專(zhuān)利名稱(chēng)：一種制備奶牛性別控制精子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及性別控制精子的制備方法，具體地說(shuō)，涉及一種奶牛性別控制精子的 制備方法。
背景技術(shù)：
性別控制(sex control)技術(shù)，即Χ/Υ精子分離技術(shù)，是利用X、Y精子中DNA 含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)精子類(lèi) 另|J，給液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將X、Y精子分離開(kāi)來(lái)(例如，Johnson LA, Pinkel D. Modificationof a laser-based flow cytometer for high resolution DNA analysis ofmammalian spermatozoa. Cytometry 1986，7 :268 273)。該技術(shù)在畜牧生產(chǎn)中意義重 大，該技術(shù)可以按照生產(chǎn)需求人為地控制動(dòng)物后代的性別，快速繁育高產(chǎn)家畜，加速家畜育 種進(jìn)程，提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)畜牧業(yè)發(fā)展。在哺乳動(dòng)物中，每一個(gè)體的X精子和Y精子，其DNA含量都是恒定的。根據(jù)研究， 所有哺乳動(dòng)物X染色體的DNA含量都要高于Y染色體，相差大多在3. 6% -4. 2%之間。而 這種差異就是X和Y精子流式細(xì)胞儀分離的理論基礎(chǔ)。其中奶牛X、Y精子差異為3. 8%， 豬為3. 6%，綿羊?yàn)?. 2%等多種哺乳動(dòng)物X、Y精子DNA含量差異都已近獲得。不同動(dòng)物精子對(duì)溫度的敏感性、精子膜上化學(xué)成分(如蛋白質(zhì)和磷脂的比例以及 膽固醇和磷脂的比例和羥鏈的不飽和程度)等可能不同，而奶牛精子的抗凍能力比其他精 子的抗凍能力強(qiáng)，奶牛冷凍精子的人工授精的受胎率已達(dá)到85%以上。奶牛精清中的抗氧化物質(zhì)會(huì)對(duì)原精有保護(hù)作用，但精子經(jīng)過(guò)稀釋處理后，這種保 護(hù)作用就會(huì)降低。此外，在奶牛性別控制精液的生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)有大量的自由氧產(chǎn)生，且用 流式細(xì)胞儀分離精子會(huì)導(dǎo)致奶牛精子的受精能力降低，尤其是再經(jīng)過(guò)低溫存儲(chǔ)或者在液氮 中冷凍保存之后，精子的受精能力會(huì)明顯下降。同時(shí)經(jīng)過(guò)分離的精子的存活時(shí)間會(huì)明顯比 原精液存活時(shí)間短。這是由于精子質(zhì)膜富含不飽和脂肪酸，且對(duì)自由氧超級(jí)敏感(Sikka 1996)，因此脂質(zhì)氧化在精子功能上具有關(guān)鍵的作用，而分離及冷凍操作會(huì)造成脂質(zhì)過(guò)氧 化，從而造成精子的損傷尤其是對(duì)精子頂體膜的損傷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種制備奶牛性別控制精子的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的制備奶牛性別控制精液的方法，其在奶牛精子分離 之前的緩沖液中加入2-0-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細(xì)胞分離儀分離奶牛精子，將分 離得到的奶牛性別控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。本發(fā)明的上述制備方法中，所述AA-2G在緩沖液中的終濃度為150-250 μ M，優(yōu) 選為200 μ M ；所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述冷凍液中的濃度為150-250 μ Μ,優(yōu)選為 200 μ Μ。本發(fā)明中所述性別控制精液是將精子進(jìn)行性別分離制得的單一性別精液。其是通過(guò)χ/Υ精子分離技術(shù)，利用X、Y精子中DNA含量的差異，借助特異性染色劑染色，然后根 據(jù)發(fā)出的熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)精子類(lèi)別，然后給液滴附加電荷，根據(jù)靜電原理，將Χ、Υ 精子分離開(kāi)來(lái)，從而對(duì)精子進(jìn)行性別分離，制得單一性別精液。 2-0-葡萄糖苷抗壞血酸(AA-2G)是抗壞血酸(VC)的一種衍生物，由于2位上有 葡萄糖基掩蔽，所以不易發(fā)生氧化，所以在水溶液中特別穩(wěn)定，并且沒(méi)有直接還原性。AA-2G 在酶的作用下能很快的釋放出高活性的VC，能很快與自由基反應(yīng)以降低脂質(zhì)過(guò)氧化作用。 因此，在奶牛精子上分離機(jī)之前的緩沖液中和分離后的收集液中添加抗氧化劑AA-2G，能夠 提高奶牛性控 精子的受精能力和存活時(shí)間，且該性控冷凍精液進(jìn)行人工輸精后受胎率達(dá)到 85%以上。 具體地說(shuō)，本發(fā)明的制備奶牛性別控制精液的方法，包括如下步驟1)取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200 X IO6精子/mL，然后加入熒 光染料煙酸己可堿(H33342)至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量體積比4%提純卵黃和重量體積比5%食品紅的!fepes緩沖液進(jìn)一 步稀釋至100 X IO6精子/mL;其中，添加食品紅的目的是減弱死精子上的H33342熒光，使這部分精子在分離過(guò) 程中被棄除，提高分離精子的活力；3)然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離，回收分離得到的奶牛性別控 制精子，并收集在含有150-250 μ M AA-2G的冷凍液中；當(dāng)精子收集到8 X IO6精子時(shí)，立刻 在4°C溫度、840g下離心20min，棄掉上清；4)用含有AA-2G的冷凍液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml
細(xì)管裝管、密封。特別地，密封后的奶牛性別控制精子可以在15°C保存，也可以投入到液氮中冷凍， 制得冷凍精子。本發(fā)明中的冷凍液可以選用現(xiàn)有技術(shù)中常用的冷凍液，例如李喜和主編的《家畜 性別控制技術(shù)》(北京科學(xué)出版社，2009)中公開(kāi)的冷凍I液、冷凍II液等，其中冷凍I液 可以按如下配比進(jìn)行配制首先配置Tris-A工作液50ml Tris-AU. 766g Trisma Base、 0. 8615g檸檬酸、0. 6325g D-果糖，攪拌30min，再加入超純水50ml，調(diào)節(jié)pH為6. 8,0. 22 μ m 過(guò)濾除菌，5°C保存可供14天使用；其次配置25ml 20%卵黃Tris-A液19. 9ml Tris-A工 作液、5. Iml卵黃液，攪拌15min，5°C溫度下12h析出沉淀，靜止后析出表面卵脂，并在3850g 的條件下離心5min，取上清再過(guò)濾滅菌，5°C保存可供7天使用。本發(fā)明中所提到的重量體積比的單位均為g/ml。通過(guò)本發(fā)明方法制得的奶牛性別控制精子可以進(jìn)行人工輸精、或直接冷凍保存。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明通過(guò)在奶牛精子分離之前的緩沖液中和分離后的收集 冷凍液中添加抗氧化劑AA-2G，制得奶牛性別控制精子。由于AA-2G在水溶液中很穩(wěn)定，因 此奶牛性別控制精子在分離過(guò)程中的損傷能在很大程度得到避免，能夠提高精子品質(zhì)、提 高精子的受精能力，還能夠延長(zhǎng)存活時(shí)間；本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)單，能夠廣泛應(yīng)用于商 業(yè)化推廣中，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí) 施例中的重量體積比的單位均為g/ml。實(shí)施例11、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為150 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進(jìn)一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有250 μ M AA-2G的冷凍I液中；當(dāng)精子收集到8\106精子時(shí)，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細(xì)管裝管，密封后在15°C保存。實(shí)施例21、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為250 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進(jìn)一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有150 μ M AA-2G的冷凍I液中；當(dāng)精子收集到8\106精子時(shí)，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細(xì)管裝管，密封后在15°C保存。實(shí)施例31、取一定量奶牛原精液，用!fepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入 H33342至終濃度為0. IlmM及AA-2G至終濃度為200 μ M，在34°C水浴中染色45min ；2、用含有4% (重量體積比)提純卵黃和5% (重量體積比)食品紅的Ifepes緩 沖液進(jìn)一步稀釋至100X IO6精子/mL ；3、然后用SX-MoFlo流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行精子分離和回收，分離后的精液收集在 含有200 μ M AA-2G的冷凍I液中；當(dāng)精子收集到8\106精子時(shí)，立刻在840g下離心20min，
棄掉上清；4、用含有AA-2G的冷凍I液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3 X IO6精子0. 25ml 細(xì)管裝管，密封后在15°C保存。實(shí)施例4緩沖液中加入AA-2G的作用根據(jù)實(shí)施例1的制備方法同時(shí)進(jìn)行了 4組試驗(yàn)，其中對(duì)照組在分離前的緩沖液中 不添加任何抗氧化劑、A組添加AA-2G ；M組添加褪黑素；E組添加維生素E。各組抗氧化劑 的用量如表1所示，并用等量hepes緩沖液溶解，其余步驟及條件均與實(shí)施例1相同。將制 得的牛性別控制精液在37°C條件下，熒光顯微鏡檢測(cè)精子活力，結(jié)果如表1所示。表1不同抗氧化劑對(duì)奶牛精子活力及存活時(shí)間的影響
權(quán)利要求
1.一種制備奶牛性別控制精子的方法，其特征在于，在奶牛精子分離之前的緩沖液中 加入2-0-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細(xì)胞分離儀分離奶牛精子，將分離得到的奶牛性 別控制精子回收到含有2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在緩沖 液中的終濃度為150-250 μ M。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在緩沖 液中的終濃度為200 μ Μ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述 冷凍液中的濃度為150-250 μ Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述2-0-葡糖糖苷抗壞血酸在所述 冷凍液中的濃度為200 μ Μ。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)取一定量奶牛原精液，用Hepes緩沖液稀釋至200X IO6精子/mL，然后加入熒光染料 煙酸己可堿至終濃度為0. IlmM及2-0-葡糖糖苷抗壞血酸至終濃度為150-250 μ M，在34°C 水浴中染色45min ；2)用含有重量體積比4%提純卵黃和重量體積比5%食品紅的!fepes緩沖液進(jìn)一步稀 釋至100 X IO6精子/mL;3)然后用流式細(xì)胞分離儀進(jìn)行奶牛精子分離，回收分離得到的奶牛性別控制精子，并 收集在含有150-250μΜ 2-0-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中；當(dāng)精子收集到8 X IO6精子 時(shí)，立刻在4°C溫度、840g下離心20min，棄掉上清；4)用含有AA-2G的冷凍液重新懸浮沉淀物，以每管精子密度3X IO6精子0. 25ml細(xì)管 裝管，密封。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備奶牛性別控制精子的方法，其是在奶牛精子分離之前的緩沖液中加入2-O-葡糖糖苷抗壞血酸，然后用流式細(xì)胞分離儀分離奶牛精子，將分離得到的奶牛性別控制精子回收到含有2-O-葡糖糖苷抗壞血酸的冷凍液中。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明通過(guò)在奶牛精子分離之前的緩沖液中和分離后的精子收集液中添加抗氧化劑AA-2G來(lái)制備奶牛性別控制精子，能夠避免奶牛性別控制精子在性別分離處理過(guò)程中的損傷，提高精子品質(zhì)及精子的受精能力，還能夠延長(zhǎng)存活時(shí)間；本發(fā)明的制備方法操作簡(jiǎn)單，能夠廣泛應(yīng)用于商業(yè)化推廣中，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102144631SQ201110059938
公開(kāi)日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者吳中紅, 夏春梅, 安磊, 楊升, 田見(jiàn)暉 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)