哺乳動(dòng)物及精子樣品。
此外，本發(fā)明的實(shí)施方案還可包括精子的處理方法，所提供的步驟為獲取精子、將精子深低溫保藏、將精子解凍、將精子進(jìn)行處理以及將精子深低溫保藏。本發(fā)明的另一實(shí)施方案可包括生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其包括以下方法步驟獲取精子、將精子深低溫保藏、將精子解凍、分選精子、將精子深低溫保藏、將精子解凍、給至少一個(gè)卵受精，從至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
而且，為了達(dá)到本發(fā)明的多種目的和目標(biāo)，本發(fā)明的一些實(shí)施方案是針對(duì)人工授精(體內(nèi))和體外受精過(guò)程的，也有一些實(shí)施方案是針對(duì)超數(shù)排卵過(guò)程的。另外，一些實(shí)施方案還可進(jìn)一步涉及哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物胚胎的生產(chǎn)，以及進(jìn)一步涉及確定精子樣品以及精液的處理，所述精子樣品如授精管、丸狀樣品(pellet)、授精劑量或其它制備的精子樣品。
發(fā)明的另一些實(shí)施方案會(huì)在本發(fā)明的說(shuō)明書和下面的權(quán)利要求書中進(jìn)行公開。


正表A中每一個(gè)申請(qǐng)中包括的每一個(gè)圖均以參考的方式引入本文作為本發(fā)明說(shuō)明書的一部分。
圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
圖2是本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
圖3是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
圖4是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案的流程圖。
圖5是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，在某些實(shí)施方案中，可能會(huì)結(jié)合圖1的實(shí)施方案一起提供。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明公開了精液和精子的處理和保藏技術(shù)，并且公開了保藏、刺激、受精和授精對(duì)一個(gè)或一個(gè)以上的精子特征或精子的質(zhì)量、刺激性、保藏性和受精率的影響，所述精子質(zhì)量例如細(xì)胞的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性。本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)一步公開了增強(qiáng)或保持的授精特性，例如胚泡的發(fā)育率、體外發(fā)育能力和妊娠率或者細(xì)胞分裂。可以在各種各樣的處理技術(shù)，例如收集、加工、分離、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精等處理技術(shù)中研究精子的特征或精子的質(zhì)量。
精子的質(zhì)量可能是以前提及的或在這里會(huì)進(jìn)一步提及的精子的各種屬性中的一種或多種，如生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性；甚至可能被認(rèn)為是精子的發(fā)育特性中的一種或多種。精子的特征可以指一個(gè)或一個(gè)以上的精子的生物學(xué)、化學(xué)、物理、生理學(xué)或功能屬性等多種特征的一種或多種，例如細(xì)胞攜帶的染色體的特性，在一些實(shí)施方案中可指以前描述的精子的質(zhì)量。
生育特性能得以增強(qiáng)或保持，所述生育特征可以包括胚泡發(fā)育力、體內(nèi)發(fā)育能力、妊娠率或細(xì)胞分裂。
精液或精子的處理技術(shù)可以指保藏、刺激、授精、受精、分選、選擇、分離、解凍中的一種或多種的組合，也可能專門針對(duì)收集、加工、選擇、貯存、運(yùn)輸、使用、受精或授精技術(shù)中的一種或多種的組合。
精子樣品可以指含有精子的物質(zhì)，可能帶有精液、液體載體或其他物質(zhì)，并可包括一個(gè)或多個(gè)的丸狀樣品、授精管、授精劑量或其他制備的精子樣品。
精子可根據(jù)本發(fā)明得以保持或改良，在一些實(shí)施方案中也得以保持或改良，并且可根據(jù)受精及授精技術(shù)體現(xiàn)出來(lái)，所述實(shí)施方案例如精子的保藏，或更寬泛的精子的處理，例如通過(guò)在精子分選或精子保藏中的處理步驟。實(shí)施方案可以包括精子保藏的幾個(gè)成分特性或其他的處理技術(shù)，這些在以前提及的專利和專利申請(qǐng)中公開過(guò)以及在下面會(huì)進(jìn)一步描述，每一個(gè)以參考方式明確引用的參考文獻(xiàn)均達(dá)到與本發(fā)明相符的程度。
正如下面會(huì)進(jìn)一步述及的那樣，在一些實(shí)施方案中精子也能通過(guò)保藏和刺激技術(shù)得以保持和改良，與前邊提及的專利申請(qǐng)和專利中的處理、刺激、保藏、受精和授精技術(shù)配合使用也會(huì)得以保持和改良。
因此，本發(fā)明可以體現(xiàn)為精子的處理方法。參見圖1，在流程圖中顯示一些實(shí)施方案中的精子處理步驟。獲取精子10并將精子深低溫保藏20。然后將精子解凍14，接著進(jìn)行后續(xù)的深低溫保藏16步驟。這些特性中的每一個(gè)都將在下面進(jìn)一步描述。圖2顯示了本發(fā)明的另一個(gè)精子處理實(shí)施方案，其與圖1所示特征一致。該實(shí)施方案提供了步驟20、步驟22、步驟24和步驟26，這些與圖1中的實(shí)施方案一致，該實(shí)施方案還進(jìn)一步提供了確定至少一個(gè)精子樣品的步驟。精子樣品可以包括前邊述及的任一精子樣品，并與下邊將進(jìn)一步描述的一致。
本發(fā)明還可進(jìn)一步體現(xiàn)為生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，這和圖1中的實(shí)施方案一致，這在圖3的步驟30、步驟32、步驟34和步驟36可以很容易的辨別出來(lái)。來(lái)自于特征36的精子使至少一個(gè)卵受精38，并從至少一個(gè)的卵中生產(chǎn)出哺乳動(dòng)物40。這些特性中的每一個(gè)同樣都會(huì)在下面進(jìn)一步描述。
圖4顯示了本發(fā)明的精子處理的實(shí)施方案。如圖所示以及對(duì)前面描述的特征進(jìn)行詳細(xì)表述，可從哺乳動(dòng)物源獲取精子50，既可以直接獲取該精子，也可以通過(guò)多種方法獲取，如通過(guò)貯存設(shè)備?？蓪⒕由畹蜏乇２?2。深低溫保藏將在本發(fā)明的下面實(shí)施方案中進(jìn)一步闡述。接著，可將精子解凍54。在再次對(duì)精子進(jìn)行深低溫保藏58前進(jìn)一步對(duì)精子進(jìn)行處理56。
總體上的精子處理和前述的過(guò)程可以獨(dú)立于授精和受精技術(shù)而完成，或作為這些技術(shù)的一部分或與這些技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。上面過(guò)程中的每一個(gè)都可以分別在超數(shù)排卵技術(shù)中實(shí)施。因此，如圖5所示，本發(fā)明的一些實(shí)施方案是生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法。經(jīng)上述處理之后，或在一些實(shí)施方案中經(jīng)過(guò)特征50至58后，可使至少一個(gè)卵受精62。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將精子解凍60，并用精子使至少一個(gè)卵受精62。然后由處理后的精子受精的卵中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物64。在一些實(shí)施方案中描述了另外一些處理步驟例如精子的分選，優(yōu)選在第一次解凍54后進(jìn)行所述另外的處理步驟。
而且，例如如前所述的本發(fā)明的實(shí)施方案支持體內(nèi)和體外技術(shù)。因此，雌性哺乳動(dòng)物可以被從它的同類動(dòng)物所獲取的精子授精，所述精子例如前面已提到經(jīng)處理的精子或經(jīng)分選和深低溫保藏的精子。授精技術(shù)可以包括用精子使至少一個(gè)雌性動(dòng)物授精，提供的精子可能是解凍的、或有時(shí)是在未解凍的環(huán)境中的深低溫保藏精子，這些精子可能采用丸狀樣品或是以前提及的其他精子樣品形式。如果例如精子的質(zhì)量在處理精子或生產(chǎn)哺乳動(dòng)物中能夠得以保持或改良的話，優(yōu)選解凍后的精子。但是，在授精中也可以使用未解凍的、深低溫保藏的精子，而且如果例如精子在雌性體內(nèi)解凍是可接受的，且如果希望減少子宮外的步驟如精子處理，優(yōu)選用未解凍的深低溫保藏的精子。而且，總的來(lái)說(shuō)可以用未解凍的深低溫保藏的精子來(lái)完成本發(fā)明的人工授精和體外受精技術(shù)，所述未解凍的深低溫保藏獨(dú)立于其他處理特征或與其他處理特征配合，所述其他處理特征如解凍，后續(xù)的深低溫保藏、分選、或本發(fā)明公開的其他步驟。也可完成如精子的分選這些處理步驟。
可用如前所述的至少一個(gè)精子樣品進(jìn)行授精。可使至少一個(gè)卵受精并從該至少一個(gè)受精卵中生產(chǎn)哺乳動(dòng)物?？筛鶕?jù)體外過(guò)程在體外使至少一個(gè)卵受精?？蓪⑦@至少一個(gè)受精卵轉(zhuǎn)移到雌性受體中，可生產(chǎn)哺乳動(dòng)物胚胎，或在一些實(shí)施方案中，從該至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
本發(fā)明還包括超數(shù)排卵技術(shù)?？墒鼓撤N動(dòng)物的雌性個(gè)體超數(shù)排卵，在一些實(shí)施方案中，超數(shù)排卵的雌性個(gè)體可由精子授精，并使至少一個(gè)卵受精。在另一些實(shí)施方案中，獲取超數(shù)排卵雌性個(gè)體的至少一個(gè)卵，并在體外使該至少一個(gè)卵受精。在人工授精或體外受精技術(shù)中，可將這至少一個(gè)的受精卵轉(zhuǎn)移到雌性受體中。
如前所述，精子的處理方法可包括確定精子的至少一個(gè)精子樣品。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案中可包括與前描述的實(shí)施方案相一致的精子處理的方法，如圖2所示，包括確定精子的至少一個(gè)精子樣品這個(gè)特征。在一些實(shí)施方案中，這確定的至少一個(gè)精子樣品會(huì)成為后續(xù)深低溫保藏步驟的對(duì)象，也就是說(shuō)將該至少一個(gè)精子樣品深低溫保藏。
由于采用傳統(tǒng)的處理技術(shù)，以前認(rèn)為這些處理的精子和確定的精子樣品，不能得到足夠的精子質(zhì)量或受精能力。但是，本發(fā)明的一些優(yōu)選的實(shí)施方案表明如以下多個(gè)實(shí)施方案所述，精子樣品能使雌性哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)卵受精；更進(jìn)一步，用這至少一個(gè)精子樣品使這種雌性個(gè)體授精，并在一些實(shí)施方案中，用這至少一個(gè)精子樣品使雌性哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)卵受精。在一些實(shí)施方案中，精子樣品的受精能力的特性延伸到了使某種超數(shù)排卵的雌性哺乳動(dòng)物受精的能力，以及用至少一個(gè)精子樣品來(lái)使這種超數(shù)排卵的雌體個(gè)體授精的能力。在一些實(shí)施方案中，精子樣品的受精能力特性還延伸到了體外使至少一個(gè)卵受精的能力，以及用至少一個(gè)精子樣品在體外使至少一個(gè)卵受精的能力。更進(jìn)一步的實(shí)施方案提供確定至少一個(gè)能使至少一個(gè)雌性哺乳動(dòng)物授精的精子樣品以及用所說(shuō)的至少一個(gè)精子樣品使所述的至少一個(gè)雌體個(gè)體授精的步驟。與精子樣品的受精能力和以上所述的其他特征一致，本發(fā)明提供大量卵的受精，甚至哺乳動(dòng)物胚胎的生產(chǎn)，可被轉(zhuǎn)移到雌性受體中的胚胎，以及廣泛的哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)，例如哺乳動(dòng)物的后代的生產(chǎn)。描述精子樣品能力的本發(fā)明的實(shí)施方案可進(jìn)一步包括利用所述經(jīng)深低溫保藏處理的精子生產(chǎn)至少一個(gè)預(yù)先選擇性別的動(dòng)物。再次說(shuō)明，可相應(yīng)地確定精子樣品，使其成為授精管、丸狀樣品、授精劑量或其他制備的精子樣品。
有人會(huì)認(rèn)為前述的每一個(gè)實(shí)施方案和下面將進(jìn)一步描述的實(shí)施方案偏離傳統(tǒng)的精子處理、哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)、哺乳動(dòng)物胚胎的生產(chǎn)和精子樣品的確定。傳統(tǒng)認(rèn)為這些處理精子的方法不能有效地確保精子的質(zhì)量，或不能提供足夠高的授精率、受精率或妊娠率。但是，正如在多種引用的參考文獻(xiàn)中所教導(dǎo)的那樣，實(shí)際上為了以下目的可對(duì)精子進(jìn)行處理，所述目的例如是為了分選精子，可能是去區(qū)分精子是含X染色體的精子還是含Y染色體的精子，或在一些情況下對(duì)哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物胚胎進(jìn)行性別的預(yù)先選擇。本發(fā)明也為這些處理過(guò)程，而且在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供額外的保藏特性，這些特征是迄今為止傳統(tǒng)認(rèn)為商業(yè)上不可行的，或不可能的，并且迄今為止本發(fā)明為那些以前已確定但仍未解決的問(wèn)題提供了解決方案。
迄今為止，精液，特別是精子，可由本發(fā)明的哺乳動(dòng)物獲取或者處理，這些哺乳動(dòng)物包括馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物、貓科動(dòng)物、羊科動(dòng)物(ovids)、犬科動(dòng)物、水牛、牛、麋鹿、豬或其它哺乳動(dòng)物種類。更進(jìn)一步，一些實(shí)施方案可提供從珍奇哺乳動(dòng)物種類、瀕危哺乳動(dòng)物種類、稀有哺乳動(dòng)物種類、甚至動(dòng)物學(xué)樣品或個(gè)體中獲取和處理精液。并可根據(jù)前述及下面詳細(xì)描述的技術(shù)，由此生產(chǎn)哺乳動(dòng)物或哺乳動(dòng)物的胚胎。如前所述，在一些實(shí)施方案中，確定了精子樣品。
例如可以通過(guò)冷凍將精子樣品深低溫保藏，深低溫保藏可以使用多種保藏技術(shù)，例如用Hepes(N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)緩沖的冷藏稀釋劑(crydiluent)冷藏。精子可以丸狀樣品或授精管的形式提供，而且例如公羊精子可用多種解凍技術(shù)解凍?？稍趯?duì)精子進(jìn)行處理的過(guò)程中提供其它精子樣品，并且當(dāng)該精子樣品被確定為精子樣品時(shí)或?qū)⑵溆糜谑诰蚴孤咽芫珪r(shí)可以經(jīng)深低溫保藏也可以不經(jīng)深低溫保藏。
可以在精液、精子或精子樣品中單獨(dú)加入或聯(lián)合加入一種或一種以上的添加物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可向精子樣品中加入冷藏稀釋劑以用來(lái)保藏精子。向精子樣品中加入一種或多種添加物，在一些深低溫保藏步驟或具有深低溫保藏(有時(shí)稱冷凍)步驟的實(shí)施方案中，所述添加劑例如為冷藏稀釋劑。添加物的加入可以保持或改良精子，可進(jìn)一步保持或改良精子的質(zhì)量，所述質(zhì)量例如精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性，和可保持或刺激性、受精率及其它一個(gè)或一個(gè)以上的可能的精子特性。在本發(fā)明的另一些實(shí)施方案中，可以從精子樣品中去除單獨(dú)加入或聯(lián)合加入的一種或多種諸如冷藏稀釋劑等添加物。在一些具有深低溫保藏的實(shí)施方案中從精子樣品中去除冷藏稀釋劑或其他添加物，還可以保持或改良精子，可更進(jìn)一步保持或改良精子的質(zhì)量、受精率及其他可能的一個(gè)或一個(gè)以上的精子特性，所述保持或改良精子的質(zhì)量例如保持或改良精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性。
作為所公開的技術(shù)的一部分，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中精子得以保持或改良，并且精子的質(zhì)量和其它可能的一個(gè)或一個(gè)以上的精子特性可進(jìn)一步得以保持和提高，所述精子的質(zhì)量例如生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性。而且，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)特征和下面將進(jìn)一步描述的內(nèi)容，受精率至少可得以保持，甚至有了提高。受精特性也可得以保持或提高，在一些實(shí)施方案中，胚泡發(fā)育力可得以提高，單精子受精作用至少得以保持或提高，分裂率至少得以保持或提高。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，如前所述，精子樣品可通過(guò)以下方法來(lái)保藏，所述方法如深低溫保藏(例如冰凍)，或前面提及的、以參考的方式引入本文專利申請(qǐng)和專利中所公開的其他保藏技術(shù)。在如下描述的一些實(shí)施方案中精子質(zhì)量得以保持。然而，精子質(zhì)量的保持應(yīng)解釋為包含精子特性的改良。例如，本發(fā)明可使精子的運(yùn)動(dòng)力、生存力、功能性得以提高，并且在一些實(shí)施方式中，可使精子樣品中精子的運(yùn)動(dòng)力、生存力、功能性得以提高。
因此，可向精子樣品中單獨(dú)加入或聯(lián)合加入冷藏稀釋劑或其他添加物來(lái)保藏或刺激精子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，向精子樣品中加入冷藏稀釋劑或其它添加物，這種加入有利于通過(guò)深低溫保藏即冷凍精子樣品來(lái)保藏精子，從而保持或改良精子，進(jìn)而保持或提高精子的質(zhì)量及其他可能的一個(gè)或一個(gè)以上的精子特性，所述保持或提高的精子質(zhì)量例如至少保持或提高精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性。如前所述，可在樣品保藏前或樣品保藏過(guò)程中向精子樣品中加入冷藏稀釋劑或其它添加物。然后，可通過(guò)例如前面提及的專利申請(qǐng)及專利中所公開的收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精等技術(shù)對(duì)所述樣品進(jìn)行處理。
在一個(gè)實(shí)施方案中，向預(yù)先收集的精子樣品中單獨(dú)加入或聯(lián)合加入冷藏稀釋劑或其它添加物，隨后將所述樣品例如通過(guò)冷凍深低溫保藏，接著將樣品解凍，然后進(jìn)行處理，該處理包括收集、加工、分選、貯藏、運(yùn)輸、使用、受精或授精等處理技術(shù)。一個(gè)這種處理步驟可以是分選，在一些實(shí)施方案中將含Y染色體精子與含X染色體精子分離，可能會(huì)分選出一個(gè)或一個(gè)以上的高純度樣品。通過(guò)這種處理技術(shù)有很多好處，其中包括精子質(zhì)量的保持。例如，如前所述的專利申請(qǐng)和專利中描述的多種分選方法，能將含Y染色體精子與含X染色體精子分離，同時(shí)最大限度地降低了對(duì)可生存的精子的損害。更進(jìn)一步，不能生存的精子、污染物、冷藏稀釋劑或其它添加物、可通過(guò)這些分離技術(shù)除去。而且，精子質(zhì)量的其它方面也可得以保持或改良，特別是精子的生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性方面。可在處理過(guò)程中進(jìn)一步對(duì)精子樣品進(jìn)行刺激以保持或改良前面描述的精子質(zhì)量。美國(guó)專利號(hào)5,135,759中了描述本領(lǐng)域已知這樣一種精子處理的方法，其公開了一種流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分選技術(shù)，將其以參考的方式引入本文。
可通過(guò)前述的分選精子的方法對(duì)精子進(jìn)行處理，或在一些實(shí)施方案中，根據(jù)以下方法進(jìn)行處理。在一些實(shí)施方案中，分選可能包括根據(jù)至少一個(gè)理想的特征來(lái)選擇精子，所述理想的特征可能是精子的質(zhì)量特性，如生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性、刺激性和保藏性，或是一個(gè)或一個(gè)以上的精子的生物學(xué)、化學(xué)、物理、生理學(xué)、功能等屬性中的一種或一種以上的特性的組合，例如精子所攜帶的染色體的特性。可對(duì)精子進(jìn)行染色，優(yōu)選用Hoechst 33342或類似的染料或染色劑，或用這些染料或染色劑的組合，并根據(jù)所述染色情況和選擇來(lái)區(qū)分精子。然后根據(jù)精子的差別特征來(lái)分離精子并隨后進(jìn)行收集?？梢酝ㄟ^(guò)引用的參考文獻(xiàn)或以參考的方式作為引用的多種方法對(duì)精子進(jìn)行處理，在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，所述處理包括精子質(zhì)量的保持。
實(shí)施方案1在一個(gè)關(guān)于保藏和處理技術(shù)的實(shí)施方案中，將200μl的解凍后的精子放置在2ml的PurespermTM、人工制備物和基于Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)的稀釋液的分離梯度(90％∶45％)上。然后將梯度制備物在1000g離心15分鐘，去除PurespermTM離心后的沉淀，緩慢地利用溫的基于Tris的稀釋液稀釋4倍，然后在650g離心3分鐘。除去上清液，然后根據(jù)以前描述的辦法對(duì)精子進(jìn)行染色、溫育和分選。將基于Tris稀釋液用作染色介質(zhì)，將Androhep_(minitub，德國(guó))和20％的蛋黃用作收集介質(zhì)。
上述的例子是本發(fā)明技術(shù)的各種實(shí)施方案之一，其提供例如通過(guò)深低溫保藏或者冷凍對(duì)精子進(jìn)行保藏；將精子解凍；例如通過(guò)染色鑒定精子；將精子分選為例如含X染色體精子和含Y染色體精子。
雖然上面的例子提供了精子保藏技術(shù)和精子收集、保藏、解凍和分離等處理技術(shù)，本發(fā)明還包含或明確公開了其他的技術(shù)。例如，收集、加工、分離、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、使用、受精或者授精等多種技術(shù)的一種或者多種結(jié)合可以作為本發(fā)明的有創(chuàng)造性的技術(shù)的一部分進(jìn)行實(shí)施。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以收集精子，然后將含Y染色體精子與含X染色體精子分離。在某些環(huán)境，例如，在收集精子之后可以方便地使用分選器設(shè)備的環(huán)境中，在分離精子之前可能不需要保藏步驟。然后作為附加的步驟，可以將經(jīng)分選的精子樣品或樣品保藏起來(lái)，并且如上文所述，可能用于進(jìn)一步的加工、分離、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、利用、受精或者授精中。可以在處理過(guò)程中對(duì)分選后的精子樣品進(jìn)行刺激以保持和提高如前所述的精子質(zhì)量。下一個(gè)例子描述了處理技術(shù)的一個(gè)例子。
實(shí)施方案2將分選后的樣品在室溫(24℃)于700g離心6分鐘，去掉上清液，分選后的精子可以被“新鮮”地用于AI(人工授精)或者IVF系統(tǒng)；或者使用以Hepes為基礎(chǔ)的冷藏稀釋劑將剩余的沉淀稀釋4倍，該稀釋液可以與對(duì)精子進(jìn)行最初深低溫保藏使用的稀釋液相同，以及使用各種各樣的技術(shù)，例如用那些以前描述過(guò)的和下面描述的技術(shù)進(jìn)行冷凍。使用以下方法對(duì)重新冷凍和分選后的精子進(jìn)行解凍，然后可用于AI或者IVF系統(tǒng)中，所述解凍方法例如將玻璃試管在37℃的水浴中進(jìn)行搖晃。
實(shí)施方案3將從冷凍-解凍沉淀中分選出的精子用于羊科哺乳動(dòng)物的體外受精系統(tǒng)中。用0.5ml的IVF介質(zhì)將用于羊科IVF系統(tǒng)中的冷凍-分選和冷凍-分選-冷凍精子緩慢稀釋，并且在一些實(shí)施方案中，使用羊科IVF的標(biāo)準(zhǔn)程序，放入具有嚴(yán)密的蓋子的Falcon試管中，在300g離心6分鐘。除去上清液，然后將剩余精子以濃度為1,000,000個(gè)有運(yùn)動(dòng)力精子/ml的濃度快速放在IVF池中。優(yōu)選高標(biāo)準(zhǔn)的介質(zhì)制品(即，使用不足24小時(shí)的卵、超速離心蛋黃稀釋液和精細(xì)過(guò)濾)和需要對(duì)樣品進(jìn)行處理(即常溫)。
其他的保藏、加工、受精和授精技術(shù)不需要包括分離步驟。例如，可以收集精液，然后進(jìn)行保藏步驟和后續(xù)的加工、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、使用、受精或者授精。
此外，作為保藏、加工、受精和授精技術(shù)或者是它們的聯(lián)合的一部分，可以進(jìn)行一個(gè)或一個(gè)以上的保藏步驟，在一些實(shí)施方案中這些保藏包括例如將精子樣品進(jìn)行冷凍的深低溫保藏和后續(xù)的解凍步驟，所述保藏可以在進(jìn)行一個(gè)或者一個(gè)以上的其他處理技術(shù)之前、同時(shí)或者之后進(jìn)行。
實(shí)施方案4如前所述，當(dāng)分選器離雄性個(gè)體距離較遠(yuǎn)時(shí)，在繁殖家畜和野生動(dòng)物中使用的精子分選方法可能會(huì)受到限制，但是如果分選深低溫保藏和解凍后的精子，例如冷凍-解凍精子(Lu KH等，Theriogenology 1999521393～1405)，然后深低溫保藏或者重新冷凍它就便利多了?？梢栽谔幚沓ダ洳叵♂屢褐笥觅|(zhì)量得以保持的冷凍-解凍公羊精子進(jìn)行高純度的分選。本研究的目的在于評(píng)估分選以及第二次深低溫保藏/解凍步驟后的冷凍-解凍精子的功能。整個(gè)試驗(yàn)中使用兩個(gè)公羊的冷凍精液(n＝每只公羊的2次射精量)。解凍后的精子處理組包括(i)未分選(對(duì)照)；(ii)分選(冷凍-分選)和(iii)分選后重新冷凍(冷凍-分選-冷凍)。在利用Hoechst 33342和食用色素溫育除去不能存活的精子后，利用高速分選器(SX MoFlo(R)，Cytomation，CO，美國(guó))分離X和Y精子。重新分析顯示所有的處理組均為富含X和Y的高純度樣品(87.0％±4.5％)。對(duì)于IVF，用1×106個(gè)能動(dòng)精子/mL對(duì)472個(gè)IVM(體外成熟)卵母細(xì)胞進(jìn)行授精。在SOF(合成輸卵液)介質(zhì)中培養(yǎng)3小時(shí)后，將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Sydney(悉尼)IVF分裂介質(zhì)(Cook(R)QLD，澳大利亞)中培養(yǎng)4天，然后利用Sydney IVF胚泡介質(zhì)(Cook(R))再在5％O2∶5％CO2∶90％N2培養(yǎng)3天。在授精后(p.i.)24和48小時(shí)測(cè)定卵母細(xì)胞的分裂。在授精后52小時(shí)，利用苔紅素對(duì)未裂變的卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，以確定成熟和受精。可以通過(guò)方差分析(ANOVA)、卡方檢驗(yàn)和費(fèi)歇爾精確試驗(yàn)(FisherExact Test)對(duì)三次重復(fù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在授精時(shí)，冷凍-分選(85.8％±2.4％)和冷凍-分選-冷凍(66.7％±7.7％)的可運(yùn)動(dòng)精子％(±SEM(標(biāo)準(zhǔn)平均誤))比對(duì)照組(36.7％±2.1％)的要高(P＜0.001)。成熟率是95.6％(451/472)。單性生殖對(duì)照組(沒(méi)有精子)的卵母細(xì)胞的分裂很低(2/56；3.6％)。多精子受精很低(9/451；2.0％)，并且處理組之間沒(méi)有差異。
表1、卵母細(xì)胞的受精和早期胚胎發(fā)育，所述卵母細(xì)胞分別與冷凍-解凍的未分選(對(duì)照組)、冷凍-解凍和分選(冷凍-分選)、冷凍-解凍和分選然后再冷凍-解凍(冷凍-分選-冷凍)的公羊精子溫育。括號(hào)中的數(shù)值是百分?jǐn)?shù)。
處理組 受精后的成 授精后進(jìn)行分裂的成熟形成胚泡的分裂后卵母熟卵母細(xì)胞 卵母細(xì)胞的數(shù)量 細(xì)胞的數(shù)量的數(shù)量d24小時(shí) 48小時(shí) 第5天 第6天 第7天對(duì)照 40(67.8)26(44.1) 36(61.0) 4(11.1) 13(36.1) 16(44.4)a冷凍-分選110(63.6) 67(38.7) 109(63.0) 24(22.1) 34(31.2) 57(52.3)ab冷凍-分選- 94(57.7)71(43.6) 91(55.8) 23(25.3) 347(40.7) 59(64.8)bc冷凍d單精受精，各豎欄中，具有不同上標(biāo)的數(shù)值有差異(p＜0.05)所有處理組的受精率和分裂率都一致很高，使用冷凍-分選-冷凍精子受精的卵母細(xì)胞胚泡的發(fā)育率比使用對(duì)照精子受精的卵母細(xì)胞胚泡的發(fā)育率高。這個(gè)結(jié)果證明了冷凍-解凍公羊精子在重新深低溫保藏后可以立即進(jìn)行或者將來(lái)在IVF系統(tǒng)中進(jìn)行性別分選。
上面的例子是本發(fā)明技術(shù)的各種各樣的實(shí)施方案中的一個(gè)，其提供例如通過(guò)深低溫保藏或者冷凍對(duì)精子進(jìn)行保藏；將精子解凍；將精子分選為例如含X染色體精子和含Y染色體精子；通過(guò)深低溫保藏或者冷凍對(duì)所述分選后的精子進(jìn)行保藏；進(jìn)一步包括將精子樣品解凍精子以用于例如受精或者授精。
應(yīng)當(dāng)考慮到保藏和處理過(guò)程的各自生育率，所述過(guò)程例如下一個(gè)例子所描述的對(duì)性別分選和深低溫保藏的精子樣品進(jìn)行分離，以及與本發(fā)明所公開的深低溫保藏、解凍，加工和隨后的深低溫保藏結(jié)合起來(lái)。
實(shí)施方案5利用少量(2×106～4×106)的深低溫保藏的經(jīng)分選性別的精子進(jìn)行人工授精(AI)后生產(chǎn)了羔羊。使用分選后含X或者Y染色體的冷凍-解凍精子進(jìn)行人工授精后的母羊的妊娠率(分別為25％和15％)比采用商業(yè)劑量的未分選過(guò)的冷凍-解凍精子進(jìn)行人工授精后的母羊的妊娠率(54％)低。本研究的目的在于確定與未分選的精子獲得相同妊娠率的所需的經(jīng)分選的、冷凍-解凍精子的最低量。
如前所述，對(duì)來(lái)自2只公羊的單次射精液的精子樣品進(jìn)行染色、溫育、分析并采用改進(jìn)的高速細(xì)胞分選器(MoFlo_Cytomation，F(xiàn)ort Collins，CO，美國(guó))進(jìn)行分選。將未經(jīng)性別分選的精子在15,000～18,000/serc處理放入離心管中，該離心管預(yù)先用鞘液中1％的BSA(牛血清白蛋白)浸泡過(guò)，所述鞘液含有0.2ml的Tris-緩沖液和20％的蛋黃(體積比)。對(duì)于每一個(gè)樣品，對(duì)1.3×106個(gè)精子進(jìn)行性別分選并進(jìn)行分析以確定純度。使用含有13.5％的蛋黃和6％的甘油的兩性離子緩沖稀釋液對(duì)分選和未分選(對(duì)照)樣品進(jìn)行稀釋，并且冷凍成250μl含有5×106個(gè)精子的小丸，利用孕激素棉球劑(sponge)(FGA，Vetrepharm A/Asia，Sydney)插入陰道12天控制144只美利奴(Merino)羊的發(fā)情時(shí)間，在除去棉球劑(SR)時(shí)注射400I.U的PMSG(孕馬血清促性腺激素，Pregnecol，VetrepharmA/Asia)，在除去棉球劑后的36小時(shí)，給134只母羊注射了40μg的GnRH(促性腺素釋放激素，F(xiàn)ertagyl_，Intervet)以控制排卵的時(shí)間。在除去棉球劑57～60小時(shí)后，利用5×106、10×106、20×106、40×106個(gè)分選后或未分選的冷凍-解凍精子，對(duì)111只母羊在子宮中通過(guò)腹腔鏡檢法進(jìn)行了人工授精。13只沒(méi)有給予GnRH的母羊利用商業(yè)劑量的未分選的冷凍-解凍精子進(jìn)行了授精。13只沒(méi)有給予GnRH的母羊在除去棉球劑后57～58小時(shí)利用商業(yè)劑量的未分選的冷凍-解凍精子進(jìn)行了授精?？梢酝ㄟ^(guò)超聲波在第53天診斷妊娠狀況。通過(guò)卡方分析數(shù)據(jù)。
解凍后的精子運(yùn)動(dòng)力是37.8％±1.78％(經(jīng)分選)的和42.9％±0.93％(未經(jīng)分選的)。7/13(53.8％)的沒(méi)有給予GnRH的母羊懷孕，對(duì)于給予GnRH的母羊，妊娠率受授精用精子數(shù)量的影響(p＜0.05)，但是不受公羊或者精子類型的影響(p＞0.05)。對(duì)于利用分選或者未分選(對(duì)照)的冷凍-解凍精子進(jìn)行授精的母羊，使用授精量為10×106和40×106的妊娠率高于使用授精量為5×106和20×106的妊娠率(表1)。這個(gè)結(jié)果表明在接近排卵期的授精時(shí)，為達(dá)到商業(yè)上可接受的妊娠率，所需的最小量是40×106個(gè)分選后的冷凍-解凍精子。
表1利用冷凍-解凍后的對(duì)照組和分選后的公羊精子對(duì)母羊進(jìn)行子宮內(nèi)授精后的妊娠狀況。

ab在同一個(gè)豎列，不同的上標(biāo)有差異(p＜0.05)a本研究得到XY，Inc；CO，美國(guó)；Australian Research Council，Vetrephann A/Asia的支持。
實(shí)施方案6能夠?qū)鋬?解凍精子進(jìn)行分選和重新冷凍將顯著提高精子處理技術(shù)例如精子的性別分離技術(shù)的潛在應(yīng)用，例如用于品種管理。根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，冷凍-解凍、分選、重新冷凍然后解凍的公羊精子在體外表現(xiàn)出更全的功能，其產(chǎn)生胚泡的能力比冷凍-解凍、未分選的精子(Hollingshead FK等，2003 Theriogenology 59 209)的更強(qiáng)。-些實(shí)施方案對(duì)于評(píng)價(jià)體外生成胚胎的體外能力非常有用，所述胚胎由經(jīng)分選和第二次深低溫保藏/解凍步驟后，冷凍-解凍的精子進(jìn)行處理而來(lái)。
本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案的整個(gè)過(guò)程使用2只公羊的冷凍精液(n＝每只公羊的三次射精量)。解凍后的精子處理組包括(i)未分選(對(duì)照)；(ii)經(jīng)分選(冷凍-分選)和(iii)分選然后重新冷凍(冷凍-分選-冷凍)。在利用Hoechst 33342和食用色素進(jìn)行溫育以除去沒(méi)有生存力的精子后，將X和Y精子利用高速分選器進(jìn)行分離(SX MoFlo_，DakoCytomation，F(xiàn)ort Collins，CO，美國(guó))。在一些實(shí)施方案中，重新分析表明在所有的處理組為高純度的富含X染色體和富含Y染色體的樣品(89％±1.2％)。在本發(fā)明實(shí)施的一個(gè)技術(shù)方案中，在受精后的第6天，將2個(gè)胚胎(胚泡階段或者更大)轉(zhuǎn)移給每一個(gè)受體。用卡方和費(fèi)歇爾精確試驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。在本實(shí)施方案中，在體內(nèi)，胚胎的成活率在整個(gè)精液的處理組中都是相同的(28/64，全部為43.8％)，并且20/23(87.0％)經(jīng)性別選擇的羔羊?yàn)轭A(yù)先確定的性別(表2)。本發(fā)明實(shí)施方案的這些結(jié)果可以證明在體外生產(chǎn)的經(jīng)性別分離的胚胎在體內(nèi)的發(fā)育能力很高，由此增加了諸如性別分選技術(shù)等精子處理技術(shù)的潛在應(yīng)用，所述胚胎由經(jīng)過(guò)分選和第二次深低溫保藏/解凍步驟后的冷凍-解凍公羊精子進(jìn)行處理而來(lái)。
表2將體外生產(chǎn)的胚胎轉(zhuǎn)移到體內(nèi)的存活率，所述胚胎由冷凍-解凍的未分選(對(duì)照)、冷凍-解凍并分選(冷凍-分選)和冷凍-解凍，分選然后冷凍-解凍(冷凍-分選-冷凍)的公羊精子進(jìn)行處理而來(lái)。

a通過(guò)血液孕酮化驗(yàn)進(jìn)行診斷。b.通過(guò)超聲波檢查法進(jìn)行診斷。
本發(fā)明可以進(jìn)一步包括如前文定義的精子樣品，例如根據(jù)本發(fā)明中任何上述的實(shí)施方案中生產(chǎn)的授精管和在一些實(shí)施方案中用于IVF中的授精管，所述實(shí)施方案例如任何處理、哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)、哺乳動(dòng)物胚胎的生產(chǎn)、刺激、保藏、受精和授精技術(shù)，并且精子質(zhì)量得以保持或者增強(qiáng)，例如授精管具有理想的生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性，或者其他性質(zhì)，或者諸如本發(fā)明所公開的性質(zhì)等性質(zhì)的組合，在一些實(shí)施方案中，特別是對(duì)于馬科動(dòng)物而言可能會(huì)導(dǎo)致理想水平的受精率。精子樣品例如至少一個(gè)或者多個(gè)授精管可能特別適合單個(gè)胚胎的生產(chǎn)。
本發(fā)明可以進(jìn)一步包括根據(jù)本發(fā)明中任意一種上述實(shí)施方案所生產(chǎn)哺乳動(dòng)物；或者可以包括根據(jù)本發(fā)明的各種各樣提供精子授精樣品的實(shí)施方案獲得的預(yù)先確定性別的哺乳動(dòng)物，所述精子授精樣品具有富含X染色體的精子群體或者富含Y染色體的精子群體；或者根據(jù)本發(fā)明中任意一個(gè)實(shí)施方案生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物，其中精子授精樣品中含有精子比用于使該特定種類哺乳動(dòng)物授精的典型量少；或者根據(jù)上述本發(fā)明公開的內(nèi)容生產(chǎn)的麇鹿后代。
本發(fā)明進(jìn)一步包括本發(fā)明所公開的、和前面提及的專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)所公開的組合特征中可能包含的各種各樣的處理、保藏、刺激、受精、授精、和哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物胚胎的生產(chǎn)技術(shù)。相應(yīng)的，由保藏、刺激、受精、授精、和哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物的胚胎生產(chǎn)系統(tǒng)的實(shí)施方案形式提供的精液和精子的各種各樣處理特征，表明了與前述專利申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)相一致的精子質(zhì)量，例如，諸如生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性或者受精率等一個(gè)或者一個(gè)以上的精子的特征。此外，可以在以下條件下關(guān)注精子特性，所述條件為各種各樣的收集、處理、分離、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、使用、受精或者授精技術(shù)，并且在那些或者其他的各種各樣的實(shí)施方案中在分析、試驗(yàn)、精子的生物學(xué)，化學(xué)、物理、生理學(xué)或者功能等屬性的條件下關(guān)注精子特性。因此，本發(fā)明的系統(tǒng)可以提供精子處理、刺激、保藏、受精和授精，例如引入流式分選技術(shù)、高純度分離技術(shù)、低劑量受精和授精技術(shù)，異精(heterospermic)受精過(guò)程，例如根據(jù)僅有幾個(gè)例子所示，評(píng)價(jià)在分選器中的不同壓力環(huán)境下處理的相對(duì)生存力、運(yùn)動(dòng)力、功能性或者生育力。
無(wú)論是設(shè)備、方法、還是其他，以參考的方式引入本文的公開內(nèi)容，例如所提供的各種各樣將Y染色體精子與X染色體精子分離的各種例子，以及公開的其他有關(guān)收集、處理、分離、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、使用、受精和授精技術(shù)，并不是意味著將本發(fā)明限定到任何特定的實(shí)施方案。以參考方式引入的描述和各種各樣的例子不能解釋為將本發(fā)明僅限定至精子分選技術(shù)或者僅為精子保藏技術(shù)。然而，應(yīng)理解，公開內(nèi)容將各種各樣的技術(shù)并入本發(fā)明的各種實(shí)施方案中。此外，本發(fā)明應(yīng)當(dāng)理解為包含了與公開的特征相一致的精子的處理、保藏、刺激、受精和授精這些技術(shù)。
從上文中，可以很容易理解本發(fā)明的基本觀點(diǎn)，這些觀點(diǎn)可以采用多種方式體現(xiàn)。它包括精子的保藏、精子的處理、精子樣品、包括實(shí)現(xiàn)精子處理的技術(shù)和設(shè)備在內(nèi)的哺乳動(dòng)物或者哺乳動(dòng)物胚胎生產(chǎn)系統(tǒng)。在本申請(qǐng)中，各種精子處理技術(shù)以所描述的各種各樣的設(shè)備所取得的部分成果和以固有的應(yīng)用步驟的形式得以公開。它們僅僅是使用預(yù)期和描述的設(shè)備的自然結(jié)果。此外，當(dāng)一些設(shè)備公開后，應(yīng)當(dāng)理解這些設(shè)備不但可以成功實(shí)施一些確定的方法，而且可以以多種形式加以變化。重要的是，關(guān)于上文的所有內(nèi)容，所有的方面都應(yīng)理解為包括在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。
而且，本發(fā)明及權(quán)利要求的每一不同元件還可以多種方式獲得。本公開內(nèi)容應(yīng)理解為包括每一個(gè)這樣的變化，不論它是任意裝置實(shí)施方案、方法或過(guò)程實(shí)施方案的變更，還是甚至僅僅是其中任意元件的變更。特別是，應(yīng)該理解，由于本公開內(nèi)容涉及本發(fā)明的元件，每一元件的文字可以用等同的裝置術(shù)語(yǔ)或方法術(shù)語(yǔ)來(lái)表達(dá)——甚至僅僅是其具有相同的功能或結(jié)果。應(yīng)認(rèn)為這些等同的、更廣泛的甚至是更上位的術(shù)語(yǔ)包含于各元件或動(dòng)作的描述中。當(dāng)需要使本發(fā)明所包括的隱含的廣泛范圍明確時(shí)，這些術(shù)語(yǔ)可加以替換。
僅舉一個(gè)例子來(lái)說(shuō)，應(yīng)該理解的，是所有的動(dòng)作均可以用執(zhí)行該動(dòng)作的裝置或促使產(chǎn)生該動(dòng)作的元件來(lái)表達(dá)。類似地，每一公開的物理元件應(yīng)理解為包含了對(duì)所述物理元件執(zhí)行的動(dòng)作的公開。就此最后一方面來(lái)說(shuō)，僅舉一個(gè)例子，“深低溫保藏元素”或者“深低溫保藏設(shè)備”或者類似的公開應(yīng)當(dāng)理解為包括了“深低溫保藏”的動(dòng)作的公開——無(wú)論是否明確的討論過(guò)——并且，相反的，如果有效地公開了“深低溫保藏”的動(dòng)作，這樣的公開應(yīng)當(dāng)理解為包括“深低溫保藏器”和甚至“深低溫保藏方式”的公開。這樣的變化和可替換的術(shù)語(yǔ)可以被理解為清楚的包括在說(shuō)明書中。
本專利申請(qǐng)中提及的任何法律、法令、規(guī)章或準(zhǔn)則的條款，或此專利申請(qǐng)中提及的專利、出版物或其他參考文獻(xiàn)均以參考的方式引入本文。另外，對(duì)于所用的每一術(shù)語(yǔ)，應(yīng)當(dāng)理解，除非其在本申請(qǐng)中的應(yīng)用與通用詞典中的解釋不一致，否則應(yīng)當(dāng)認(rèn)為，本文引入了通用詞典中對(duì)各條術(shù)語(yǔ)的定義。在此以參考的方式引入例如Random House Webster’s UnabridgedDictionary(《蘭登書屋韋氏大詞典》)第二版的所有定義、替代術(shù)語(yǔ)和同義詞。最后，以參考方式引入該臨時(shí)專利申請(qǐng)的參考文獻(xiàn)列表中所列出的所有文獻(xiàn)或其他與該申請(qǐng)同時(shí)提交的信息聲明均在此附上，并以參考的方式引入；但是，對(duì)于上述每一項(xiàng)來(lái)說(shuō)，這些以參考方式引入的信息或聲明可被認(rèn)為與此/這些發(fā)明的專利權(quán)不一致，很清楚這樣的聲明不能認(rèn)為是本申請(qǐng)人所做出的。
這樣，應(yīng)當(dāng)理解申請(qǐng)人至少要求以下權(quán)利i)這里公開和描述的每一個(gè)精子處理方法、哺乳動(dòng)物生產(chǎn)方法、精子樣品、哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物胚胎；ii)所公開和描述的相關(guān)的系統(tǒng)、裝置和多個(gè)設(shè)備；iii)這些各系統(tǒng)和方法的類似、等同甚至是隱含的變化；iv)完成公開和描述的所示各功能的替代設(shè)計(jì)；v)完成每一所示功能的替代設(shè)計(jì)和方法，其為隱含的完成所公開和描述的功能的替代設(shè)計(jì)和方法；vi)作為分開的和獨(dú)立的發(fā)明所示的每一性質(zhì)、元件及步驟；vii)由所公開的不同系統(tǒng)或組分改進(jìn)的申請(qǐng)；viii)由此類系統(tǒng)或元件所生成的終產(chǎn)品；ix)基本在上文和參考任何所附實(shí)施例所描述的方法和裝置；x)所公開元件的各種組合及排列；及xi)作為從屬于所述獨(dú)立權(quán)利要求或概念的各潛在從屬權(quán)利要求或概念。
申請(qǐng)人可提交具有最初一系列從屬權(quán)利要求的權(quán)利要求。應(yīng)當(dāng)理解的是，應(yīng)當(dāng)達(dá)到有關(guān)新物質(zhì)法規(guī)(new matter laws)所要求的支持程度，以便能夠在一項(xiàng)獨(dú)立權(quán)利要求或概念之下增加任何不同的從屬權(quán)利要求或其他要素，作為任何其他獨(dú)立權(quán)利要求或概念的從屬權(quán)利要求或要素，上述法規(guī)包括但不限于《歐洲專利公約》第123(2)條款和美國(guó)專利法35 USC 132或其他此類法律。
此外，如果使用或當(dāng)使用表示轉(zhuǎn)接關(guān)系的措詞“包含”時(shí)，根據(jù)習(xí)慣上對(duì)權(quán)利要求的解釋，使用該詞是為了保持本文權(quán)利要求為“開放式”。因此，除非上下文需要，術(shù)語(yǔ)“包含”或諸如“包括“或“含有”等變化形式應(yīng)理解為，它們意指包括所聲明的要素或步驟或一組要素或步驟，而不排除任何其他的要素或步驟或一組要素或步驟。這樣的術(shù)語(yǔ)應(yīng)以其最廣泛的形式來(lái)解釋，以使申請(qǐng)人獲得法律許可的最廣泛的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括以下步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；對(duì)所述的精子進(jìn)行分選；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；使至少一個(gè)卵受精；以及從所述的至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
2.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的分選步驟包括根據(jù)至少一個(gè)所需的精子特征選擇所述的精子。
3.如權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的選擇步驟包括根據(jù)至少一個(gè)所需的精子特征對(duì)所述的精子進(jìn)行染色。
4.如權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的選擇步驟還包括根據(jù)所述的至少一個(gè)所需的精子特征來(lái)區(qū)分所述的精子。
5.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的區(qū)分步驟包括區(qū)分所述的精子是含X染色體的精子還是含Y染色體的精子。
6.如權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的選擇步驟還包括分離具有所述至少一個(gè)所需精子特征的所述精子。
7.如權(quán)利要求4或6所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括收集所述的精子的步驟。
8.如權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的收集所述精子的步驟包括保持精子質(zhì)量的步驟。
9.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的分選步驟包括流式細(xì)胞儀分選。
10.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括從所述的經(jīng)分選的精子確定精子樣品的步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的第二個(gè)深低溫保藏的步驟包括將所述的精子樣品深低溫保藏。
12.如權(quán)利要求10所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的確定精子樣品的步驟包括確定多個(gè)的精子樣品，并且其中所述的第二個(gè)深低溫保藏步驟包括將所述的多個(gè)樣品深低溫保藏。
13.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括從所述的經(jīng)分選、深低溫保藏、解凍后的精子確定精子樣品的步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的確定精子樣品的步驟包括確定多個(gè)精子樣品。
15.一種精子樣品，該精子樣品由權(quán)利要求10、11、12、13或14所述的方法確定。
16.如權(quán)利要求15所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括授精管。
17.如權(quán)利要求15所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括丸狀樣品。
18.如權(quán)利要求15所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括授精劑量。
19.如權(quán)利要求15所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括所制備的精子樣品。
20.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的獲取步驟包括獲取具有大量精子的精液，其中所述的第一個(gè)深低溫保藏步驟包括將所述的精液深低溫保藏，而其中所述的第一個(gè)解凍步驟包括將所述深低溫保藏的精液解凍。
21.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的獲取步驟包括從動(dòng)物學(xué)樣品獲取精子。
22.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求1所述的分選后深低溫保藏的精子生產(chǎn)的。
23.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求20所述的分選后深低溫保藏的精子生產(chǎn)的。
24.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求15所述的精子樣品生產(chǎn)的。
25.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求16、17、18或19所述的精子樣品生產(chǎn)的。
26.如權(quán)利要求22、23或24所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物馬科動(dòng)物、牛科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、水牛、公牛、麋鹿和豬。
27.如權(quán)利要求25所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物、貓科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、水牛、牛、麋鹿和豬。
28.如權(quán)利要求22、23或24所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物珍奇哺乳動(dòng)物品種、瀕危哺乳動(dòng)物品種和稀有哺乳動(dòng)物品種。
29.如權(quán)利要求25所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物珍奇哺乳動(dòng)物品種、瀕危哺乳動(dòng)物品種和稀有哺乳動(dòng)物品種。
30.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求10、11、12、13或14所述的方法確定的精子樣品生產(chǎn)的。
31.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括保持所述的分選后深低溫保藏的精子的精子質(zhì)量的步驟。
32.如權(quán)利要求31所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括提高所述的分選后深低溫保藏的精子的運(yùn)動(dòng)力。
33.如權(quán)利要求31所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括提高所述的分選后深低溫保藏的精子的生存力。
34.如權(quán)利要求31所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括改進(jìn)所述的分選后深低溫保藏的精子的功能性。
35.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用所述分選后深低溫保藏的精子來(lái)保持受精率的步驟。
36.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)增強(qiáng)胚泡的發(fā)育率的步驟。
37.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)保持單精受精的步驟。
38.如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)保持分裂率的步驟。
39.一種精子處理方法，該方法包括以下步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；對(duì)所述的精子進(jìn)行處理；以及將所述的精子深低溫保藏。
40.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，其中所述的處理步驟包括對(duì)所述的精子進(jìn)行分選。
41.如權(quán)利要求40所述的精子處理方法，其中所述的分選步驟包括根據(jù)至少一個(gè)所需的精子特征選擇所述的精子。
42.如權(quán)利要求41所述的精子處理方法，其中所述的選擇步驟包括根據(jù)至少一個(gè)所需的精子特征對(duì)所述的精子進(jìn)行染色。
43.如權(quán)利要求42所述的精子處理方法，其中所述的選擇步驟還包括根據(jù)至少一個(gè)所需的精子特征區(qū)分所述的精子。
44.如權(quán)利要求43所述的精子處理方法，其中所述的區(qū)分步驟包括區(qū)分所述的精子是含X染色體的精子還是含Y染色體的精子。
45.如權(quán)利要求43所述的精子處理方法，其中所述的選擇步驟還包括分離具有所述至少一個(gè)所需的精子特征的所述精子。
46.如權(quán)利要求43或45所述的精子處理方法，該方法還包括收集所述的精子的步驟。
47.如權(quán)利要求46所述生產(chǎn)的哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的收集所述的精子的步驟包括保持精子質(zhì)量的步驟。
48.如權(quán)利要求40所述的精子處理方法，其中所述的分選步驟包括流式細(xì)胞儀分選。
49.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，該方法還包括從所述的經(jīng)處理精子確定精子樣品的步驟。
50.如權(quán)利要求49所述的精子處理方法，其中所述的第二個(gè)深低溫保藏步驟包括將所述的精子樣品深低溫保藏。
51.如權(quán)利要求49所述的精子處理方法，其中所述的確定精子樣品的步驟包括確定多個(gè)精子樣品，并且其中所述的第二個(gè)深低溫保藏步驟包括將所述的多個(gè)樣品深低溫保藏。
52.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，該方法還包括從所述的處理后深低溫保藏的精子確定精子樣品的步驟。
53.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，該方法還包括將所述的處理后深低溫保藏的精子解凍的步驟。
54.如權(quán)利要求53所述的精子處理方法，該方法還包括從所述的經(jīng)處理、深低溫保藏、解凍的精子確定精子樣品的步驟。
55.如權(quán)利要求53所述的精子處理方法，其中所述的確定精子樣品的步驟包括確定多個(gè)的精子樣品。
56.如權(quán)利要求54所述的精子處理方法，其中所述的確定精子樣品的步驟包括確定多個(gè)的精子樣品。
57.一種精子樣品，該精子樣品由權(quán)利要求49、51、52、54、55或56所述的方法確定。
58.如權(quán)利要求57所述的精子處理方法，其中所述的精子樣品包括授精管。
59.如權(quán)利要求57所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括丸狀樣品。
60.如權(quán)利要求57所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括授精劑量。
61.如權(quán)利要求57所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括所制備的精子樣品。
62.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，其中所述的獲取步驟包括獲取具有大量精子的精液，其中所述的深低溫保藏步驟包括將所述的精液深低溫保藏，并且所述的解凍步驟包括將所述的深低溫保藏后的精液解凍。
63.如權(quán)利要求39所述的精子處理方法，其中所述的獲取步驟包括從動(dòng)物學(xué)樣品獲取精子。
64.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求39所述的處理后深低溫保藏的精子生產(chǎn)的。
65.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求62所述的處理后深低溫保藏的精子生產(chǎn)的。
66.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求57的精子樣品生產(chǎn)的。
67.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求58、59、60或61所述的精子樣品生產(chǎn)的。
68.如權(quán)利要求64、65或66所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物馬科動(dòng)物、?？苿?dòng)物、貓科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、水牛、公牛、麋鹿和豬。
69.如權(quán)利要求67所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物馬科動(dòng)物、牛科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、水牛、公牛、麋鹿和豬。
70.如權(quán)利要求64、65或66所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物珍奇哺乳動(dòng)物品種、瀕危哺乳動(dòng)物品種和稀有哺乳動(dòng)物品種。
71.如權(quán)利要求67所述的哺乳動(dòng)物，其中所述的哺乳動(dòng)物包括選自以下組的哺乳動(dòng)物珍奇哺乳動(dòng)物品種、瀕危哺乳動(dòng)物品種和稀有哺乳動(dòng)物品種。
72.一種哺乳動(dòng)物，該哺乳動(dòng)物是利用權(quán)利要求49、51、52、54、55或56所述的方法確定的精子樣品生產(chǎn)的。
73.如權(quán)利要求39所述的精子處理的方法，該方法還包括保持所述的處理后深低溫保藏的精子的精子質(zhì)量的步驟。
74.如權(quán)利要求73所述的精子處理的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括提高所述的處理后深低溫保藏的精子的運(yùn)動(dòng)力。
75.如權(quán)利要求73所述的精子處理的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括提高所述的處理后深低溫保藏的精子的生存力。
76.如權(quán)利要求73所述的精子處理的方法，其中所述的保持精子質(zhì)量的步驟包括改進(jìn)所述的處理后深低溫保藏的精子的功能性。
77.如權(quán)利要求39所述的精子處理的方法，該方法還包括利用所述的處理后深低溫保藏的精子來(lái)保持受精率的步驟。
78.如權(quán)利要求39所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)增強(qiáng)胚泡的發(fā)育率的步驟。
79.如權(quán)利要求39所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)保持單精受精的步驟。
80.如權(quán)利要求39所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括利用分選后深低溫保藏的精子來(lái)保持分裂率的步驟。
81.一種精子處理方法，該方法包括以下步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；以及將所述處理后精子深低溫保藏。
82.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括以下步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；將所述的精子深低溫保藏；用所述精子使至少一個(gè)卵受精；以及從所述的至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
83.如權(quán)利要求82所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括用所述的精子對(duì)所述哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)雌性個(gè)體進(jìn)行授精的步驟。
84.如權(quán)利要求83所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的授精步驟包括利用非解凍的條件下的所述精子進(jìn)行授精。
85.如權(quán)利要求83所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中對(duì)雌性個(gè)體進(jìn)行授精的步驟包括利用所述的精子對(duì)超數(shù)排卵的雌性個(gè)體進(jìn)行授精。
86.如權(quán)利要求83所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括使所述哺乳動(dòng)物的雌性個(gè)體超數(shù)排卵的步驟，并且其中所述的對(duì)雌性個(gè)體進(jìn)行授精的步驟包括對(duì)所述超數(shù)排卵的雌性個(gè)體進(jìn)行授精。
87.如權(quán)利要求82所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括獲取所述哺乳動(dòng)物的超數(shù)排卵的雌性個(gè)體的至少一個(gè)卵的步驟，并且其中所述的受精步驟包括對(duì)所述的至少一個(gè)卵進(jìn)行體外受精。
88.如權(quán)利要求85、86或87所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括將所述的至少一個(gè)受精卵轉(zhuǎn)移到雌性受體中的步驟。
89.如權(quán)利要求82所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的受精步驟包括對(duì)所述的至少一個(gè)卵進(jìn)行體外受精。
90.如權(quán)利要求89所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括將所述的至少一個(gè)受精卵轉(zhuǎn)移到雌性受體中的步驟。
91.如權(quán)利要求82所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括對(duì)所述的精子進(jìn)行分選的步驟。
92.如權(quán)利要求82所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法還包括將所述的精子解凍的步驟。
93.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物胚胎的方法，該方法包括以下步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；將所述的精子深低溫保藏；用所述的精子使至少一個(gè)卵受精；以及從所述的至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物胚胎。
94.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括下列步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；將所述的精子深低溫保藏；用所述的精子對(duì)所述的至少一個(gè)卵進(jìn)行體外受精；將所述的至少一個(gè)受精卵轉(zhuǎn)移到雌性受體體內(nèi)；以及從所述的至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
95.一種生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括下列步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；將所述的精子深低溫保藏；用所述的精子對(duì)所述哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)雌性個(gè)體進(jìn)行授精；用所述的精子使至少一個(gè)卵受精；以及從所述的至少一個(gè)受精卵生產(chǎn)哺乳動(dòng)物。
96.一種精子處理方法，該方法包括下列步驟獲取精子；將所述的精子深低溫保藏；將所述的精子解凍；將所述的精子深低溫保藏；以及確定所述精子的至少一個(gè)精子樣品。
97.如權(quán)利要求96所述的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物的方法，其中所述的確定步驟包括確定所述解凍后精子的至少一個(gè)精子樣品，并且所述的第二個(gè)深低溫保藏步驟包括將所述的至少一個(gè)精子樣品深低溫保藏。
98.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，其中所述的確定步驟包括確定所述精子的至少一個(gè)精子樣品，該精子樣品能夠使雌性哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)卵受精。
99.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，其中所述的確定至少一個(gè)精子樣品的步驟包括確定能夠使超數(shù)排卵的雌性哺乳動(dòng)物受精的至少一個(gè)精子樣品。
100.如權(quán)利要求99所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述的至少一個(gè)精子樣品對(duì)至少一個(gè)超數(shù)排卵的雌性哺乳動(dòng)物進(jìn)行授精的步驟。
101.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，其中所述的確定至少一個(gè)精子樣品的步驟包括生成能夠使至少一個(gè)卵體外受精的至少一個(gè)精子樣品。
102.如權(quán)利要求101所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述的至少一個(gè)精子樣品對(duì)至少一個(gè)卵進(jìn)行體外受精的步驟。
103.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，其中所述的確定至少一個(gè)精子樣品的步驟包括生成能夠?qū)χ辽僖粋€(gè)雌性動(dòng)物進(jìn)行授精的至少一個(gè)精子樣品。
104.如權(quán)利要求103所述的精子處理方法，該方法還包括對(duì)至少一個(gè)雌性哺乳動(dòng)物進(jìn)行授精的步驟。
105.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述至少一個(gè)精子樣品使雌性哺乳動(dòng)物的至少一個(gè)卵受精的步驟。
106.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，該方法還包括使雌性哺乳動(dòng)物的多個(gè)卵受精的步驟。
107.如權(quán)利要求96所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述的精子樣品生產(chǎn)哺乳動(dòng)物胚胎的步驟。
108.如權(quán)利要求107所述的精子處理方法，其中所述的生產(chǎn)所述胚胎的步驟還包括將所述的哺乳動(dòng)物胚胎轉(zhuǎn)移到雌性動(dòng)物受體中的步驟。
109.如權(quán)利要求96～108任一項(xiàng)所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述的精子樣品生產(chǎn)后代的步驟。
110.如權(quán)利要求96～108任一項(xiàng)所述的精子處理方法，該方法還包括利用所述的深低溫保藏的處理后精子生產(chǎn)至少一個(gè)預(yù)先選定性別的動(dòng)物的步驟。
111.一種精子樣品，該精子樣品是由權(quán)利要求96所述的方法確定的。
112.如權(quán)利要求111所述的精子樣品，其中所述的精子樣品包括選自以下組的樣品授精管、丸狀樣品，授精劑量和制備的精子樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開了精子的保藏和精子的其他處理。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及精子的保藏，而精子的保藏可能進(jìn)一步涉及人工授精、體外授精、超數(shù)排卵、哺乳動(dòng)物的生產(chǎn)、通常的精子樣品和精子處理。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及精子的處理特征，例如收集、處理、分選、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、使用、受精或者授精技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明，精子的保藏可以在于保持和改進(jìn)精子質(zhì)量，并且，在一些實(shí)施方案中，在于保持和改進(jìn)一個(gè)或者一個(gè)以上的精子特征，例如生存力、運(yùn)動(dòng)力和功能性。受精率也得以保持和提高。一個(gè)實(shí)施方案可包括獲取精子(10)?？蓪⒕由畹蜏乇２?20)和解凍(30)?？蓪?duì)精子進(jìn)行處理(40)并對(duì)精子進(jìn)行深低溫保藏(50)。
文檔編號(hào)A61NGK1681921SQ03821753
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者威廉·馬克斯韋爾·奇澤姆·馬克斯韋爾, 費(fèi)安娜·凱特·霍林斯墨德, 賈斯蒂娜·凱利·奧布蘭, 加雷斯·埃文斯 申請(qǐng)人:Xy公司