專利名稱：：一種單細胞微生物的高效破壁方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物
技術領域：
，具體地涉及單細胞微生物的細胞破碎方法。
背景技術：
：微生物發(fā)酵在工業(yè)中發(fā)揮著巨大的作用，很多抗生素、酶類、有機酸、色素等均通過微生物發(fā)酵獲得。特別是構建基因工程菌株，高效表達目的產(chǎn)物，已經(jīng)成為人們大量獲取有益產(chǎn)物的途徑。由于微生物細胞壁組成和厚度差異很大，還沒有一個對細菌和真菌通用的方法進行細胞破碎。通常采用酸堿破壁會造成污染，且易破壞擬提取的產(chǎn)物，化學法破壁對環(huán)境不友好，現(xiàn)有的壓力破壁機(FrenchPress)效率極低，只限實驗室使用，且不適于酵母菌的破壁。而一些酵母菌需要釆用蝸牛酶或纖維素酶輔助破壁，對一些壁厚的酵母菌作用不顯著，常常需要根據(jù)情況混合不同的酶液，調(diào)整酶解條件,花費大，效率低，不適于大規(guī)模生產(chǎn)使用。
發(fā)明內(nèi)容(一)要解決的技術問題本發(fā)明的目的在于針對上述不足提供一種高效快速的細胞破壁方法，既可達到100%破壁，又便于胞內(nèi)產(chǎn)物的提取。(二)技術方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案是釆用高壓勻質(zhì)機對細胞懸液直接進行破碎。其包括步驟首先將細胞制備成1030%的細胞懸液通入高壓均質(zhì)機中，對于原核單細胞微生物而言，設置壓力為6090Mpa，對于真核單細胞微生物，則設置壓力為90150Mpa，流速為580升/小時，循環(huán)14次。當然，也可以將發(fā)酵罐中的發(fā)酵液直接加入高壓勻質(zhì)機，按照上述條件進行破壁。具體地說，對于原核單細胞微生物，優(yōu)選將其制備成20~30%的細胞懸液，通入高壓勻質(zhì)機，選擇壓力80Mpa,采用流速為7升/小時的高壓均質(zhì)機，循環(huán)2次，即可100%破壁。對于真核單細胞微生物，優(yōu)選將其制備成2030%的細胞懸液，通入高壓勻質(zhì)機，選擇壓力120Mpa，釆用流速為50-70升/小時，循環(huán)2-3次，即可100%破壁。(三)有益效果本發(fā)明建立了直接快速的單細胞破壁方法，發(fā)酵罐中培養(yǎng)的細胞直接進入破壁程序，無需經(jīng)過離心-再懸浮混勻的過程，并且可保證目標物完好無損，破碎的細胞粗提液即可直接進入產(chǎn)物純化的過程，減少了生產(chǎn)環(huán)節(jié)，節(jié)約了工作時間。本發(fā)明適用于所有單細胞微生物的破壁環(huán)節(jié)，其能夠在發(fā)酵工業(yè)中提高工作效率，并且該方法無需任何化學藥物輔助，顯著降低生產(chǎn)成本，同時對環(huán)境無排放污染，可以廣泛推廣使用，經(jīng)濟效益不可估量。圖1:磁螺菌破壁效果檢測(60Mpa，20%細胞液，循環(huán)2次破壁后光學顯微鏡照片(xlOOO));圖2:法夫酵母破壁圖(120Mpa，30%細胞液，循環(huán)2次破壁后光學顯微鏡照片(x400))。具體實施例方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護范圍。實緣備及其參數(shù)型號NCJJ-7/200流量(L/H):7最大壓力(Mpa):200額定壓力(Mpa):180功率(KW):0.75型號NCJJ-75/150流量(L/H):75最大壓力(Mpa):150額定壓力(Mpa):120功率(KW):7.5最大投入粒徑(|im):50最大投入粒徑(pm):10實施例l原核單細胞生物的細胞破碎本例釆用單細胞模式微生物趨磁螺菌g，fe而她騰)為代表菌株，將發(fā)酵后的趨磁細菌從發(fā)酵罐中直接以管道通入高壓均質(zhì)機，設定好壓力，流速為7L/h,循環(huán)2次后，細胞全部破碎，提取磁小體，經(jīng)電鏡觀察，磁小體顆粒均勾，外膜完整，質(zhì)量完好。表l是磁螺菌在不同條件下的破壁效果。圖1是20%細胞液，在60Mpa壓力下破碎后，經(jīng)結晶紫染色后的結果。細胞破碎率達90%。表1磁螺菌在不同條件下的破壁效果<table>Complextableseetheoriginaldocumentpage5<table>實施例2真核單細胞生物的細胞破碎本例釆用單細胞微生物法夫酵母(Mt^w皿)為代表菌株,分別配制成10%、20%和30%的細胞懸液，通入高壓均質(zhì)機，在不同條件下進行破壁。結果如表2所示。表2法夫酵母在不同條件下的破壁效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表可以看出10%的細胞懸液在90Mpa的壓力處理破壁率即可達到87.7%,在120Mpa，150Mpa的處理能徹底的使細胞壁破碎，色素提取率近100%。因此我們選擇120Mpa為法夫酵母破壁的最適壓力，并大規(guī)模的應用于生產(chǎn)。圖2是30%細胞懸液，經(jīng)120Mpa壓力破壁后的細胞400倍光學顯微鏡照片。視野中僅有少量完整細胞，95°/。以上的細胞已經(jīng)被破碎。法夫酵母破壁后蝦青素提取率高于其他破壁方法。實施例3大流量高壓均質(zhì)機對細菌和酵母的破壁效果表3在不同條件下的破壁效果<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3顯示大流量高壓均質(zhì)機對磁螺菌和法夫酵母的破壁效果，釆用80-140Mpa的工作壓力，在流量為75升/h,循環(huán)2-4次，均可達到98%-100%破壁效果。權利要求1、一種單細胞微生物破壁方法，其包括步驟首先將細胞制備成10～30％的細胞懸液通入高壓均質(zhì)機中，對于原核單細胞微生物而言，設置壓力為60～90Mpa，對于真核單細胞微生物，則設置壓力為90～150Mpa，流速為5～80升/小時，循環(huán)1～4次。2、如權利要求1所述的方法，其特征在于，破壁對象為真核單細胞微生物則設置細胞懸液濃度為2030%，壓力120Mpa。3、如權利要求1所述的方法，其特征在于，破壁對象為原核微生物設置細胞懸液濃度為2030%，壓力80Mpa。4、如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的原核單細胞微生物為趨磁細菌。5、如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的真核單細胞微生物為法夫酵母。6、如權利要求1~5任一項所述的方法，其特征在于，所述細胞懸液為發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液。全文摘要本發(fā)明提供了一種高效快速的單細胞微生物的破壁方法，該方法首先將細胞制備成10～30％的細胞懸液通入高壓均質(zhì)機中，對于原核單細胞微生物而言，設置壓力為60～90MPa，對于真核單細胞微生物，則設置壓力為90～150MPa，流速5～80升/小時，循環(huán)1～4次，即可對細菌或酵母實現(xiàn)100％的破壁。本發(fā)明方法可有效地應用于發(fā)酵工程產(chǎn)物提取工藝，節(jié)約時間，提高生產(chǎn)效率，并且無需任何化學藥物輔助，尤其適用于發(fā)酵工業(yè)。文檔編號C12N1/20GK101195813SQ20081005566公開日2008年6月11日申請日期2008年1月4日優(yōu)先權日2008年1月4日發(fā)明者濤唐,偉姜,穎李,李季倫,王珍芳,田杰生,苗莉莉申請人:中國農(nóng)業(yè)大學