專利名稱：一種防治害蟲的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對農(nóng)作物害蟲防治的方法，特別是涉及通過種植一種轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米植物來防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種用在玉米中表達的來源于自然界存在的土壤細菌蘇云金桿菌庫斯塔基亞種(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki，B.t.k.)中的CryIAb蛋白來防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種其體內(nèi)可表達B.t.k.中CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810用于防治亞洲玉米螟為害玉米的方法；本發(fā)明也涉及所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，特別是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810作為防治亞洲玉米螟為害玉米的用途。
玉米螟在中國所有玉米產(chǎn)區(qū)都有為害發(fā)生，是玉米生產(chǎn)上的第一大害蟲。一般年份春玉米受害減產(chǎn)7～10％，大發(fā)生年減產(chǎn)30％以上。夏玉米由于生長季節(jié)短，因玉米螟為害造成的損失更大。玉米是中國第三大糧食作物，年種植面積在2千萬公頃以上。按每公頃平均單產(chǎn)4,500公斤計算，每年因玉米螟為害而減產(chǎn)達60～90億公斤，折合人民幣約20～30億元。
亞洲玉米螟一生經(jīng)歷卵、幼蟲、蛹和成蟲4個蟲態(tài)。幼蟲是玉米螟一生中為害作物的唯一蟲態(tài)。亞洲玉米螟屬典型的兼性滯育昆蟲，從北到南一年可發(fā)生1～7代，但在玉米的整個生育期只發(fā)生兩代為害，即心葉期世代和穗期世代。如在北方春玉米地區(qū)，第一代卵盛期在玉米生長發(fā)育的心葉中期，所以也叫心葉期世代。卵多產(chǎn)于葉片背面中脈附近，以植株中上部完全展開葉的葉片為多。幼蟲一經(jīng)孵化既表現(xiàn)潛藏習性，爬入心葉叢蛀食心葉或在葉片間隙取食幼嫩葉片的葉肉造成針孔或窗戶紙狀的花葉，若3齡以上的幼蟲蛀穿縱卷的未展開心葉，則葉片抽出時即出現(xiàn)排孔。一般來說，葉片輕微受害對玉米生長無明顯影響。但若種植感蟲品種，且螟蟲發(fā)生較重，葉片嚴重受害時，則受害后的雄穗不能正常抽出，植株高度會顯著降低。幼蟲取食心葉組織發(fā)育至3齡前后時，玉米進入打苞期。此時幼嫩的雄穗對螟蟲比心葉更具有吸引力，所以幼蟲全部轉(zhuǎn)移到雄穗取食。抽雄后幼蟲被帶出心葉叢。在雄穗散開之前幼蟲繼續(xù)取食雄穗。當雄穗逐漸散開時，幼蟲即失去符合其上述主要趨性所需要的條件，即生存所必需的小環(huán)境，除少數(shù)已老熟的幼蟲可在雄穗上化蛹外，所有幼蟲開始向下轉(zhuǎn)移，由于此時的幼蟲基本上已是4～5齡，開始明顯地發(fā)揮其“鉆蛀”的特性。除一部分蛀入雄穗柄發(fā)育至老熟或再次向下轉(zhuǎn)移外，由于雄穗柄很細，一般只能容納1～2條老熟幼蟲，因此更多的幼蟲必需爬過雄穗柄繼續(xù)向下轉(zhuǎn)移，尋找更適宜的部位鉆蛀。其中，雌穗著生節(jié)及其上下節(jié)是最易遭受襲擊的部位。此時玉米雌穗已開始發(fā)育，如其附近莖節(jié)被蛀后，會明顯地影響其正常發(fā)育甚至中止發(fā)育。如果第一穗受害較早，則第二穗可繼續(xù)發(fā)育，但已不可能長到第一穗應(yīng)有的大小。如果第二穗未及時發(fā)育成熟又被螟蟲鉆蛀而停止發(fā)育，則此株玉米多絕產(chǎn)。此外，由于螟蟲在植株中下部蛀莖，遇風極易造成倒折，使損失更大。第一代幼蟲或在雄穗上，或在雄穗柄內(nèi)，或在莖稈內(nèi)發(fā)育至老熟，除一小部分進入滯育成為來年蟲源外，大部分化蛹、羽化而產(chǎn)生第一代成蟲。
第二代卵(第一代成蟲所產(chǎn))盛期在玉米花絲盛期，也叫穗期世代，卵仍多產(chǎn)于中上部葉片背面，偶爾也產(chǎn)在莖稈和苞葉上。初孵幼蟲大多集中潛藏到雌穗頂端的花絲基部內(nèi)，取食花絲繼而取食雌穗頂部的幼嫩籽粒，亦有少數(shù)潛伏在葉腋處取食積存的花粉或葉腋組織。幼蟲發(fā)育到3齡以后，開始出現(xiàn)鉆蛀行為，或直接從穗頭蛀入穗軸，或繼續(xù)取食正在灌漿的籽粒，或從雌穗頂向下轉(zhuǎn)移再次蛀入雌穗、雌穗柄或莖稈。此時玉米雌穗已經(jīng)充分發(fā)育到其應(yīng)有的大小，并已進入乳熟期。因此穗期螟害不會影響雌穗大小，但影響玉米正常灌漿，從而降低千粒重。如果雌穗柄被蛀空，會造成穗折而脫落。幼蟲取食籽粒除直接造成產(chǎn)量損失外，常引發(fā)玉米穗、莖腐病的感染，更加重了產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降。
中國玉米螟的防治工作始于50年代。其所采用的主要防治方法有農(nóng)業(yè)防治、化學防治、物理防治、性信息素防治和生物防治等。
農(nóng)業(yè)防治是把整個農(nóng)田生態(tài)系多因素的綜合協(xié)調(diào)管理，調(diào)控作物、害蟲、環(huán)境因素，創(chuàng)造一個有利于作物生長而不利于螟蟲發(fā)生的農(nóng)田生態(tài)環(huán)境。如利用處理玉米螟越冬寄主、改革耕作制度、種植抗螟品種、種植誘集田和間作等措施壓低玉米螟的為害。因農(nóng)業(yè)防治必須服從作物布局和增產(chǎn)的要求，應(yīng)用有一定的局限性，不能作為應(yīng)急措施，在螟害爆發(fā)時就顯得無能為力。
化學防治即農(nóng)藥防治，是利用化學殺蟲劑來殺滅害蟲，是玉米螟綜合治理的重要組成部分，它具有速效、方便、簡便和高經(jīng)濟效益的特點，特別是在害蟲大發(fā)生的情況下，是必不可少的應(yīng)急措施，它可以在害蟲造成為害前將其消滅。如目前推廣面積最大的顆粒劑防治方法，效果最為穩(wěn)定和可靠，但高效施顆粒劑的工具仍遠未過關(guān)，嚴重影響其作用的發(fā)揮。此外還有撒毒土、藥液噴霧、敵敵畏封垛熏蒸秸稈垛內(nèi)越冬代成蟲等藥劑防治方法。但化學防治也有其局限性，如使用不當往往會導(dǎo)致農(nóng)作物發(fā)生藥害、害蟲產(chǎn)生抗藥性，以及殺傷天敵，污染環(huán)境，使農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞和農(nóng)藥殘留對人、畜的安全構(gòu)成威脅等不良后果。
物理防治主要根據(jù)害蟲對環(huán)境條件中各種物理因素的反應(yīng)，利用各種物理因素如光、電、色、溫濕度等及機械設(shè)備進行誘殺、輻射不育等方法來防治害蟲。目前應(yīng)用最廣泛的是高壓汞燈誘殺，它利用越冬代幼蟲集中在村屯中的玉米秸稈垛中越冬的特點，在越冬代成蟲羽化期，大范圍連片在村屯設(shè)置高壓汞燈，對玉米螟成蟲進行誘殺，防治效果明顯。高壓汞燈必須是保證夜間連續(xù)供電的村屯方能應(yīng)用，且操作有一定難度。
性信息素防治是利用人工合成的玉米螟性信息素直接誘殺玉米螟雄蟲和干擾螟蟲交配，減少田間雌蛾受精率，減輕螟害。
其中的誘殺法是利用人工合成的玉米螟性信息素在玉米螟的交尾棲息場所如長勢好的麥田或菜地等誘殺玉米螟雄蛾。此法的缺點是水盆誘捕器管理費工，并且必須大面積連片使用才有效。
其中的迷向法是在越冬代玉米螟成蟲羽化10％時，在其交尾場所每公頃用性信息素散發(fā)器4500～6000個掛在作物上，干擾螟蛾的交尾。利用性信息素防治一代玉米螟，方法簡便，效果良好，不污染環(huán)境，不傷害天敵。不足之處是誘芯的投放費工。
生物防治是利用某些有益生物或生物代謝產(chǎn)物來控制害蟲種群數(shù)量，以達到壓低或消滅害蟲的目的。其特點是對人、畜安全，對環(huán)境污染少，對某些害蟲可達到長期控制的目的。最常見的生物防治有赤眼蜂和白僵菌等。但赤眼蜂防治受氣候因素影響大，效果常不穩(wěn)定，并且不論螟蟲發(fā)生輕重均需同樣投資進行。
轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米就是將外源抗蟲基因通過植物基因工程的手段轉(zhuǎn)入玉米細胞，繼而再生植株，從而使玉米獲得本身所不具有的抗蟲特性。
蘇云金桿菌又叫蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，是一種能形成芽孢的革蘭氏陽性土壤芽孢桿菌，在其孢子形成期能在菌體內(nèi)形成伴孢晶體。這些伴孢晶體主要由(27～140KD)蛋白質(zhì)組成，具有高度專一的抗蟲作用，對人畜及非靶標昆蟲無毒。不同菌株產(chǎn)生的晶體蛋白(Cry)對不同種類昆蟲表現(xiàn)出特異的殺蟲活性，到目前為止，全世界已分離出幾萬株蘇云金桿菌菌株。
Cry蛋白根據(jù)其抗蟲譜的不同可分為I、II、III、IV類，I類抗鱗翅目，II類抗鱗翅目和雙翅目，III類抗鞘翅目，IV類抗雙翅目，各類中又根據(jù)氨基酸同源性的多少分成若干小類。例如，在cryI基因間，氨基酸同源性為82％～90％的歸為cryIA；55％～71％的歸為cryIB；cryIC和cryID彼此之間不同，也不同于cryIA。在cryIA基因中，根據(jù)限制性內(nèi)切酶的酶譜和分子量的大小，又分為cryIAa，4.5kb；cryIAb，5.3kb；cryIAc，6.6kb亞類基因。
CryIAb蛋白是人們發(fā)現(xiàn)的一種由蘇云金桿菌庫斯塔基亞種(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki，B.t.k.)產(chǎn)生的伴孢結(jié)晶蛋白，它是不溶性晶體蛋白。晶體蛋白以蛋白原毒素的形式組成。CryIAb晶體蛋白的殺蟲性要求蛋白被吸收。在昆蟲腸道中，由于高pH值，蛋白原溶解，通過酶的作用與蛋白的活性核緊密結(jié)合，不再被昆蟲腸道中的蛋白酶降解。核心蛋白在鱗翅目昆蟲腸道中與有特異性的受體結(jié)合，插入腸膜，形成離子特異性通道。這些生化反應(yīng)打亂了消化過程，導(dǎo)致昆蟲死亡。非靶標昆蟲、哺乳類動物、鳥類和魚類的消化道組織不含能與CryIAb蛋白結(jié)合的受體，因此，CryIAb蛋白不能被破壞消化，從而也無毒性。
隨著分子遺傳技術(shù)的發(fā)展，已分離出多種殺蟲結(jié)晶蛋白的基因并測定了其DNA序列。已用這些基因在大豆、玉米、土豆等作物上創(chuàng)建了一些遺傳工程植株。已證明這種基因工程植株抗多種鱗翅目(Lepidoptera)害蟲的侵害。然而，至今尚無關(guān)于通過產(chǎn)生表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米植株來控制亞洲玉米螟對玉米為害的報道。
不同實驗室和公司由于使用cry基因種類的不同，構(gòu)建表達載體所使用調(diào)控元件如啟動子、內(nèi)含子、終止子等不同，導(dǎo)致其所得轉(zhuǎn)化體抗蟲種類和程度有差異。MON810抗蟲玉米品系是由美國孟山都公司利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)開發(fā)出來的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，其在體內(nèi)表達的是B.t.k.中的CryIAb，其商品名稱中文為保豐玉米，英文為YieldGard。其產(chǎn)品在美國已進行了商業(yè)化，在美國市場可以買到。
雖然MON810抗蟲玉米品系在美國已進行了商業(yè)化，但其防治對象是歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，而本發(fā)明的防治對象是亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)。
歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)和亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)雖都隸于昆蟲綱，鱗翅目，螟蛾科，且都是為害玉米等作物的蛀食性害蟲，但兩者是在生物學上清晰的、截然不同的兩個物種，至少存在以下主要區(qū)別(植物保護學報，1988，Vol.15(3)145-152；農(nóng)業(yè)百科全書-昆蟲卷，1990，456-459)1、在中國玉米主產(chǎn)區(qū)，亞洲玉米螟是為害玉米的主要害蟲，還沒有發(fā)現(xiàn)歐洲玉米螟為害玉米的證據(jù)中國玉米螟綜合防治研究協(xié)作組經(jīng)過多年的調(diào)查和研究，證明亞洲玉米螟主要分布在中國東半壁黑龍江至廣東的廣大地區(qū)，是玉米、谷子、高粱等作物的大害蟲。中國主要玉米產(chǎn)區(qū)均在此范圍內(nèi)，包括黑龍江、吉林、遼寧、北京、河北、河南、湖北、廣東、四川、云南、江蘇、寧夏、貴州、內(nèi)蒙古、山東、甘肅等17省市(自治區(qū))。
歐洲玉米螟到目前為止僅發(fā)現(xiàn)分布于新疆的伊寧、內(nèi)蒙古的呼和浩特、寧夏的永寧和河北的張家口、蘆臺。除在新疆的伊寧為害玉米外，其它地區(qū)主要寄生于蒼耳和大麻等，還沒有發(fā)現(xiàn)為害玉米的證據(jù)。
2、在美國，亞洲玉米螟是不存在的亞洲玉米螟分布在亞洲溫帶和熱帶、澳大利亞和大洋洲密克羅尼西亞等地區(qū)。除中國外，亞洲玉米螟廣泛分布于日本、東南亞和澳大利亞，而在上述地區(qū)均未見有關(guān)歐洲玉米螟存在的報道。
歐洲玉米螟分布在歐洲、北美洲、西非及小亞西亞，在這些地區(qū)未見有亞洲玉米螟存在的報道。
3、二者對玉米的為害習性不同據(jù)報道，四齡前的歐洲玉米螟幼蟲在玉米穗期為害時隱藏在葉鞘與莖稈交界處為害；而四齡前的亞洲玉米螟玉米穗期為害時多在玉米雌穗上為害花絲和嫩籽粒。
4、二者在形態(tài)上不同大多數(shù)昆蟲種群的鑒定最終是靠解剖比較其雄或雌性昆蟲的外生殖器的結(jié)構(gòu)來決定的。也就是說，有許多昆蟲種群在外觀上非常相似，但生殖器卻有所不同，實際為完全不同的物種；反之亦然。
中國玉米螟綜合防治研究協(xié)作組經(jīng)過多年的研究，證明了在中國發(fā)生的亞洲玉米螟在形態(tài)上是和歐洲玉米螟截然不同的兩個物種，二者在雄性外生殖器(抱器腹)特征上存在以下區(qū)別●亞洲種一般具3-4個大刺或2個大刺及1個小刺，平均數(shù)多于歐洲種。
●亞洲種具刺區(qū)長于無刺區(qū)，歐洲種相反。
●兩側(cè)抱器腹的兩區(qū)長度關(guān)系不一致。
5、二者之間存在生殖隔離生物不同種之間的根本區(qū)別是其間存在生殖上的隔離，即不同種之間不能交配產(chǎn)生具有正常繁殖能力的后代。中國玉米螟綜合防治研究協(xié)作組用了5年時間，對1300余對采自不同地區(qū)(包括奧地利)的玉米螟，進行多種組合交配。試驗發(fā)現(xiàn)，所有來自中國東部玉米產(chǎn)區(qū)玉米上的玉米螟均與來自奧地利的歐洲玉米螟存在生殖隔離，只有來自新疆伊寧玉米及寧夏和張家口蒼耳等地區(qū)的玉米螟與歐洲玉米螟無生殖隔離。因此，在中國玉米主產(chǎn)區(qū)發(fā)生的玉米螟和歐洲玉米螟之間存在生殖隔離。
6、二者對性信息素的反應(yīng)不同不同種昆蟲的性信息素化學結(jié)構(gòu)是不同的。昆蟲性信息素由多種化合物組成。而且以化合物的種類和混合比不同來完成性的隔離。已有報道證明，歐亞兩種玉米螟性信息素的化學結(jié)構(gòu)截然不同。
中國玉米螟綜合防治研究協(xié)作組用了5年時間，在20個省市34個地區(qū)進行了歐亞兩種玉米螟性信息素的誘蛾活性試驗。結(jié)果表明，在中國發(fā)生的亞洲玉米螟對歐洲玉米螟性信息素不發(fā)生反應(yīng)。
7、二者的性信息素化學成分及結(jié)構(gòu)不同性信息素的化學成分及各組分的配比是區(qū)分不同昆蟲種群的重要指標之一。對玉米螟性信息素結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，在中國發(fā)生的亞洲玉米螟的性信息素的化學成分為順、反12-十四烯醇乙酸酯，配比為47∶53，而歐洲玉米螟的性信息素的化學成分為97∶3的順、反11-十四烯醇乙酸酯，二者是不一樣的。
綜上所述，由于亞洲玉米螟與歐洲玉米螟存在諸多方面的不同，因此，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米用于防治亞洲玉米螟為害玉米的方法并非是顯而易見的。
本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米來防治亞洲玉米螟的為害。該轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米本身可表達CryIAb蛋白，從而使得玉米產(chǎn)生了抵抗亞洲玉米螟的能力。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種可以表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，特別是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810，來防治亞洲玉米螟為害玉米的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，特別是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810作為防治亞洲玉米螟為害玉米的用途。
本發(fā)明涉及一種防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其特征在于，通過種植一種在其體內(nèi)可表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米植物，從而使攝取該植物組織的亞洲玉米螟的取食和生長受到抑制，并最終導(dǎo)致死亡，來實現(xiàn)對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其中所述的CryIAb蛋白具有下述的CryIAb蛋白的氨基酸序列CryIAb蛋白的氨基酸序列如下，其與自然存在的CryIAb蛋白相同1 MDNNPNINEC IPYNCLSNPE VEVLGGERIE TGYTFIDISL SLTQFLLSEF51 VPGAGFVLGL VDIIWGIFGP SQWDAFLVQI EQLINQRIEE FARNQAISRL101 EGLSNLYQIY AESFREWEAD PTNPALREEM RIQFNDMNSA LTTAIPLFAV151 QNYQVPLLSV YVQAANLHLS VLRDVSVFGQ RWGFDAATIN SRYNDLTRLI201 GNYTDHAVRW YNTGLERVWG PDSRDWIRYN QFRRELTLTV LDIVSLFPNY251 DSRTYPIRTV SQLTREIYTN PVLENFDGSF RGSAQGIEGS IRSPHLMDIL301 NSITIYTDAH RGEYYWSGHQ IMASPVGFSG PEFTFPLYGT MGNAAPQQRI351 VAQLGQGVYR TLSSTLYRRP FNIGINNQQL SVLDGTEFAY GTSSNLPSAV401 YRKSGTVDSL DEIPPQNNNV PPRQGFSHRL SHVSMFRSGF SNSSVSIIRA451 PMFSWIHRSA EFNNIIPSSQ ITQIPLTKST NLGSGTSWKGPGFTGGDIL501 RRTSPGQIST LRVNITAPLS QRYRVRIRYA STTNLQFHTS IDGRPINQGN551 FSATMSSGSN LQSGSFRTVG FTTPFNFSNG SSVFTLSAHV FNSGNEVYID601 RIEFVPAEVT FEAEYDLERA QKAVNELFTS SNQIGLKTDV TDYHIDQVSN651 LVECLSDEFC LDEKKELSEK VKHAKRLSDE RNLLQDPNFR GINRQLDRGW701 RGSTDITIQG GDDVFKENYV TLLGTFDECY PTYLYQKIDE SKLKAYTRYQ751 LRGYIEDSQD LEIYLIRYNA KHETVNVPGT GSLWPLSAPS PIGKCAHHSH801 HFSLDIDVGC TDLNEDLGVW VIFKIKTQDG HERLGNLEFL EGRAPLVGEA851 LARVKRAEKK WRDKREKLEW ETNIVYKEAK ESVDALFVNS QYDRLQADTN901 IAMIHAADKR VHSIREAYLP ELSVIPGVNA AIFEELEGRI FTAFSLYDAR951 NVIKNGDFNN GLSCWNVKGH VDVEEQNNHR SVLVVPEWEA EVSQEVRVCP1001 GRGYILRVTA YKEGYGEGCV TIHEIENNTD ELKFSNCVEE EVYPNNTVTC1051 NDYTATQEEY EGTYTSRNRG YDGAYESNSS VPADYASAYE EKAYTDGRRD1101 NPCESNRGYG DYTPLPAGYV TKELEYFPET DKVWIEIGET EGTFIVDSVE1151 LLLMEE
按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其中所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810，其包括任何MON810自交系、雜交種、綜合種或其群體，例如，自交系LH185MON810和Mo17MON810等，雜交種LH198×LH185MON810、B73×Mo17MON810等。
按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其中所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的整個植株對亞洲玉米螟為害玉米的防治；所述的整個植株對亞洲玉米螟的防治包括其葉片、莖桿、雄穗、花藥和花絲等對亞洲玉米螟為害玉米的防治；按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟的方法，其中所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的全生育期對亞洲玉米螟為害玉米為害玉米的防治；所述的全生育期對亞洲玉米螟的防治包括其苗期、新葉期、打苞期、抽雄期、花絲期等對亞洲玉米螟的防治；按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟的方法，其中所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指不因種植地點的改變而改變，不因種植時間的改變而改變；另外，按照本發(fā)明所述的防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其中所述的對亞洲玉米螟危害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田人工接種亞洲玉米螟條件下所表現(xiàn)出的增產(chǎn)作用、籽粒重量的提高、莖桿抗性的改善等，以及其在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下所表現(xiàn)出的增產(chǎn)作用、籽粒重量的提高、莖桿抗性的改善等。
本發(fā)明還涉及所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米特別是轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810作為防治亞洲玉米螟為害玉米的用途。
本發(fā)明與現(xiàn)有的對亞洲玉米螟防治的最明顯的區(qū)別，即本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果是本發(fā)明具有明顯的增產(chǎn)作用。玉米是中國重要的糧食作物，常年播種面積在2000萬公頃以上，每公頃平均單產(chǎn)約5,000公斤，若全部改種抗蟲玉米MON810，以本實驗的增產(chǎn)幅度19.6％計算(實施例6)，每年可為中國增收糧食近200億公斤，折合人民幣約160億元；即使以10％的增產(chǎn)幅度計算，每年也可為中國增收糧食近100億公斤，折合人民幣約80億元?？梢姳景l(fā)明具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。這是目前采用的任何亞洲玉米螟防治方法所無法比擬的。
現(xiàn)階段使用的化學殺蟲劑防治亞洲玉米螟的方法，雖對控制亞洲玉米螟對玉米的為害起到了一定作用，但同時也帶來了對人體、家畜和土壤本身的危害，使用本發(fā)明的方法，可消除這些危害。
現(xiàn)有的亞洲玉米螟防治方法主要是通過外部作用即外因來達到對亞洲玉米螟為害玉米的防治。而本發(fā)明是通過植物體內(nèi)產(chǎn)生能殺死亞洲玉米螟的CryIAb蛋白來防治亞洲玉米螟的，即通過內(nèi)因來防治；現(xiàn)有的亞洲玉米螟防治方法都不是全生育期的，而本發(fā)明是對玉米進行全生育期的保護，抗蟲玉米品系MON810從玉米生長的苗期，到新葉期，到打苞期，到吐絲期乃至成熟期，都免遭亞洲玉米螟的侵害。這是現(xiàn)有的亞洲玉米螟防治方法所無法達到的；現(xiàn)有的對亞洲玉米螟的防治方法不存在所謂全植株的防治，而本發(fā)明是對玉米整個植株進行保護，抗蟲玉米品系MON810的葉片、莖稈、花藥、花絲等都是抗亞洲玉米螟的，這也是目前亞洲玉米螟防治所無法解決的；現(xiàn)有的亞洲玉米螟防治方法，其效果是不穩(wěn)定的，而本發(fā)明對亞洲玉米螟為害玉米的防治效果是穩(wěn)定的，抗蟲玉米品系MON810對亞洲玉米螟的防治效果在不同地點、不同時間、不同遺傳背景都是穩(wěn)定一致的；現(xiàn)有的亞洲玉米螟防治方法，其效果是不徹底的，只起到減輕作用，本發(fā)明的抗蟲玉米品系MON810對初孵亞洲玉米螟幼蟲的防治效果幾乎為百分之百，極個別存活幼蟲體形極小，都是明顯的發(fā)育不良，且已停止發(fā)育，很難再對玉米造成為害；
與現(xiàn)有亞洲玉米螟防治方法相比，本發(fā)明具有簡單、方便、經(jīng)濟和對環(huán)境不產(chǎn)生污染等優(yōu)點。采用本發(fā)明的技術(shù)，只需種植能表達CryIAb蛋白的抗蟲玉米品系MON810即可，而不需要采用其它措施，從而節(jié)省了大量人力、物力和財力，亦不會對環(huán)境產(chǎn)生污染；本發(fā)明與現(xiàn)有亞洲玉米螟防治的不同之處還在于，本發(fā)明可使玉米籽粒性狀和莖稈的表現(xiàn)得到改善；本發(fā)明與現(xiàn)有亞洲玉米螟防治的不同之處還在于，雖然MON810玉米品系表現(xiàn)的活性CryIAb蛋白的氨基酸序列與做為微生物殺蟲劑的蘇云金桿菌產(chǎn)生的蛋白完全一致，但兩者卻差異很大。由于蘇云金桿菌制劑需要直接噴施到作物表面，因此就造成了有活性的結(jié)晶蛋白(包括CryIAb蛋白)在環(huán)境中被降解，導(dǎo)致殺蟲劑的重復(fù)生產(chǎn)和重復(fù)應(yīng)用，并為在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的實際應(yīng)用帶來困難，大大增加了成本。而本發(fā)明是使這種CryIAb蛋白在植物體內(nèi)進行表達，有效地避免了生物殺蟲劑在自然界不穩(wěn)定等缺點，節(jié)省了人力和物力。
下面對附圖進行簡要說明


圖1為PV-ZMBK07和PV-ZMGT10的質(zhì)粒示意圖Southern分析用到的限制位點及其位置(用堿基對表示)如本圖所示。
圖2為玉米品系MON810DNA的Southern分析圖，即為插入片段數(shù)目的分析。泳道1和泳道2分別是下列DNA的NdeI消化產(chǎn)物，PV-ZMBK07是雜交探針。泳道1MON818的DNA；泳道2MON810的DNA。
→表示從分子量標記得出的DNA片段大小的符號；≈表示從分子量標記和質(zhì)粒消化產(chǎn)物得出的DNA片段大小的符號；*表示背景帶的符號。
圖3為玉米品系MON810DNA的Southern分析圖，即對CryIAb基因的分析。泳道1、泳道2和泳道3分別是下列DNA的NcoI/EcoRI消化產(chǎn)物，cryIAb基因是雜交探針。泳道1約50pg PV-ZMBK07；泳道2MON818的DNA；泳道3MON810的DNA。
→表示從溴化乙錠(EB)染色的凝膠中分子量標記得出的DNA片段的大小的符號；—表示從質(zhì)粒消化產(chǎn)物得出的DNA片段大小的符號；≈表示從分子量標記和質(zhì)粒消化產(chǎn)物得出的DNA片段大小的符號；**表示臨近泳道的雜交區(qū)域。該符號只在泳道1出現(xiàn)，因為其DNA電泳時以某一角度偏離泳道1。
圖4為玉米品系MON810DNA的Southern分析圖，即對CP4 ESPSP基因和gox基因的分析。泳道1、泳道2、泳道3和泳道4分別是下列DNA的NcoI/BamHI消化產(chǎn)物泳道1和泳道3是約50pg的質(zhì)粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10，泳道2和泳道4是MON810的DNA，泳道1和泳道2的雜交探針是CP4 ESPSP基因，泳道3和泳道4的雜交探針是gox基因；→表示從溴化乙錠(EB)染色的凝膠中分子量標記得出的DNA片段大小的符號；—表示從質(zhì)粒消化產(chǎn)物得出的DNA片段大小的符號。
圖5為玉米品系MON810DNA的Southern分析圖。泳道1-6分別是下列DNA的NcoI/EcoRI消化產(chǎn)物泳道1和泳道4是約50pg的質(zhì)粒PV-ZMBK07；泳道2和泳道5是MON818的DNA，泳道3和泳道6是MON810的DNA；泳道1-3的探針是nptII區(qū)域；泳道4-6的雜交探針是ori-pUC區(qū)域。
→表示從溴化乙錠(EB)染色的凝膠中分子量標記得出的DNA片段大小的符號；
—表示從質(zhì)粒消化產(chǎn)物得出的DNA片段大小的符號。
為進一步說明本發(fā)明，對所述的可表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810的基本情況進行如下描述1.目的基因cryIAbcryIAb基因是插入MON810抗蟲玉米品系中的抗蟲目的基因，來源于自然界存在的土壤細菌蘇云金芽孢桿菌庫斯塔基亞種(Bacillusthuringiensis subsp.kurstaki，B.t.k.)。用于轉(zhuǎn)化的PV-ZMBK07質(zhì)粒載體中的cryIAb基因為結(jié)構(gòu)基因，長度為3468個核苷酸。與原B.t.k.中的cryIAb相比，它的基因序列經(jīng)過改變，從而使CryIAb蛋白在玉米中的表達水平大大提高。
2.目的基因cryIAb編碼的CryIAb蛋白目的基因cryIAb編碼的B.t.k.HD-1[CryIAb]蛋白由1156個氨基酸組成，此蛋白經(jīng)胰蛋白酶處理后，產(chǎn)生一種在植株體內(nèi)和體外約含600個氨基酸的具有抗胰蛋白酶的蛋白產(chǎn)物。MON810玉米品系編碼的CryIAb蛋白的結(jié)構(gòu)及其所表現(xiàn)的活性與蘇云金桿菌產(chǎn)生的蛋白完全一致。
CryIAb蛋白的氨基酸序列與自然界存在的CryIAb蛋白相同。
3.質(zhì)粒載體的構(gòu)建MON810抗蟲玉米品系的產(chǎn)生使用兩種質(zhì)粒PV-ZMBK07[含cryIAb基因]及PV-ZMGT10[含CP4EPSPS和gox基因]。二種質(zhì)粒載體的遺傳成分列于表1和表2，兩種質(zhì)粒載體的遺傳圖譜見
圖1。
PV-ZMBK07質(zhì)粒載體顯示的cryIAb基因處于增強的CaMV35S啟動子E35S的控制之下，該啟動子大小約為0.6Kb。位于E35S啟動子和cryIAb基因之間的是來自玉米hsp70(熱激蛋白)基因的0.8Kb的內(nèi)含子，其作用是提高基因轉(zhuǎn)錄水平。Hsp70內(nèi)含子后面是大小為3.46Kb的cryIAb基因。cryIAb基因插入到0.26Kb的胭脂氨酸合成酶3′末端非翻譯序列，NOS3′，該序列提供mRNA多聚腺苷化信號。
有關(guān)PV-ZMGT10質(zhì)粒載體序列的標記基因及其功能的敘述純粹是知識性的，因為MON810抗蟲玉米品系未曾查出PV-ZMGT10載體的有關(guān)基因序列。PV-ZMGT10質(zhì)粒含有g(shù)ox和CP4EPSPS標記基因，它們參與了葉綠體中轉(zhuǎn)CTP1和CTP2肽。兩個編碼區(qū)均在含有CaMV35S啟動子、玉米hsp70內(nèi)含子和NOS3′終止子序列的控制之下。
CP4EPSPS基因是從土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)CP4菌株中分離出來的，引入植物后表明對草甘膦抑制作用有強大的抵抗力。草甘膦和目的酶EPSPS結(jié)合，阻塞了其活性，EPSPS是芳香族氨基酸生物合成途徑中的一個酶。與大多數(shù)EPSPS相比，CP4EPSPS對草甘膦的抑制作用有強大的忍受力，并有高度催化作用。因為芳香化合物的存在滿足了有忍受力的EPSPS酶的連續(xù)作用，使植物細胞表達的CP4EPSPS蛋白對培養(yǎng)基中的草甘膦有抗性。
在PV-ZMGT10中的CP4EPSPS基因含有從擬南芥菜EPSPS中分離出來的葉綠體中轉(zhuǎn)移肽CTP2，它將CP4EPSPS蛋白導(dǎo)向葉綠體，即EPSPS在植物中的位置和芳香氨基酸合成的位點。攜帶CTP2的CP4EPSPS基因的大小約為1.7Kb。CP4EPSPS基因族(通過3′末端序列的啟動子)整合到gox基因族中。
為草甘膦編碼、使草甘膦氧化還原酶(GOX)發(fā)生代謝變化的gox基因是采用克隆技術(shù)從無色桿菌屬(新屬褐黃桿菌)的LBAA菌株取得。GOX蛋白被整合到含有葉綠體轉(zhuǎn)移肽序列CTP1的質(zhì)粒中。CTP1是來自擬南芥菜核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(SSU1A)基因的一個小亞單位基因。GOX酶降解草甘膦，使其轉(zhuǎn)化為氨甲基磷酸和乙醛酸。
編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因的α區(qū)在細菌控制的啟動子存在下，出現(xiàn)在PV-ZMBK07和PV-ZMGT10中。該區(qū)域含有一個多接頭，允許相容的基因在質(zhì)粒載體中進行克隆。lacZ-α區(qū)之后是0.65KbpUC質(zhì)粒(ori-pUC)復(fù)制起始點，該質(zhì)粒也可在大腸桿菌中復(fù)制。
ori-pUC區(qū)域之后是II型新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)基因。該酶對氨基糖苷類抗生素有耐藥性(例如卡那霉素和新霉素)，被用于在構(gòu)建質(zhì)粒時作為抗性標記。編碼nptII基因的序列是在其本身的細菌啟動子存在的條件下從原核生物轉(zhuǎn)座子Tn5衍生而來。
表1PV-ZMBK07質(zhì)粒中DNA成分一覽表
<p>表2PV-ZMGT10質(zhì)粒中DNA成分一覽表
4.受體材料導(dǎo)入目的基因的最初玉米受體為Hi-II，是來自于一個由A188和B73二個玉米自交系雜交而產(chǎn)生的后代。A188和B73分別是美國明尼蘇達大學和衣阿華州立大學選育的自交系，在美國種子市場上可以買到。該受體在組織培養(yǎng)階段有較強的再生能力。
5.轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化載體和受體系統(tǒng)建成后，就可通過適當?shù)霓D(zhuǎn)化方法進行操作，將外源目的基因cryIAb導(dǎo)入受體Hi-II。本研究采用的轉(zhuǎn)化方法是基因槍法。
用氯化鈣和精脒使DNA沉淀到鎢與金的微粒上。將裹有DNA的微粒滴在塑料大載體上，用火藥的爆炸力使其通過槍筒高度加速。大載體擊中塑料擋板，大載體的飛行被阻，但裹有DNA的微粒繼續(xù)飛行。微粒穿透靶標植物細胞，DNA沉淀，與細胞染色體整合。
6.轉(zhuǎn)化體篩選再生轉(zhuǎn)化后要從未轉(zhuǎn)化細胞中篩選出轉(zhuǎn)化體。細胞被培養(yǎng)于含有植物生長激素2，4-D的組織培養(yǎng)基上生長。雖然用于轉(zhuǎn)化的DNA溶液含有能編碼構(gòu)成對草甘膦有耐受性的基因(例如CP4EPSPS及gox基因)，便于在含有草甘膦的介質(zhì)中選擇遺傳改變的細胞，但這些基因在MON810抗蟲品系的植株中并不存在。因此，MON810品系中得出的細胞有可能是草甘膦選擇過程中的“漏網(wǎng)者”。在以后的階段中，在沒有草甘膦的情況下，愈傷組織再生植株，加以化驗，鑒定是否存在CryIAb蛋白產(chǎn)物。
7.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定分析整合在MON810品系中的DNA經(jīng)過分析，以便確定每一基因的插入物數(shù)目(玉米染色體組內(nèi)結(jié)合點的數(shù)目)以及復(fù)制數(shù)量。鑒定時采用Southern印跡法，分析從對照玉米植株和抗蟲品系玉米植株葉片組織中分離出來的染色體組的DNA。
MON810抗蟲玉米品系的產(chǎn)生是通過基因槍方法，所用DNA溶液含有兩種質(zhì)粒PV-ZMBK07[含cryIAb基因]及PV-ZMGT10[含CP4EPSPS和gox基因]。MON810玉米品系并未并入PV-ZMGT10質(zhì)粒序列。該品系包含一個約5.5KbNdeI片段所整合的DNA，其中含有一個E35S啟動子、hsp70內(nèi)含子和cryIAb基因。nptII基因和PV-ZMBK07質(zhì)粒的主鏈并未整合在內(nèi)。該品系不含CP4EPSPS、gox或nptII基因，也不含PV-ZMGT10質(zhì)粒的質(zhì)粒主鏈.
A.Southern雜交結(jié)果質(zhì)粒PV-ZMBK07具有cryIAb基因，質(zhì)粒PV-ZMGT10具有CP4EPSPS基因和gox基因。PV-ZMBK07和PVZMGT10這兩種質(zhì)粒載體以及在Southern雜交中用到的限制位點的位置如
圖1所示。
MON818和MON810植株的DNA在經(jīng)過多種限制酶消化之后，用于Southern雜交，以鑒定在粒子轟擊時進入玉米基因組的基因。具體地說，就是檢測插入片段的數(shù)目(玉米基因組中整合位點的數(shù)目)，各個基因的拷貝數(shù)及其完整性。
B.NdeI的消化結(jié)果NdeI消化實驗的目的是確定在玉米品系MON810中質(zhì)粒DNA插入片段的數(shù)目。質(zhì)粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10都沒有NdeI位點。因此，該酶在插入片段之外進行有效地切割，釋放出一條含有插入DNA和臨近的玉米基因組DNA的片段。MON818的對照DNA和MON810的DNA經(jīng)過NdeI消化，用質(zhì)粒PV-ZMBK07作探針進行雜交，結(jié)果如圖2所示。MON818的DNA(泳道1)產(chǎn)生一條很亮但擴散的約21.0Kb的帶；這是一條背景帶，因為在MON818和MON810中它都存在。MON810產(chǎn)生一條約5.5Kb的帶(泳道2)。這個結(jié)果證明抗蟲玉米品系MON810含有一個整合的DNA片段。插入的DNA加上臨近的直到NdeI限制位點的玉米基因組DNA，約有5.5Kb。
C.插入片段的成份1).cryIAb基因的整合MON818和MON810的DNA用NcoI/EcoRI消化，以產(chǎn)生cryIAb基因，在Southern雜交中用cryIAb基因作為探針。實驗結(jié)果如圖3(泳道1-3)所示。陽性雜交對照(泳道1)產(chǎn)生1個3.46Kb的片段，相當于預(yù)期的cryIAb基因的大小(參考
圖1的質(zhì)粒示意圖)。由于質(zhì)粒DNA中沒有對照的基因組DNA，這條帶看起來比其實際的分子量要大。MON818的DNA(泳道2)沒有產(chǎn)生帶，這與對照品系的預(yù)期結(jié)果相同。MON810(泳道3)產(chǎn)生一條約3.1Kb的帶。
2).CP4ESPSP基因的整合質(zhì)粒DNA(PV-ZMBK07和PV-ZMGT10)和抗蟲玉米品系MON810DNA用NcoI/BamHI消化，以產(chǎn)生CP4ESPSP基因，在Southern雜交中用CP4ESPSP基因作為探針。實驗結(jié)果如圖4(泳道1-2)所示。約50pg的兩種質(zhì)粒的混合DNA(泳道1)產(chǎn)生1條3.1Kb的帶，相當于預(yù)期的CP4ESPSP片段的大小，這與從質(zhì)粒示意圖(
圖1中的PV-ZMGT10)估計的結(jié)果相同。MON810的DNA(泳道2)沒有與CP4ESPSP探針雜交的片段，證明玉米抗蟲品系MON810沒有CP4ESPSP基因。
3).gox基因的整合質(zhì)粒DNA(PV-ZMBK07和PV-ZMGT10)和抗蟲玉米品系MON810DNA用NcoI/BamHI消化，以產(chǎn)生gox基因，在Southern雜交中用gox基因作為探針。實驗結(jié)果如圖4(泳道3-4)所示。約50pg的兩種質(zhì)粒的混合DNA(泳道3)產(chǎn)生1條約3.1Kb的NcoI/NcoI片段，相當于預(yù)期的gox片段的大小，這與從質(zhì)粒示意圖(
圖1中的PV-ZMGT10)估計的結(jié)果相同。MON810的DNA(泳道4)沒有與gox探針雜交的片段，證明抗蟲玉米品系MON810沒有g(shù)ox基因。
4).載體骨架的整合質(zhì)粒PV-ZMBK07、對照品系MON818和抗蟲玉米品系MON810的DNA用NcoI/EcoRI消化，以產(chǎn)生nptII/ori-pUC骨架，在Southern雜交中用nptII基因作為探針。實驗結(jié)果如圖5(泳道1-3)所示。約50pg的質(zhì)粒PV-ZMBK07的DNA產(chǎn)生兩條分別為2.5Kb和1.8Kb的帶(泳道1)。2.5Kb和1.8Kb的帶相當于預(yù)期的來自載體PV-ZMBK07的片段的大小(參考
圖1)。MON818的DNA(泳道2)沒有產(chǎn)生帶，這與未被轉(zhuǎn)化的對照品系的預(yù)期結(jié)果相同。MON810的DNA(泳道3)沒有產(chǎn)生帶，證明載體的骨架序列沒有整合進抗蟲玉米品系MON810。
Southern雜交膜洗凈后用ori-pUC區(qū)域作為雜交探針。質(zhì)粒PV-ZMBK07和PV-ZMGT10的DNA(泳道4)具有1條1.8Kb的帶。1.8Kb的帶相當于預(yù)期的來自PV-ZMBK07骨架的片段的大小(參考
圖1)。MON818的DNA(泳道5)沒有產(chǎn)生帶，這與未被轉(zhuǎn)化的對照品系的預(yù)期結(jié)果相同。MON810的DNA(泳道6)沒有產(chǎn)生帶，證明載體的骨架序列沒有整合進抗蟲玉米品系MON810。缺少與oripUC探針和nptII探針雜交的帶證明抗蟲玉米品系MON810不含任何骨架序列。
8.轉(zhuǎn)基因后代遺傳，表型穩(wěn)定性鑒定MON810抗蟲玉米品系等位基因分離和穩(wěn)定性數(shù)據(jù)經(jīng)過收集整理，表明與cryIAb基因組DNA單一活性的插入點的數(shù)據(jù)一致。
轉(zhuǎn)入基因及其對玉米螟抗性的穩(wěn)定性在七代雜交和隨后的產(chǎn)品商業(yè)應(yīng)用中均已證實。
9.回交轉(zhuǎn)育采用常規(guī)雜交和回交育種方法，以任何MON810抗蟲玉米作為供體，就可得到我們所需遺傳背景的MON810抗蟲玉米。
為了更好的理解本發(fā)明，我們對下述實施例中所采用的一些技術(shù)作如下闡述1.玉米螟的來源本實施例凡涉及到人工接種亞洲玉米螟的研究，所用亞洲玉米螟均為河北省衡水地區(qū)越冬種群。采用中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室發(fā)明并獲國家專利的無瓊脂半人工飼料和周大榮(1980)標準的亞洲玉米螟人工大量飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)。實驗所用亞洲玉米螟卵塊和初孵幼蟲均為高質(zhì)量的。
2.室內(nèi)生測方法第一步按照下述配方的要求，配制用于飼養(yǎng)亞洲玉米螟的基礎(chǔ)飼料?；旌虾?，置于食品攪拌器中攪拌3次，每次1分鐘(以防連續(xù)攪拌過熱)。
成分 用量 (g)1 大豆粉15.02 玉米粉18.03 啤酒酵母 9.04 葡萄糖(或食用白糖)7.55 維生素0.56 紅霉素0.157 山梨酸0.58 JSMD(瓊脂代用品) 10.0第二步稱取45g供鑒定的組織剪成碎片后放入攪拌杯；取90ml自來水，加4滴(約0.2ml)40％甲醛后倒入攪拌杯；開機攪拌3次，每次1分鐘，間隔30秒。
第三步將一、二兩步所得物在燒杯中混合均勻，制成含MON810和非MON810玉米組織的兩種測試飼料備用。
第四步將測試飼料分裝入2.5cm×8.0cm的指形管，每管6g，各接初孵玉米螟幼蟲10頭，用鑲有銅紗的橡皮塞堵緊管口，置28-30℃恒溫、70-80％RH條件下培養(yǎng)7-1 0天后進行觀察。調(diào)查存活幼蟲數(shù)并稱其體重。
3.改進的室內(nèi)生測方法在原室內(nèi)生測方法上，做了進一步改進。將從田間采回的新鮮MON810和非MON810玉米的葉片、雄穗和花絲等分別切碎，再放入研缽中。倒入適量液氮速凍，研磨成漿后，將其與一定量經(jīng)加工過的無瓊脂半人工飼料分別混勻，制成測試飼料備用。
取一普通透明膠卷盒，在其蓋上打一直徑為5mm的圓孔，并在內(nèi)側(cè)粘一片不銹鋼紗片，做成測試盒。將每份測試飼料分裝到100個測試盒，每盒約2g，接一頭初孵亞洲玉米螟幼蟲，每10盒為一組，放在28-30℃恒溫、RH為70-80％的條件下飼養(yǎng)，8天后檢查并記錄每組的亞洲玉米螟活蟲數(shù)和蟲重。
4.食葉級別采用國際玉米螟協(xié)作組制定的9級分級標準。
1～3級蟲孔針刺狀(又稱針孔)。
1級稀少、分散，2級中等數(shù)量，3級大量。
4～6級蟲孔火柴頭大小。
4級稀少、分散，5級中等數(shù)量，
6級大量。
7～9級蟲孔大于火柴頭。
7級稀少、分散，8級中等數(shù)量，9級大量。其中，1～2.9級為高抗型；3～4.9級為抗型；5～6.9級為中抗型；7～9級為感蟲型(超過8級即為高感型)。
實施例1證明抗蟲玉米品系MON810在葉片中表達的CryIAb蛋白使得其葉片抗亞洲玉米螟。
實施例1的下述各實驗于1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室(北京)進行。供試材料MON810玉米為雜交種B73×Mo17MON810，而非MON810為其同型的常規(guī)雜交種B73×Mo17。B73由美國衣愛華州立大學選育，Mo17由美國密蘇里州立大學選育，Mo17MON810由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司通過回交轉(zhuǎn)育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可從美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)。
實驗1生測方法表明，抗蟲玉米品系MON810在新葉組織中表達的CryIAb蛋白使得其新葉組織抗亞洲玉米螟。
稱取45g玉米新鮮心葉組織，采用室內(nèi)生測方法進行鑒定。觀察發(fā)現(xiàn)，非MON810的對照管中，極易看到發(fā)育良好的3～4齡幼蟲，而MON810各管中則沒有看到3～4齡幼蟲。在MON810各管中，可見的是沒有發(fā)育即死亡的幼蟲附著在綠色的測試飼料上和指形管的管壁上。
實驗2田間鑒定表明，抗蟲玉米品系MON810在玉米新葉中期的葉片中表達的CryIAb蛋白使得玉米新葉中期的葉片抗亞洲玉米螟。
供鑒定的MON810和非MON810玉米于1997年4月23日播種，鑒定于6月17和20日在玉米的心葉中期進行，每株接黑頭卵2塊(每塊約40-50粒)，于6月28日調(diào)查結(jié)果，共2項指標一是國際食葉等級，二是每株幼蟲成活數(shù)。結(jié)果見表3，清楚表明極佳的防治效果在MON810玉米植株上未發(fā)現(xiàn)存活幼蟲。
表3玉米心葉期對亞洲玉米螟的抗性結(jié)果
實驗3抗蟲玉米品系MON810在玉米新葉期的不同葉片中表達的CryIAb蛋白使得玉米新葉期的不同葉片抗亞洲玉米螟表4心葉期不同葉片對亞洲玉米螟的抗性
在田間生長的MON810和非MON810玉米植株發(fā)育至心葉中期時，標出其自下而上的第5片葉片，然后齊地面將植株割斷取回。進一步將全部葉片按自下而上分別標明葉序，并齊莖稈著生處逐片剪下，分成5組，即第5、6葉，第7、8葉，第9、10葉，第11、12葉以及最后2-3片尚未展出的緊包雄穗芽的嫩葉。將所有從6株MON810和6株非MON810玉米上剪下的各5組葉片剪碎、分別按組混合，按室內(nèi)生測方法加工處理和接蟲觀察。結(jié)果列于表4。
表4結(jié)果清楚表明所有來自不同高度的MON810葉片以及心葉組織含有的CryIAb均有足以殺死幾乎全部供試初孵幼蟲的能力。在全部MON810葉片喂養(yǎng)試驗中，所接種的1000頭初孵幼蟲中，只發(fā)現(xiàn)1頭明顯發(fā)育不良、體形極小的活蟲，表現(xiàn)在停留在2齡階段，而不是像非MON810處理對照均已達3～4齡。
實驗4抗蟲玉米品系MON810在包裹幼嫩雄穗的最上部兩片葉中表達的CryIAb蛋白使得包裹幼嫩雄穗的最上部兩片葉抗亞洲玉米螟將在抽雄期的MON810和非MON810玉米植株地上部取回實驗室，將包著雄穗的最上部兩片剪下。生測方法同前，結(jié)果表明包裹幼嫩雄穗的最上部兩片葉都含有足夠的CryIAb毒蛋白，初孵幼蟲死亡率達到100％(見表5)。
表5包裹雄穗的最后兩片葉對亞洲玉米螟的抗性
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<p>表6露雄期包裹雄穗的兩片葉片的殺蟲活性處理 幼蟲數(shù)(頭)存活蟲數(shù)總重 死亡率 蟲重/頭飼料∶組織 接蟲數(shù) 存活蟲數(shù) (g)(％) 平均(mg) 平均1∶1 非MON81011 8 0.182227.278.73 22.775021.066410 8 0.235720 29.462511 11 0.20610 18.736412 12 0.20650 17.208310 10 0.17690 17.690010 10 0.19450 19.450010 9 0.169210 18.800010 9 0.195710 21.744410 10 0.20460 20.460010 8 0.194720 24.33751∶1 MON810 10 0 100 99 0.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 1 0.0000900.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 1003∶2 MON810 10 0 100 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 100
實驗6抗蟲玉米品系MON810抽雄期包裹雄穗的兩片葉以下的5片展開葉片中表達的CryIAb蛋白使得抽雄期包裹雄穗的兩片葉以下的5片展開葉片抗亞洲玉米螟將在抽雄期的MON810和非MON810玉米植株地上部取回實驗室，將包著雄穗的兩葉片以下的5片展開葉片剪下。依改進的室內(nèi)生測方法測定其抗性，結(jié)果列于表7。從表7中可以看到，MON810玉米葉片的處理含有足夠的CryIAb蛋白，亞洲玉米螟幼蟲死亡率分別為98％和100％，而非MON810僅為3％和6.91％；且MON810和非MON810存活幼蟲體重差異很大。
表7露雄期包裹雄穗的兩片葉以下的5片展開葉片的殺蟲活性處理幼蟲數(shù)(頭) 存活蟲數(shù)總重 死亡率 蟲重/頭飼料∶組織 接蟲數(shù) 存活蟲數(shù)(g) (％)平均(mg) 平均3∶2 非MON81088 0.178 0 3 22.2500 19.846410 8 0.137 20 17.125011 11 0.20490 18 627310 10 0.184 0 18.400010 10 0.21430 21.430010 10 0.17540 17.540010 9 0.170310 18.922210 10 0.21860 21 860010 10 0.22640 22.640010 10 0.19670 19.67003∶2 MON810 10 1 0.000090 98 0.0 0.010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 1 0.0000 90 0.0
10 0 10010 0 10010 0 1001∶1 非MON810 10 8 0.18 20 6.9122.5000 22.341410 10 0.24820 24.820010 10 0.22420 22.420010 8 0.148420 18.550010 10 0.22380 22.380012 12 0.299 0 24.916711 10 0.22599.1 22.590010 8 0.174320 21.787510 10 0.19870 19.870010 10 0.23580 23.58001∶1 MON81010 0 100 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 10010 0 100實施例2證明抗蟲玉米品系MON810雄穗中表達的CryIAb蛋白使得其雄穗抗亞洲玉米螟。
該實施例的下述各實驗于1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室(北京)進行。供試材料MON810玉米為雜交種B73×Mo17MON810，而非MON810為其同型的常規(guī)雜交種B73×Mo17。B73由美國衣愛華州立大學選育，Mo17由美國密蘇里州立大學選育，Mo17MON810由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司通過回交轉(zhuǎn)育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可從美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)。
實驗1雄穗抗性的鑒定技術(shù)是將2塊黑頭卵放在幼嫩雄穗上，然后套上一個授粉袋并扎緊袋口以減少逃逸或被鳥類啄食。1997年7月4日對MON810和非MON810的玉米各26株進行了接種，7月16日調(diào)查成活幼蟲數(shù)，結(jié)果見表8。MON810和非MON810的雄穗差別顯著，MON810玉米雄穗含有足夠的CryIAb蛋白，沒有發(fā)現(xiàn)存活幼蟲，幼蟲死亡率達到100％。
表8MON810雄穗對亞洲玉米螟的抗性
實驗2室內(nèi)生測方法同前，只是攪碎組織時加水量減少10ml，因新鮮雄穗含水量遠較心葉為多。結(jié)果表明，MON810玉米雄穗含有足夠的CryIAb蛋白，初孵幼蟲死亡率達到100％(見表9)。
表9雄穗芽對亞洲玉米螟的抗性
實驗3散粉前的雄穗中表達的CryIAb蛋白使得散粉前的雄穗抗亞洲玉米螟采用前述改進的室內(nèi)測定方法，結(jié)果表明，含有MON810玉米散粉前雄穗組織的飼料可殺死93％以上的亞洲玉米螟初孵幼蟲，存活下來的幼蟲發(fā)育停滯(見表10)，可見其含有足夠的CryIAb蛋白。
表10散粉前的雄穗對亞洲玉米螟的抗性處理幼蟲數(shù) 存活蟲數(shù)總重 死亡率蟲重/頭飼料∶組織 接蟲數(shù) 存活蟲數(shù)(g) (％) 平均 (mg)平均3∶2 非MON81010 10 0.150101.2515.01 17.322611 11 0.2123019.3010 10 0.1513015.1310 9 0.207 10 23.0011 11 0.1572014.2910 10 0.1352013.5210 10 0.1871018.7110 10 0.1962019.623∶2 MON810 11 1 0.000290.9193.980.20 0.150010 1 0.0001900.1011 1 0.000090.91 0.010 0 10010 1 0.0002900.2010 0 10010 0 10010 1 0.000190 0.101∶1 非MON81010 9 0.09 10 2.5010.00 14.272110 9 0.190510 21.1710 10 0.1252012.5210 10 0.1402014.0210 10 0.1134011.3410 10 0.1598015.9810 10 0.1344013.4410 10 0.1571015.711∶1 MON810 11 2 0.000281.8295.23 0.10 0.233310 0 10010 1 0.000390 0.3010 0 10010 0 10010 1 0.000390 0.3010 0 10010 0 100
實施例3證明抗蟲玉米品系MON810在花藥中表達的CryIAb蛋白使得其花藥抗亞洲玉米螟。
實驗于1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室(北京)進行。供試材料MON810玉米為雜交種B73×Mo17MON810，而非MON810為早代系MC-37。B73由美國衣愛華州立大學選育，Mo17由美國密蘇里州立大學選育，Mo17MON810由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司通過回交轉(zhuǎn)育而成。B73×Mo17MON810可從美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)。非MON810玉米為早代系MC-37，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室提供。
花藥的采集用授粉袋套住散粉期的雄穗，第二天抖動雄穗，將散落在袋中的花藥用分樣篩與花粉分開，帶回室內(nèi)。生測方法同前。
結(jié)果表明，MON810玉米的花藥含有足夠的CryIAb蛋白，含有MON810玉米花藥的飼料能殺死100％的亞洲玉米螟初孵幼蟲(見表11)。
表11花藥的殺蟲活性處理 幼蟲數(shù) 存活蟲數(shù)總重 死亡率 蟲重/頭接蟲數(shù)存活蟲數(shù)(g)(％)平均(mg)平均MON810 5 0 100 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 1005 0 100MC-37(CK)5 30.010140 16 3.37 4.76825 50.034106.82
54 0.0204205.1055 0.01670 3.3454 0.0171204.2855 0.00770 1.5453 0.0228407.6054 0.0222205.5555 0.01720 3.4454 0.0266206.65實施例4證明抗蟲玉米品系MON810在花絲中表達的CryIAb蛋白使得其花絲抗亞洲玉米螟。
該實施例中的下述各實驗于1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室(北京)進行。供試材料MON810玉米為雜交種B73×Mo17MON810，而非MON810為其同型的常規(guī)雜交種B73×Mo17。B73由美國衣愛華州立大學選育，Mo17由美國密蘇里州立大學選育，Mo17MON810由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司通過回交轉(zhuǎn)育而成。B73×Mo17MON810和B73×Mo17可從美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′s Foundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)。
實驗1采自田間成束的MON810和非MON810玉米新鮮花絲，先在清水中浸沾一下以便保持新鮮，略涼干后放入直徑為11.5cm，高10.5cm的塑料罐內(nèi)，罐底墊一張濾紙，每罐的花絲上接2塊黑頭卵(約30粒/塊)。而后，在每塑料罐上覆扣一個完全相同的空罐，但在罐壁中部開有4個等距的孔，各孔均鑲有不銹鋼紗以防幼蟲孵化后逃逸，上下兩罐在接卵后用膠帶粘合成一整體，置于28-30℃恒溫、70-80％RH條件下培養(yǎng)6天后觀察。
結(jié)果顯示，飼養(yǎng)6天后，MON810玉米的花絲仍新鮮完好，而對照非MON810玉米的花絲已全部被吃光，只剩深棕色的糞便和碎屑，并且在MON810的處理罐中一頭活幼蟲也見不到，二者的差異極其明顯?？梢?，MON810玉米的花絲中含有足夠的CryIAb蛋白。
實驗2選取初孵幼蟲，采用CIMMYT昆蟲學家Mihm博士發(fā)明的接種槍(Bazooka)接種初孵幼蟲于玉米剛吐出的新鮮花絲上。調(diào)查結(jié)果見表12?？梢?，MON810玉米與非MON810玉米的花絲表現(xiàn)出極明顯的差異，因此，MON810玉米的花絲中含有足夠的CryIAb蛋白。
表12MON810玉米花絲的抗性
實驗3實驗于1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室進行，實驗方法采用室內(nèi)改進的生測方法。結(jié)果列于表13。MON810玉米花絲含有足夠的CryIAb蛋白，用其配制的飼料能殺死96％以上的亞洲玉米螟初孵幼蟲，且存活下來的幼蟲發(fā)育停滯。
表13花絲對亞洲玉米螟的抗性處理幼蟲數(shù)存活蟲數(shù)總重死亡率蟲重/頭飼料∶組織 接蟲數(shù)存活蟲數(shù) (g) (％) 平均％(mg)平均3∶2 非109 0.13791013.75 15.3212.16MON810108 0.088420 11.05109 0.113110 12.57108 0.086120 10.76106 0.043240 7.2010100.15430 15.4310100.089 0 8.90109 0.144610 16.073∶2 MON810100 100 98.75 0.0100 100100 100
100100100100101 0.0000900.01001001001001∶1 非107 0.116 3010.81 16.5714.08MON8101010 0.16 0 16.001010 0.17340 17.34109 0.12091013.43109 0.0897109.971010 0.15780 15.78108 0.10032012.541110 0.12099.090912.09119 0.117418.1818 13.041∶1 MON810112 0.000681.8182 96.180.30 0.27100100101 0.0003900.30100100100100100100101 0.0002900.20100100100100100100實施例5證明在大田人工接種亞洲玉米螟條件下，CryIAb蛋白在抗蟲玉米品系MON810中所表現(xiàn)的增產(chǎn)作用。
試驗于1998年在位于中國北方玉米主栽區(qū)的沈陽市農(nóng)業(yè)科學院、河南省農(nóng)業(yè)科學院、吉林省農(nóng)業(yè)科學院和吉林省農(nóng)作物新品種引育中心4個地點進行。供試材料共計14個玉米雜交種，包括6對同型雜交種和二個當?shù)刂髟云贩N(對照)。以LH系組配的雜交種可由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′sFoundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)，其它同型雜交種可從美國孟山都公司買到。當?shù)貙φ辗N子可在中國當?shù)胤N子市場買到。每一對同型雜交種是由1個MON810抗蟲雜交種和一個非MON810常規(guī)雜交種組成，二者的區(qū)別在于MON810抗蟲雜交種可表達CryIAb蛋白，而非MON810雜交種則不能，而其它遺傳組成是一致的。顯而易見，同型雜交種之間所表現(xiàn)的不同是由于含或不含CryIAb蛋白的結(jié)果。
在整個玉米生長季節(jié)，接蟲分三次進行。第一次在新葉期，兩塊亞洲玉米螟黑頭卵(約50～60粒/塊)被放入植株的上部新葉中；第二次在抽雄前的打苞期，上部葉片接種兩塊亞洲玉米螟黑頭卵；第三次在吐絲期，兩塊亞洲玉米螟黑頭卵被接種在玉米剛吐出的新鮮花絲中。這樣，每株玉米接種量合計約為300～360粒亞洲玉米螟黑頭卵。產(chǎn)量結(jié)果見表14。
表14表明，可以編碼CryIAb蛋白的MON810雜交種相對其同型的非MON810雜交種，在接蟲條件下，表現(xiàn)出明顯的增產(chǎn)效果。表14可以看出，所有單對同型雜交種在所有試驗地點，均表現(xiàn)為MON810雜交種增產(chǎn)，增產(chǎn)幅度最低的為6.7％，最高的為89.5％。在所有4個試驗點上，6個非MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均僅為7103公斤，而它們的6個同型MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均則達9102公斤，每公頃增產(chǎn)糧食1999公斤，增產(chǎn)幅度28.1％。4個測試點，MON810雜交種相對非MON810雜交種的增產(chǎn)幅度，以河南農(nóng)業(yè)科學院最高，達69.1％，沈陽農(nóng)業(yè)科學院次之，為29.5％，其次為吉林省農(nóng)業(yè)科學院，為25.1％，最低的為引育中心，亦有15.5％。盡管MON810相對非MON810的增產(chǎn)幅度隨6對測試雜交組合的不同而不同，但均表現(xiàn)為增產(chǎn)，幅度為19.8％～32.9％?？梢缘贸觯c不含有編碼CryIAb蛋白的非MON810玉米雜交種相比，含有編碼CryIAb蛋白的MON810玉米雜交種產(chǎn)量水平較高，產(chǎn)量的提高是由于CryIAb蛋白對亞洲玉米螟的抗性所致。
表141998年孟山都MON810效果驗證試驗產(chǎn)量結(jié)果表
引育中心吉林省農(nóng)作物新品種引育中心同型增產(chǎn)MON810雜交種相對同型常規(guī)雜交種的增產(chǎn)幅度實施例6證明在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下，CryIAb蛋白在抗蟲玉米品系MON810中所表現(xiàn)出的增產(chǎn)作用。
試驗于1998年在沈陽市農(nóng)業(yè)科學院、山東農(nóng)業(yè)大學、丹東農(nóng)業(yè)科學院、吉林省農(nóng)業(yè)科學院和吉林省農(nóng)作物新品種引育中心5個地點進行。這些地點常年遭受亞洲玉米螟的為害，并導(dǎo)致一定的產(chǎn)量損失。供試材料共計22個玉米雜交種，其中20個是由10對同型雜交種組成，另外2個為當?shù)刂魍朴衩纂s交種(對照)。以LH系組配的雜交種可由美國Holden′s基礎(chǔ)種子公司買到(Holden′sFoundation Seeds L.L.C.，Williamsburg，Iowa，USA)，其它同型雜交種可從美國孟山都公司買到。當?shù)貙φ辗N子可在中國當?shù)胤N子市場買到。同型雜交種如實施例5所述。試驗是在大田自然條件下進行，所有的植株都不人為接種亞洲玉米螟，所有亞洲玉米螟的為害都是在大田自然條件下發(fā)生。產(chǎn)量結(jié)果列于表15。
從表15可知，每一對同型雜交種在所有試驗地點，均表現(xiàn)為MON810雜交種產(chǎn)量高于其同型非MON810雜交種。在所有5個試驗點上，10個非MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均僅為8066公斤，而它們的10個同型MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均則達9645公斤，每公頃增產(chǎn)糧食1579公斤，增產(chǎn)幅度19.6％。對于5個測試點而言，MON810雜交種相對非MON810雜交種的增產(chǎn)幅度，以丹東農(nóng)業(yè)科學院最高，達46.3％，最低的為吉林省農(nóng)業(yè)科學院，亦有9.8％，沈陽農(nóng)業(yè)科學院、山東農(nóng)業(yè)大學和引育中心位居中間，分別為22.6％、15.0％和13.4％。盡管MON810相對非MON810的增產(chǎn)幅度隨10對測試雜交組合的不同而不同，但均表現(xiàn)為增產(chǎn)，幅度為12.3％～26.4％。本試驗可以得出，與不含有編碼CryIAb蛋白的非MON810玉米雜交種相比，含有編碼CryIAb蛋白的MON810玉米雜交種產(chǎn)量較高，產(chǎn)量的增加是由于CryIAb蛋白對亞洲玉米螟的抗性所致。
表151998年孟山都MON810雜交種比較試驗產(chǎn)量結(jié)果表
引育中心吉林省農(nóng)作物新品種引育中心同型增產(chǎn)MON810雜交種相對同型常規(guī)雜交種的增產(chǎn)幅度實施例7證明，在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下，CryIAb蛋白在抗蟲玉米品系MON810的表達，使得其籽粒重量增加、莖桿抗性改良(抗倒伏、減少莖腐病)，而對其它性狀表現(xiàn)影響不大。
試驗方法同實施例6，結(jié)果見下述表16。
由表16中可以看到，MON810雜交種含有的CryIAb蛋白不僅使玉米籽粒的千粒重提高，同時由于莖桿質(zhì)量的改善，使其莖腐病減少、倒伏性降低。就千粒重而言，MON810雜交種平均348克，而非MON810雜交種平均321克，MON810雜交種提高27克，達8.4％。莖腐病、根倒伏和莖倒伏這些性狀上，MON810雜交種平均分別為9％、5％和0％，而相應(yīng)的非MON810雜交種則為19％、9％和1％。顯然，這是由于在含有CryIAb蛋白的玉米植株上，亞洲玉米螟的減少而引起的物理和生理破壞的降低而產(chǎn)生的結(jié)果。
由表16也可以看到，就株高、穗位高和生育期這些植株性狀和生育性狀來說，6個MON810雜交種平均為269cm、100cm和110天，相應(yīng)的6個同型的非MON810雜交種分別為268cm、99cm和110天，二者沒有明顯區(qū)別。主要的葉部病害和穗部性狀，如灰斑病、大斑病、小斑病、穗長、穗粗、穗行數(shù)、出籽率，除出籽率二者有微小差別(87％對86％)外，其余性狀表現(xiàn)二者完全相同。
表161998年孟山都MON810雜交種比較試驗主要性狀結(jié)果
實施例8證明，在大田人工接蟲亞洲玉米螟的條件下，CryIAb蛋白在抗蟲玉米品系MON810中的表達，使得其籽粒重量增加、莖桿抗性改良(抗倒伏、減少莖腐病)，而對其它性狀表現(xiàn)影響不大。
試驗方法同實驗例5，觀察結(jié)果見表17。
從表17可以看到，在人工大劑量接蟲條件下，可以表達CryIAb蛋白的MON810雜交種和非MON810雜交種在株高、穗位高、生育期、大斑病、小斑病、粗縮病、灰斑病、穗長、穗粗、穗行數(shù)和出籽率等主要性狀上沒有大的差別。然而在粒重和莖稈抗性上，MON810表現(xiàn)為不僅千粒重增加，而且植株莖桿抗性增強(倒伏性降低，莖腐病減少)。MON810雜交種的千粒重、倒伏度和莖腐病三個性狀的平均值分別為330克、12％和7％，而非MON810雜交種的相應(yīng)值分別是313克、20％和12％。顯然，這是由于在含有CryIAb蛋白的玉米植株上，亞洲玉米螟的減少而引起的物理和生理破壞的降低而產(chǎn)生的結(jié)果。
表171998年孟山都MON810雜交種效果驗證試驗主要性狀結(jié)果表
<p>實施例9證明在大田接蟲條件下，抗蟲玉米品系MON810在葉片、莖桿和植株中表達的CryIAb使得其葉片、莖桿和植株抗亞洲玉米螟。
試驗方法同實施例5，測定項目包括單株蟲孔數(shù)、食葉級別、單株隧道長度和為害株率。觀察結(jié)果見表18。
由表18可知，所有參試的6對同型雜交種，在4個指標性狀上，雖然其數(shù)值大小隨組合的不同而上下變動，但MON810雜交種所遭受亞洲玉米螟的為害程度均遠低于其同型的非MON810雜交種。參試的6個MON810雜交種在單株蟲孔數(shù)、食葉級別、單株隧道長度和為害株率這4個指標性狀上，分別為0.04個、0.52級、0.03cm和1.67％，而相應(yīng)的6個非MON810則為5.48個、3.92級、11.09cm和85％，非MON810雜交種是MON810雜交種的137倍、7倍、370倍和50倍。當?shù)囟€常規(guī)對照品種的4個指標性狀分別為5.81個、2.39級、13.56cm和85.4％，與非MON810雜交種進行比較可以發(fā)現(xiàn)，二者對亞洲玉米螟的感染程度是一致的?？梢?，可編碼CryIAb蛋白的MON810雜交種所受亞洲玉米螟為害明顯低于不含編碼CryIAb蛋白的二個當?shù)貙φ蘸屯碗s交種。因此，表18表明，在人工接蟲處理下，含有CryIAb蛋白玉米雜交種的葉片、莖稈以及整個植株所受亞洲玉米螟的為害要遠遠低于那些不含CryIAb蛋白的玉米雜交種。顯然，這來自于CryIAb蛋白對亞洲玉米螟的防治效果。
表181998年孟山都MON810雜交種效果驗證試驗主要危害性狀結(jié)果表
<p>實施例5和例6的綜合分析表明，抗蟲玉米品系MON810表達的CryIAb蛋白表現(xiàn)了明顯的增產(chǎn)作用。在亞洲玉米螟自然為害的大田條件下，MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均9645公斤，而它們同型的非MON810雜交種僅為8066公斤，MON810雜交種每公頃增產(chǎn)糧食1579公斤，增產(chǎn)幅度19.6％。在人工接種亞洲玉米螟的大田條件下，非MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均僅為7103公斤，而它們的同型MON810雜交種每公頃產(chǎn)量平均則達9102公斤，每公頃增產(chǎn)糧食1999公斤，增產(chǎn)幅度28.1％。因此，廣泛地講，只要有亞洲玉米螟為害的地方，種植MON810抗蟲玉米，其所表達的CryIAb蛋白都應(yīng)該是使玉米增產(chǎn)的。
實施例1到例9的綜合分析表明，在各種鑒定方法檢測下(室內(nèi)生測方法、改進的室內(nèi)生測方法、田間鑒定)，MON810抗蟲玉米品系的葉片、莖稈、雄穗、花藥和花絲等組織的CryIAb蛋白的表達量足以殺死幾乎全部的亞洲玉米螟的初孵幼蟲，因此，這是一種全植株的對亞洲玉米螟的防治能力。這種殺滅害蟲的能力不僅體現(xiàn)在亞洲玉米螟最易為害玉米的新葉中期(又叫新葉期世代)和花絲盛期(又叫穗期世代)，而且體現(xiàn)在苗期、打苞期、成熟期等，因此，這也是一種全生育期的對亞洲玉米螟的防治能力。由此可見，MON810抗蟲玉米所產(chǎn)生的CryIAb蛋白，對玉米是一種全植株和全生育期的防護。
實施例1到例9的綜合分析表明，MON810玉米品系對亞洲玉米螟產(chǎn)生毒殺作用的CryIAb蛋白的表達不因種植地點的不同而不同，不因種植時間的變化而變化。1997年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室(北京)進行的實驗表明，MON810玉米品系的CryIAb蛋白的表達量足以防治亞洲玉米螟對其的為害。1998年在夏玉米區(qū)的河南省農(nóng)業(yè)科學院(鄭州)、山東農(nóng)業(yè)大學(泰安)和在春玉米區(qū)的沈陽市農(nóng)業(yè)科學院(沈陽)、丹東市農(nóng)業(yè)科學院(丹東)、吉林省農(nóng)業(yè)科學院(公主嶺)和吉林省農(nóng)作物新品種引育中心(公主嶺)也都顯示，不管是大田亞洲玉米螟自然為害條件下，或是大田人工接蟲亞洲玉米螟的條件下，MON810玉米品系表達的CryIAb蛋白亦都足以防治亞洲玉米螟對玉米的為害。因此，廣泛地講，在任何時間和地點，只要有亞洲玉米螟為害玉米的地方，種植MON810抗蟲玉米，其所產(chǎn)生的CryIAb蛋白都應(yīng)足以防治亞洲玉米螟對玉米的為害。
實施例1到例9的綜合分析表明，抗蟲玉米品系MON810的CryIAb蛋白的表達不因玉米遺傳背景的改變而改變。中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所玉米螟研究室采用的供試材料的遺傳背景為B73×Mo17MON810，在大田人工接蟲亞洲玉米螟條件下，供試的為六個遺傳背景不同的MON810雜交種(見表14)，而在大田亞洲玉米螟自然為害條件下，供試的為十個遺傳背景不同的MON810雜交種(見表15)，所有這些遺傳背景不同的MON810雜交種，均表現(xiàn)出一致的防治亞洲玉米螟的良好效果。這也廣泛地說明，CryIAb蛋白的表達從遺傳上來說是受制于其是否是MON810抗蟲玉米品系。因此，任何MON810抗蟲玉米品系，不管是自交系、雜交種、群體、綜合種等，都應(yīng)該是抗亞洲玉米螟的。
本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對亞洲玉米螟的防治顯然是因為玉米本身可產(chǎn)生CryIAb蛋白，而MON810玉米僅是CryIAb蛋白表達的一個載體，因此，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，根據(jù)CryIAb蛋白對亞洲玉米螟的相同毒殺作用，可產(chǎn)生類似的可表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米，用于防治亞洲玉米螟對玉米的為害。
適用于該發(fā)明的CryIAb蛋白是本文所給出氨基酸序列的CryIAb多肽。
通過前述實施例的介紹，我們不難看出本發(fā)明的獨特之處。
本發(fā)明是提供了一種防治亞洲玉米螟為害玉米的新方法，它是利用了現(xiàn)代生物學技術(shù)使對亞洲玉米螟產(chǎn)生毒性的CryIAb蛋自在植物體內(nèi)的表達來實現(xiàn)的。廣泛地講，這種所述的防治方法不僅對玉米，而且對任何遭受亞洲玉米螟為害的作物都是如此。這些被亞洲玉米螟為害的作物包括(但不限于)棉花、谷子、高粱等。因為只要CryIAb蛋白在這些作物體內(nèi)表達，就可防治亞洲玉米螟對其的為害。
權(quán)利要求
1.一種防治亞洲玉米螟為害玉米的方法，其特征在于，其通過種植一種在體內(nèi)可表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米植物，從而使攝取該植物組織的亞洲玉米螟的取食和生長受到抑制，并最終導(dǎo)致死亡，來實現(xiàn)對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CryIAb蛋白具有所述的CryIAb蛋白的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米為轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系MON810包括任何MON810自交系、雜交種、綜合種或群體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的整個植株對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的整個植株對亞洲玉米螟為害玉米的防治包括其葉片、莖桿、雄穗、花藥和花絲對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米的全生育期對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米全生育期對亞洲玉米螟為害玉米的防治包括其苗期、新葉期、打苞期、抽雄期、花絲期對亞洲玉米螟為害玉米的防治。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟的防治不因種植地點的改變而改變。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治不因種植時間的改變而改變。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田人工接種亞洲玉米螟條件下所表現(xiàn)出的增產(chǎn)作用。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田人工接種亞洲玉米螟條件下所表現(xiàn)出的籽粒重量的提高。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田人工接種亞洲玉米螟條件下所表現(xiàn)出的莖桿抗性的改善。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下所表現(xiàn)出的增產(chǎn)作用。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下所表現(xiàn)出的籽粒重量的提高。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其特征在于，所述的對亞洲玉米螟為害玉米的防治是指轉(zhuǎn)基因抗玉米在大田亞洲玉米螟自然發(fā)生為害條件下所表現(xiàn)出的莖桿抗性的改善。
17.權(quán)利要求1至4任一項所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米作為防治亞洲玉米螟為害玉米的用途。
全文摘要
一種防治亞洲玉米螟為害玉米的方法,其通過種植在其體內(nèi)可表達CryIAb蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米植物,特別是抗蟲玉米品系MON810,從而使攝取該植物組織的亞洲玉米螟的取食和生長受到抑制,并最終導(dǎo)致死亡。所述方法對亞洲玉米螟的防治是全植株的和全生育期的,不因種植時間、種植地點等的改變而改變。并使抗蟲玉米的產(chǎn)量明顯提高,同時改善了其籽粒性狀和莖稈性狀的表現(xiàn)。所述方法效果好,具有簡單、方便、經(jīng)濟和對環(huán)境不產(chǎn)生污染等優(yōu)點。
文檔編號A01H1/04GK1266616SQ00100699
公開日2000年9月20日 申請日期2000年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月28日
發(fā)明者保羅·F·約翰森, 周大榮, 劉石, 趙永亮 申請人:孟山都公司