專利名稱：兒童過敏性哮喘遺傳檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種兒童過敏性哮喘 遺傳檢測方法。
背景技術(shù)：
兒童過敏性哮喘是兒童最常見的慢性呼吸道疾病，以反復(fù)發(fā)作的呼吸困難、伴有 喘鳴音出現(xiàn)為主要癥狀，多在冬、春季發(fā)病，初次發(fā)病年齡多在學(xué)齡前。哮喘反復(fù)發(fā)作，對兒 童健康、學(xué)習(xí)和生活影響很大，且部分兒童哮喘可遷延至成人哮喘，成為終生疾患，如診治 不及時，隨病程延長可產(chǎn)生氣道不可逆性狹窄和氣道重塑，因此，對哮喘的合理防治至關(guān)重 要。兒童患過敏性哮喘有家族性說明該病和遺傳因素有關(guān)，因此遺傳體質(zhì)不同的人， 應(yīng)該采取不同的疾病風(fēng)險控制策略才能更好的預(yù)防哮喘的發(fā)生；有效區(qū)分喘息性疾病忠兒 的病因(哮喘性和非哮喘性)，進(jìn)行有效早期干預(yù)治療，將提高治療的針對性，避免過度化 治療。利用現(xiàn)代科學(xué)研究成果，開發(fā)一項基于分子遺傳基礎(chǔ)的兒童過敏性哮喘遺傳輔助診 斷與評估預(yù)測產(chǎn)品會對兒童過敏性哮喘的發(fā)生起到預(yù)警、個性化防治的作用。腎上腺素能受體(ADRB2或β 2_AR)是與鳥嘌呤核苷蛋白耦聯(lián)(G蛋白耦聯(lián))的肽 鏈跨膜至少7次的受體家族成員之一。ADRB2在機(jī)體多種組織中均有表達(dá)，包括心肌細(xì)胞、 支氣管和血管平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及腎臟細(xì)胞。通過ADRB2激動劑的介導(dǎo)(如異丙腎 上腺素、腎上腺素)后，引起血管擴(kuò)張、支氣管平滑肌松弛等生理效應(yīng)。rsl042713是位于 ADRB2第46位的A/G多態(tài)，導(dǎo)致氨基酸16的改變，即精氨酸(Argl6)變?yōu)楦拾彼?Glyl6)。 ADRB2編碼區(qū)第16位氨基酸的變異已在體外試驗中證實可以改變ADRB2的功能，影響氣道 平滑肌松弛和組胺等介質(zhì)的釋放，是近年來國際上研究哮喘易感性及疾病調(diào)節(jié)基因的重要 候選基因之一。ADRB2基因多態(tài)性不僅能引起ADRB2表型功能的改變，而且在一定程度上影 響到哮喘的發(fā)生、嚴(yán)重程度及對治療的反應(yīng)。TNF-α基因，位于人類染色體6ρ21. 3位置，位于HLA-I類和HLA-II類基因之間， 并且與之緊密連鎖。TNF-α基因全長2. 81Λ，共有4個外顯子，mRNA全長l，669nt，編碼234 個氨基酸殘基的蛋白。TNF-α可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和 表皮細(xì)胞，但主要來源于巨噬細(xì)胞。TNF-α基因存在多個多態(tài)位點，其是位于TNF-α基因 啟動子區(qū)第-308位的鳥嘌呤(G)變異為腺嘌呤(A)，存在三種基因型GG(無突變)，GA(突 變雜合子)，AA(突變純合子)。許多研究發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性與哮喘疾病的易感性相關(guān)?？缒そY(jié)構(gòu)域4亞家族A，成員2(MS4A2)是一異型多聚復(fù)合物，屬于多條鏈的免疫 識別受體，其生物學(xué)功能，最主要功能是參與IgE介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，促進(jìn)肥大細(xì)胞、嗜 堿性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，分泌細(xì)胞因子，表達(dá)粘附分子。過敏氣喘相關(guān)的兩種細(xì)胞巨細(xì)胞 (Mast cells)及嗜堿性白血球(Basophils)，都有MS4A2基因產(chǎn)生的接受器，環(huán)境中的過敏 原與MS4A2結(jié)合后，會啟動急性高度敏感反應(yīng)，巨細(xì)胞會釋放組織胺(Histamine)以及蛋白 分解酵素，合成前列腺素(ftOstaglandins)及白血球三烯素(Leukotrienes)，這過程會引起高度的敏感反應(yīng)。rs569108基因多態(tài)性，即MS4A2E237G，是β鏈基因第七個外顯子6843 位點堿基由鳥嘌呤(G)取代了腺嘌呤(A)，從而導(dǎo)致β鏈氨基酸系列中胞漿區(qū)羧基末端第 237位氨基酸由甘氨酸(G)代替了谷氨酸(E)。β鏈羧基末端胞漿區(qū)在IgE與α鏈結(jié)合后 與細(xì)胞漿之間的信號傳遞中起重要作用。由于甘氨酸為非極性疏水性氨基酸，谷氨酸卻為 酸性氨基酸，含兩個羧基，甘氨酸不帶電荷、谷氨酸帶負(fù)電荷，E237G便改變了 β鏈羧基末 端的親水性，并進(jìn)而可能影響β鏈的功能，導(dǎo)致血清總IgE水平升高，引起肥大細(xì)胞等釋放 炎性介質(zhì)增多。同時，β鏈羧基末端第237位氨基酸鄰近酪氨酸激酶受體與酪氨酸激酶相 互作用并通過酪氨酸的磷酸化而激活細(xì)胞，E237G可能是通過影響ITAM的功能而導(dǎo)致細(xì)胞 內(nèi)信號傳遞方式發(fā)生改變。ACE基因編碼血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，位于第17號染色體17q23. 3位置。全長 44，769bp，mRNA全長4，195nt，共有48個外顯子，編碼1，306個氨基酸殘基的蛋白。ACE是 一種膜結(jié)合糖蛋白，屬二肽基羧肽酶，能將血管緊張素I (十肽，由腎素轉(zhuǎn)化而來)肽鏈C末 端的組氨酸和亮氨酸殘基水解，形成具有增壓作用的血管緊張素II，從而在血壓調(diào)節(jié)和電 解質(zhì)平衡方面發(fā)揮重要作用。ACE不僅使具有降血壓作用和參與炎性作用的緩激肽、P物質(zhì) 等多肽性物質(zhì)滅活，還能直接作用于腎上腺皮質(zhì)，促進(jìn)醛固酮分泌。因此，它是腎素-血管 緊張素-醛固酮系統(tǒng)以及緩激肽系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因素，影響人體多種生理功能。從1988年 ACE基因被克隆，目前已發(fā)現(xiàn)多種ACE基因多態(tài)性標(biāo)志。近年來研究最多的是位于第16內(nèi) 含子中一段長的插入/缺失多態(tài)rs4646994位點，含有此片段的ACE等位基因稱為I 型等位基因，不含此片段的稱為D型等位基因。從而產(chǎn)生了三個不同的基因型，即在17號 染色體上均插入這一片段為插入型純合子(I/I型)，均缺失這一片段為缺失型純合子(D/D 型)，如在一條染色體上插入而另一條染色體缺失這一片段為雜合子(I/D型)。關(guān)于DD型 影響哮喘發(fā)病的機(jī)制，可能是通過Ang II的產(chǎn)生增加有關(guān)，另外DD基因可能與哮喘患者肺 功能損害的程度有關(guān)。通過對兒童哮喘的風(fēng)險基因型的遺傳檢測，從基因角度評估兒童哮喘的遺傳風(fēng) 險，從而更好的預(yù)防疾病的發(fā)生。作為疾病傳統(tǒng)防控方法的創(chuàng)新發(fā)展，遺傳檢測項目在疾病 尚未發(fā)生時，就從遺傳角度提示疾病發(fā)生風(fēng)險，繼而對遺傳高發(fā)病風(fēng)險人群進(jìn)行改變生活 方式、調(diào)整環(huán)境因素及其他手段予以干預(yù)，達(dá)到降低疾病發(fā)生風(fēng)險的目的，從而降低人群中 兒童過敏性哮喘發(fā)病率，提升了群眾生活質(zhì)量，減輕了社會醫(yī)療負(fù)擔(dān)。并且此遺傳檢測作 為兒童哮喘疾病的一種輔助診斷和鑒別診斷方法，把過敏性哮喘從兒童喘息性疾病區(qū)分出 來，保證了診斷的正確性，在哮喘規(guī)范的診斷及治療同時減少其誤診的機(jī)會，對臨床工作提 供了有利的指導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種兒童過敏性哮喘遺傳檢測方法。通過采集受檢者的口腔粘膜細(xì)胞，提取其基因組DNA，對其基因組DNA的ADRB2 基因rs 1042713位點、TNFA基因rs 1800629位點、MS4A2基因rs569108位點和ACE基因 rs4646994位點多態(tài)性進(jìn)行檢測，從基因?qū)用嬖u估兒童哮喘的遺傳風(fēng)險，并作為輔助診斷和 鑒別診斷，把過敏性哮喘從兒童喘息性疾病區(qū)分出來，保證了診斷的正確性，在哮喘規(guī)范的 診斷及治療同時減少其誤診的機(jī)會，對臨床工作提供了有利的指導(dǎo)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 μ 1，包含濃度為20ng/ μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA 聚合 酶、20 μ M的有義引物和反義引物各0. 225 μ 1、10 μ M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各0.25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟3:基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對SNP位點進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點的基因 型。
權(quán)利要求
1. 一種兒童過敏性哮喘遺傳檢測方法，其特征在于采集受檢者的口腔粘膜細(xì)胞，提 取其基因組DNA，對其基因組DNA的ADRB2基因rsl042713位點、TNFA基因rsl8006^位 點、MS4A2基因rs569108位點和ACE基因rs4646994位點多態(tài)性進(jìn)行檢測，從基因?qū)用嬖u 估兒童哮喘的遺傳風(fēng)險，并作為輔助診斷和鑒別診斷，把過敏性哮喘從兒童喘息性疾病區(qū) 分出來，保證了診斷的正確性，在哮喘規(guī)范的診斷及治療同時減少其誤診的機(jī)會，對臨床工 作提供了有利的指導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種兒童過敏性哮喘遺傳檢測方法，通過采集受檢者的口腔粘膜細(xì)胞，提取其基因組DNA，對其基因組DNA的ADRB2基因rs1042713位點、TNFA基因rs1800629位點、MS4A2基因rs569108位點和ACE基因rs4646994位點多態(tài)性進(jìn)行檢測，從基因?qū)用嬖u估兒童哮喘的遺傳風(fēng)險，并作為輔助診斷和鑒別診斷，把過敏性哮喘從兒童喘息性疾病區(qū)分出來，保證了診斷的正確性，在哮喘規(guī)范的診斷及治療同時減少其誤診的機(jī)會，對臨床工作提供了有利的指導(dǎo)。
文檔編號C12Q1/68GK102108383SQ20091020048
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者馮哲民, 賀憲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司