專利名稱：：一種工程菌及其構(gòu)建和用其制備d-纈氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。涉及人工構(gòu)建工程菌以及酶催化產(chǎn)物的分離純化。具體是一種可以同時(shí)表達(dá)重組D-海因酶和重組N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的工程菌的構(gòu)建以及利用該菌轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-纈氨酸。
背景技術(shù)：
：D-纈氨酸是一種重要的有機(jī)手性源，主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑等領(lǐng)域。用D-纈氨酸代替L-纈氨酸合成的殺蟲菊脂殺蟲活性提高5000倍，而對(duì)動(dòng)物的毒性卻要降低10倍；D-纈氨酸也是合成抗菌性藥物的重要原料，如合成抗菌活性藥物更生霉素的中間體及二碘代苯二甲酰衍生物藥物、合成青霉素前體苯?；?L-半胱氨酸-D-纈氨酸二硫化物原料、以及合成具有增強(qiáng)免疫力抵抗AIDS等疾病的青霉胺類衍生物；由于D-氨基酸構(gòu)成的多肽不被或者緩慢的被蛋白酶水解，因此D-氨基酸越來(lái)越多地被用于合成生理活性肽。另外，D-纈氨酸參與合成的一種抗腫瘤藥物放線菌素D，合成具有增強(qiáng)生物體抵抗病原體的a-?；诙难苌?。D-纈氨酸的制備，文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有誘導(dǎo)結(jié)晶法，化學(xué)拆分法和微生物不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法。微生物不對(duì)稱轉(zhuǎn)化法是利用可以同時(shí)產(chǎn)D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的菌株或者兩種各產(chǎn)一酶的天然菌株按比例混合轉(zhuǎn)化5'-單替代海因生成相應(yīng)的D-氨基酸，其轉(zhuǎn)化過(guò)程見圖1。該法由于收率高、產(chǎn)物光學(xué)活性高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單以及環(huán)保無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)逐步取代其它方法而成為生產(chǎn)D-氨基酸的主流。20世紀(jì)80年代，日本首創(chuàng)了用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)D-纈氨酸的新技術(shù)。我國(guó)有采用可以同時(shí)生產(chǎn)兩酶的天然菌株生產(chǎn)D-氨基酸的報(bào)道(中國(guó)專利公告號(hào)87108140)。但是天然菌株如農(nóng)桿菌在發(fā)酵過(guò)程中容易被噬菌體污染并且需要添加帶來(lái)環(huán)境污染的甲硫乙基海因誘導(dǎo)劑等，因此其生產(chǎn)規(guī)模受到很大的限制。如果將兩個(gè)酶在一個(gè)工程菌中表達(dá)，進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，將有可能克服上述缺陷。我們己經(jīng)從假單胞菌YZ26中克隆到D-海因酶基因(中國(guó)專利公告號(hào)1560244)，從中華根瘤菌S!'"oAizoW,印.SS-ori中克隆到N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(高技術(shù)通訊，13(145):22-26)，并在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)(中國(guó)抗生素雜志，29(1):1114)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種工程菌及其構(gòu)建方法，該工程菌可以同時(shí)表達(dá)D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述構(gòu)建的工程菌制備D-纈氨酸的方法。本發(fā)明提供的一種工程菌，含有重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab，可以同時(shí)表達(dá)D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。本發(fā)明工程菌，可通過(guò)如下方法構(gòu)建(1)將D-海因酶基因(hyd)克隆到質(zhì)粒pET-28a(Novergen公司)，將N-氨甲酰-D-氨基酸酰氨水解酶(以下簡(jiǎn)稱水解酶)基因(cab)克隆到質(zhì)粒pQE-30(Qiagen公司)；(2)然后利用共轉(zhuǎn)化技術(shù)將兩個(gè)重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab共轉(zhuǎn)入同一大腸桿菌細(xì)胞￡.co"BL21(DE3)，獲得可以，時(shí)表達(dá)D-海因酶和水解酶的工程菌細(xì)胞￡.C0/ZBL21(DE3)/(pET28a-hyd,pQE30-cab)。該工程菌可以轉(zhuǎn)化5'取代基不帶電荷的海因衍生物生成相應(yīng)的D-氨基酸。所述的D-海因酶基因以假單胞菌i^Wowo"必/n^》YZ26菌株基因組DNA為模板，用PCR法分離克隆得到D-海因酶基因，DNA序列分析表明全長(zhǎng)1440bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，不含內(nèi)含子，共編碼479個(gè)氨基酸殘基，其DNA序列見中國(guó)專利(公告號(hào)1560244)。所述的N-氨甲酰-D-氨基酸酰氨水解酶基因以中華根瘤菌&'ww/H^Wwmw.SS-ori菌株基因組DNA為模板，用PCR法分離克隆得到N-氨甲酰-D-氨基酸酰氨水解酶(以下簡(jiǎn)稱水解酶)基因，DNA序列分析表明全長(zhǎng)915bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA,不含內(nèi)含子，共編碼304個(gè)氨基酸殘基，其DNA序列見《N-氨甲?；?D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆與表達(dá)》(高技術(shù)通訊13(145):22-26)。本發(fā)明提供的一種利用上述構(gòu)建的工程菌制備D-纈氨酸的方法，包括如下步驟(1)將上述構(gòu)建好的工程菌接種于含50嗎/mLAmp和40|ig/mLKan的液體LB培養(yǎng)基，在37。C培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.7-1.2時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.01-0.4mmol/L，再在16-25°C繼續(xù)培養(yǎng)814h;所述的IPTG可以用乳糖代替；(2)收集上述培養(yǎng)好的工程菌細(xì)胞置于容器中，按每升菌液菌體量加入500mL的比例加入含有50mmol/L異丙基海因溶液，用氮?dú)庵脫Q容器中的空氣后封口，在35-43'C振蕩反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜锏霓D(zhuǎn)化率達(dá)到90%，離心去除菌體；(3)上清液經(jīng)活性碳脫色，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，乙醇漂洗，雙蒸水重新溶解后調(diào)節(jié)pH至酸性，通過(guò)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂，以35倍雙蒸水洗去雜質(zhì)，然后以0.5mol/L的氨水洗脫，得到D-纈氨酸溶液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用無(wú)水乙醇洗滌后過(guò)濾獲得D-纈氨酸。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明構(gòu)建的工程菌可以同時(shí)表達(dá)D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。在利用該工程菌制備D-纈氨酸過(guò)程中，無(wú)需中間產(chǎn)物二次穿膜，在一個(gè)細(xì)胞內(nèi)就可完成整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程，提高了轉(zhuǎn)化效率，避免了中間產(chǎn)物在二次穿膜過(guò)程中被氧化；該方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保等特點(diǎn)，與現(xiàn)有市場(chǎng)產(chǎn)品相比，相對(duì)生產(chǎn)成本低。圖l:D-氨基酸的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)示意2:重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab的示意圖圖3:D-纈氨酸產(chǎn)品的IR圖譜圖4:D-纈氨酸產(chǎn)品的NMR圖譜具體實(shí)施方式實(shí)施例l:重組質(zhì)粒和工程菌的構(gòu)建以本室保存菌種假單胞菌尸ww^momwYZ26基因組DNA為模板，利用引物5'-CCCGAATTCCATATGTCCCTGTTGATCCGT-3，和5'-CCCGGATCCTCAGCGCTGAACTGG-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，經(jīng)iVt/eI/5amHI雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pET-28a上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-hyd(圖2)，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，單菌落PCR篩選陽(yáng)性重組子，MfeIAS,HI雙酶切鑒定插入片段大小，最后用DNA序列分析確認(rèn)。以為本室保存菌種中華根瘤菌S/"wWzoWww印.SS-ori基因組DNA模板，利用引物5，-GGGGATCCATGACACGTCAGAAGATAC-3，和5，-GGGAAGCTTTCAGAATTCCGCGATCA-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收，經(jīng)SflwH雙酶切后連接到同樣酶切后的載體pQE-30上，獲得pQE30-cab(圖2)，轉(zhuǎn)化￡.co//DH5a感受態(tài)細(xì)胞，單菌落PCR篩選陽(yáng)性重組子，SamH1////^/III雙酶切鑒定插入片段大小，最后用DNA序列分析確認(rèn)。取重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab各2pL加入100pL用氯化鈣制備的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min。42'C熱休克2min，然后冰浴5min，加入80(^LLB液體培養(yǎng)液，在37"C下振蕩培養(yǎng)lh，將菌液離心后吸出800nL上清，重新懸浮菌體后涂在含50pg/mLAmp和40昭/mLKan的LB平板上，37。C過(guò)夜培養(yǎng)。實(shí)施例2:工程菌活性檢測(cè)根據(jù)酶催化反應(yīng)性和產(chǎn)物D-氨基酸的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，可以用茚三酮顯色法經(jīng)顏色測(cè)定OD570nm光吸收值計(jì)算產(chǎn)物生成的量及酶活性。也可以用HPLC法直接測(cè)定。1.茚三酮顯色法取200nL菌液離心后棄上清，所得菌體用100mmol/LPBS(pH8.0)洗一次，再用lmL溶于相同緩沖液的25mmol/L異丙基海因重新懸浮菌體，對(duì)照只用100mmol/LPBS懸浮，37°C震蕩反應(yīng)lh,13000r/min離心10min，取400|iL反應(yīng)液加入等體積的2mol/LNaAc緩沖液(pH5.5)，6(TC溫浴5min，再加入400^iL茚三酮(58mg還原茚三酮，58mg水合茚三酮溶于5mL乙二醇甲醚)60。C震蕩反應(yīng)20min，加入2.4mL65。/。乙醇震蕩后室溫放置5min后于OD570nm讀數(shù)。用己知濃度的D-纈氨酸為標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物，在相同體系情況下，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出K值，根據(jù)公式計(jì)算酶活性。2.HPLC法取適量菌體與底物異丙基海因反應(yīng)一定時(shí)間后，12000r/min離心，取上清液直接上樣，色譜柱為HypersilTMGOLDCl8(250mmX4.6隱，5nm)，用20mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5，含1Ommol/L四丁基溴化胺)一甲醇(體積比為90:10)進(jìn)行洗脫，流速為lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物的出峰時(shí)間與峰面積可進(jìn)行定量測(cè)定。酶活單位(U)定義為在上述條件下，以菌體濃度為100D6,m計(jì)，每mL菌體在lmin內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成lpmolD-纈氨酸所需酶量。分別以海因、苯海因、對(duì)羥基苯海因、異丙基海因、羧甲基海因?yàn)榈孜?，取適量菌體在最適條件下進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果(表1)顯示在五種底物中，不同底物酶活力測(cè)定(以最終產(chǎn)物D-氨基酸計(jì)算)表明苯海因?yàn)樽钸m底物，工程菌不能轉(zhuǎn)化羧甲基海因。表1工程菌對(duì)不同底物的催化反應(yīng)底物產(chǎn)物海因酶活力(U/L'100D6oo腿)水解酶活力(U/L.10OD600nm)海因甘氨酸1550405'-苯海因D-苯甘氨酸9702305'-對(duì)羥基苯海因D-對(duì)羥基苯甘氨酸2301705'-異丙基海因D-纈氨酸7601205'-羧甲基海因D-天冬氨酸NDND注ND表示未檢測(cè)到實(shí)施例3:用工程菌BL21(DE3)/(pET28a-hyd,pQE30-cab)轉(zhuǎn)化5，-異丙基海因生產(chǎn)D-纈氨酸取按實(shí)施例1，從平板上挑取單菌落接于5mLLB(含50嗎/mLAmp和40pg/mLKan)液體培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)1012h。取上述預(yù)培養(yǎng)菌以2%接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的含抗生素Amp(50pg/mL)和Kan(40ng/mL)的1LLB液體培養(yǎng)液，37'C震蕩培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到0D,腦-1.2時(shí)加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，在20'C繼續(xù)培養(yǎng)1012h，離心收集菌體。用無(wú)離子水配制400mL50mmol/L5'-異丙基海因溶液，用飽和NaOH調(diào)pH至9.0，加入6上述收集得到的菌體后裝入三角瓶中，用氮?dú)鈱⑷瞧恐械难鯕庵脫Q后封口，在搖床上37'C振蕩反應(yīng)42h。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)13000r/min離心，上清液用3%活性炭在25。C振蕩脫色。脫色后的溶液用13000r/min離心去雜質(zhì)，上清在60。C真空旋轉(zhuǎn)蒸干，所得固體用無(wú)水乙醇洗3次，然后用ddH20重新溶解后離心取上清。上清液用6NHC1調(diào)pH到3.0后通過(guò)強(qiáng)酸性苯乙烯陽(yáng)離子交換樹脂(001x7)，先以3倍床體積的去離子水洗去雜質(zhì)，然后以0.5mmol/L的氨水洗脫得到D-纈氨酸溶液，6(TC真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用無(wú)水乙醇洗滌后得D-纈氨酸，底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物收率為別為91.4%和72.2%。實(shí)施例4:D-纈氨酸的產(chǎn)品鑒定取按實(shí)施例三所得D-纈氨酸進(jìn)行如下分析1.熔點(diǎn)測(cè)定取少量產(chǎn)品D-纈氨酸放于載玻片上，于X-5顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司)上進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定，測(cè)得樣品的熔點(diǎn)為〉29(TC，文獻(xiàn)值為〉295。C。2.比旋光度測(cè)定用上海物理光學(xué)儀器廠WZZ-1自動(dòng)指示旋光儀測(cè)得產(chǎn)品D-纈氨酸的比旋光度為[a]^-26.6(C=5,5NHC1)，文獻(xiàn)值[°^°=-27.5(€=5,5NHC1)。3.元素分析樣品采用氧化溫度為U5(TC，還原溫度為850°C，燃燒后的混合氣經(jīng)吸附柱分離，利用德國(guó)VarioEL元素分析儀，熱導(dǎo)檢測(cè)C、H、N元素。產(chǎn)品D-纈氨酸的元素分析表明下述組成實(shí)測(cè)值C51.25°/。，H9.50%，N12.17%理論值C51.28%，H9.40%,N11.97%4.紅外光譜分析稱取產(chǎn)品D-纈氨酸5mg和995mg溴化鉀于瑪瑙研缽中充分混合研細(xì)，即為5mg/g固體標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確稱取100mg進(jìn)行壓片，壓力控制在24MPa，壓片時(shí)間為3min。然后將壓制好的晶片在日本島晶公司FTIR-8300紅外光譜儀上進(jìn)行掃描，樣品的透射光譜檢測(cè)3次，保證3次光譜檢測(cè)中的最大相對(duì)誤差小于2%，3次光譜檢測(cè)的平均值作為最終光譜數(shù)據(jù)。產(chǎn)品D-纈氨酸的紅外光譜圖見圖35.'HNMR溶劑D20;共振頻率300MHz;脈動(dòng)寬度(pw):10^S;譜寬30.12KHz;循環(huán)延遲時(shí)間(dl):1S;溫度25。C。D-纈氨酸的結(jié)構(gòu)與編號(hào)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(C)樣品利用瑞士BRUKER公司DRX-300超導(dǎo)核磁共振儀進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)品D-纈氨酸的核磁譜圖見圖4。根據(jù)誘導(dǎo)效應(yīng)、共軛效應(yīng)、場(chǎng)效應(yīng)的綜合分析，其！H化學(xué)位移歸屬見表2，其中的一NH2和一COOH因譜峰較寬，所以未觀察到。產(chǎn)物中H和CH3的'H化學(xué)位移值與標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma產(chǎn)品)一致。表2D-纈氨酸的'H化學(xué)位移(ppm)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種工程菌，其特征在于含有重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab。2、如權(quán)利要求1所述的工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)將D-海因酶基因克隆到質(zhì)粒pET-28a，將N-氨甲酰-D-氨基酸酰氨水解酶基因克隆到質(zhì)粒pQE-30;(2)利用共轉(zhuǎn)化技術(shù)將兩個(gè)重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab共轉(zhuǎn)入同一大腸桿菌細(xì)胞￡.co//BL21(DE3)，獲得可以同時(shí)表達(dá)D-海因酶和水解酶的工程菌BL21(DE3)/(pET28a陽(yáng)hyd,pQE30-cab)。3、一種用權(quán)利要求l所述的工程菌制備D-纈氨酸的方法，包括如下步驟(1)將上述構(gòu)建好的工程菌接種于含50嗎/mLAmp和40嗎/mLKan的液體LB培養(yǎng)基，在37。C培養(yǎng)至OD6咖m達(dá)到0.7-1.2時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.01-0.4mmol/L，再在16-25°C繼續(xù)培養(yǎng)8~14h;(2)收集上述培養(yǎng)好的工程菌細(xì)胞置于容器中，按每升菌液菌體量加入500mL底物的比例加入濃度為50mmol/L異丙基海因溶液，用氮?dú)庵脫Q容器中的空氣后封口，在35-43'C振蕩反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜锏霓D(zhuǎn)化率達(dá)到90%，離心去除菌體；(3)上清液經(jīng)活性碳脫色，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，乙醇漂洗，雙蒸水重新溶解后調(diào)節(jié)pH至酸性，通過(guò)強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂，以35倍雙蒸水洗去雜質(zhì)，然后以0.5mol/L的氨水洗脫，得到D-纈氨酸溶液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，用無(wú)水乙醇洗滌后過(guò)濾獲得D-纈氨酸。4、如權(quán)利要求3所述制備D-纈氨酸的方法，其特征在于所述的IPTG用乳糖代替。全文摘要本發(fā)明提供了一種工程菌，該工程菌可以同時(shí)表達(dá)D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。其構(gòu)建方法是將D-海因酶基因克隆到質(zhì)粒pET-28a，將N-氨甲酰-D-氨基酸酰氨水解酶基因克隆到質(zhì)粒pQE-30，然后利用共轉(zhuǎn)化技術(shù)將兩個(gè)重組質(zhì)粒pET28a-hyd和pQE30-cab共轉(zhuǎn)入同一大腸桿菌細(xì)胞。本發(fā)明還提供了利用該工程菌轉(zhuǎn)化5’-異丙基海因生產(chǎn)D-纈氨酸的方法。該方法具有產(chǎn)品光學(xué)純度高，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保等特點(diǎn)，與現(xiàn)有市場(chǎng)產(chǎn)品相比，生產(chǎn)成本低。文檔編號(hào)C12N1/21GK101260381SQ20081005482公開日2008年9月10日申請(qǐng)日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者石亞偉,袁靜明,鈕利喜申請(qǐng)人:山西大學(xué)