專利名稱：一種鐵調(diào)素抑制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鐵調(diào)素抑制，具體涉及當(dāng)歸多糖(ASP)作為鐵調(diào)素(hepcidin)抑制劑及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
人體存在著嚴(yán)格的鐵代謝調(diào)節(jié)機制，確保體內(nèi)鐵始終處于正常水平。在人體，小腸是鐵吸收的唯一部位，肝臟和內(nèi)皮系統(tǒng)(retoculoendothelial system，RE)是鐵儲存的主要部位，而骨髓是利用鐵的主要部位。機體鐵穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵依賴于小腸鐵吸收和機體鐵需要之間的平衡。機體缺鐵時，小腸鐵吸收增加，反則反之。最近研究顯示，鐵調(diào)素(Hepcidin)是一種控制小腸鐵吸收及調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)。它能在肝臟、小腸、網(wǎng)織紅細(xì)胞和RE系統(tǒng)之間傳遞有關(guān)鐵調(diào)節(jié)的信號，控制和調(diào)節(jié)這些組織鐵吸收或釋放蛋白的表達(dá)。當(dāng)任何原因引起循環(huán)鐵增加時，肝細(xì)胞攝鐵也增加。這回導(dǎo)致肝細(xì)胞增加合成和分泌鐵調(diào)素進(jìn)入血液，鐵調(diào)素經(jīng)血流運輸?shù)绞改c隱窩細(xì)胞，促成隱窩細(xì)胞攝鐵量增加，隱窩細(xì)胞內(nèi)鐵池增大進(jìn)而抑制腸吸收上皮細(xì)胞四種鐵吸收蛋白表達(dá)下降，鐵吸收量因此下降。當(dāng)循環(huán)鐵較低時，經(jīng)肝細(xì)胞鐵攝取將會減少，肝臟合成分泌的鐵調(diào)素將會減少，這將引起隱窩細(xì)胞鐵池變小，腸吸收上皮相關(guān)蛋白表達(dá)增加，腸鐵吸收量增加，是鐵水平回復(fù)到正常。同時肝臟分泌的鐵調(diào)素也可經(jīng)血液到達(dá)RE系統(tǒng)和骨髓，調(diào)節(jié)這些組織鐵代謝作相應(yīng)變化。
鐵代謝及其在鐵調(diào)節(jié)中作用的認(rèn)識是進(jìn)入21世紀(jì)后鐵代謝領(lǐng)域中最重要的突破性進(jìn)展。無論對臨床診斷還是治療各類貧血及高鐵負(fù)荷相關(guān)疾病，其意義均是巨大的。很多鐵代謝相關(guān)疾病是由于體內(nèi)hepcidin的調(diào)節(jié)失調(diào)所導(dǎo)致，還有一些因為鐵吸收障礙而導(dǎo)致的鐵缺乏癥都可以通過抑制hepcidin的表達(dá)來達(dá)到一定的預(yù)防以及治療效果。hepcidin基因的表達(dá)主要受機體鐵水平、炎癥和感染、紅細(xì)胞生成活性等因素調(diào)節(jié)。機體鐵水平高時，血色病基因(hemochromatosis gene product，HFE)、血幼素(hemojuvelin，HJV)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2(transferrin receptor 2，TfR2)等分子會增加hepcidin的表達(dá)；炎癥和感染導(dǎo)致某些細(xì)胞因子如IL-6的分泌增加也會刺激hepcidin的表達(dá)；但是，機體紅細(xì)胞生成活性的增強卻會抑制hepcidin的表達(dá)，從而開放鐵釋放通道，促進(jìn)腸道鐵吸收及巨噬細(xì)胞鐵釋放，有利于增加紅細(xì)胞對鐵的有效利用，因此能迅速改善機體鐵缺乏的貧血癥狀。
傳統(tǒng)中藥當(dāng)歸[Angelica sinensis(Oliv.)Diels]是一味歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效?，F(xiàn)代研究證實，當(dāng)歸的主要成分當(dāng)歸多糖(Angelica sinensis polysaccharide，ASP)通過刺激造血細(xì)胞生長微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞分泌造血生長因子(如EPO、IL-2、GM-CSF等)，促進(jìn)造血祖細(xì)胞和多能造血干細(xì)胞增殖和分化。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鐵調(diào)素抑制劑，使其具有抑制hepcidin表達(dá)的作用。同時，本發(fā)明還提供了該鐵調(diào)素抑制劑在治療hepcidin表達(dá)過量引起的疾病中的應(yīng)用，即通過抑制hepcidin調(diào)節(jié)機體血鐵水平從而治療鐵代謝相關(guān)疾病。
實現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案是 本發(fā)明提供的這種鐵調(diào)素抑制劑是當(dāng)歸多糖。
本發(fā)明揭示當(dāng)歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達(dá)，從而增加小腸對鐵的吸收以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏癥狀。
當(dāng)歸多糖的提取與純化方法如下 1.水提醇沉法制備當(dāng)歸粗多糖當(dāng)歸飲片100g加入蒸餾水1000ml，煮沸1h，過濾。藥渣加入蒸餾水1000ml，煮沸1h，過濾，合并濾液。濾液減壓濃縮至較小體積后，加入氫氧化鈣調(diào)pH至堿性，靜置過夜后過濾，濾液中加入硫酸調(diào)pH至酸性，過濾，取濾液醇沉，醇沉物冷凍干燥，得14.176g棕黃色粉末當(dāng)歸粗多糖，見圖1。以苯酚-硫酸法測定糖含量，總糖含量為70.88％。[硫酸苯酚法參考吳立軍.天然藥物化學(xué).人民衛(wèi)生出版社，第78頁] 2.凝膠柱法制備精制當(dāng)歸多糖將當(dāng)歸粗多糖配成30mg/ml的水溶液，過濾后，取5ml上Sephadex G-50凝膠柱(35cm×2.5cm)，以蒸餾水洗脫，流速7ml/min，每5ml收集一管，共收集50管。從這50管中每管取1ml以苯酚-硫酸法于490nm處測定吸光度，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見圖3。該圖顯示洗脫曲線有兩個洗脫峰，分別在第10～12管與第24～27管，洗脫峰處的洗脫液為含糖液。因此，分別收集第10～12管，第24～27管，合并兩部分收集液于50℃減壓濃縮后冷凍干燥，得到4.152mg淡黃色粉末即為精制當(dāng)歸多糖，以苯酚-硫酸法測定糖含量為96.5％，見圖2。
本發(fā)明實驗中稱取精制當(dāng)歸多糖40g，溶于200ml蒸餾水中配制成0.2g/ml的當(dāng)歸多糖溶液，大鼠灌胃給藥后，測定大鼠血清hepcidin的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖對正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達(dá)有良好的抑制效果。
我們將大鼠灌胃給藥當(dāng)歸多糖溶液后，Elisa試劑盒法測定hepcidin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示正常大鼠體內(nèi)hepcidin血清濃度在末次給藥后12h時開始降低，于48h降到最低值；缺鐵性貧血大鼠ASP給藥組在末次給藥后24h時，其Hepcidin下降到最低值，與末次給藥后1h時比，下降率為21％。說明當(dāng)歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達(dá)。Hepcidin是一種控制小腸鐵吸收及調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵物質(zhì)。它能在肝臟、小腸、網(wǎng)織紅細(xì)胞和RE系統(tǒng)之間傳遞有關(guān)鐵調(diào)節(jié)的信號，控制和調(diào)節(jié)這些組織鐵吸收或釋放蛋白的表達(dá)。當(dāng)任何原因引起循環(huán)鐵增加時，肝細(xì)胞就會增加合成和分泌鐵調(diào)素，鐵調(diào)素經(jīng)血流運輸?shù)绞改c隱窩細(xì)胞，促成隱窩細(xì)胞攝鐵量增加，隱窩細(xì)胞內(nèi)鐵池增大進(jìn)而抑制腸吸收上皮細(xì)胞四種鐵吸收蛋白表達(dá)下降，鐵吸收量因此下降參見1.郭曉強.海帕西啶與鐵代謝.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，794-797；2.LydieViatte，SophieVaulont.Hepcidin，theironwatcher.Biochimie，1223-1228.。因此當(dāng)歸多糖可通過抑制hepcidin的表達(dá)增加小腸對鐵的吸收以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏癥狀。本發(fā)明揭示當(dāng)歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠hepcidin的表達(dá)，從而增加小腸對鐵的吸收以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏癥狀。
當(dāng)歸多糖是天然產(chǎn)物，制備工藝簡單，產(chǎn)率高，污染小，成本低，無毒副作用，適合作為hepcidin抑制劑，可用于輔助鐵制劑治療鐵代謝相關(guān)性疾病。



圖1是經(jīng)過水提醇沉法制備的當(dāng)歸粗多糖，為棕黃色粉末。
圖2是當(dāng)歸粗多糖經(jīng)過Sephadex G-50凝膠柱后制備的精致當(dāng)歸多糖，為淡黃色粉末。
圖3是以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制的當(dāng)歸多糖洗脫曲線，從曲線可以看出有兩個洗脫峰，分別位于第10～12管與第24～27管之間，收集洗脫峰處的洗脫液為含糖液。
圖4是rhEPO及ASP末次給藥后正常大鼠體內(nèi)血清中hepcidin含量變化圖大鼠血清中hepcidin在最后一次給藥后12h時開始降低，于48h降到最低值，之后緩慢回升，說明當(dāng)歸多糖可較長時間地抑制正常狀態(tài)下大鼠體內(nèi)hepcidin的表達(dá)。
圖5是rhEPO及ASP末次給藥后IDA大鼠體內(nèi)血清中hepcidin含量變化圖Hepcidin在給藥后24h時，下降到最低值，至給藥后48h仍略低于水平值，說明當(dāng)歸多糖可較長時間地抑制IDA病理狀態(tài)下大鼠體內(nèi)hepcidin的表達(dá)，并且抑制效果比rhEPO給藥組更顯著。

具體實施例方式 下面通過具體的實施實例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
實施實例1 實驗方法稱取精制當(dāng)歸多糖40g，溶于200ml蒸餾水中配制成0.2g/ml的當(dāng)歸多糖溶液。實驗用健康SD大鼠共14只，隨機分為兩組。第一組腹腔注射rhEPO 3天，第二組灌胃當(dāng)歸多糖溶液每天一次，每次1ml，連續(xù)14天。在給藥前及末次給藥后各時間點取血，測定血清中hepcidin的含量。
實驗結(jié)果ASP與rhEPO體內(nèi)給藥對hepcidin表達(dá)的抑制效果相似。大鼠體內(nèi)hepcidin血清濃度在最后一次給藥后12h時開始降低，于48h降到最低值，與給藥1h所測值有顯著差異，之后緩慢回升，見表1和圖4。末次給藥后，比較rhEPO組及ASP組抑制hepcidin的持續(xù)時間得出ASP給藥后，大鼠體內(nèi)hepcidin濃度可長時間維持在較低水平，正常大鼠體內(nèi)hepcidin含量直至給藥后48h仍顯著低于給藥前。即當(dāng)歸多糖可較長時間地抑制正常狀態(tài)下大鼠體內(nèi)hepcidin的表達(dá)。
表1末次給藥后正常大鼠體內(nèi)血清中hepcidin含量變化(ng/ml，

n＝7)
*表示與t＝1h時比有顯著性差異，p＜0.05；**表示與給藥前比有顯著性差異，p＜0.01 實施實例2 實驗方法 1.造模實驗用健康SD大鼠21只，造模前取血測血液指標(biāo)。造模期間飼喂低鐵飼料，并定期定量放血，每周取血測血液指標(biāo)，直至各指標(biāo)有顯著性差異，指示缺鐵性貧血造模成功，實驗過程中杜絕鐵污染。
2.給藥及檢測造模后，模型大鼠隨機分成三組，第一組腹腔注射rhEPO 3天，第二組灌胃當(dāng)歸多糖溶液每天一次，每次1ml，連續(xù)14天，第三組灌胃同等體積的生理鹽水作為模型對照組。在造模前，造模后給藥前及末次給藥后各時間點取血，采用ELISA測定血清中hepcidin的含量。
實驗結(jié)果 1.分別于造模前后采用血細(xì)胞自動分析儀測定大鼠血液中各指標(biāo)，測定結(jié)果見表2，結(jié)果顯示與造模前相比，造模后大鼠Hb、HCT、MCV、MCH及MCHC均顯著下降，RDW增加，對實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗，各項指標(biāo)造模前后有極顯著性差異，表明造模組大鼠具有明顯的缺鐵性貧血癥狀，缺鐵性貧血模型構(gòu)建成功。
2.給藥后hepcidin檢測結(jié)果顯示ASP給藥組hepcidin的受抑制效果比rhEPO給藥組更顯著，ASP給藥組在末次給藥后24h時，其Hepcidin下降到最低值，與末次給藥后1h時比，下降率為21％，見表3和圖5。末次給藥后，比較rhEPO組及ASP組抑制hepcidin的持續(xù)時間得出ASP給藥后，大鼠體內(nèi)hepcidin濃度在末次給藥后可長時間維持在較低水平，IDA大鼠體內(nèi)hepcidin濃度在末次給藥后48h也仍略低于水平值。即當(dāng)歸多糖可較長時間地抑制IDA病理狀態(tài)下大鼠體內(nèi)hepcidin的表達(dá)。結(jié)果說明當(dāng)歸多糖能夠抑制缺鐵性貧血大鼠(IDA)體內(nèi)hepcidin的表達(dá)。
表2大鼠造模前后血常規(guī)變化(

n＝21)
表3末次給藥后IDA大鼠體內(nèi)血清中hepcidin含量變化(ng/ml，

n＝7)
**表示與造模前比有顯著性差異，p＜0.01；*表示與t＝1h時比有顯著差異，p＜0.0權(quán)利要求
1.一種鐵調(diào)素抑制劑，其特征在于，它是當(dāng)歸多糖。
2.當(dāng)歸多糖在制備鐵調(diào)素抑制劑中的應(yīng)用。
3.當(dāng)歸多糖在制備用于治療鐵調(diào)素表達(dá)過量所致疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鐵調(diào)素抑制劑，該鐵調(diào)素抑制劑是當(dāng)歸多糖。本發(fā)明提供的鐵調(diào)素抑制劑當(dāng)歸多糖能夠抑制正常大鼠及缺鐵性貧血大鼠鐵調(diào)素的表達(dá)，從而增加小腸對鐵的吸收以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的對鐵的釋放，改善機體鐵缺乏癥狀。本發(fā)明鐵調(diào)素抑制劑是天然產(chǎn)物，其制備工藝簡單，產(chǎn)率高，污染小，成本低，無毒副作用，適合制備用于治療鐵調(diào)素表達(dá)過量所致疾病藥物。
文檔編號A61K31/715GK101816674SQ201010174779
公開日2010年9月1日 申請日期2010年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月18日
發(fā)明者王凱平, 張玉, 汪繼紅, 胡明惠, 周漠炯 申請人:華中科技大學(xué)