專利名稱：：一種鑒定大白菜—甘藍異附加系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種鑒定大白菜一甘藍異附加系的方法，屬于分子遺傳學理論應(yīng)用與育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前，關(guān)于大白菜(brassiesca順e5^Wssynra，ssp.尸eh'/e7757'51，AA)與甘藍(丑Weracesvar.L.，CC)染色體的鑒定限于細胞水平，由于染色體小且形態(tài)相近，核型分析的方法很難在大白菜染色體背景下準確鑒定甘藍染色體。Chen等人禾U用^firas57'cacai7pes^rz'5^丑a/eraceavar.a76o《〗a6ra單體異附加系根尖體細胞前中期染色體核型分析，僅鑒定了附加甘藍最長染色體的1個異附加系；由于大白菜與甘藍同源性較強，基因組原位雜交不能區(qū)分二者染色體；Robert等人以5SrDNA和25SrDNA為探針的熒光原位雜交，鑒定了5號、8號、9號丑ca歷/es^rz'5^及a/eraceavar.a〗Zwg〗aAra單〈本異附加系，但對于沒有雜交位點的丑sM^is6ra染色體也不能準確鑒定。這就制約了大白菜一甘藍異附加系等重要遺傳材料的鑒定與應(yīng)用。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，甘藍連鎖群已趨于飽和，為利用分子標記技術(shù)鑒定甘藍染色體奠定了基礎(chǔ)。由于大白菜與甘藍同源性較強，必須選用一種多態(tài)性強、穩(wěn)定性好的分子標記，并且要求操作簡便，DNA用量小。經(jīng)檢索，現(xiàn)有文獻中未發(fā)現(xiàn)理想的技術(shù)鑒定大白菜一甘藍異附加系的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種鑒定大白菜一甘藍異附加系的方法，為利用甘藍基因改良大白菜遺傳背景奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的基本原理是利用甘藍連鎖群相對大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍及異附加系基因組DNA為模板進行PCR擴增，比較它們的擴增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物均與大白菜一致，則表明異附加系中沒有附加甘藍的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物與雜交種一致，則表明異附加系中附加了甘藍的該連鎖群。因此，本發(fā)明的特點是利用甘藍不同連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物，在分子水平鑒定大白菜一甘藍異附加系的外源甘藍連鎖群。具體地，本發(fā)明的方法包括以下步驟(1)根據(jù)己發(fā)表的甘藍遺傳圖譜，選用位于甘藍不同連鎖群的91對SSR引物；(2)CTAB法提取不同品種的大白菜和甘藍的基因組DNA，PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測；(4)篩選甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物；篩選在大白菜中沒有擴增產(chǎn)物，而甘藍中有擴增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴增產(chǎn)物，但甘藍的擴增產(chǎn)物不同于大白菜擴增產(chǎn)物的引物，作為甘藍連鎖群相對于大白菜的特異SSR引物；(5)利用篩選到甘藍連鎖群相對于大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍及異附加系基因組DNA為模板進行PCR擴增，鑒定大白菜—甘藍異附加系。具體地，本發(fā)明的方法詳述為根據(jù)己發(fā)表的甘藍遺傳圖譜，選用了位于甘藍不同連鎖群的91對SSR引物，引物的連鎖群分布及序列如表1所示，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。將8個甘藍品種(春季早熟甘藍品種中甘ll，8312，極早甘藍；春季中熟甘藍品種京豐一號；春秋兼用早熟甘藍品種中甘17;秋季中熟甘藍品種中甘19;秋季晚熟甘藍品種晚豐甘藍，中甘18)和7個大白菜品種(抗抽薹炮彈型大白菜品種強豐春白菜，高抗王；中晚熟直筒合抱大白菜品種多抗75;極早熟疊抱大白菜品種超級夏陽，早熟五號；早熟高樁直筒大白菜品種秋綠55;中熟矮樁疊抱大白菜品種新鄉(xiāng)小包23)種子播種于穴盤，常規(guī)管理，當幼苗長到46片真葉時，剪取幼嫩新葉，采用CTAB法提取基因組DNA。以這些材料基因組DNA為模板，以獲取的甘藍連鎖群SSR引物進行PCR擴增。每個PCR反應(yīng)體系為20叱，含模板DNA50ng，2mmol/LMg2+，1Xbuffer，200Mmol/LdNTP，1UTap酶，正反向引物各2.5ng>L。PCR擴增程序為，94。C預變性2min;94。C變性lmin，6CTC復性30s，72'C延伸45s，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低O.5°C;94。C變性lmin，55。C復性30s，72。C延伸45s，共30個循環(huán)；72"C延伸5min.，4"C保存。擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測。篩選甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物，篩選在大白菜中沒有擴增產(chǎn)物，而甘藍中有擴增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴增產(chǎn)物，但甘藍的擴增產(chǎn)物不同于大白菜擴增產(chǎn)物的引物，作為甘藍不同連鎖群的相對于大白菜特異的SSR引物。結(jié)果表明，25對引物能夠在甘藍、大白菜擴增出有差異的片段，片段長度在40-430bp,其中7對引物在結(jié)球甘藍中有擴增產(chǎn)物而在大白菜中無擴增產(chǎn)物，18對引物在大白菜和結(jié)球甘藍中的擴增產(chǎn)物不同，這25對SSR引物涉及了甘藍的9個連鎖群(見表2)，在大白菜和甘藍中的擴增結(jié)果如圖1所示。利用這25對甘藍連鎖群相對大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍及異附加系基因組DNA為模板進行PCR擴增，比較它們的擴增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物與大白菜一致，則異附加系中沒有附加甘藍的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物都與雜交種一致，則異附加系中附加了甘藍的該連鎖群。表1SSR引物連鎖群分布及序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2相對于大白菜特異的甘藍連鎖群SSR引物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2中"一"表示尚不清楚。本發(fā)明取得的有益效果是本發(fā)明從分子水平鑒定大白菜一甘藍異附加系，既提高到了鑒定的準確性，又使通過這種方法鑒定的異附加系在不同的實驗室間具有很好的交流性。圖1是25對特異SSR引物在8個甘藍品種和7個大白菜品種中的擴增結(jié)果。圖1中的標號代表的含義是1、極早甘藍2、晚豐甘藍3、中甘174、京豐一號5、中甘186、中甘ll7、中甘198、83129、秋綠5510、超級夏陽11、新鄉(xiāng)小包2312、多抗7513、早熟五號14、高抗王15、強豐春白菜。圖l中A、引物NalOH03擴增結(jié)果；B、引物Ni4B10擴增結(jié)果；C、引物Nal2C08擴增結(jié)果；D、引物O113G05擴增結(jié)果；E、引物sORA43擴增結(jié)果；F、引物Nal2C03擴增結(jié)果；G、引物Nal2H09擴增結(jié)果；H、引物0111G11擴增結(jié)果；I、引物BN12A擴增結(jié)果；J、引物Nal2E05擴增結(jié)果；K、引物O110F12擴增結(jié)果；L、引物O111H08擴增結(jié)果；M、引物NalODll擴增結(jié)果；N、引物Ra2A04擴增結(jié)果；O、引物Apla5pr擴增結(jié)果；P、引物Nal4F11擴增結(jié)果；Q、引物O110B01擴增結(jié)果；R、引物BN72a擴增結(jié)果；S、引物Nal2F03擴增結(jié)果；T、引物O110H04擴增結(jié)果；U、引物O112D05擴增結(jié)果；V、引物O112G04擴增結(jié)果；W、引物O112D09擴增結(jié)果；X、引物RalF03擴增結(jié)果；Y、引物O112A04擴增結(jié)果。圖2是甘藍連鎖群特異SSR引物在雜交種及其親本和大白菜一甘藍雙單體異附加系中的擴增結(jié)果。圖2中的標號含義如下1、大白菜2、甘藍3、雜交種4、異附加系。圖2中A、引物NalOH03擴增結(jié)果；B、引物Ni4B10擴增結(jié)果；C、引物Nal2C08擴增結(jié)果；D、引物0113G05擴增結(jié)果；E、引物sORA43擴增結(jié)果；F、引物Nal2C03擴增結(jié)果；G引物Nal2H09擴增結(jié)果；H、引物OlllGll擴增結(jié)果;I、引物BN12A擴增結(jié)果；J、引物Nal2E05擴增結(jié)果；K、引物0110F12擴增結(jié)果；L、引物0111H08擴增結(jié)果；M、引物NalODll擴增結(jié)果；N、引物Ra2A04擴增結(jié)果；0、引物Apla5pr擴增結(jié)果；P、引物Nal4F11擴增結(jié)果；Q、引物0110B01擴增結(jié)果；R、引物BN72a擴增結(jié)果；S、引物Nal2F03擴增結(jié)果;T、引物0110H04擴增結(jié)果；U、引物0112D05擴增結(jié)果；V、引物0112G04擴增結(jié)果；W、引物0112D09擴增結(jié)果；X、引物RalF03擴增結(jié)果；Y、引物0112A04擴增結(jié)果。具體實施例方式以下實施例用以說明本發(fā)明。實施例以大白菜一甘藍雙單體異附加系(四倍體大白菜與二倍體甘藍雜交獲得異源三倍體雜交種，雜交種與二倍體大白菜回交，在回交群體中篩選到的2『20A+2022)的鑒定為例，對本發(fā)明進行說明。原理說明利用甘藍連鎖群相對大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍及異附加系基因組DNA為模板進行PCR擴增，比較它們的擴增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物均與大白菜一致，則表明異附加系中沒有附加甘藍的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物都與雜交種一致，則表明異附加系中附加了甘藍的該連鎖群。具體方法根據(jù)已發(fā)表的甘藍遺傳圖譜，選用了位于甘藍不同連鎖群的91對SSR引物，引物序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。將8個甘藍品種(春季早熟甘藍品種中甘ll，8312，極早甘藍；春季中熟甘藍品種京豐一號；春秋兼用早熟甘藍品種中甘17;秋季中熟甘藍品種中甘19;秋季晚熟甘藍品種晚豐甘藍，中甘1S)和7個大白菜品種(抗抽薹炮彈型大白菜品種強豐春白菜，高抗王；中晚熟直筒合抱大白菜品種多抗75;極早熟疊抱大白菜品種超級夏陽，早熟五號；早熟高樁直筒大白菜品種秋綠55;中熟矮樁疊抱大白菜品種新鄉(xiāng)小包23)種子播種于穴盤，常規(guī)管理，當幼苗長到46片真葉時，剪取幼嫩新葉，采用CTAB法提取基因組DNA。以這些材料基因組DNA為模板，以獲取的甘藍連鎖群SSR引物進行PCR擴增。每個PCR反應(yīng)體系為20ML，含模板DNA50ng，2廳ol/LMg2+，1Xbuffer，200Mmol/LdNTP,1UTap酶，正反向引物各2.5ng/叱。PCR擴增程序為，94。C預變性2min;94。C變性lmin，60。C復性30s，72。C延伸45s，共10個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降低O.5°C;94。C變性lmin，55。C復性30s，72。C延伸45s，共30個循環(huán)；72。C延伸5min.，4。C保存。擴增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測。篩選甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物，篩選在大白菜中沒有擴增產(chǎn)物，而甘藍中有擴增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴增產(chǎn)物，但甘藍的擴增產(chǎn)物不同于大白菜擴增產(chǎn)物的引物，作為甘藍不同連鎖群的相對于大白菜特異的SSR引物。結(jié)果表明，25對引物能夠在甘藍、大白菜擴增出有差異的片段，片段長度在40-430bp，其中7對引物在結(jié)球甘藍中有擴增產(chǎn)物而在大白菜中無擴增產(chǎn)物，18對引物在大白菜和結(jié)球甘藍中的擴增產(chǎn)物不同，這25對SSR引物涉及了甘藍的9個連鎖群(表2)，在大白菜和甘藍中的擴增結(jié)果如圖1。利用這25對甘藍連鎖群相對大白菜的特異SSR引物，以雜交種及其親本大白菜、甘藍及異附加系基因組DNA為模板進行PCR擴增，比較它們的擴增產(chǎn)物，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物與大白菜一致，則異附加系中沒有附加甘藍的該連鎖群，若某連鎖群中的特異引物在異附加系中的擴增產(chǎn)物都與雜交種一致，則異附加系中附加了甘藍的該連鎖群。結(jié)果表明，該異附加系對位于甘藍01連鎖群的3對SSR引物NalOH03、Ni4B10、Nal2C08(見圖2，A-C)和08連鎖群的2對SSR引物0112D05、0112G04(見圖2，U、V)擴增出與雜交種相同的片段，而對位于其他連鎖群引物的擴增結(jié)果均與大白菜一致(見圖2)，這就表明，該異附加系是附加2條甘藍染色體的雙單體異附加系，這2條外源染色體與甘藍01、08連鎖群相對應(yīng)。權(quán)利要求1、一種鑒定大白菜—甘藍異附加系的方法，其特征在于包括以下步驟(1)根據(jù)甘藍遺傳圖譜，選用位于甘藍不同連鎖群的91對SSR引物；(2)CTAB法提取不同品種的大白菜和甘藍的基因組DNA，PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測；(4)篩選甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物；(5)利用篩選到甘藍連鎖群相對于大白菜的特異SSR引物，鑒定大白菜—甘藍異附加系。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定大白菜一甘藍異附加系的方法，其特征在于步驟(4)的篩選方法是篩選在大白菜中沒有擴增產(chǎn)物，而甘藍中有擴增產(chǎn)物的引物，或在二者中都有擴增產(chǎn)物，但甘藍的擴增產(chǎn)物不同于大白菜擴增產(chǎn)物的引物，作為甘藍連鎖群相對于大白菜的特異SSR引物。全文摘要本發(fā)明公開了一種鑒定大白菜—甘藍異附加系的方法。該方法包括(1)根據(jù)已發(fā)表的甘藍遺傳圖譜，選用了位于甘藍不同連鎖群的91對SSR引物；(2)提取不同品種的大白菜和甘藍的基因組DNA，PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染檢測；(4)篩選甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物；(5)利用甘藍連鎖群相對于大白菜特異的SSR引物，鑒定大白菜—甘藍異附加系。本發(fā)明可以在分子水平快速、準確鑒定大白菜與甘藍的雜交種、異附加系、異代換系、易位系等重要的遺傳分析材料，為利用甘藍基因改良大白菜遺傳背景奠定基礎(chǔ)。文檔編號C12Q1/68GK101423867SQ20081005531公開日2009年5月6日申請日期2008年7月3日優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日發(fā)明者王彥華,申書興,趙建軍,陳雪平,顧愛俠申請人:河北農(nóng)業(yè)大學