專利名稱：引物特異熒光pcr檢測(cè)egfr突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，特別涉及以引物特異的實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)檢 測(cè)表皮生長(zhǎng)因子受體(Epithelium Growth Factor Recptor， EGFR)常見突變的試劑盒。
背景技術(shù)：
由阿斯利康公司研制的吉非替尼(gefitinib，易瑞沙)EGFR酪氨酸激酶抑制劑 (EGFR-TKI)，是一種新型的腫瘤靶向治療藥物，有效地切斷表皮生長(zhǎng)因子受體向細(xì)胞內(nèi)發(fā)出 信號(hào)，從而阻礙腫瘤的發(fā)生發(fā)展。美國(guó)、日本和中國(guó)學(xué)者近幾年的研究表明，EGFR的體細(xì)胞 突變與NSCLC患者對(duì)吉非替尼的敏感性相關(guān)。對(duì)EGFR突變的腫瘤，Gefitinib的有效率高達(dá) 80%-90%，而對(duì)沒有EGFR突變的腫瘤Gefitinib絕大部分沒有效果。EGFR蛋白酪氨酸激酶 功能區(qū)由EGFR外顯子18-24編碼，迄今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR突變主要發(fā)生在酪氨酸激酶域ATP 結(jié)合域附近，約90%的突變?yōu)橥怙@子19的堿基缺失和21外顯子在第858為密碼子的堿基替 換突變。目前國(guó)內(nèi)外主要采用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中EGFR突變，但是測(cè)序方法歩驟繁瑣、 周期長(zhǎng)、對(duì)操作人員要求高，難以在臨床上廣泛開展。更重要的是由于測(cè)序方法本身的限制 靈敏度不高，只能檢測(cè)出突變基因占總基因15% 20%以上的突變，而腫瘤組織是一個(gè)異質(zhì) 性的組織，EGFR突變又是一種雜合性的突變一即腫瘤細(xì)胞的含有EGFR基因的兩條DNA中只 有一條發(fā)生突變，如果突變細(xì)胞在手術(shù)切除的腫瘤組織中的比例小于20%，則普通的測(cè)序方 法無法檢出。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng) 的(終點(diǎn)檢測(cè))PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法不僅實(shí)現(xiàn)了低拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分 析，而且還具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增 阻礙突變系統(tǒng)(amplification refractory mutation system, ARMS),是進(jìn)行根據(jù)PCR擴(kuò)增 引物與模板的匹配程度不同來區(qū)分單一位點(diǎn)突變型與野生型序列間差異的一種PCR方法。該 方法設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物的3'端的最后一個(gè)堿基與突變型堿基對(duì)應(yīng)，相應(yīng)野生型模板就不能有效擴(kuò) 增。在這種定性的ARMS基礎(chǔ)上，結(jié)合TaqMan定量技術(shù)，又發(fā)展了一種TaqMAMA方法(Taqman mismatch amplification mutation assay),該技術(shù)進(jìn)一步將非特異擴(kuò)增時(shí)引物與模板之間 的引物不匹配程度從3'端的最后一個(gè)堿基擴(kuò)展到了倒數(shù)第二個(gè)，由此得以成功地辨別單一位 點(diǎn)突變[Warren E. Glaab et al, Mutation Research, 430: 1-12(1999)]。本發(fā)明主要就基于以上技術(shù)檢測(cè)EGFR外顯子中的常見突變。目前文獻(xiàn)中用熒光PCR方法檢測(cè)EGFR突變基本上都是采用Taqman-MGB探針技術(shù)，MGB 可以提高探針的Tm值，使探針設(shè)計(jì)更短，具有更好的淬滅效果，可以實(shí)現(xiàn)單點(diǎn)突變的檢測(cè)。 但是， 一方面Taqman-MGB探針的設(shè)計(jì)對(duì)模板序列要求嚴(yán)格，難以保證在所有突變位置有合適 的探針序列；另一方面，利用Taqman探針的特異性來檢測(cè)突變需要針對(duì)每一個(gè)突變類型設(shè)計(jì) 一對(duì)野生型和突變型探針，如EGFR外顯子19的缺失突變據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道就有20種以上，如果要 檢測(cè)其中10種突變就需要20個(gè)熒光探針，而T叫man-MGB探針價(jià)格昂貴，多重探針的使用會(huì) 大大增加檢測(cè)成本。采用引物特異的熒光PCR方法則可以避免這兩方面的問題，引物的設(shè)計(jì) 更加簡(jiǎn)單，而且合成成本低廉，對(duì)同一位置的不同突變類型可以采用多重引物一個(gè)探針進(jìn)行 檢測(cè)，既體現(xiàn)了熒光PCR方法簡(jiǎn)便，靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)，有達(dá)到了降低檢測(cè)費(fèi)用的 目的。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)EGFR基因突變的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，可用于臨床樣品 中EGFR基因常見突變檢測(cè)。為了完成上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為(1) 針對(duì)EGFR19外顯子、21外顯子突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的分別能夠與野生型和突變型模板的上 游或下游寡核苷酸引物，分別與EGFR 19外顯子、21外顯子野生型和突變型保守序列結(jié)合的下 游或上游寡核苷酸引物和寡核苷酸探針。(2) 配制適宜于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系包括19外顯子野生型檢測(cè)體系 (A)、 19外顯子突變型檢測(cè)體系(B)、 21外顯子突變型檢測(cè)體系(C)，每個(gè)檢測(cè)體系中都包括耐熱DNA聚合酶、dNTP、 UNG酶、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能 夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探 針、含有鎂離子的緩沖液。(3) 從待測(cè)樣本中提取DNA，加入前述的三個(gè)反應(yīng)體系中，在熒光定量PCR以上進(jìn)行PCR檢測(cè)。(4) 確定樣本在野生型檢測(cè)體系、19外顯子突變型檢測(cè)體系、21外顯子突變型檢測(cè)體系 的Ct值，分別標(biāo)記為CtA， CtB和CtC，如果CtB - CtA 〈閾值，則該標(biāo)本EGFR外顯子19有缺失 突變，如果CtC - CtA <閾值，則該標(biāo)本EGFR外顯子21有缺失突變，否則為野生型。本發(fā)明提供的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒包括以下組分(1)野生型PCR反應(yīng)液、19外顯子 突變PCR反應(yīng)液、21外顯子突變PCR反應(yīng)液、酶系、陰性質(zhì)控品、野生型質(zhì)控品、19突變型質(zhì)控品、21突變型質(zhì)控品，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中酶系包含耐 熱DNA聚合酶、dNTPs、 UNG酶和純化水。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中試劑盒的野生型PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、19型 正向引物、19野生型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò) 增的19型正向引物、19野生型反向引物和19型熒光探針的序列分別是 19型正向引物(EGFR19-F): 5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3' (SEQ ID N0:1) 19野生型反向引物(EGFR19-W-R): 5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3' (SEQ ID N0:2) 19型熒光探針(EGFR19-P) : 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3， (SEQIDN0:3)， 其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系，分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中試劑盒的19外顯子突變型PCR反應(yīng)液由PCR緩沖 液、19型正向引物、19突變型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，19突變型反向引物 又包括19突變型1反向引物、19突變型2反向引物、19突變型3反向引物、19突變型4反 向引物、19突變型5反向引物、19突變型6反向引物、19突變型7反向引物，其特征在于 用于靶多核苷酸擴(kuò)增的19型正向引物、19突變型反向引物和19型熒光探針的序列分別是 19型正向引物(EGFR19-F): 5' TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC 3' (SEQ ID N0:1) 19突變型1反向引物(EGFR19-Ml-R): 5'-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT -3' (SEQ ID N0:4)19突變型2反向引物(EGFR19-M2-R) 19突變型3反向引物(EGFR19-M3-R) 19突變型4反向引物(EGFR19-M4-R) 19突變型5反向引物(EGFR19-M5-R) 19突變型6反向引物(EGFR19-M6-R) 19突變型7反向引物(EGFR19-M7-R)5，- TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT -3' (SEQ ID NO:5) 5'- TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT -3' (SEQ ID NO:6) 5' -TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT -3' (SEQ ID NO:7) 5'- CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT -3' (SEQ ID NO:8) 5'- GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT -3' (SEQ ID NO:9) 5'-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3' (SEQ ID NO:10) 19型熒光探針(EGFR19-P): 5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3' (SEQ ID NO: 3)， 其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系，分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，其中試劑盒的21外顯子突變型PCR反應(yīng)液由PCR緩沖 液、21型正向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針和純化水組成，其特征在于用于靶 多核苷酸擴(kuò)增的21型正向引物、21突變型反向引物和21型熒光探針的序列分別是 21型正向引物(EGFR2卜F): 5'-GGAGGACCGTCGCTTGG -3' (SEQ ID NO:ll) 21突變型反向引物(EGFR21-M-R): 5' -GCACCCAGCAGTTTGGCTC -3' (SEQ ID NO: 12) 21型熒光探針(EGFR21-P): 5， X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC - Y 3，(SEQ ID NO: 13)其中x/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系，分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基te。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒中的陰性質(zhì)控品為生理鹽水，野生型質(zhì)控品、 19突變型質(zhì)控品和21突變型質(zhì)控品分別為測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為EGFR野生型、外顯子19突變型和21 突變型的組織、血液或者細(xì)胞系提取的DNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒的待檢樣品是從各種途徑獲取的含有腫瘤 DNA的臨床樣品，包括手術(shù)切除的癌組織、肺石蠟包埋的腫瘤組織、穿刺組織、血清和胸水等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒所檢測(cè)的EGFR21外顯子突變指的是在EGFR 酪氨酸激酶區(qū)的21外顯子上的L858R點(diǎn)突變，EGFR19外顯子突變指的是在EGFR酪氨酸激酶 區(qū)的19外顯子出現(xiàn)的常見缺失突變和復(fù)合突變等，如Del E746-A750(1) ， Del E746-A750(2)， Del E746-T751， Del L747-T751insP， Del L747-S752insS， Del L747-S752ins VI， Del L747-S752等。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中試劑盒用于判定檢測(cè)方法有效性的標(biāo)準(zhǔn)是每次 檢測(cè)都使用野生型PCR反應(yīng)液、突變型PCR反應(yīng)液分別檢測(cè)野生型質(zhì)控品和突變型質(zhì)控品， 然后根據(jù)兩次熒光PCR所得出的ACt值作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于野生型質(zhì)控品ACt值應(yīng)大于閾值，對(duì)于突變型質(zhì)控品ACt值應(yīng)小于閾值。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒按照下述標(biāo)準(zhǔn)判定被檢序列是野生型或者突變 型1)在At大于閾值的情況下，則該樣品即可判定野生型；2)在ACt小于閾值的情況下， 則該樣品即可判定為突變型。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，試劑盒檢測(cè)結(jié)果的閾值可以根據(jù)不同標(biāo)本類型或者不 同的靈敏度及特異性要求設(shè)為3—9之間的任意值，優(yōu)選使用5 — 7之間的任意值。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可以根據(jù)所擴(kuò)增序列的特殊情況，例如CG堿基含量高 和/或重復(fù)序列多等，在試劑盒的PCR緩沖液中加入甜菜堿、甲酰胺和二甲基亞砜等PCR反應(yīng) 添加劑。本發(fā)明所述的EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒，針對(duì)用測(cè)序方法步驟繁瑣、操作復(fù)雜、靈敏度 低的缺點(diǎn)，采用引物特異的熒光PCR方法，分別針對(duì)TK區(qū)的每個(gè)外顯子的設(shè)計(jì)野生型與突變型 引物以及公用探針，利用熒光PCR方法靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)， 一次PCR操作即可檢出多種常見突 變，靈敏度至少可以達(dá)到1%。本發(fā)明與現(xiàn)有的測(cè)序技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1) 靈敏度更高，可以檢出1%的突變模板，高于測(cè)序方法20%的靈敏度。(2) 全封閉反應(yīng)，提取基因組DNA后，直接用PCR檢測(cè)判斷結(jié)果，避免了用PCR產(chǎn)物測(cè)序 造成的污染；(3) 檢測(cè)速度快，整個(gè)過程僅需4 5小時(shí)；(4) 操作簡(jiǎn)單，可控性強(qiáng)，可進(jìn)行大批量樣品檢測(cè)，有利于臨床操作。


圖l顯示試劑盒質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線，其中圖1A顯示野生型質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線，圖1B顯示 EGFR19突變型質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線，圖1C顯示EGFR21突變型質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。 圖2顯示試劑盒檢測(cè)EGFR 19外顯子突變型的肺癌組織標(biāo)本的擴(kuò)增曲線。 圖3顯示試劑盒檢測(cè)EGFR 21外顯子突變型的肺癌組織標(biāo)本的擴(kuò)增曲線。 圖4顯示DNA提取失敗的肺癌組織標(biāo)本的擴(kuò)增曲線，其中圖4A中反應(yīng)液A、 B均無擴(kuò)增曲線， 說明DNA提取失敗。圖4B中B管無特異性增長(zhǎng)曲線且CtA〉23，說明DNA濃度太低，不能用于PCR 檢測(cè)具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例l: EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒及其使用(1) 試劑盒的組成PCR反應(yīng)液A l管(820 ul /管)、PCR反應(yīng)液B l管(820 ul /管)、PCR反應(yīng)液C l管 (820 ul /管)、酶系l管(240 yl /管)、野生型質(zhì)控品l管(30ul/管)、19突變型標(biāo)準(zhǔn)品1 管(30ul/管)、19突變型標(biāo)準(zhǔn)品1管(30ul/管)，陰性對(duì)照l管(30, ul/管)。PCR反應(yīng)液A 包括19型正向引物、19野生型反向引物、19型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；PCR反應(yīng)液B 中包括19型正向引物、19突變型l-7反向引物、19型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；PCR反應(yīng) 液C中包括21型正向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針、PCR緩沖液、純化水；Taq酶系 中包括UNG酶、dNTPs、 Taq酶。(2) 核酸提取取10-50mg新鮮組織或石蠟包埋組織樣本或者200-500 n l外周血清，建議使用Qiagen或 者RochDNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取過程按照試劑盒說明書進(jìn)行，最后收集到100ul DNA溶液。(3) PCR檢測(cè)按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液、Taq酶系(PCR反應(yīng)液A和PCR反應(yīng)液B 41W/人份+Taq酶系4rt/人份)，充分混勻后按45W/管分裝至PCR反應(yīng)管中，備用。向準(zhǔn)備好PCR反應(yīng)液A和B的PCR反應(yīng)管中，分別加入處理后的同一個(gè)樣品的DNA提取液5y 1，并蓋緊管蓋，3000rpm離心2分鐘，8熒光定量PCR上機(jī)。PCR循環(huán)條件是50°C 3分鐘一94度3分鐘一(預(yù)擴(kuò)增步驟)94度30秒，60 度45秒，10個(gè)循環(huán)—94度15秒，60度(讀熒光)60秒，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；或40。C 30分鐘一94 度30秒，60度(讀熒光)45秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(參見附圖l)。選擇熒光定量PCR儀上FAM/TAMRA 通道進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。(4) 結(jié)果分析根據(jù)擴(kuò)增曲線設(shè)置Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(start值可以 在1 10、 st叩值可以在5 20、 Value值可以在0.01 0.2范圍選擇)，在Analysis菜單下選 擇Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。(5) 結(jié)果判定A. 對(duì)野生型質(zhì)控品，A管有特異性增長(zhǎng)曲線，B管和C管無特異性增長(zhǎng)曲線(圖1A); 對(duì)E19突變型質(zhì)控品，A管和B管有特異性增長(zhǎng)曲線，C管無特異性增長(zhǎng)曲線(圖1B);對(duì) E21突變型質(zhì)控品，A管和C管有特異性增長(zhǎng)曲線，B管無特異性增長(zhǎng)曲線。同時(shí)滿足上述 條件本次實(shí)驗(yàn)有效(圖1C)。B. 每個(gè)樣品均要同時(shí)進(jìn)行A、 B和C三管的檢測(cè)，其Ct值分別記為CtA、 CtB、 Cte。試 劑盒檢測(cè)的最適DNA濃度范圍為10ng/反應(yīng)-500ng/反應(yīng)，對(duì)應(yīng)的CX值范圍約為12-20 (對(duì) 應(yīng)的循環(huán)數(shù)為22-30)。C. 對(duì)同一樣品，如果B管呈特異性增長(zhǎng)曲線，iCtB-CtA〈6 (圖2)，則該標(biāo)本EGFR 外顯子19有缺失突變，否則為野生型。D. 對(duì)同一樣品，如果C管呈特異性增長(zhǎng)曲線，且Ctr CtA 〈 6 (圖3)，則該標(biāo)本EGFR 外顯子21有L858R的點(diǎn)突變，否則為野生型。E. 如果A， B， C管均無特異性增長(zhǎng)曲線(參見附圖4A)或者B， C管無特異性增長(zhǎng)曲線且CtA > 23(循環(huán)數(shù)為33)(參見附圖4B)，則該樣本檢測(cè)無效，需重新檢測(cè)或者提取DNA。<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120>弓I物特異熒光PCR檢測(cè)EGFR突變的試劑盒<140><141><160> 13<210> 1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220><223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400〉 1tcacaattgccagttaacgtcttc<210>2 <211>23 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 2gctttcggagatgttgcttctct<210> 3 <211>26 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 <400> 3tctc3ccttctgggatccagagtccc<210>4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 4tggctttcggagatgttttgat<210> 5 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 5tggctttcggagatgtcttgat<210>6 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 6tgttggctttcggagatttgat<210> 7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 7ttggctttcggaggttcctt<210>8 <211>21 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 8ccttgttggctttcgattcct<210>9 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 9gttggctttcggaaccttgat<210> 10 <211>21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 10cttgttggctttcggttcctt<210> 11 <211> 17 <212> DNA <213>人工序列 <220〉<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 11ggaggaccgtcgcttgg<210> 12 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 <400> 12gcacccagcagtttggctc<210> 13 <211> 26 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 <400> 13tctcaccttctgggatccagagtccc
權(quán)利要求
1、一種采用引物特異的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測(cè)EGFR突變的試劑盒，該試劑盒包括野生型PCR反應(yīng)液、19外顯子突變PCR反應(yīng)液、21外顯子突變PCR反應(yīng)液、酶系、陰性質(zhì)控品、野生型質(zhì)控品、19突變型質(zhì)控品、21突變型質(zhì)控品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其中19外顯子突變型PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、19型正向引物、19突變型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，19突變型反向引物又包括19突變型1反向引物、19突變型2反向引物、19突變型3反向引物、19突變型4反向引物、19突變型5反向引物、19突變型6反向引物、19突變型7反向引物，其特征在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的19型正向引物、19突變型反向引物的序列分別是19型正向引物5′-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3′19突變型1反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTTTTGAT-3′19突變型2反向引物5′-TGGCTTTCGGAGATGTCTTGAT-3′19突變型3反向引物5′-TGTTGGCTTTCGGAGATTTGAT-3′19突變型4反向引物5′-TTGGCTTTCGGAGGTTCCTT-3′19突變型5反向引物5′-CCTTGTTGGCTTTCGATTCCT-3′19突變型6反向引物5′-GTTGGCTTTCGGAACCTTGAT-3′19突變型7反向引物5′-CTTGTTGGCTTTCGGTTCCTT-3′。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于19外顯子突變型PCR反應(yīng)液中19型熒光探 針的序列為5，X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC—Y 3，，其中X/Y表示熒光標(biāo)記 檢測(cè)體系，分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中21外顯子突變PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、21型正 向引物、21突變型反向引物、21型熒光探針和純化水組成，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò) 增的21型正向引物、21突變型反向引物的序列分別是 '21型正向引物5'-GGAGGACCGTCGCTTGG-3'21突變型反向引物5'-GCACCCAGCAGTTTGGCTC-3'。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于21外顯子突變PCR反應(yīng)液中21型熒光探針 的序列是5'X-TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC-Y 3，，其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢 測(cè)體系，分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其中野生型PCR反應(yīng)液由PCR緩沖液、19型正向引物、 19野生型反向引物、19型熒光探針和純化水組成，其特征還在于用于靶多核苷酸擴(kuò)增的19 型正向引物、19野生型反向引物的序列分別是19型正向引物5'-TCACAATTGCCAGTTAACGTCTTC-3'19野生型反向引物5'-GCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCT-3'。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于野生型PCR反應(yīng)液中19型熒光探針的序列 是5， X- TCTCACCTTCTGGGATCCAGAGTCCC -Y 3'，其中X/Y表示熒光標(biāo)記檢測(cè)體系， 分別為熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于酶系中包含Taq酶、dNTP和UNG酶。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于陰性質(zhì)控品為生理鹽水，野生型質(zhì)控品、19 突變型質(zhì)控品和21突變型質(zhì)控品分別為測(cè)序檢測(cè)結(jié)果為EGFR野生型、外顯子19突變型和21突 變型的組織、血液或者細(xì)胞系提取的DNA。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于每個(gè)樣品野生型和突變型體系熒光PCR測(cè)得的 ACt值是指同一樣品在突變型PCR體系擴(kuò)增的Ct值減去其在野生型PCR體系擴(kuò)增的Ct值的差值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種引物特異熒光PCR檢測(cè)EGFR突變的試劑盒，特別涉及腫瘤組織以及腫瘤患者外周血清中EGFR基因突變的診斷。本試劑盒針對(duì)分子靶向抗癌藥物療效相關(guān)的特定突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性的寡核苷酸引物序列和探針序列，對(duì)每一個(gè)待測(cè)樣品，分別用野生型PCR體系和突變型PCR體系進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，通過兩次反應(yīng)Ct值差值(ΔCt)的大小，判斷樣品是否存在EGFR19外顯子和21外顯子的突變。本發(fā)明可對(duì)EGFR的特定位點(diǎn)是否存在突變進(jìn)行檢測(cè)，可用于分子靶向抗腫瘤新藥的療效預(yù)測(cè)和腫瘤患者臨床個(gè)體化用藥方案的指導(dǎo)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101565742SQ20081002767
公開日2009年10月28日 申請(qǐng)日期2008年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月25日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 荃 吳, 明 李, 鋼 程 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司