專利名稱：：一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蟲害一直是造成農(nóng)業(yè)減產(chǎn)的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，各種作物因蟲害而遭受的經(jīng)濟(jì)損失平均達(dá)20%30%，每年損失大約數(shù)千億美元。通過基因工程的手段將抗蟲基因引入農(nóng)作物細(xì)胞并使其穩(wěn)定的表達(dá)和遺傳，培育抗蟲作物新品種，從而獲得農(nóng)作物的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn),已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的方向。目前廣泛應(yīng)用于植物基因工程的抗蟲基因按來源可分為三類一類是來源于微生物蘇云金芽孢桿菌(fifldW船f/H/n'wg/en^;s，簡稱Bt)的殺蟲晶體蛋白基因；第二類是來自高等植物的蛋白酶抑制劑(PI)基因和凝集素基因；第三類為動(dòng)物來源的蛋白酶抑制劑基因和動(dòng)物毒素基因。Bt毒蛋白基因是最先利用的基因，其發(fā)展已有幾十年的歷史，有很多植物因?yàn)檗D(zhuǎn)入了Bt毒蛋白而提高了抗蟲性，轉(zhuǎn)Bt毒蛋白的植物也成功進(jìn)入商品市場，如1987年Vaeck等首次證明轉(zhuǎn)蘇云金桿菌殺蟲蛋白基因的煙草能抗煙草天蛾。此后在番茄上也獲得了成功，可抗番茄果蟲和番茄蠹蛾。經(jīng)過改造的殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入棉花后已獲得了抗蟲藍(lán)花，經(jīng)田間試驗(yàn)，證明能抗甘藍(lán)尺蠖、甜菜夜蛾和棉鈴蟲。但是由于Bt毒蛋白的毒性太強(qiáng)，對昆蟲的選擇壓力太大，昆蟲容易產(chǎn)生抗性，影響其抗蟲效果。由此，人們普遍把目光轉(zhuǎn)向一種新的抗蟲基因一蛋白酶抑制劑基因。蛋白酶抑制劑(PIs)廣泛存在于植物中，受昆蟲攻擊后激活表達(dá)而行使功能，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用。研究表明，PIs主要存在于植物貯存器官如種子或塊莖中，還存在于葉、花和根中。植物蛋白酶抑制劑中的絲氨酸型蛋白酶抑制劑可抑制取食昆蟲消化道中的蛋白酶活性，致使昆蟲不能分解攝取的蛋白質(zhì)，從而影響昆蟲的生長發(fā)育甚至導(dǎo)致昆蟲死亡。所以，蛋白酶抑制劑在抗蟲基因工程中有廣泛的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種具有抗蟲作用的龍葵蛋白酶抑制劑基因及其編碼的蛋白。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述基因的重組質(zhì)粒、植物表達(dá)載體、細(xì)菌表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞及其再生植株。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述龍葵蛋白酶抑制劑基因在增強(qiáng)植物抗蟲能力中的應(yīng)用。本發(fā)明克隆的龍葵蛋白酶抑制劑基因一龍葵蛋白酶抑制劑IIb，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，命名為NPIB。該蛋白酶抑制劑基因是絲氨酸型蛋白酶抑制劑，屬馬鈴薯蛋白酶抑制劑11(PIN2)家族，是受傷誘導(dǎo)表達(dá)型的蛋白酶抑制劑。其編碼的蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，可以抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。本發(fā)明的NPIB基因可與植物表達(dá)載體質(zhì)粒pART27重組，構(gòu)建獲得含NPIB基因的植物表達(dá)載體pAH2b，NPIB基因在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)，可獲得具有抗蟲能力的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明的NPIB基因可與重組原核表達(dá)載體pGEX-4T-l重組，構(gòu)建獲得含NPIB基因的細(xì)菌表達(dá)載體pGZJOl。本發(fā)明參照分子克隆第三版9899頁方法，將含有NPffi基因的植物表達(dá)載體pAH2b轉(zhuǎn)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌；參照Horsch等人(1985)發(fā)展的葉盤轉(zhuǎn)化法，利用攜帶該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草，獲得轉(zhuǎn)NPIB基因的煙草。本發(fā)明通過PCR檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。從轉(zhuǎn)基因子一代(T1代)開始，做卡那霉素抗性篩選。將卡那抗性植株再做PCR檢測，選擇陽性植株。本發(fā)明通過Northernblot檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株。選取野生型煙草葉片總的RNA做負(fù)對照。探針選取NPIB基因的cDNA片段。結(jié)果表明NPIB基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中發(fā)生轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明通過Westemblot檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株中NPIB基因編碼蛋白的表達(dá)。提取轉(zhuǎn)基因煙草相同位置的葉片總蛋白做Westemblot檢測，選取野生型煙草及轉(zhuǎn)pART27空載體煙草葉片總蛋白做負(fù)對照，野生型龍葵的總蛋白做正對照。用NPIB特異性抗體。結(jié)果表明NPIB基因編碼的蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中表達(dá)。本發(fā)明參照Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法測量NPIB對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶以及昆蟲中腸類胰蛋白酶的抑制能力。結(jié)果表明NPIB所編碼的蛋白對胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶以及昆蟲中腸類胰蛋白酶有抑制活性。其與對照組存在極顯著差巳升o本發(fā)明通過向轉(zhuǎn)基因煙草人工接種棉鈴蟲幼蟲試驗(yàn)，用非轉(zhuǎn)基因煙草及轉(zhuǎn)空載體煙草接種幼蟲作對照，研究轉(zhuǎn)基因煙草抗蟲效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的受損程度明顯低于對照組，轉(zhuǎn)基因植株上接種的幼蟲體重明顯小于對照組。與目前技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明提供的NPIB基因是在茄科植物龍葵中分離的基因，其所編碼的蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性有顯著的抑制作用，可提高植物抗蟲性；2.利用本發(fā)明NPIB基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，該基因可以用于抗蟲植物基因工程的研究以及棉鈴蟲等磷翅目昆蟲的生物防治，在植物抗蟲基因工程領(lǐng)域、醫(yī)藥和分子生物學(xué)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。圖1:載體pAH2b和pGZJOl的示意圖2:轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測圖3:轉(zhuǎn)基因煙草的Northernblot檢測圖；圖4:轉(zhuǎn)基因煙草的Westernblot檢測圖；圖5:NPIB編碼蛋白抑制棉鈴蟲和斜紋夜蛾中腸蛋白酶活性的柱狀圖；圖6:轉(zhuǎn)基因煙草喂食棉鈴蟲后，植株受損情況對比圖；圖7:轉(zhuǎn)基因煙草喂食棉鈴蟲后，幼蟲體重分析柱形圖；其中，圖1中，A為載體pAH2b，包括35S啟動(dòng)子，NPIB基因和OCS終止子以及左右邊界；B為載體pGZJOl，包括Ptac啟動(dòng)子，GST基因和NPIB基因。圖2中，1為lOObpMarker;2和3為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草；4為轉(zhuǎn)空載體煙草；5為非轉(zhuǎn)基因煙草；6為pAH2b質(zhì)粒(正對照)；圖3中，1和2為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草，出現(xiàn)相應(yīng)的一條雜交條帶；3為用非轉(zhuǎn)基因煙草作對照，無雜交條帶；圖4中，l為野生型龍葵花總蛋白作正對照，出現(xiàn)相應(yīng)的一條雜交條帶；2為用非轉(zhuǎn)基因煙草作負(fù)對照，無雜交條帶；3為用轉(zhuǎn)空載體煙草作負(fù)對照，無雜交條帶；46為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草，出現(xiàn)相應(yīng)的一條雜交條帶；圖5中，1為斜紋夜蛾中腸蛋白；2為斜紋夜蛾中腸蛋白+大豆蛋白酶抑制劑；3為斜紋夜蛾中腸蛋白+NPIB蛋白；4為棉鈴蟲中腸蛋白；5為棉鈴蟲中腸蛋白+大豆蛋白酶抑制劑；6為棉鈴蟲中腸蛋白+NPIB蛋白；圖6中，l為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草；圖7中，l為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPffi基因煙草。具體實(shí)施例方式實(shí)施例lNPIB的獲得及其表達(dá)載體的構(gòu)建1、NPIB的獲得及植物表達(dá)載體pAH2b的構(gòu)建本發(fā)明根據(jù)SaPIN2b部分序列，用龍葵花mRNA經(jīng)RT-PCR，獲得NPIBcDNA，再用弓I物ZF259和引物ZF260弓|入5amffl和K/wI酶切位點(diǎn)。再將其和pGEM-Teasy(PROMEGA)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用藍(lán)白斑篩選克隆的轉(zhuǎn)化子。提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用I/wI和Sflmffl內(nèi)切酶進(jìn)行酶切檢驗(yàn)，并回收酶切片段。I和ffl酶切pHANNIBAL載體(pHANNIBAL載體具有提供基因表達(dá)的CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子，具有Amp抗性)，經(jīng)過酶切后的pHANNIBAL片段凝膠回收，與NPIBcDNA片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci，篩選陽性克隆，陽性克隆取名為pH2b。用MfI酶切pH2b得到pH2b載體上的"啟動(dòng)子一NPIBcDNA—終止子"表達(dá)框，再連到雙元載體pART27上，得到NPIB植物表達(dá)載體pAH2b。2、細(xì)菌表達(dá)載體pGZJOl的構(gòu)建(1)設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物ZF303/ZF304，以pT2b質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，除去信號肽的部分，即得NPIB(M)PCR產(chǎn)物；(2)用￡coRI和X/ioI分別雙酶切pGEX-4T-l和NPIB(M)PCR產(chǎn)物，用割膠回收試劑盒分別回收酶切后的片段，將回收的片段連接，并轉(zhuǎn)化入表達(dá)用大腸桿菌菌株BL21中；(3)挑取單克隆，提取質(zhì)粒，并用I和XbI雙酶切鑒定，酶切片段測序結(jié)果正確，即得重組細(xì)菌表達(dá)載體pZJGOl。本實(shí)施例構(gòu)建的NPIB基因的植物表達(dá)載體pAH2b，如圖1A所示；NPIB基因的細(xì)菌表達(dá)載體pGZJOl，如圖1B所示。本實(shí)施例中各引物序列ZF2595'-CCGGATCCATTAAAAACAAACGC-3':ZF2605'-CAGGTACCAATGGCTGTTCACAAAG-3':ZF3035'-GCGAATTCGTAAAACATGTTGAT-3';ZF3045'-GGCTCGAGTAAAAACTACAACGC陽3'。實(shí)施例2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化和卡那霉素抗性篩選從平板接種對應(yīng)的農(nóng)桿菌菌株于含相應(yīng)抗生素(卡那霉素50mg/ml，利福平50mg/L)的YEB液體培養(yǎng)基，28°C180rpm培養(yǎng)兩天;然后用液體TRM培養(yǎng)基稀釋農(nóng)桿菌液至OD6。。約為0.20.3。將無菌的葉片切成小葉盤，放入稀釋的農(nóng)桿菌液中5分鐘。取少量切好的葉片放入無農(nóng)桿菌的液體TRM培養(yǎng)基中，分別移到不含或含Kan(50mg/L)的平板上做為轉(zhuǎn)化的正負(fù)對照。28'C暗培養(yǎng)兩天，用液體TRM培養(yǎng)基漂洗外植體至少5次，在無菌濾紙上吸干液體。將外植體移至含相應(yīng)抗生素(含有100嗎/ml的卡那霉素，250pg/ml的羧芐青霉素)的TRM固體平板上，28。C培養(yǎng)。每兩周換一次培養(yǎng)基；4至6周后，切下小芽移到組織培養(yǎng)瓶中生根壯苗。待長根后，移入土中。實(shí)施例3將卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株作PCR檢測本實(shí)施例所用引物5'端引物序列ZF565'-TCCCACTATCCTTCGCAAGACCC-3';3'端引物序列ZF1715，-CCGCTCGAGGCATTTCATTGATTAG-3'。PCR反應(yīng)條件為95°C,5分鐘l個(gè)循環(huán)，后經(jīng)95。C50秒，58。C40秒，72。C40秒，35個(gè)循環(huán)，然后72。C延伸10分鐘。選擇PCR鑒定為陽性的材料，結(jié)果如圖2所示，轉(zhuǎn)基因植株及正對照擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因植株的Northernblot檢測每個(gè)樣品取20嗎RNA，于10mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)電泳，電壓為100V。電泳結(jié)束后用濾紙制作轉(zhuǎn)移的鹽橋，紙橋兩端搭于轉(zhuǎn)移緩沖液(20XSSC)中，轉(zhuǎn)移過夜。將膜在2XSSC中漂洗一下，然后在空氣中干燥10min，于80°C抽真空烘烤2h，紫外交聯(lián)3min。然后將雜交膜置于預(yù)雜交液中42°C溫育4h。預(yù)雜交液中加入新鮮制備的探針(NPIB基因片段)，混勻，42°C雜交過夜。洗膜后用保鮮膜將雜交膜包好，放在磷屏中，室溫下放置4h以上。使用Typhoon8600VariableModeImager掃描信號，結(jié)果如圖3所示，轉(zhuǎn)基因植株雜交出相應(yīng)的條帶。實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因植株Westernblot檢測提取植物總蛋白，將蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，95°C變性5分鐘，冷卻后點(diǎn)樣。150V，電泳至溴酚藍(lán)即將跑出膠。轉(zhuǎn)膜按照Amersham公司的TransphorTE62型推薦的程序進(jìn)行，恒電流350mA轉(zhuǎn)移1小時(shí)。Western雜交采用NBT/BCIP蛋白顯色檢測系統(tǒng)，其二抗為連有堿性磷酸酶的羊抗兔抗體。操作按照建議進(jìn)行將電轉(zhuǎn)移之后的硝酸纖維素膜浸泡在TBS中，溫和搖動(dòng)510分鐘。再重復(fù)洗一次。將膜浸入到封閉液中，溫和搖動(dòng)到l小時(shí)。再將膜轉(zhuǎn)到TTBS中，溫和搖動(dòng)5分鐘。再重復(fù)洗一次。傾去TTBS，加入一抗溶液(NPIB基因特異性抗體，濃度1:5000溶于抗體緩沖液)，溫和搖動(dòng)過夜。將膜轉(zhuǎn)到TTBS中，溫和搖動(dòng)510分鐘。再重復(fù)洗一次。傾去TTBS，加入二抗溶液(濃度1:10000溶于抗體緩沖液)，溫和搖動(dòng)12小時(shí)。用TTBS重復(fù)洗兩次。加入顯色液，待膜上出現(xiàn)明顯雜交帶，終止反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。轉(zhuǎn)基因植株及正對照雜交出相應(yīng)的條帶。實(shí)施例6NPIB編碼蛋白抑制活性檢測方法胰蛋白酶(TAME法)參考Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)的方法，將樣品與胰蛋白酶混勻，于室溫下放置3分鐘，再加入底物溶液(1.1mmol/LTAME)至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計(jì)中，37°C，于247nm處掃描3分鐘，每30秒計(jì)數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計(jì)算出活性值。胰凝乳蛋白酶(BTEE法)參考Kollipara&Hymowitz(1992)和Rickauer等(1989)，將樣品與胰凝乳蛋白酶混勻，于室溫下放置3分鐘，再加入底物溶液(lmmol/LBTEE)至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計(jì)中，37°C，于256nm處掃描3分鐘，每30秒計(jì)數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計(jì)算出活性值。昆蟲中腸提取物的類胰蛋白酶活性測定方法參考胰蛋白酶活性測定方法，由適量昆蟲中腸提取物代替商用蛋白酶，不足部分用相應(yīng)分析緩沖液補(bǔ)足。室溫下放置3分鐘，再加入相應(yīng)底物溶液至總體積為3mL。迅速混勻后，將反應(yīng)液放入分光光度計(jì)中，37°C，相應(yīng)波長下掃描3分鐘，每30秒計(jì)數(shù)一次。找出反應(yīng)過程中的線性變化部分的AA，即可計(jì)算出活性值。由表1可以看出，NPIB蛋白對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶有抑制活性。由圖5可以看出，NPIB蛋白對昆蟲中腸類胰蛋白酶有抑制活性。其與對照組存在顯著差異。表1NPIB蛋白對蛋白酶的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例7人工接種棉鈴蟲幼蟲試驗(yàn)當(dāng)移栽到溫室的轉(zhuǎn)基因植株長至約50cm高，1012片葉齡時(shí)，25。C條件下，植株接種二齡棉鈴蟲幼蟲10頭，重復(fù)三次。圖6是煙草喂食棉鈴蟲后受損情況，1為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草。這說明轉(zhuǎn)基因植株的受損程度明顯低于對照組。取下植株上的棉鈴蟲，稱重并將數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。如圖7所示，A圖是接種棉鈴蟲，1為非轉(zhuǎn)基因煙草；2為轉(zhuǎn)空載體煙草；3為轉(zhuǎn)NPIB基因煙草。這說明食轉(zhuǎn)NPIB基因煙草的幼蟲的體重明顯小于對照組，PO.Ol。如表2所示，取食轉(zhuǎn)NPIB基因煙草的幼蟲死亡率明顯地高于對照組。綜上所述，本發(fā)明提供的NPIB基因是在茄科植物龍葵中分離的基因，其功能是生產(chǎn)蛋白酶抑制劑，提高植物抗蟲性。利用本發(fā)明NPIB基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，該基因可以用于抗蟲植物基因工程的研究以及棉鈴蟲等磷翅目昆蟲的生物防治。表2棉鈴蟲死亡率統(tǒng)計(jì)植株棉鈴蟲死亡率非轉(zhuǎn)基因煙草23.3%轉(zhuǎn)空載體煙草30.0%轉(zhuǎn)NPIB基因煙草56.7%一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用序列表.txtSEQUENCELISTING<110><120><130><160〉〈170〉<210>〈211〉<212><213〉中山大學(xué)，深圳市東域投資發(fā)展有限公司一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用Patentlnversion3.21692DNA龍葵(Solanuraamericanum)<220〉<221>CDS<222>(33)..(491)<400〉1gaagataattaatcacgatcgagaaagaatatggetgttcacaaagasgtt53MetAlaValHisLysGluVal15agtteccttgettacetacttgttcttggattaatg"tttetacatgta101SerSerLeuAlaTyrLeuLeuValLeuGlyLeuMetPheLeuHisVal101520agegcggtaaaacatgttgatgccaagccatgtacaagagaa"tgtgg"t14:9SerAlaValLvsHisValAspAlaLysProCysThrArgGluCysGly253035aatcttgggtatggaatatgcccgcgtteagaaggaagtccggaaaat197AsnLeu6iyTyrGlylieCysProArgSer6lu6IySerPro6luAsn40455055cccatatgcacgaattgttgcteaggctataaaggttgcaactattat245ProlieCysThrAsnCysCysSerGlyTyrLysl^yCysAsnTyrTyr606570agtgetaatgggacttttatttgcgaaggaagttctgaccctaaaaac293SerAlaAsnGlyThrPhelieCysGluGlySerSerAspProLysAsn758085ccaaatacttgccccttattttgtgatggagatattgcctatteaaaa341ProAsnThrCysProLeuPheCysAspGlvAsplieAlaTyrSerLys9095100tgtccccgtteagaaggagagactataatatatcccacgggatgcacc389CysProArgSerGluGlyGluThrlielieTyrProThrGlyCysThr105110115acctgttgcacggggtacaagggttgctactattttagtaaagaaggt437ThrCvsCysThrGlyTyrLysGlyCysTyrTyrPheSerLysGluGly120125130135gagtttgtgtgtgaaggagagagtgatgaacccaacgttatttctaat485GluPheValCysGluGlyGluSerAspGluProAsnVallieSerAsn140145150caatgaaatgcgttgtagtttttaatataatgtatgaaataaaagtatgcagtacg541Gingcaat.atatgataatcactatagtgtgggcatcacagttgtgctttatatgtaattacta601attatctgaataagagaaaaagatcatccatgaggacttggctcctctccagtagtggtg661atctccttcctaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa692<210>2一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用序列表.txt<211>152<212>PRT<213〉龍葵<400〉2(Solarm邁americammOMetAlaValHisLysGluValSerSerLeuAlaTyrLeuLeuValLeu151015GlyLeuMetPheLeuHisValSerAlaValLysHisValAspAlaLys202530ProCysThrArgGluCvsGlyAsnLeuGlyTvi.GlvlieCysProArg354045SerGluGlySerProGluAsnProlieCvsThrAsnCysCysSerGly505560TyrLysGlyCysAsnTyrTyrSerAlaAsnGlyThrPhelieCysGlu65707580GlySerSerAspProLysAsnProAsnThrCysProLeuPheCysAsp859095GlyAsplieAlaTyrSerLysCysProArgSerGluGlyGluThrlie100105110lieTyrProThrGlyOsThrThrCysCysThrGlyTyrLysGlyCys115120125TyrTyrPheSerLvsGluGlyGluPheValCysGluGlyGluSerAsp130135140GluProAsnVallieSerAsnGin145150權(quán)利要求1.一種龍葵蛋白酶抑制劑基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3、含有權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因的重組質(zhì)粒。4、含有權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因的植物表達(dá)載體。5、含有權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因的細(xì)菌表達(dá)載體。6、含有權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或其再生植株。7、含有權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因的宿主菌。8、權(quán)利要求1所述龍葵蛋白酶抑制劑基因在增強(qiáng)植物抗蟲能力中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種龍葵蛋白酶抑制劑基因及其應(yīng)用，該基因序列如SEQIDNo1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNo2所示。本發(fā)明提供的NPIB基因是在茄科植物龍葵中分離的基因，其編碼的蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性有顯著的抑制作用，可提高植物抗蟲性。利用本發(fā)明NPIB基因作為目的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，在花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下超量表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲能力，該基因可以用于抗蟲植物基因工程的研究以及棉鈴蟲等磷翅目昆蟲的生物防治，在植物抗蟲基因工程領(lǐng)域、醫(yī)藥和分子生物學(xué)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。文檔編號C12N1/19GK101280310SQ20081002781公開日2008年10月8日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日發(fā)明者鋒吳,徐增富,王兆玉,鳴羅申請人:中山大學(xué);深圳市東域投資發(fā)展有限公司