專利名稱：：引物、成套引物、使用其的核酸擴增方法和變異檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于擴增目的核酸序列的成套引物、使用其的核酸擴增方法和變異檢測方法。
背景技術(shù)：
：疾病的基因診斷、基因的表達解析等中，需要檢測具有某些特定序列的目的核酸，該檢測中廣泛利用熒光。具體而言，已知使用焚光物質(zhì)的方法，其中所述熒光物質(zhì)的熒光強度隨著目的核酸序列的增加而增大。作為前述的熒光物質(zhì)代表性的例如為嵌入雙螺旋結(jié)構(gòu)、通過激發(fā)光照射而發(fā)出熒光的物質(zhì)。若使用用這樣的熒光物質(zhì)進行標(biāo)記的引物進行目的核酸序列的擴增，例如通過前述引物與模板DNA的目的核酸序列雜交形成雙鏈體，前述焚光物質(zhì)發(fā)出熒光。因此，若測定前述引物的熒光物質(zhì)的熒光強度，則可以檢測例如有無擴增和擴增量、目的核酸序列中的檢測目標(biāo)有無變異等。但是，現(xiàn)有的熒光物質(zhì)有時即使在例如不形成雙螺旋結(jié)構(gòu)的情況下也發(fā)出熒光。另外，在僅消除標(biāo)記有熒光物質(zhì)的探針和引物的熒光的目的下，利用FRET的方法是有效的(非專利文獻l~4等)，但是存在例如導(dǎo)入2種熒光染料導(dǎo)致的成本等的問題。另外，作為與DNA或RNA相互作用而熒光強度增大的熒光染料，已知作為花青染料的一種的噻唑橙。有過嘗試使噻唑橙以共價鍵結(jié)合到DNA上來制備熒光探針的例子，但是通過與含有噤呤堿基的單鏈體DNA的相互作用也發(fā)出強的熒光(非專利文獻5),形成雙螺旋時的熒光強度的增加變小，可以說是不成功的(非專利文獻6和7)。進一步，近年來發(fā)明人等報道了劃時代的方法，該方法通過僅在等溫條件下進行目的核酸序列的核酸擴增，就可以簡便且迅速地進行基因變異的檢測(非專利文獻8~10、專利文獻1~2)。在該方法中也使用前述這樣的熒光物質(zhì)，但期待可更有效地進行檢測的焚光物質(zhì)。非專利文獻l:Tyagi,S.,Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechnol.14,303-308。非專利文南大2:Nazarenko，I.A.,Bhatnagar，S.K.,Hohman，R.J.(1997)NucleicAcidsRes.25,2516-2521。非專利文獻3:Gelmini,S.,Orlando,C.，Sestini,R.，Vona,G.,Pinzani,P.,Ruocco，L.，Pazzagli，M.(1997)Clin.Chem.43,752-758。非專利文獻4:Whitcombe,D.，Theaker，J.,Guy，S.P.,B薩n，T.，Little,S.(1999)Nat.Biotechnol.17,804-807。非專利文南夫5:Biopolymers1998,46,39—51。非專利文獻6:AnalyticaChimicaActa2002,470，57-70。非專利文獻7:Chemistry-AEuropeanJournal2006,12,2270-2281。非專利文南史8:MitaniY.，LezhavaA.,KawaiY.,KikuchiT.，Oguchi-KatayamaA.,KogoY.,ItohM.，MiyagiT.etal.2007."RapidSNPdiagnosticsusingasymmetricisothermalamplificationandanewmismatch-suppressiontechnology."Nat.Methods4(3):257-262。專利文獻l:日本特許第3897926號公報專利文獻2:日本特許第3942627號公報
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供引物和成套引物、以及使用其的核酸擴增方法和變異檢測方法，其中，所述引物和成套引物用于在例如目的核酸的擴增中使用，可有效J也檢測核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)。用于解決問題的方法為了解決前述問題，本發(fā)明的引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的引物，該引物是包含至少一個下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula><image>imageseeoriginaldocumentpage24</image>(18b)式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中，B為具有天然核酸堿基(腺。票呤、鳥噤呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團，Z"和Z^分別為顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同，L1、1^2和1^分別為linker(橋原子或原子團)，主鏈長(主鏈原子數(shù))為任意，主鏈中可以分別含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主鏈中可以分別含有或不含有單鍵、雙鍵、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、1,2和1^3相互間可以相同也可以不同、D為CR、N、P、P=0、B或者SiR,R為氬原子、烷基或任意的取代基，b為單鍵、雙鍵或者三鍵，或者，前述式(16)和(16b)中，可以是L)和L2為前述linker,L3、D和b不存在，！^和L2直接與B結(jié)合，其中，式(16)、(17)和(18)中，E為前述(i)的原子團，磷酸橋中的至少一個O原子可以用S原子if又代，式(16b)、(17b)和(18b)中，E為前述(ii)的原子團，式(17)和(17b)中，各B可以相同也可以不同，各E可以相同也可以不同。本發(fā)明的成套引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的成套引物，包含一對引物，前述一對引物的至少一個引物為本發(fā)明的引物。本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒,其特征在于，其為擴增目的核酸序列的核酸擴增方法中所使用的核酸擴增用試劑盒，包含本發(fā)明的引物或成套引物另外，本發(fā)明的變異檢測用試劑盒，其特征在于，其為檢測目的核酸序列中有無變異的變異檢測方法中所使用的變異檢測用試劑盒，包含本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒。本發(fā)明的核酸擴增方法，其特征在于，其為擴增核酸試樣中的目的核酸序列的方法，包含下述(A)工序、下述(B)或(B，)工序(A)準(zhǔn)備前述核酸試才羊的工序，(B)使用本發(fā)明的引物或成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(B，)包含下述(B1，)工序和(B2，)工序的工序，(Bl，)使用引物或包含一對引物的成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(B2，)前述(Bl，)工序中擴增的單鏈體核酸序列，與探針進行雜交的工序，其中，該探針由包含至少一個前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的的標(biāo)記核酸形成。本發(fā)明的變異檢測方法，其特征在于，其為核4全測酸試樣中的目的核酸序列中有無變異的方法，包含下述(a)~(c)工序(a)通過本發(fā)明的核酸擴增方法擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(b)分別測定前述(a)工序的前后的熒光強度的工序，(c)通過比4交前述(b)工序中測定的前述(A)工序前后的熒光強度來檢測有無變異的工序。發(fā)明效果本發(fā)明的引物和本發(fā)明的成套引物為含有前述式所示的結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸，由此在用于例如目的核酸序列的擴增方法時，可有效地;險測前述目的核酸序列的擴增。另外，由于這樣可有效地檢測擴增，進一步可以優(yōu)異的靈敏度^:測目的核酸序列中有無目的變異等。本發(fā)明由于在核酸的檢測靈敏度等方面如此優(yōu)異，因此可以用于例如研究、臨床、診斷、試管內(nèi)基因檢測、生物體內(nèi)基因檢測等廣泛的用途中。圖1為示意性地示出本發(fā)明的原理的圖。圖2表示實施例的化合物的1H和13CNMR光譜。圖3表示實施例的其它化合物的^和"CNMR光譜。圖4表示提純的DNA寡聚物5，-d(CGCAATXTAACGC)-3'的MALDITOFMS譜圖。箭頭為來自提純的生成物的質(zhì)量峰(4101.9)。由分子量計算值4102.8(C134H176N52076P12)計算出的[M-Hr的計算值為4101.8,兩值一致。圖5表示DNA寡聚物5，-d(CGCAATXTAACGC)-3'和生物素衍生物的反應(yīng)生成物的MALDITOFMS語圖。箭頭為來自提純的生成物的質(zhì)量峰(4554.3)。由分子量計算值4555.4(C134H176N52076P12)計算出的[M-H]—的計算值為4554.4，兩值一致。圖6表示實施例的化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的^NMR光譜(DMSO-d6)。圖7表示圖6的化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的反相I-IPLC的圖。圖8表示圖6的化合物(用染料標(biāo)記的DNA)的MALDITOFMS譜圖。圖9表示實施例的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的UV光譜。圖10表示使用488nm的激發(fā)光的情況下，圖9的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的熒光光譜。圖ll為表示使用510nm的激發(fā)光的情況下，圖9的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的熒光光譜。圖12為表示其它實施例的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的UV光譜。圖13為表示圖12的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的熒光光傳。圖14為表示另一個實施例中的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的UV光謙。圖15為表示圖14的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的熒光光譜。圖16為表示另一個實施例中的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的UV光謙。圖17為表示圖16的熒光DNA寡聚物為單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品的熒光光譜。圖18為表示實施例中的數(shù)種熒光DNA寡聚物的吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)光光譜的圖表。圖19為表示實施例中的其它熒光DNA寡聚物的吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)光光譜的圖表。圖20為表示在各種溫度和濃度下測定實施例的熒光DNA寡聚物的吸收光語的吸收光i脊。圖21為表示實施例的熒光DNA寡聚物進行雜交的雙鏈體的CD光譜。圖22為表示實施例中的其它熒光DNA寡聚物的吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)光光譜的圖表。圖23為表示實施例中的其它熒光DNA寡聚物進行雜交形成雙鏈體時的熒光發(fā)光的圖。圖24為表示實施例中的其它熒光DNA寡聚物的吸收光譜和發(fā)光光譜的圖。圖25為表示與實施例的熒光DNA寡聚物進行雜交的RNA鏈被RNaseH消化時的熒光變化的圖。圖26為表示改變互補DNA鏈相對于實施例的熒光DNA寡聚物的濃度比來觀測熒光發(fā)光強度的變化的圖。圖27為表示參考例的印跡分析中熒光發(fā)光狀態(tài)的圖。圖28為表示將參考例的熒光DNA寡聚物導(dǎo)入細胞時的微分干涉測定照片。圖29為表示將參考例的熒光DNA寡聚物導(dǎo)入細胞時的熒光觀察時的照片。圖30為表示將圖28和圖29疊加的照片。圖31A為表示將參考例中的其它熒光DNA寡聚物導(dǎo)入細胞時的熒光觀察時的照片。圖31B為表示將參考例中的其它熒光DNA寡聚物導(dǎo)入細胞時的熒光觀察時的照片。圖32為表示將與圖28~30相同的DNA寡聚物注入細胞核后的焚光隨時間變化的圖。圖33為表示將參考例中的其它熒光DNA寡聚物導(dǎo)入細胞時的熒光觀察時的照片。圖34為表示實施例中的包含目的核酸序列的區(qū)域、各種引物的序列的圖。圖35為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表。圖36為圖35的局部放大圖。圖37為表示實施例中的包含H3N2的目的核酸序列的區(qū)域和各種引物的序列的圖。圖38為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，A為對反應(yīng)液a和b、B為對反應(yīng)液c和d分別在FAM的；皮長(492nm/516nm)禾口Cy5的〉皮長(635nm/665nm)下檢測熒光強度的結(jié)果。圖39為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，對反應(yīng)液e和f分別在FAM的波長(492nm/516nm)和Cy5的波長(635nm/665nm)下才全觀'J熒光強度的結(jié)果。圖40為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，對反應(yīng)液b、c、e和f分別在FAM的波長(492nm/516nm)和Cy5的波長(635nm/665nm)下觀'J定焚光強度的結(jié)果。圖41A為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，對反應(yīng)液i分別在FAM的波長(492nm/516nm)和Cy5的波長(635nm/665nm)下觀寸定焚光強度的結(jié)果。圖41B為表示實施例中的通過SMAP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，B為對反應(yīng)液g、h、i、j和k在FAM的波長(492nm/516nm)下測定熒光強度的結(jié)果，C為對反應(yīng)液g、h、i、j和k在Cy5的波長(635nm/665nm)下測定熒光強度的結(jié)果。圖42為表示實施例中的通過PCR法進行擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表，圖42B為實施例中的進行PCR反應(yīng)時的擴增產(chǎn)物的電泳照片。圖43為表示實施例中的融解曲線的圖表。圖44為表示實施例中的通過LAMP法進行等溫擴增反應(yīng)時的擴增概況的圖表。圖45為表示本發(fā)明的SMAP法中通過第一引物進行核酸合成的作用機理的圖。圖46為表示本發(fā)明的SMAP法中的第二引物的一個例子的圖。圖47A為表示本發(fā)明的SMAP法的作用機理的示意圖。圖47B為表示本發(fā)明的SMAP法的作用機理的示意圖。具體實施例方式下面，對本發(fā)明的實施方式進行更具體地i兌明。[引物和成套引物]如前所示，本發(fā)明的引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的引物，該引物是包含至少一個下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸。另外，這些的互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或他們的鹽，也包括在本發(fā)明的標(biāo)記核酸內(nèi)。另外，本發(fā)明的成套引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的成套引物，包含一對引物，前述一對引物的至少一個引物為本發(fā)明的引物。以下將具有顯示熒光性的原子團Z"和Z^的、下述各式所示的結(jié)構(gòu)稱為"標(biāo)記結(jié)構(gòu)"，將含有前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)的前述標(biāo)記核酸，即本發(fā)明的引物稱為"標(biāo)記引物"。本發(fā)明中，"目的核酸序列"不僅是指擴增目的的核酸序列，還包含與其互補的序列。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>(18b)式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中，B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團，Z"和Z"分別為顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同，L1、！^和I^分別為linker(橋原子或原子團)，主鏈長(主鏈原子數(shù))為任意，主鏈中可以分別含有或不含有C、N、O、S、P和Si，主鏈中可以分別含有或不含有單鍵、雙鍵、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚4建、硫醚4建和硫酯鍵，L1、L/和I^相互間可以相同也可以不同、D為CR、N、P、P=0、B或者SiR,R為氫原子、烷基或任意的取代基，b為單鍵、雙鍵或者三鍵，或者，前述式(16)和(16b)中，可以是L'和L2為前述linker,L3、D和b不存在，L1和L2直接與B結(jié)合，其中，式(16)、(17)和(18)中，E為前述(i)的原子團，磷酸橋中的至少一個O原子可以用S原子取代，式(16b)、(17b)和(18b)中，E為前述(ii)的原子團，式(17)和(17b)中，各B可以相同也可以不同，各E可以相同也可以不同。前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，L1、！^和I^的主鏈長(主鏈原子數(shù))分別優(yōu)選為2以上的整數(shù)。L1、1^和I^的主鏈長(主鏈原子數(shù))上限沒有特別限制，例如為100以下，更優(yōu)選30以下，特別優(yōu)選10以下。Z"和Z^優(yōu)選顯示激發(fā)子效果的原子團。由此，例如形成雙螺旋結(jié)構(gòu)時的熒光的增大變大，可以更有效地檢測雙螺旋結(jié)構(gòu)。其中，本發(fā)明中，Z"和Z"即使不為顯示激發(fā)子效果的原子團，另外，即使在l分子中僅導(dǎo)入l個顯示熒光性的原子團(染料)也可以有效地一全測雙螺旋結(jié)構(gòu)。Z"和Z"只要是具有熒光性的原子團即可，前述具有熒光性的原子團沒有特別限制。Z"和Z"更優(yōu)選例如各自獨立為由噻唑橙、噁唑黃、花青、半花菁、其它花青染料、曱基紅、偶氮染料或這些的衍生物衍生的基團。另外，也可以適當(dāng)應(yīng)用由其它公知的染料衍生的基團。通過與DNA等核酸結(jié)合而改變熒光強度的熒光染料已經(jīng)被報道了多種。代表性的例子已知溴乙啶嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)而顯示強的熒光，多用于DNA檢測中。另夕卜，已知芘基曱酰胺(pyrenecarboxamide)或prodan這樣的可根據(jù)微觀的極性控制熒光強度的熒光染料。另外，前述噻唑橙為苯并噻唑環(huán)和喹啉之間用次甲基連接的熒光染料，通常顯示微弱的熒光，但通過嵌入具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA可賦予強的熒光發(fā)光。此外還可列舉例如熒光黃或Cy3等染料。Z"和Z^更優(yōu)選各自獨立為下述式(7)~(9)的任意個所示的原子團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>R"(9)式(7)~(9)中，x'和x2為s或o，n為0或正的整數(shù)，r1—r10、r"r"各自獨立為氬原子、卣原子、低級烷基、低級烷氧基、硝基、或氨基，RH和R'2之中，一方為與前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中的I^或者I^結(jié)合的連接基，另一方為氫原子或低級烷基，R"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同，R"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同、Z"中的X1、X2和R11121、Z"中的X1、x2和RiR"相互間可以相同也可以不同。前述式(7)~(9)中，RiR"中前述低級烷基為碳原子數(shù)l~6的直鏈或支鏈烷基，前述低級烷氧基進一步優(yōu)選為碳原子數(shù)l~6的直鏈或支鏈烷氧基。前述式(7)~(9)中，rU和R"中，前述連接基進一步優(yōu)選為碳原子數(shù)2以上的聚亞曱基羰基(polymethylenecarbonyl)，用羰基部分與前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的Li或者L"結(jié)合。前述聚亞甲基羰基的碳原子數(shù)上限沒有特別限制，例如為100以下，優(yōu)選50以下，更優(yōu)選30以下，特別伊0選10以下。Z"和Z^為前述式(7)~(9)所示的情況下，更優(yōu)選各自獨立為式(19)或(20)所示的基團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage39</formula>式(19)和(20)中，X表示-S-或-O-。R1R10、RU和R"分別獨立表示氫原子、鹵原子、低級烷基、低級烷氧基、硝基、或氨基。R"和R^的一方表示與前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)(18)和(18b)中的I^和L2結(jié)合的連接基，R11和R"的另一方表示氫原子、或低級烷基。前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，B可以具有天然核酸石威基骨架，^旦如前所述，也可以具有人工核酸堿基骨架。例如B優(yōu)選為Py(嘧咬環(huán))、Pyder.、Pu(。票呤環(huán))、或Puder.所示的結(jié)構(gòu)。其中，前述Py是指在下述式(11)記載的6元環(huán)之中，在l位具有與E結(jié)合的共價結(jié)合臂，在5位具有與linker部結(jié)合的共價結(jié)合臂的原子團，前述Pyder.是指前述Py的6元環(huán)的全部原子的至少一個用N、C、S或O原子取代的原子團，前述N、C、S或O原子可適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基，前述Pu是指下述式(12)記載的縮合環(huán)之中，在9位具有與E結(jié)合的共價結(jié)合臂，在8位具有與linker部結(jié)合的共價結(jié)合臂的原子團，前述Puder.是指前述Pu的5元環(huán)的全部原子的至少一個用N、C、S或O原子取代的原子團，前述N、C、S或O原子可以適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基。前述標(biāo)記引物所包含的前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)的數(shù)量沒有特別的限制，例如為110個左右，優(yōu)選為120個左右。另外，前述標(biāo)記引物中，包含前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)的部位也沒有特別限制。本發(fā)明的標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)和包含其的本發(fā)明的成套引物以及后述的核酸試樣和目的核酸序列中，各核酸的基本骨架沒有特別限制，可以為例如寡聚核苷酸、修飾寡聚核苷酸、寡聚核苷、修飾寡聚核苷、多核苷酸、修飾多核苷酸、多核苷、修飾多核苷、DNA、修飾DNA、RNA、》務(wù)飾RNA、LNA、PNA(Peptidenucleicacid,肽核酸)、或這些嵌合分子的任意一個，也可以為其它結(jié)構(gòu)。另外，前述核酸的基本骨架可以為天然的，也可以為人工合成的。前述核酸，在本發(fā)明的引物或成套引物的情況下，只要可以形成例如堿基對結(jié)合即可；在核酸試樣或目的核酸序列的情況下，只要發(fā)揮例如作為互補鏈合成的模板的作用即可。因此，前述核酸例如可以部分或整體完全為由人工的結(jié)構(gòu)形成的核普酸衍生物。作為構(gòu)成前述核酸的人工堿基可列舉例如2-氨基-6-(N,N-二曱基氨基)嘌呤嘧啶-2-酮、5-曱基嘧啶-2-酮、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤、吡咯-2-曱醛、9-甲基咪唑[(4,5)-b]嘧。定、5-石典代-2-氧代-(1H)嘧啶2-氧代-(1H)嘧啶、2-氨基-6-(2-噻唑基)。票呤、7-(2-p塞吩基)-咪唑并[4，5-b]嘧啶等等，但不限于這些。作為本發(fā)明的引物，基本骨架優(yōu)選例如寡聚核苷酸、多核苷酸、DNA、這些的修飾體。本發(fā)明中"核苷酸"是指例如脫氧核糖核酸和核糖核酸的任意一種，"寡聚核苷酸"和"多核普酸"可以由例如脫氧核糖核酸和核糖核酸的任意一種構(gòu)成，也可以包含兩種。本發(fā)明中，核酸的構(gòu)成堿基數(shù)量沒有特別限制。核酸這一詞語通常與多核苷酸這一詞語同義。寡聚核普酸這一詞語通常用作表示多核苷酸之中特別是構(gòu)成堿基數(shù)少的多核苷酸的詞語。通常將例如2~100石咸基長度、更一般來說將2~50堿基長度左右的多核苷酸稱為"寡聚核苷酸"，但并不限定于該數(shù)值。多核苷酸這一詞語在本發(fā)明中也包括例如多核苷酸和寡聚核苷酸以及肽核酸、嗎啉代核酸、曱基磷酸酯核酸、S-寡聚核酸等人工合成核酸。前述肽核酸(PNA)通常具有用肽主鏈置換寡聚核苷酸的脫氧核糖主鏈的結(jié)構(gòu)。作為前述肽主鏈可列舉例如通過酰氨鍵結(jié)合的N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重復(fù)單位。作為與PNA的肽主鏈結(jié)合的堿基可列舉例如胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺噤呤、鳥嘌呤、肌苷、尿嘧啶、5-曱基胞嘧啶、硫尿嘧咬和2，6-二氨基嘌呤等天然存在的堿基、溴代胸腺嘧啶、氮雜腺噪呤和氮雜鳥。票呤等人工堿基，但不限于這些。LNA通常為糖-磷酸骨架中，核糖的2，位的氧原子和4，位的碳原子之間用亞曱基橋結(jié)合的、具有2個環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸。包含LNA的寡聚核苷酸與DNA退火時，雙鏈體的構(gòu)象發(fā)生變化，熱穩(wěn)定性上升。LNA由于與通常的寡聚核苷酸相比對核酸的結(jié)合力強，可通過例如寡聚的設(shè)計條件而成為更可靠、牢固的雜交。本發(fā)明的標(biāo)記引物通過包含至少一個具有前述的熒光性原子團的標(biāo)記結(jié)構(gòu)，與例如不含有前述熒光性原子團的未標(biāo)記核酸相比，對耙的特異性高，雜交變強。即本發(fā)明的標(biāo)記引物與例如基本骨架為相同石咸基序列且為相同核酸片革殳長的未標(biāo)記核酸相比，融解溫度(Tm值)提高。因此，可比前述未標(biāo)記核酸更牢固地與耙進行雜交。所以，通過本發(fā)明的標(biāo)記引物例如可有效、特異性高地檢測。的PNA或LAN等同樣提高Tm值，而成為提高擴增特異性的應(yīng)用技術(shù)。另外，通過使本發(fā)明的標(biāo)記引物的基本骨架為PNA或LNA,可比未標(biāo)記的PNA或LAN進一步提高Tm值，因而可進一步提高雜交的效率。特別是如后面所述，在識別l個堿基~數(shù)個堿基變異的情況下或檢測插入或缺失的情況下，使用本發(fā)明的標(biāo)記核酸(也包括例如標(biāo)記PNA、標(biāo)記LNA等)，可有效、特異性高的檢測。若將本發(fā)明的標(biāo)記核酸用作例如引物或探針，通過對耙序列是完全匹配還是錯配，Tm值的差別大、雜交效率不同。因此，l個堿基識別等變異的檢測變得更容易。另外，本發(fā)明中的標(biāo)記引物與未標(biāo)記核酸相比，Tm值變高，可應(yīng)用于例如與特定區(qū)域牢固地結(jié)合、覆蓋該區(qū)域、不能作為擴增的模板的PCRclamp法、PNAPCRclamp法、LNAPCRclamp法、PNA-LNAPCRclamp法中。本發(fā)明的引物和本發(fā)明的成套引物所包含的各引物的堿基數(shù)沒有特別限制，各引物可以為相同堿基數(shù)，也可以分別為不同的堿基數(shù)。作為前述堿基數(shù)的具體例子，因為是引物而優(yōu)選為10~100bp左右的寡聚核苷酸，進一步優(yōu)選為10~50bp左右，特別優(yōu)選為10~30bp左右。本發(fā)明的引物的序列沒有特別限制，只要具有前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)即可。另外，構(gòu)成本發(fā)明的前述一對引物的各引物的序列沒有特別限制，只要至少一個引物具有前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)即可。另夕卜，前述各引物的序列可如下設(shè)定例如根據(jù)擴增目的目的核酸序列的序列，例如DNA或RNA中的前述目的核酸序列的附近的序列信息而適當(dāng)設(shè)定，或者，根據(jù)應(yīng)用本發(fā)明的引物和成套引物的核酸擴增反應(yīng)(核酸擴增法)的種類而適當(dāng)設(shè)定。各引物的序列可通過目前^^知的方法而設(shè)定，通常，為了4吏DNA或RNA等核酸中的目的核酸序列包含在擴增產(chǎn)物中，而設(shè)計成在嚴格條件下與前迷核酸進行雜交。"嚴格條件"如下決定例如依據(jù)本發(fā)明的引物、或本發(fā)明的成套引物中的各引物和其互補鏈形成的雙鏈的融解溫度Tm(。C)、以及雜交溶液的鹽濃度等而決定。作為具體例子，可以參考J.Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis:MolecularCloning2ndedition,ColdSpringHarborLaboratory(1989)等。例如在比所使用的引物的融解溫度稍低的溫度下進行雜交時，引物可與具有目的核酸序列的核酸特異性地雜交。這樣的引物可以使用市售的引物構(gòu)建軟件例如Primer3(WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch公司生產(chǎn))等進行設(shè)計。本發(fā)明的引物(標(biāo)記核酸)可以與例如堿基序列與前述標(biāo)記核酸的i威基序列相同的的未標(biāo)記的引物(未標(biāo)記核酸)一起使用。由此可以充分抑制進行標(biāo)記導(dǎo)致的成本提高。另外，本發(fā)明的引物這樣與未標(biāo)記核酸一起使用時，也可以獲得充分的4企測靈敏度。本發(fā)明的標(biāo)記核酸與未標(biāo)記核酸的比例沒有特別限制，例如，在兩者的總計中，前述標(biāo)記核酸優(yōu)選為0.01~100%、更優(yōu)選為1~100%,進一步優(yōu)選為5~50%,特別優(yōu)選為10~50%。本發(fā)明的標(biāo)記引物，每l分子中可以僅具有1個熒光性的原子團(染料)，但優(yōu)選具有2個以上。由此，例如前述具有熒光性的原子團(染料)成為具有激發(fā)子效果。根據(jù)激發(fā)子效果，抑制例如單鏈體狀態(tài)下的焚光強度，可更有效地檢測雙螺旋結(jié)構(gòu)。另外激發(fā)子效果(excitoncoupling)是指例如多個染料并行聚集形成H締合體(H-aggregate)而基本不顯示熒光發(fā)光的效果。該效果認為因如下的原因產(chǎn)生染料的激發(fā)狀態(tài)通過Davydovsplitting分裂為2個能級，向上位能級的激發(fā)—向下位能級的內(nèi)轉(zhuǎn)換(internalconversion)—發(fā)光在熱力學(xué)上一皮禁止。其中，這些說明并不對本發(fā)明進行限制。能夠發(fā)生激發(fā)子效果，可以如下確認形成H締合體的染料的吸收帶比單一的染料的吸收帶出現(xiàn)在短波長。作為顯示這樣的效果的染料可列舉例如前述的p塞唑橙和其衍生物、噁唑黃和其衍生物、花青和其衍生物、半花菁和其衍生物、曱基紅和其衍生物、其它通常被稱為花青染料、偶氮染料的染料群。這些染料通過嵌入而易于結(jié)合到形成雙螺旋的DNA_DNA雙鏈體或DNA-RNA雙鏈體、或者碌u代磷酸酯核酸、PNA(肽核酸)、LNA(BNA)這樣的人工核酸與DNA或者RNA形成的雙鏈體上。預(yù)先將多個這樣的染料導(dǎo)入引物時，通常的單鏈體狀態(tài)(也就是雜交前僅引物的狀態(tài))下，由于激發(fā)子效果而強烈猝滅，但與目的DNA或者RNA雜交后，締合體分解，各染料隨機嵌入雙鏈體。此時染料間沒有電子的相互作用，因此不產(chǎn)生激發(fā)子效果而顯示強的熒光發(fā)光。此時的染料的吸收帶與單一的染料的吸收帶相同，表示染料間未產(chǎn)生激發(fā)子效果。另外，染料嵌入雙鏈體時，由于染料自身具有的結(jié)構(gòu)上的扭轉(zhuǎn)消失，熒光發(fā)光進一步變強。所以例如通過設(shè)計引物而使多個染料表現(xiàn)出激發(fā)子效果，可實現(xiàn)與目的序列雜交所帶來的熒光的極其明確的出現(xiàn)和消失。另外，僅僅是在引物序列上僅結(jié)合l分子染料，不會出現(xiàn)激發(fā)子效果，但是，例如由于形成雙鏈體所導(dǎo)致的染料的嵌入會使染料的結(jié)構(gòu)平坦化等，因此也可能比單鏈體時發(fā)出更強的熒光。另外，即使結(jié)合有2分子以上的染料，在各染料相隔不顯示電子相互作用的距離的情況下，不出現(xiàn)激發(fā)子效果。即，為了發(fā)揮激發(fā)子效果，2分子以上的染料必須以被配置在可以充分接近的距離這樣的方式結(jié)合在本發(fā)明的化合物或核酸的分子上。即，本發(fā)明中的標(biāo)記引物優(yōu)選在前述引物內(nèi)的一個核苷酸上結(jié)合2個以上的染料，或在連續(xù)的2個以上的核苷酸上各結(jié)合l個染料。本發(fā)明的引物和成套引物，為了例如可以提高核酸擴增的效率，可以進一步包含外引物。作為外引物，可列舉例如可以在模板核酸上，在位于目的核酸序列的外側(cè)的部分提供互補鏈合成起點的引物。本發(fā)明的成套引物包含外引物的情況下，除前述成套引物的標(biāo)記引物之外，前述外引物也為標(biāo)記核酸，或者代替前述成套引物的標(biāo)記引物，前述外引物為標(biāo)記核酸。本發(fā)明的引物和成套引物如后面所述可應(yīng)用在核酸擴增方法中，因此可以進一步包含可在核酸擴增中使用的藥品。作為前述藥品可以含有例如DNA聚合酶等聚合酶；dNTPmix(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)等底物、Tris—HC1buffer、卜，4,〉〉buffer、磷酸鈉buffer、磷酸鉀buffer等緩沖液；氯化鎂、醋酸鎂、硫酸鎂等催化劑；二曱基亞砜(dimethylsulfoxide)或氨基乙酸甜菜堿(N，N,N-trimethylglycine)等添加物；國際公開第99/54455號說明書中記載的酸性物質(zhì)、陽離子絡(luò)合物；酶穩(wěn)定劑等。作為前述酶穩(wěn)定劑沒有限制，可以列舉例如甘油、牛血清白蛋白、糖類等，其中，優(yōu)選糖類，更優(yōu)選為單糖或寡糖，更優(yōu)選為海藻糖、山梨醇、甘露醇、或這些2種以上的混合物。另外，本發(fā)明的引物和成套引物例如可以提高核酸擴增率，因此可以進一步包含融解溫度調(diào)整劑。作為前述融解溫度調(diào)整劑可列舉例如二曱基亞砜(DMSO)、氨基乙酸甜菜堿、曱酰胺或者甘油、或這些的任意的組合等，優(yōu)選DMSO。另外，在供于核酸擴增方法的核酸試樣如后所述含有RNA,將其作為模板的情況下，優(yōu)選進一步包含逆轉(zhuǎn)錄酶。另外本發(fā)明的引物和成套引物中，這些藥品的比例等沒有限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)決定。本發(fā)明的引物和成套引物可以應(yīng)用于目前/〉知的各種核酸擴增方法中，其反應(yīng)形式?jīng)]有任何限制。作為前述核酸擴增方法可列舉例如等溫擴增法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法等。下面，將等溫擴增法中所使用的本發(fā)明的引物和成套引物分別稱為"等溫擴增用引物"、"等溫擴增用成套引物"，將PCR法中所使用的本發(fā)明的引物和成套引物稱為"PCR用引物"、"PCR用成套引物"。等溫擴增用引物和成套引物前述等溫擴增法通常是指在等溫下進行核酸擴增反應(yīng)的方法。作為這樣的方法可列舉例如日本特公平7-114718號公報等中公開的鏈置換型擴增(SDA;stranddisplacementamplification)法；美國專利第5824517號說明書、國際公開第99/0921l號說明書或國際7>開第95/25180號說明書等中公開的改良SDA法；日本專利第2650159號公報等中公開的依賴核酸序歹寸的擴增(NASBA;nucleicacidsequencebasedamplification)法；國際公開第00/28082號說明書等中公開的環(huán)狀介導(dǎo)等溫擴增(LAMP;Loop-MediatedIsothermalAmplification)法；國際公開第02/16639號說明書等中公開的ICAN(IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids,等溫的和嵌合引物起始的核酸擴增)法；自主序列復(fù)制系統(tǒng)(3SR;self-sustainedsequencereplication)法；TMA(transcription-mediatedamplification,轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增)法；日本專利第2710159號公報中公開的Q卩復(fù)制酶(Q卩replicase)法；日本專利第389726號公報、專利第3942627號公報和NATUREMETHODS(Vol.4，No.3，March2007，pp.257-262)、MitaniY.,LezhavaA.,KawaiY.,KikuchiT.，Oguchi-KatayamaA.，KogoY.,ItohM.,MiyagiT.etal.2007."RapidSNPdiagnosticsusingasymmetricisothermalamplificationandanewmismatch-suppressiontechnology."Nat.Methods4(3):257-262.等中7>開的方法(下面稱、為"SMAP(SmartAmplificationProcess)法，，)、Invader法、RCA(rollingcycleamplification)法等。前述等溫擴增法的情況下，優(yōu)選使用具有鏈置換(stranddisplacement)能力(鏈置換活性)的聚合酶。因此，本發(fā)明的等溫擴增用引物和成套引物優(yōu)選包含具有鏈置換能力的聚合酶。前述具有鏈置換能力的聚合酶可以是例如常溫性、嗜溫性和耐熱性的任意一個。另外，前述具有鏈置換能力的聚合酶可以是例如天然來源的酶，也可以是通過基因工程等制備的酶，另外，還可以是人工加入變異的突變(mutant)酶。作為這樣的聚合酶優(yōu)選例如DNA聚合酶，更優(yōu)選基本不具有5'—3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。作為具有鏈置換能力的DNA聚合酶的具體例子，可歹'J舉例如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Sac/〃wWeara/Z^rmo//7,7z^;下面稱為"B.st，，)、多孑L熱芽孢桿菌(Bacz'〃wcaWWewax、下面稱為"B.ca")等嗜熱性芽孢桿菌屬細菌來源的DNA聚合酶、這些酶的5，—3'核酸外切酶活性缺失的突變體、大腸桿菌(E.coli)來源的DNA聚合酶I、其Klenow片斷等。此外，可列舉例如VentDNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶、DeepVentDNA聚合酶、DeepVent(Exo-)DNA聚合酶、029噬菌體DNA聚合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-T叫DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、PfuturboDNA聚合酶、KODDNA聚合酶、9°NmDNA聚合酶、TherminaterDNA聚合酶、AacDNA聚合酶、GcaDNA聚合酶、BsmDNA聚合酶等。作為前述具有鏈置換能力的聚合酶，優(yōu)選進一步同時具有逆轉(zhuǎn)錄活性的DNA聚合酶。作為前述DNA聚合酶可以使用例如BcaBESTDNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶等。通過這樣的DNA聚合酶可以用l種聚合酶進行例如由全RNA或者mRNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和cDNA為模板的DNA聚合酶反應(yīng)。另夕卜，可以將DNA聚合酶與MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶等前述逆轉(zhuǎn)錄酶組合使用。本發(fā)明的等溫擴增用引物和成套引物，為了可以提高例如特異性，優(yōu)選進一步包含錯配識別蛋白。作為前述錯配識別蛋白(也稱為"錯配識別蛋白質(zhì)")只要是可識別例如雙鏈核酸中的錯配并與其^"配的部位結(jié)合的蛋白質(zhì)即可，可以使用例如本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的蛋白質(zhì)。另外，前述錯配識別蛋白只要可以識別例如雙鏈核酸中的錯配，還可以是由野生型蛋白質(zhì)的氨基酸序列中l(wèi)個或多個氨基酸置換、缺失、增加和/或插入的氨基酸序列所形成的蛋白質(zhì)(突變體)。作為前述錯配識別蛋白質(zhì)，已知有例如MutS蛋白質(zhì)(例如日本特表平9-504699號公報)、MutM蛋白質(zhì)(例如日本特開2000—300265號7〉才艮)、與GFP(GreenFluorescenceProtein)結(jié)合的MutS蛋白質(zhì)(國際公開第99/06591號說明書)、TaqMutS、這些的類似物等多種物質(zhì)(Radman，M.etal"A腿.Rev.Genet.20:523-538(1986);Radaman，M.etal.，Sci.Amer.，August1988,pp40-46;Modrich,P.,J.Biol.Chem.264:6597-6600(1989);Lahue，R.S.etal.，Science245:160-164(1988);Jiricny，J.etal，.Nucl.AcidsRes.16:7843-7853(1988);Su,S.S.etal"J.Biol.Chem.263:6829-6835(1988);Lahue,R.S.etal"Mutat.Res.198:37-43(1988);Dohet,C.etal.,Mol.Gen.Gent.206:181-184(1987);Jones，M.etal"Gentics115:605-610(1987);Salmonellatyphimurium的MutS(Lu,A丄.，Genetics118:593-600(1988);HaberL.T.etal.,J.Bacterio1.170:197-202(1988);Pang，P.P.etal.，J.Bacteriol.163:1007—1015(1985));禾口PriebeS.D.etal.,J.Bacterilo.l70:190-196(1988)等)。本發(fā)明中，優(yōu)選例如MutS、MSH2、MSH6、MutH、MutL、酵母來源的錯配識別蛋白質(zhì)。另外，前述錯配識別蛋白為了防止例如與不含錯配的雙鏈核酸結(jié)合，優(yōu)選通過活化劑進行活化。前述活化劑沒有特別的限制，可列舉例如ATP(腺苷5，-三磷酸)、ADP(腺苷5，-二磷酸)、ATP-y_S(腺苷5，-O-(3-硫代三磷酸))、AMP-PNP(腺苷5，-[P，y-亞氨基]三磷酸)等，此外也可以是一個可與錯配識別蛋白結(jié)合的核苷酸?；罨赏ㄟ^例如前述錯配識別蛋白和前述活化劑在室溫下孵育數(shù)秒鐘到數(shù)分間鐘而進行。作為本發(fā)明的等溫擴增用引物和成套引物，為了防止例如前述錯配識別蛋白與單鏈體核酸結(jié)合，優(yōu)選進一步包含單鏈體結(jié)合蛋白質(zhì)(SSB)。作為前述SSB沒有特別限制，可以使用目前公知的蛋白質(zhì)。作為SSB的具體例子可列舉例如來自^c/zer/c/z/aco/,'、果蠅和非洲爪蟾的單鏈體結(jié)合蛋白質(zhì)、T4噬菌體來源的基因32蛋白質(zhì)，以及來自其它種的這些蛋白質(zhì)。這種情況下，作為前述錯配識別蛋白可列舉MutS、MutH、MutL、HexA、MSH1~6、Rep3、RNaseA、尿嘧啶-DNA糖苷酶、T4核酸內(nèi)切酶VII、解離酶等，優(yōu)選MutS、MSH2、MSH6、或這些的2種以上的混合物，更優(yōu)選MutS。作為本發(fā)明的等溫擴增用成套引物可列舉例如非對稱型的成套引物，即前述一對引物中一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)不同(下面，稱為"非對稱型成套引物")；對稱型的成套引物，即前述一對引物中一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)相同(下面，稱為"對稱型成套引物")。前述非對稱型成套引物適用于例如前述SMAP法，前述對稱型成套引物適用于LAMP法。另外，對這些非對稱型成套引物和對稱型成套引物將在后面敘述。PCR用引物和成套引物PCR法是目前廣為人知的核酸擴增方法，相對于等溫擴增方法，其為通過改變反應(yīng)溫度，進行例如雙鏈核酸的解離、解離的單鏈與引物的退火、從引物開始的核酸合成的方法。作為PCR法中所使用的聚合酶可使用例如TaqDNA聚合酶等目前公知的聚合酶。另外，相對于各種核酸擴增方法的本發(fā)明的引物和成套引物的具體例子，與本發(fā)明的核酸擴增方法合并在一起在后面敘述。另外，本發(fā)明中的標(biāo)記引物的效果，與現(xiàn)有的單鏈體狀態(tài)猝滅型熒光引物(分子信標(biāo)(molecularbeacon)等)相比，可列舉例如以下的優(yōu)點。但是，這些也是例示，均不限制本發(fā)明。(1)僅使用l種染料的情況下，合成容易。(2)本發(fā)明的DNA引物的末端為自由端的情況下，作為引物容易使用。(3)引物不必形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等特殊的高級結(jié)構(gòu)，因此不需要莖序列等與序列識別不相關(guān)的序列(沒有多余的序列，也沒有序列的約束)。(4)可以在引物的多個部位(期望的部位)導(dǎo)入熒光染料。(5)l分子中包含2個以上染料結(jié)構(gòu)的情況下，因為受染料間的位置關(guān)系的約束，S/N比(雜交前后的熒光強度比)大。本發(fā)明中的標(biāo)記引物(前述標(biāo)記核酸)可以由例如以下所示的化合物、核酸和標(biāo)記物質(zhì)來制備。這些化合物、核酸可以作為例如本發(fā)明中的前述標(biāo)記引物而使用，另外也可以作為其合成原料或者合成中間體而使用。對于本發(fā)明中的化合物、核酸和標(biāo)記物質(zhì)，更詳細為如下所述。前述化合物為具有由單核苷或單核苷酸衍生的結(jié)構(gòu)的化合物，前述結(jié)構(gòu)為下述式(1)、(lb)或(lc)所示的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或這些的鹽。(1)(lb)(lc)前述式(1)、(lb)和(lc)中，B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團，Z"和Z"分別為氫原子、保護基、或顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同，Q在E為前述(i)的原子團的情況下為O,E為前述(ii)的原子團的情況下為NH，X在E為前述(i)的原子團的情況下為氫原子、可用酸脫保護的羥基的保護基、磷酸基(單磷酸酯基)、二磷酸基(二磷酸酯基)、或三磷酸基(三磷酸酯基)，E為前述(ii)的原子團的情況下為氫原子或氨基的保護基，Y在E為前述(i)的原子團的情況下為氫原子、羥基的保護基、或亞磷酰氨基，E為前述(ii)的原子團的情況下為氫原子或保護基，L1、！7和I^分別為linker(橋原子或原子團)，主鏈長(主鏈原子數(shù))為任意，主鏈中可以分別含有或不含有C、N、O、S、P和Si，主鏈中可以分別含有或不含有單4建、雙4建、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、L2和I^相互間可以相同也可以不同、D為CR、N、P、P=0、B或者SiR,R為氫原子、烷基或任意的取代基，b為單鍵、雙4建或者三4建，或前述式(1)中，可以是L和I^為前述linker,L3、D和b不存在，1^和I^直接與B結(jié)合，前述式(lb)中，T在E為前述(i)的原子團的情況下為磷酸橋(P04_),l個以上的氧原子(0)可以用硫原子(S取代)，E為前述(ii)的原子團的情況下為NH。前述式(1)、(lb)和(lc)中，E優(yōu)選為具有例如DNA、修飾DNA、RNA、修飾DNA、LNA、或PNA(肽核酸)的主鏈結(jié)構(gòu)的原子團。另外，前述式(1)和(lc)中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>所示的原子團為下述式(2)~(4)的任意一個所示的原子團，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>前述式(lb)中，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>所示的原子團優(yōu)選下述式(2b)~(4b)的任意一個所示的原子團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula>前述式(2)~(4)和(2b)~(4b)中，A為氫原子、羥基、烷基、或吸電子基團，M和J分別為CH2、NH、O或S,可以相同也可以不同，B、X和Y分別與前述式(1)、(lb)或(lc)相同，前述式(2)、(3)、(2b)和(3b)中，磷酸橋中的l個以上O原子可以用S原子取代。從易于合成等觀點出發(fā)，E優(yōu)選例如具有DNA、修飾DNA、RNA、或修飾RNA的主鏈結(jié)構(gòu)的原子團，但也可以為具有LNA、或PNA(肽核酸)的主鏈結(jié)構(gòu)的原子團。前述式(2)和(2b)中，A中優(yōu)選例如前述烷基為曱氧基，前述吸電子基團為卣素。前述式(1)、(lb)或(lc)中，L1、L2和I^的主鏈長(主鏈原子數(shù))優(yōu)選分別為2以上的整數(shù)。L1、！/和I^的主鏈長(主鏈原子數(shù))與前述同樣地上限沒有特別限制，例如為100以下。前述化合物優(yōu)選例如下述式(5)、(6)、(6b)或(6c)所示化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或這些的鹽。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula>前述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中，1、m和n為任意，可以相同也可以不同；B、E、Z11、Z12、X、Y和T與前述式(1)和(lb)相同。前述式(5)、(6)、(6b)和(6c)中，1、m和n分別優(yōu)選為2以上的整數(shù)。1、m和n的上限沒有特別限制，例如為100以下，更優(yōu)選為30以下，特別優(yōu)選為10以下。前述化合物中，Z"和Z"優(yōu)選顯示激發(fā)子效果的原子團。由此，例如成為雙螺旋結(jié)構(gòu)時的熒光的增大大，可以更有效地檢測雙螺旋結(jié)構(gòu)。其中，前述化合物中，ZH和Z"即使不為顯示激發(fā)子效果的原子團，另外，即使在l分子中僅導(dǎo)入l個顯示熒光性的原子團(染料)，也可以有效地檢測雙螺旋結(jié)構(gòu)。z"和z"優(yōu)選例如如前所述具有熒光性的原子團。前述具有熒光性的原子團沒有特別限制。z"和z"更優(yōu)選例如各自獨立為由噻唑橙、噁唑黃、花青、半花菁、其它花青染料、甲基紅、偶氮染料或這些的衍生物衍生的基團。另外，也可以適當(dāng)應(yīng)用由其它公知的染料衍生的基團。通過與DNA等核酸結(jié)合而改變熒光強度的熒光染料已經(jīng)被報道了有多種。代表性的例子已知溴乙啶嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)而顯示強的熒光，多用于DNA檢觀'J中。另夕卜，已知芘基曱酰胺(pyrenecarboxamido)或prodan這樣的可根據(jù)微觀的極性控制熒光強度的熒光染料。另外，前述噻唑橙為用次甲基連接苯并噻唑環(huán)和喹啉環(huán)的熒光染料，通常顯示微弱的熒光，但通過嵌入具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA可賦予強的焚光發(fā)光。此外還可列舉例如熒光黃或Cy3等染料。另外，Z"和Z"更優(yōu)選各自獨立為例如下述式(7)~(9)的任意一個所示的原子團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>式(7)~(9)中，x^口x2為S或O,n為O或正的整凄史，r1r10、r"r"各自獨立為氳原子、鹵原子、低級烷基、低級烷氧基、硝基、或氨基，r"和r"之中，一方為與前述式(1)、Ub)或(lc)中的!^或者L2,前述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH結(jié)合的連接基，另一方為氫原子或低級烷基，r"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同，r"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同、Z"中的X'和r1~r21、Z"中的X^口r1~r"相互間可以相同也可以不同。式(7)~(9)中，r'r"中，前述低級烷基為碳原子數(shù)1~6的直鏈或支鏈烷基，前述低級烷氧基進一步優(yōu)選為碳原子數(shù)l~6的直鏈或支鏈烷氧基。式(7)~(9)中，r"和r"中，前述連接基進一步優(yōu)選為碳原子數(shù)2以上的聚亞曱基羰基，以羰基部分與前述式(1)、(lb)或(lc)中的I^或者L2、前述式(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH結(jié)合。前述聚亞曱基羰基的碳原子數(shù)，其上限沒有特別限制，^旦例如為100以下。Z"和Z"為前述式(7)~(9)所示情況下，更優(yōu)選例如各自獨立為式(19)或(20)所示的基團。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>(19)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage60</formula>(20)式(19)和(20)中，X!表示-S-或-O-。R1R10、R"和R"分別獨立表示氫原子、鹵原子、低級烷基、低級烷氧基、硝基、或氨基。R"和R"的一方表示與前述式(1)、(lb)或(lc)中的I^或L2、(5)、(6)、(6b)或(6c)中的NH結(jié)合的連接基，R"和R"的另一方表示氫原子、或低級烷基。前述化合物可以是具有例如下述式(10)所示的結(jié)構(gòu)的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或這些的鹽。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>式(10)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與前述式(1)相同。前述式(1)、(lb)和(lc)中，B可以具有天然核酸堿基骨架，但如前所述，也可以具有人工核酸;咸基骨架。例如B優(yōu)選為Py、Pyder.、Pu、或Puder.所示的結(jié)構(gòu)。其中，前述Py是指在下述式(11)記載的6元環(huán)之中，在l位具有與E結(jié)合的共價結(jié)合臂，在5位具有與linker部結(jié)合的共價結(jié)合臂的原子團，前述Pyder.是指前述Py的6元環(huán)的全部原子的至少一個用N、C、S或O原子取代的原子團，前述N、C、S或O原子可適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基，前述Pu是指下述式(12)記載的縮合環(huán)之中，在9位具有與E結(jié)合的共價結(jié)合臂，在8位具有與linker部結(jié)合的共價結(jié)合臂的原子團，前述Puder.是指前述Pu的5元環(huán)的全部原子的至少一個用N、C、S或O原子取代的原子團，前述N、C、S或O原子可以適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>(11)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>(12)前述化合物例如可以為下述式(13)或(14)所示化合物其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或這些的鹽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage62</formula>Pu或Puder.(14)OY前述式(13)和(14)中，E、Z11、Z12、Q、X和Y與前述式(1)相同，Py、Pyder.、Pu和Puder.如前述的定義的同樣。前述化合物具有亞磷酰氨基的情況下，前述亞磷酰氨基優(yōu)選用例如下述式(15)表示。-P(OR22)N(R23)(R24)(15)式(15)中，R^為磷酸基的保護基，R"和R"為烷基、或芳基。更優(yōu)選前述式(15)中R"為氰基乙基，R"和R"中，前述烷基為異丙基，前述芳基為苯基。前述化合物中，例如前述式(1)所示化合物可以為下述式(21)所示化合物。NH(21)式(21)中，A表示氫原子或羥基。優(yōu)選A為氫原子。B表示腺噤呤、鳥。票呤、胞嘧啶、胸腺嘧咬或尿嘧t定的殘基。例如腺噪呤和鳥。票呤以8位與雙鍵結(jié)合，胞嘧咬、胸腺嘧咬或尿嘧啶以5位與雙鍵結(jié)合。Z"和Z"各自獨立地表示顯示熒光性的原子團、氫原子或氨基的保護基，特別優(yōu)選噻唑橙衍生物、或噁唑黃衍生物的殘基。X表示氫原子、可用酸脫保護的羥基的保護基、或單磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y為氫原子、羥基的保護基、或亞磷酰氨基團。前述式(21)所示化合物更優(yōu)選例如用下述式(22)表示。(22)式(22)中，A表示氫原子或羥基。Z"和Z"各自獨立地表示顯示熒光性的原子團、氫原子或氨基的保護基，特別優(yōu)選噻唑橙衍生物、或噁唑黃衍生物的殘基。X表示氫原子、可用酸脫保護的羥基的保護基、或單磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基。Y為氬原子、羥基的保護基、或亞磷酰氨基團。前述式(21)或(22)的化合物中，Z"和Z"為氫原子或氨基的保護基團的情況下，由于一分子中具有2個氨基(或被保護的氨基)，可以利用這些氨基在一分子中導(dǎo)入2分子的標(biāo)記分子。例如通過結(jié)合熒光物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等來制造標(biāo)記核酸，可提高核酸檢測的靈敏度。進而Z"和Z"為顯示熒光性的原子團的情況下，通過用特定的焚光物質(zhì)進行標(biāo)記可簡便地進行核酸的檢測。另外，前述式(21)或(22)的化合物中，Z"和Z"為顯示熒光性的原子團的化合物是用2分子的熒光性分子例如用p塞唑橙衍生物或噁唑黃衍生物進行修飾的核香或核苷酸。由包含這樣的化合物的單鏈體核酸形成的引物通過發(fā)生激發(fā)耦合導(dǎo)致的猝滅，在僅引物的狀態(tài)下熒光極弱，但通過與DNA或RNA進行雜交而顯示強的熒光發(fā)光。即，例如噻唑橙衍生物或噁唑黃衍生物的熒光被其扭轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)強烈抑制，但噻唑橙衍生物或噁唑黃衍生物通過與DNA結(jié)合，結(jié)構(gòu)的扭轉(zhuǎn)消失并被固定化而顯示強的熒光。熒光可以通過使用例如488nm、514nm的AR激光激發(fā)而檢測，但不限于這些。前述式(l)、(lb)或(lc)所示化合物可以供于例如本發(fā)明的標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)合成中。即，前述化合物可以作為核酸的標(biāo)記物質(zhì)(核酸標(biāo)簽化藥品)而使用。例如，通過，將前述式(l)、(lb)或(lc)所示化合物作為核苷酸底物而使用，將單鏈體核酸作為模板，進行核酸合成反應(yīng)，或使用前述式(1)、(lb)或(lc)所示的化合物通過化學(xué)合成(例如使用核酸自動合成儀的亞磷酰胺法等化學(xué)合成法)合成單鏈體核酸，可以制造在一分子中包含至少l分子以上前述化合物的核酸。此時，前述原子團Z"和Z"可以分別為顯示熒光性的原子團、氫原子或保護基。前述原子團Z"和Z"如果是例如顯示熒光性的原子團，則可以制造本發(fā)明的標(biāo)記引物；如果是氫原子或保護基，進一步通過將這些原子或基團用顯示熒光性的原子團取代，則可以制造本發(fā)明的標(biāo)記引物。本發(fā)明的標(biāo)記引物所包含的前述式(1)、(lb)或(1C)的化合物的數(shù)量沒有特別的限制，但例如為1~100個左右，優(yōu)選為1-20個左右。前述化合物或核酸(本發(fā)明的標(biāo)記引物)可以具有例如下述式(23)~(25)的任意一個所示的結(jié)構(gòu)。由此，可以作為例如導(dǎo)入了染料的熒光引物而優(yōu)選使用。但是，作為熒光引物的適當(dāng)?shù)幕衔锊⒉幌抻谶@些。(23)式(23)中，堿基B上連接有2個染料(Fluo)。堿基B與linker結(jié)合的部位沒有特別限制，例如可以以嘧啶4位、5位或者6位，。票呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的一個位置與linker進行連接。Linker:具有l(wèi)個堿基連接部位，在途中分枝成2個以上，在末端與染料連接。與堿基或者染料的連接方法除使用通過對雙鍵或三4建的金屬催化反應(yīng)、成環(huán)縮合反應(yīng)、麥克爾加成反應(yīng)等形成的鍵之外、還可以使用酰氨鍵、酯4建、二石克鍵、通過亞胺形成反應(yīng)等形成的鍵。對linker來講，長度(1,m,n)自由，可以含有單鍵、雙《建、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、胺、亞胺、醚鍵、硫醚鍵、硫酯鍵等。另外，優(yōu)選不影響二聚化所引起的激發(fā)子效果。分枝部(X)為碳、硅、氮、磷、硼各原子，可以發(fā)生質(zhì)子化(protonation)(例如NH+)或氧化(例如P二O)。染料優(yōu)選使用通過二聚化而顯示激發(fā)子效果的物質(zhì)，與linker連接的部位可以是染料的任意部分。式(23)中示出了作為DNA部分結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酸，但作為替代，核酸骨架除了為核糖核酸(RNA)夕卜，還可以是2，0-曱基RNA或2，-氟DNA等糖修飾核酸、硫代磷酸酯(phosphorothioate)核S交等磷酸修飾核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。式(24)中，堿基B上連接有2個染料(Fluo)。堿基B與linker結(jié)合的部位沒有特別限制，例如可以以嘧咬4位、5位或者6位，噤呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的兩個位置與linker進行連接。2個Linker'.具有l(wèi)個堿基連接部位，以另一個末端與染料連接。與堿基或者染料的連接方法除使用通過對雙鍵或三鍵的金屬催化反應(yīng)、成環(huán)縮合反應(yīng)、麥克爾加成反應(yīng)等形成的鍵之外，還可以使用酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、通過亞胺形成反應(yīng)等形成的鍵。對linker來講，長度(1，m)自由，可以含有單鍵、雙4建、三4建、酰氨4建、酯鍵、二石克4建、胺、亞胺、醚4定、硫醚鍵、硫酯鍵等。另外，優(yōu)選不影響通過二聚化引起的激發(fā)子效果。染料優(yōu)選使用通過二聚化而顯示激發(fā)子效果的物質(zhì)，與linker連接的部位可以是染料的任意部分。式(24)中示出了作為DNA部分結(jié)構(gòu)的脫氧核糖核酸，作為替代，核酸骨架除了為核糖核酸(RNA)夕卜，還可以是2'0-甲基RNA或2，-氟DNA等糖修飾核酸、硫代磷酸酯核酸等磷酸修飾核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage68</formula>(25)式(25)中，相連的核苷酸的各堿基(B\B2)上分別連接有l(wèi)個染料(Fluo)。各堿基與linker結(jié)合的部位沒有特別限制，例如可以以嘧咬4位、5位或者6位，。票呤2位、3位、6位、7位或者8位之中的兩個位置與linker進行連接。2個Linker:具有l(wèi)個堿基連接部位，以另一個末端與染料連接。與堿基或者染料的連接方法除使用通過對雙鍵或三鍵的金屬催化反應(yīng)、成環(huán)縮合反應(yīng)、麥克爾加成反應(yīng)等形成的鍵之外，還可以使用酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、通過亞胺形成反應(yīng)等形成的鍵。對linker來講，長度(l，m)自由，可以含有單鍵、雙鍵、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、胺、亞胺、醚鍵、硫醚鍵、硫酯鍵等。另外，優(yōu)選不影響通過二聚化引起的激發(fā)子效果。染料優(yōu)選使用通過二聚化而顯示激發(fā)子效果的物質(zhì)，與linker連接的部位可以是染料的任意部分。式(25)中示出了作為DNA部分結(jié)構(gòu)的脫氧核糖-核酸，作為替代，核酸骨架除了為核糖核酸(RNA)外，還可以是2，0-曱基RNA或2，-氟DNA等糖修飾核酸、硫代磷酸酯核酸等磷酸修飾核酸、PNA或LNA(BNA)等功能性核酸。另外，在前述化合物或核酸(例如本發(fā)明的標(biāo)記核酸)存在互變異構(gòu)體或立體異構(gòu)體(例如幾何異構(gòu)體、構(gòu)象異構(gòu)體和光學(xué)異構(gòu)體)等異構(gòu)體的情況下，任意的異構(gòu)體均可在本發(fā)明中使用。另外，前述化合物或核酸的鹽可以是酸加成鹽(acidadditionsalt)也可以是堿加成鹽。進一步，形成前述酸加成鹽的酸可以是無機酸也可以是有機酸，形成前述堿加成鹽的堿可以是無機堿也可以是有機堿。作為前述無機酸沒有特別的限制，可列舉例如硫酸、磷酸、氫氟酸、鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亞氟酸、亞氯酸、亞溴酸、亞碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高石典酸等。前述有機酸也沒有特別的限制，可列舉例如對曱苯磺酸、甲基磺酸、草酸、對溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸、安息香酸和醋酸等。作為前述無機堿沒有特別的限制，可列舉例如氫氧化銨、堿金屬氫氧化物、堿土類金屬氫氧化物、碳酸鹽和碳酸氫鹽等，更具體而言，可列舉例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈣和碳酸鈣等。前述有機堿也沒有特別的限制，可列舉例如乙醇胺、三乙胺和三(羥曱基)氨基曱烷等。這些鹽的制造方法也沒有特別的限制，可用如下的方法等制造例如在前述給電子體、電子受體連接分子上，通過公知的方法將前述這樣的酸或堿適當(dāng)加成的方法。另外，取代基等存在異構(gòu)體的情況下，可以為任意異構(gòu)體，例如稱為"萘基，，的情況下可以是l-萘基也可以是2-萘基。另外，本發(fā)明中，作為烷基沒有特別的限制，可以列舉例如曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基等，結(jié)構(gòu)中包含烷基的基團(烷基氨基、烷氧基等)也同樣。另外，作為全氟烷基沒有特別的限制，可以列舉例如由曱基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基等衍生的全氟烷基，作為結(jié)構(gòu)中包含全氟烷基的基團(全氟烷基硫?；⑷驶?也同樣。本發(fā)明中，作為?；鶝]有特別的限制，可以列舉例如甲?；⒁阴；?、丙?；?、異丁酰基、戊酰基、異戊酰基、新戊?；?、己?；h(huán)戊酮基(cyclohexanoyl)、苯偶?；?、環(huán)氧基羰基等，作為結(jié)構(gòu)中包含羰基的基團(羰基氧基、烷酰氧基等)也同樣。另外，本發(fā)明中羰基的碳原子數(shù)中包括羰基碳，例如碳原子數(shù)l的烷酰基(羰基)是指曱?；＿M一步本發(fā)明中"卣素，，是指任意的卣元素，可列舉例如氟、氯、溴和碘。另外，本發(fā)明中，作為氨基的保護基沒有特別限制，可以使用例如三氟乙酰基、甲酰基、Cl6烷基-羰基(例如乙酰基、乙基羰基等)、Cl6烷基-硫羰基、叔丁基氧羰基(下面，也稱為Boc)、芐氧羰基、烯丙基氧羰基、藥基曱氧基羰基、芳基羰基(例如笨基羰基、萘基羰基等)、芳基硫羰基(例如苯基硫羰基、萘基硫羰基等)、Cl~6烷基氧-羰基(例如曱氧基羰基、乙氧基羰基等)、C7-10芳烷基-羰基(例如芐羰基等)、曱基、芳烷基(例如芐基、二苯基甲基、三苯甲基等)等。這些基團可以用1~3個鹵原子(例如氟、氯、溴等)、硝基等取代，作為其具體例子，可列舉對硝基千氧羰基、對氯千氧羰基、間氯芐氧羰基、對甲氧基芐氧羰基等。另外，作為本發(fā)明中羥基的保護基(包含可用酸脫保護的基團)沒有特別限制，可列舉例如二甲氧基三苯曱基、單曱氧基三苯曱基、Pixyl基等。作為前述化合物或核酸(本發(fā)明的標(biāo)記核酸)特別優(yōu)選例如后述實施例中記載的化學(xué)式102-106、110、113、114、116~118、120、121、122、123、124、0DN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiBl)以及這些的幾4可異構(gòu)體、立體異構(gòu)體和鹽。特別是化合物110、113、114、116~118、120、121、122、123、124、0DN1、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN6、ODN7、ODN8、ODN9、ODN10、ODN(anti4.5S)和ODN(antiBl)由于口塞唑橙和DNA以獨特的結(jié)構(gòu)共價結(jié)合，核酸檢測靈敏度等特別優(yōu)異。進一步，l分子中包含2個噻唑橙結(jié)構(gòu)的化合物U0、113、117、118、120、121、122、123、124、ODNl、ODN2、ODN3、ODN4、ODN5、ODN9、ODN(anti4.5S)和ODN(antiBl)作為單鏈體DNA熒光引物，抑制單鏈體狀態(tài)的熒光，通過與互補的DNA或RNA形成雙螺旋而使焚光強度增加而可更加有效地使用。下面，對本發(fā)明中的標(biāo)記物質(zhì)進41S兌明。以下所示的標(biāo)記物質(zhì)可以作為本發(fā)明中的標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)而使用。即，前述標(biāo)記物質(zhì)為復(fù)合體標(biāo)記物質(zhì)，其以如下所述結(jié)構(gòu)為特征性化學(xué)結(jié)構(gòu)(i)標(biāo)記物質(zhì)，其一個分子內(nèi)的兩個平面化學(xué)結(jié)構(gòu)不在同一平面內(nèi)，以某一特定的角度而存在，該分子嵌入核酸或groovebinding(溝結(jié)合)時，兩個平面化學(xué)結(jié)構(gòu)通過配置成在同一平面內(nèi)并列而產(chǎn)生熒光發(fā)光，或(ii)2個以上染料分子群形成的標(biāo)記物質(zhì)，其由于2個以上染料分子并行聚集而產(chǎn)生的激發(fā)子效果，不顯示熒光發(fā)光，但這些分子嵌入核酸或groovebinding(溝結(jié)合)時，由于前述聚集狀態(tài)解體而產(chǎn)生熒光發(fā)光，或(iii)在同一分子內(nèi)具有2個以上的染料分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其由于2個以上染料分子并行聚集而產(chǎn)生的激發(fā)子效果，不顯示熒光發(fā)光，但這些分子嵌入核酸或groovebinding(溝結(jié)合)時，由于前述聚集狀態(tài)解體而產(chǎn)生熒光發(fā)光。前述(ii)或(iii)的情況下，前述染料分子優(yōu)選前述(i)記載的分子。另外，前述(iii)的情況下，優(yōu)選在與應(yīng)被標(biāo)記的核酸結(jié)合的linker分子上具有結(jié)合2個以上染料分子的結(jié)構(gòu)，其通過另一個linker分子而成為分支結(jié)構(gòu)來進行結(jié)合，或不通過另一個linker分子而直接結(jié)合。本發(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)優(yōu)選為前述原子團Z"和Z"為顯示熒光性的原子團的前述本發(fā)明的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或這些的鹽、或前述本發(fā)明的核酸。例如，通過其為本發(fā)明的化合物或核酸中Z"和Z"為顯示激發(fā)子效果的原子團，在成為雙螺旋結(jié)構(gòu)時焚光的增大變大，可更有效地檢測雙螺旋結(jié)構(gòu)。其中，本發(fā)明的化合物或核酸中，ZH和Z"即使不為顯示激發(fā)子效果的原子團，另外，即使在l分子中僅導(dǎo)入l個顯示熒光性的原子團(染料)，也可以作為核酸等的標(biāo)記物質(zhì)而使用，可有效地;險測雙螺旋結(jié)構(gòu)。作為本發(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)的形態(tài)例如為單鏈體核酸的熒光引物的形態(tài)，但不限于此，標(biāo)記單核普酸、標(biāo)記寡聚核苷酸、雙鏈體核酸等任意的形態(tài)均可。另外，本發(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)是例如標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡聚核苷酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物的標(biāo)記物質(zhì)，是用前述(i)~(iii)的任意一個中記載的標(biāo)記物質(zhì)，或Z和Z"為顯示熒光性的原子團的前述本發(fā)明的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或者這些的鹽、或前述本發(fā)明的核酸進行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)?；蛘撸景l(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)是例如標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡聚核普酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物的標(biāo)記物質(zhì)，是通過與單核苷酸、寡聚核苷酸、核酸或核酸類似物中的一個或其以上的堿基分子或主鏈構(gòu)成分子結(jié)合的linker分子，用前述(i)~(iii)的任意一個中記載的標(biāo)記物質(zhì)、或Z"和Z12為顯示顯示焚光性的原子團的前述本發(fā)明的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或者這些的鹽、或前述本發(fā)明的核酸進4亍標(biāo)i己的標(biāo)i己物質(zhì)?；蛘?，本發(fā)明的標(biāo)記物質(zhì)是例如標(biāo)記單核苷酸、標(biāo)記寡聚核苷酸、標(biāo)記核酸或標(biāo)記核酸類似物的標(biāo)記物質(zhì)，是通過與單核苷酸、寡聚核苷酸、核酸或核酸類似物中的一個或其以上的堿基分子的嘧啶核5位的碳原子或噤呤核8位的碳原子結(jié)合的linker分子，用前述(i)~(iii)的任意一個中記載的標(biāo)記物質(zhì)、或Z"和Z"為顯示顯示熒光性的原子團的前述本發(fā)明的化合物、其互變異構(gòu)體或者立體異構(gòu)體、或者這些的鹽、或用前述本發(fā)明的核酸進行標(biāo)記的標(biāo)記物質(zhì)。[化合物和標(biāo)記引物的制造方法]本發(fā)明中，前述化合物、核酸和標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)的制造方法沒有特別限制，可以適當(dāng)使用公知的合成方法(制造方法)。作為一個例子，當(dāng)為前述式(21)所示化合物的情況下，可通過如下的制造方法進行制造，該方法包括如下的工序活化下述式(26)所示的化合物的羧基之后，使其與三(2-氨基乙基)胺反應(yīng)的工序；氨基保護工序；進行用保護基保護上述得到的化合物中存在的羥基的反應(yīng)和進行對得到的化合物中存在的羥基加成磷酸或亞磷酰氨基的反應(yīng)的工序。式(26)中，A表示氫原子或羥基。B表示腺嘌呤、鳥嘌呤、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage73</formula>(26)胞嘧咬、胸腺嘧咬或尿嘧咬的殘基。作為在本發(fā)明的化合物、核酸或標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)的制造中可應(yīng)用的制造方法(合成方法)，是例如以下的方法。即，首先作為DNA的簡便的標(biāo)簽化法，廣泛使用使DNA中的活性氨基和標(biāo)簽化劑中被活化的羧基在緩沖溶液中反應(yīng)的方法。該方法可應(yīng)用于本發(fā)明的化合物或核酸的任意一個的制造中，特別是可應(yīng)用于linker或染料的導(dǎo)入中。作為氨基的導(dǎo)入法，有利用GLENRESEARCH公司銷售的氨基Aminomodifier亞磷酰胺的方法等。前述原子團Z"和Z"例如可以由保護基變換為氫原子(脫保護基)、進一步用具有熒光性的原子團(染料)取代氫原子。脫保護基的方法沒有特別限制，可以適當(dāng)應(yīng)用公知的方法。用具有熒光性的原子團(染料)取代的方法也沒有特別限制，例如可以使Z"和Z"為氫原子的本發(fā)明的化合物或核酸與熒光性分子(染料)適當(dāng)進行反應(yīng)。例如Z"和Z"的至少一方為活性氨基時，由于與熒光性分子(染料)容易反應(yīng)而優(yōu)選，更優(yōu)選z"和z"的兩方為活性氨基。熒光性分子(染料)沒有特別限制，可以是例如前述式(7)~(9)的任意一個所示化合物(其中，R"和R^均為氫原子或者低級烷基、或羧基聚亞曱基)。另外，核酸(多核苷酸、多核苷、寡聚核苷酸或寡聚核苷)的情況下，脫保護基的工序和用具有熒光性的原子團(染料)進行取代的工序可以在聚合(核酸合成)之前或之后。例如從防止染料部分受損的觀點出發(fā)，在合成工序中優(yōu)選在聚合(核酸合成)之后導(dǎo)入具有熒光性的原子團(染料)。作為染料如前所述，沒有特別限制、可使用所有染料，優(yōu)選例如花青染料，特別優(yōu)選噻唑橙?；ㄇ嗳玖侠缡强梢杂镁哂须s原子的2個雜環(huán)以次甲基linker結(jié)合的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過改變雜環(huán)的種類、次曱基linker的長度或?qū)腚s環(huán)的取代基等，可合成各種激發(fā)波長、發(fā)光波長的熒光染料。另外，用于DNA導(dǎo)入的linker導(dǎo)入也比較容易。另外瘞唑橙在水中基本不發(fā)出熒光，但通過與DNA或RNA相互作用而發(fā)出強的焚光。認為通過與核酸的相互作用可抑制染料分子間的相互作用，且可抑制染料分子的2個雜環(huán)之間的次曱基linker附近的旋轉(zhuǎn)，這關(guān)系到熒光強度的增加。另外噻唑橙染料的使用方法為已知、例如可參考H.SRye,M.A.Quesada,K.Peck,R.A.MathiesandA.N.Glazer，High-sensitivitytwo-colordetectionofdouble-strandedDNAwithaconfocalfluorescencegelscannerusingethidiumhomodimerandthiazoleorange,NucleicAcidsRes.，1991,19，327-33;和L.G.Lee,C.H.ChenandL.A.Chiu,Thiazoleorange:anewdyeforreticulocyteanalysis,Cytometry,1986，7,508-17來使用。本發(fā)明中，前述化合物、核酸或標(biāo)記引物(標(biāo)記核酸)的基本骨架，如前所述沒有特別限制，可以是例如寡聚核苷酸、修飾寡聚核苷酸、寡聚核苷、修飾寡聚核苷、多核苷酸、修飾多核苷酸、多核苷、修飾多核苷、DNA、修飾DNA、RNA、修飾RNA、LNA、或PNA(肽核酸)的任意一個，也可以是其它結(jié)構(gòu)。以DNA、4務(wù)飾DNA、RNA、或修飾RNA為基本骨架時，容易合成、用染料的置換(染料分子的導(dǎo)入)等也容易進行，故優(yōu)選。在LNA或PNA中導(dǎo)入染料分子的方法沒有特別限制，可以適當(dāng)應(yīng)用7>知的方法。具體而言，可以參考例如AnalyticalBiochemistry2000,281,26-35.Svanvik,N.,Westman，G.,Wang,D.,Kubista,M.(2000)AnalBiochem.281,26-35.Hrdlicka，P.J.，Babu,B.R.,Sorensen，M.D.，Harrit,N.,Wengel,J.(2005)J.Am.Chem.Soc.127,13293-〗3299.等。以寡聚核苷酸、修飾寡聚核苷酸、寡聚核苷、修飾寡聚核苷、多核苷酸、修飾多核苷酸、多核苷、修飾多核苷、DNA、修飾DNA、RNA、或〗務(wù)飾RNA為基本骨架的核酸合成方法是已知的，可通過例如所謂的亞磷酰胺法等合成。其原料即亞磷酰胺藥品可以用^^知的方法簡單地合成。在本發(fā)明的核酸為DNA特別是短的寡聚DNA的情況下，例如可用DNA自動合成儀等簡單地合成。另外，例如通過PCR等，也可以合成長鏈狀的核酸(DNA)等。DNA和染料分子的結(jié)合部位如前所述沒有特別限制，但特別優(yōu)選例如胸苷的5位。已知從胸苷的5位伸出各種取代基的核苷酸衍生物的三磷酸通過DNA聚合酶的導(dǎo)入效率比較好。由此，例如不僅在本發(fā)明的核酸為短的寡聚DNA的情況下可簡單合成，其為長鏈DNA的情況下也可簡單合成。特別是，例如利用噻唑橙的為單鏈體DNA的本發(fā)明的熒光引物(標(biāo)記核酸)具有如下優(yōu)點例如，(1)i"義對例如用DNA自動合成儀合成的DNA，在緩沖溶液中加入染料即可制備，可容易地合成；(2)通過使酶制備的長鏈DNA和染料反應(yīng)，還可制備長鏈的熒光引物，等。另外，可以用例如500nm附近的較長波長的光激發(fā)。本發(fā)明的成套引物可以含有例如具有4企測波長不同的熒光性原子團的2種以上的本發(fā)明的標(biāo)記引物。作為用于對2種以上的目的核酸序列分別擴增的引物，若同時使用具有不同的熒光性原子團的本發(fā)明的標(biāo)記引物，就可以在同一反應(yīng)液中進行擴增，且可用各焚光性原子團相應(yīng)的檢測波長下來檢測各目的核酸序列的擴增。本發(fā)明的成套引物在以檢測目的核酸序列中的變異部位為目的情況下，優(yōu)選包含例如具有與前述目的核酸序列中包含變異部位的區(qū)域完全互補的序列的引物、具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物。將完全互補的引物稱為完全匹配引物，將與除變異部位以外互補的引物稱為錯配引物。本發(fā)明中，錯配引物可以是例如除變異部位以外，進而除數(shù)個堿基以外互補的序列(以下同樣)。這樣，通過使錯配引物共存，可抑制例如完全匹配引物與模板中的錯配區(qū)域進行雜交，使更高特異性的擴增成為可能。[核酸擴增方法]本發(fā)明的核酸擴增方法是以下的第一核酸擴增方法和第二核酸擴增方法。(1)第一核酸擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的第一核酸擴增方法，其特征在于，其為擴增核酸試樣中的目的核酸序列的方法，包含下述(A)和(B)工序，(A)準(zhǔn)備前述核酸試樣的工序，(B)使用本發(fā)明的引物或本發(fā)明的成套引物，擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序。本發(fā)明的核酸擴增方法只要使用本發(fā)明的標(biāo)記引物、或包含其的本發(fā)明的成套引物即可，其它條件和工序沒有任何限制。核酸擴增的條件等可根據(jù)例如采用的核酸擴增法的種類、擴增目的目的核酸序列的序列信息等適當(dāng)設(shè)定。根據(jù)本發(fā)明的核酸擴增方法，由于使用本發(fā)明的標(biāo)記引物、或包含其的本發(fā)明的成套引物，可^U全測例如斗亥酸擴增反應(yīng)液的熒光強度來判斷目的核酸序列有無擴增。這是由于例如以下這樣的理由。由于引物與包含目的核酸序列的DNA或RNA等雜交時，形成雙鏈體核酸，前述標(biāo)記引物的原子團(染料)嵌入或溝結(jié)合到前述雙鏈核酸上。此時，由于不產(chǎn)生例如前述這樣的前述原子團(染料)的激發(fā)子效果，前述原子團產(chǎn)生熒光發(fā)光。另一方面，未雜交的情況下，由于產(chǎn)生激發(fā)子效果，前述原子團不產(chǎn)生熒光發(fā)光。因此，例如引物不與模板雜交的情況下，或不發(fā)生擴增的情況下，不能發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生熒光發(fā)光的原子團或產(chǎn)生熒光發(fā)光的原子團不增加。所以，若檢測熒光強度，其增加的情況下可判斷為目的核酸序列進行了擴增，非增加的情況下可判斷為目的核酸序列未擴增。擴增的目的核酸序列的檢測方法可通過例如圖l示意性地表示。該圖(A)(左側(cè)的記為"Non-Hybrid"的圖)表示由于激發(fā)子效果而猝滅的引物，該圖(B)(右側(cè)的記為"Hybrid"的圖)表示由于雙鏈體形成而嵌入，進行熒光發(fā)光的引物。圖中，符號l表示本發(fā)明的引物(熒光引物)。2表示顯示熒光性的原子團(染料)。l，表示引物(熒光引物)l的互補鏈。3表示由l和l，形成的雙鏈體核酸。另外，圖的上部為電子遷移圖。"Allowed"表示允許躍遷。"Forbidden"表示禁阻躍遷。"Emissive"表示可熒光發(fā)光。"Non-emissive"表示理論上不能熒光發(fā)光。即認為單鏈體狀態(tài)下(圖l(A)),基態(tài)狀態(tài)的染料2進行締合，根據(jù)激發(fā)耦合理論而相互作用，前述染料締合體的激發(fā)狀態(tài)分離成2個能級，從而抑制發(fā)光。從低能級的發(fā)光在理論上禁阻，締合體的單重態(tài)激發(fā)態(tài)停留在低發(fā)射狀態(tài)。另一方面，雜交形成雙鏈體時(圖1(B)),染料2嵌入或溝結(jié)合到雙鏈體核酸3，激發(fā)耦合消失而產(chǎn)生熒光。其中，圖l是示意性地表示本發(fā)明的目的核酸的檢測機理的一例的示意圖，本發(fā)明不受示意圖l和其說明任何限制。激發(fā)子效果中，通過控制2個染料間的距離而可以控制熒光發(fā)光。通過將該系統(tǒng)安裝到用于判斷序列的DNA上，可以得到序列選擇性熒光發(fā)光。本發(fā)明的核酸擴增方法、核酸檢測方法、變異檢測方法或試劑盒中，通過從例如試樣的下方照射可見光，可進行雜交的檢測，即使用目視也可以明確判斷。另外，本發(fā)明中，可在例如熒光單元、微板塊、凝膠、毛細管、塑料管等容器中觀察雜交。進一步，本發(fā)明中可以從例如與目的核酸混合后馬上觀測雜交。焚光強度的檢測可以與例如前述(B)工序的核酸擴增反應(yīng)同時進4亍，可連續(xù)或間歇地進行，也可以在前述(B)工序結(jié)束后進行。在前述(B)工序的反應(yīng)結(jié)束后進行的情況下，優(yōu)選合并作為背景，在前述(B)工序的反應(yīng)開始前也進行檢測。熒光強度的#r測可以通過例如向反應(yīng)液照射可見光來進行，可在熒光單元、微板塊、凝膠、毛細管、塑料管等容器中進行觀察。另外，熒光強度的檢測可以以目視進行，也可以使用例如realtimePCR裝置等市售的焚光測定儀等來進行。作為前述核酸試樣，可列舉例如包含DNA或RNA的試樣。前述DNA可以是例如基因組DNA、cDNA和合成DNA的任意一個。RNA可以是例如總RNA、mRNA、rRNA、siRNA、hnRNA、合成RNA、已剪接RNA、未剪接(unspliced)RNA的任意一個。這些核酸可以由例如血液、組織、細胞等生體來源試樣，從食品、土壤、排水等分離的微生物來源試樣來制備。另外，前述生體來源試樣可列舉例如動物、植物等。另外，核酸試樣的制備方法沒有特別限制，可通過目前公知的方法進行。作為具體例子可列舉例如通過表面活化劑的溶解處理、聲波處理、使用玻璃珠等的振蕩攪拌、使用Frenchpress的方法等。另外，在存在內(nèi)源性核酸酶的情況下，優(yōu)選將分離的核酸進行提純。核酸的提純可以通過例如苯酚抽提、層析、離子交換、凝膠電泳、密度梯度離心等來進行。本發(fā)明的核酸擴增方法中，前述(B)工序中可以使用例如具有檢測波長不同的2種以上熒光性原子團的本發(fā)明的標(biāo)記引物。具體而言，擴增2種以上的目的核酸序列的情況下，作為用于分別擴增各目的核酸序列的引物，優(yōu)選同時使用具有不同的熒光性的原子團的2種以上的本發(fā)明的標(biāo)記引物。由此，例如可以以同一反應(yīng)液進行2種以上的目的核酸序列的擴增，且可在與各熒光性原子團相應(yīng)的檢測波長下，檢測各目的核酸序列的擴增。本發(fā)明的核酸擴增反應(yīng)，在以檢測目的核酸序列中的變異部位為目的進行擴增的情況下，例如前述(b)工序中優(yōu)選使用例如具有與前述目的核酸序列中包含變異部位的區(qū)域完全互補的序列的本發(fā)明的標(biāo)記引物(標(biāo)記完全匹配引物)、具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物(錯配引物)。這樣，通過使錯配引物共存，可抑制例如完全匹配引物與模板中的錯配區(qū)域進行雜交，使更高特異性的擴增成為可能。前述錯配引物例如可以是未標(biāo)記引物，也可以是本發(fā)明的標(biāo)記引物。本發(fā)明的核酸擴增方法，如前所述，在應(yīng)用的核酸擴增反應(yīng)的形式上沒有限制、可應(yīng)用于例如SDA法、改良SDA法、NASBA法、LAMP法、ICAN法、自主序列復(fù)制系統(tǒng)法、TMA法、Q卩復(fù)制酶法、SMAP法等的等溫擴增法、PCR法等。下面，將使用等溫擴增法的本發(fā)明的核酸擴增方法稱為"本發(fā)明的等溫擴增法"，將使用PCR的本發(fā)明的核酸擴增方法稱為"本發(fā)明的PCR法"。等溫擴增法本發(fā)明的等溫擴增法如前所述是在等溫下進行核酸擴增的方法。前述(B)工序的核酸擴增反應(yīng)的條件沒有特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)決定。反應(yīng)溫度優(yōu)選設(shè)定為例如引物的融解溫度(Tm)附近的溫度或其以下，進而考慮引物的融解溫度(Tm),優(yōu)選設(shè)定嚴格的水平。作為反應(yīng)溫度的具體例子例如為約2(TC~約75。C,優(yōu)選約35。C~約65。C。對本發(fā)明的等溫擴增方法，列舉使用前述這樣的非對稱型成套引物的方法、使用對稱型成套引物的方法的例子進行說明。另外本發(fā)明不限于此。SMAP法核酸擴增方法中，SMAP法例如可以以優(yōu)異的特異性擴增目的核酸序列，因此通過基因擴增可以判斷例如基因中的變異、特別是有無一個堿基變異、有無堿基的缺失或插入等。因此，可以說通過應(yīng)用本發(fā)明的成套引物，例如可實施更高靈敏度且高精度的SMAP法。前述非對稱型的成套引物，如前所示是具有一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)不同的非對稱型的一對引物的成套引物，其中，優(yōu)選應(yīng)用于前述SMAP法。下面，^!尋該成套引物稱為"SMAP用成套引物"。作為前述SMAP用成套引物的具體例子，例如非對稱型的一對引物包含第一引物和第二引物，前述第一引物，在3，末端部分包含與目的核酸序列的3，末端部分的序列(A)雜交的序列(Ac，)，且在前述序列(Ac，)的5，側(cè)包含序列(B，)，該序列(B，)與在前述目的核酸序列中比前述序列(A)更靠近5，側(cè)的序列(B)的互補序列(Bc)雜交，前述第二引物，在3，末端部分包含與前述目的核酸序列的互補序列的3，末端部分的序列(C)雜交的序列(Cc，)，且在前述序列(Cc，)的5，側(cè)包含折疊序列(D-Dc，)，該折疊序列(D-Dc，)在同一鏈上含有相互雜交的2個核酸序列。利用第一引物進行的核酸合成的作用機理在圖45中示意地示出。首先，決定作為模板的核酸中的目的核酸序列，決定其目的核酸序列的3，末端部分的序列(A)和比序列(A)更靠近5，側(cè)的序列(B)。第一引物包含序列(Ac，)而形成，進而在其5，側(cè)包含序列(B')。序列(Ac')為與序列(A)雜交的序列，序列(B，)為與序列(B)的互補序列(Be)雜交的序列。在此，第一引物在前述序列(Ac，)和前述序列(B，)之間，可以包含對反應(yīng)沒有影響的插入序列。這樣的引物與模板核酸退火時，成為引物中的序列(Ac，)與目的核酸序列的序列(A)雜交的狀態(tài)(圖45(a))。以該狀態(tài)發(fā)生引物延伸反應(yīng)時，可合成包含目的核酸序列的互補序列的核酸。且在合成的核酸的5，末端側(cè)存在的序列(B，)與該核酸中存在的序列(Bc)雜交，由此在合成的核酸的5，末端部分形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。其結(jié)果，模板核酸上的序列(A)成為單鏈體，具有與前面的第一引物相同的序列的其它引物與該部分雜交(圖45(b))。然后通過鏈置換反應(yīng)，發(fā)生從新雜交的第一引物開始的延伸反應(yīng)，同時先前合成的核酸從模板核酸分離(圖45(c))。上述的作用機理中，序列(B，)與序列(Bc)雜交的現(xiàn)象，代表性的是由于在同一鏈上存在互補區(qū)域而發(fā)生雜交。通常雙鏈體核酸解離成單鏈體時，從其末端或這以外的較不穩(wěn)定的部分開始部分地解離。上述通過第一引物的延伸反應(yīng)中生成的雙鏈體核酸在較高溫度下，末端部分的堿基對處于解離和結(jié)合的平衡狀態(tài)、整體上保持雙鏈體。這樣的狀態(tài)下，在同一鏈上存在末端解離的、部分互補的序列時，作為亞穩(wěn)定狀態(tài)，可形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。該莖環(huán)結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定地存在，相同的其它引物與通過該結(jié)構(gòu)的形成而脫落的互補鏈部分(模板核酸上的序列(A))結(jié)合，立即通過聚合酶進行延伸反應(yīng)，由此先前合成的鏈被置換而游離，同時可以生成新的雙鏈體核酸。本發(fā)明的優(yōu)選方式中的第一引物的設(shè)計基準(zhǔn)如下。首先，為了在通過引物的延伸合成模板核酸的互補鏈之后，新的引物有效與該模板核酸退火，通過合成的互補鏈的5，末端形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)而使模板核酸上的前述序列(A)的部分成為單鏈體是必須的。因此序歹'j(Ac，)的堿基數(shù)X與目的核酸序列中的夾在前述序列(A)和前述序列(B)中的區(qū)域的石咸基數(shù)Y之差(X-Y)相對于X的比例(X-Y)/X變得重要。其中，在模板核酸上，比序列(A)更靠近5，側(cè)的、到與引物的雜交無關(guān)的部分不必成為單鏈體。另外，為了新的引物有效與模板核酸退火，必須有效形成上述的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。且對于有效形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、即有效地使序列(B，)和序列(Bc)雜交來說，前述序列(B，)和前述序列(Bc)之間的距離(X+Y)變得重要。通常用于引物延伸反應(yīng)的最適溫度最高為72。C附近，在這樣低的溫度下，延伸鏈較難在長的區(qū)域內(nèi)解離。所以認為為了使序列(B，)與序列(Bc)有效進行雜交，兩序列之間的堿基數(shù)優(yōu)選為少。另一方面，認為為了序列(B，)與序列(Bc)雜交，模板核酸上的前述序列(A)的部分成為單鏈體，則序列(B，)和序列(Bc)之間的堿基數(shù)優(yōu)選為多。從以上這樣的觀點出發(fā)，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的前述第一引物，在構(gòu)成引物的序列(Ac')和序列(B')之間不存在插入序列的情況下，設(shè)計為使(X-Y)/X例如為-l.OO以上，優(yōu)選為0.00以上，進一步優(yōu)選為0.05以上，進一步優(yōu)選為0.10以上；另夕卜，(X-Y)/X例如為l.OO以下，優(yōu)選為0.75以下，進一步優(yōu)選為0.50以下，進一步優(yōu)選為0.25以下。進一步(X+Y)優(yōu)選為15以上，進一步優(yōu)選為20以上，進一步優(yōu)選為30以上；另夕卜，優(yōu)選為50以下，進一步優(yōu)選為48以下，進一步優(yōu)選為42以下。另外，構(gòu)成引物的序列(Ac)和序列(B')之間存在插入序列(堿基數(shù)為Y，)的情況下，本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的前述第一引物設(shè)計為使(X-(Y-Y，)}/X例如為-l.OO以上，優(yōu)選為0.00以上，進一步優(yōu)選為0.05以上，進一步優(yōu)選為0.10以上；另外，(X-(Y-Y，)}/X例如為l.OO以下，優(yōu)選為0.75以下，進一步優(yōu)選為0.50以下，進一步優(yōu)選為0.25以下。進一步(X十Y+Y，)優(yōu)選為15以上，進一步優(yōu)選為20以上，進一步優(yōu)選為30以上；另外，優(yōu)選為100以下，進一步優(yōu)選為75以下，進一步優(yōu)選為50以下。前述第一引物為在賦予的條件下可維持必要的特異性，同時具有可與目的核酸的堿基對結(jié)合的左右的鏈長。該引物的鏈長優(yōu)選為15~IOO核苷酸，更優(yōu)選為20~60核苷酸。另外，構(gòu)成前述第一引物的序列(Ac')和序列(B')的長度分別為優(yōu)選為5~50核苷酸、更優(yōu)選為730核苷酸。另外，根據(jù)需要，序列(Ac，)和序列(B，)之間，可以插入不影響反應(yīng)的插入序列(interveningsequence)。本發(fā)明的成套引物所包含的第二引物，如上所述，在3，末端部分包含與前述目的核酸序列的互補序列(對第一引物雜交的鏈來說為相反側(cè)的鏈)的3，末端部分的序列(C)雜交的序列(Cc，)而構(gòu)成，且在前述序列(Cc，)的5，側(cè)包含折疊序列(D-Dc，)，該折疊序列(D-Dc，)在同一鏈上含有相互雜交的2個核酸序列。這樣的第二引物的結(jié)構(gòu)例如如圖46所示，^旦并不限定于圖46所示的序列或核苷酸數(shù)。構(gòu)成第二引物的序列(Cc')的長度優(yōu)選為550核苷酸、更優(yōu)選為10~30核苷酸。另外，前述折疊序列(D-Dc，)的長度優(yōu)選為2~IOOO核苷酸、更優(yōu)選為2~100核苷酸、進一步優(yōu)選為4~60核苷酸、進一步優(yōu)選為6~40核苷酸，通過折疊序列的內(nèi)部雜交而形成的；威基對的核苷酸數(shù)優(yōu)選為2-500bp，更優(yōu)選為250bp,進一步優(yōu)選為2~30bp,進一步優(yōu)選為3-20bp。折疊序列(D-Dc，)的核苷酸序列以是所有的序列，沒有特別限定，但優(yōu)選為不與目的核酸序列雜交的序列。另外，根據(jù)需要，序列(Cc，)和折疊序列(D-Dc，)之間，可以插入不影響反應(yīng)的插入序列。使用圖47(圖47A和圖47B)對這些第一引物和第二引物的核酸擴增反應(yīng)所考慮的作用機理進行說明。另外，為了簡化說明圖47中進行雜交的2個序列設(shè)為相互互補的序列，但本發(fā)明并不受此限定。首先，第一引物與目的核酸的有義鏈雜交，發(fā)生該引物的延伸反應(yīng)(圖47A(a))。接著，在延伸鏈(-)上形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，新的第一引物與由此成為單鏈體的目的核酸有義鏈上的序列(A)進行雜交(圖47A(b)),發(fā)生該引物的延伸反應(yīng)，先前合成的延伸鏈(-)脫離。接著，第二引物與脫離的延伸鏈(-)上的序列(C)雜交(圖47A(c))，發(fā)生該引物的延伸反應(yīng)而合成延伸鏈(+)(圖47A(d))。在生成的延伸鏈(+)的3，末端和延伸鏈(-)的5，末端形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(圖47A(e))，從游離型的3，末端即延伸鏈(+)的環(huán)前端發(fā)生延伸反應(yīng)，同時前述延伸鏈(-)脫離(圖47A(f))。通過從環(huán)前端的前述延伸反應(yīng)，生成發(fā)夾型雙鏈體核酸，該發(fā)夾型雙鏈體核酸是延伸鏈(-)夾著序列(A)和序列(Bc)與延伸鏈(+)的3，側(cè)結(jié)合而形成的，第一引物與該序列(A)和序列(Bc)雜交(圖47A(g)),通過該延伸反應(yīng)生成延伸鏈(-)(圖47A(h)和(i))。另外，通過前述發(fā)夾型雙鏈體核酸的3'末端存在的折疊序列來提供游離型的3'末端(圖47A(h)),通過由此開始的的延伸反應(yīng)(圖47B(i)),生成在兩端具有折疊序列、夾著來自于第一和第二引物的序列而交互包含延伸鏈(+)和延伸鏈(-)的單鏈體核酸(圖47B(j))。由于該單鏈體核酸通過其3，末端存在的折疊序列來提供游離型的3，末端(互補鏈合成起點)(圖47B(k)),反復(fù)進行同樣的延伸反應(yīng)，每1次延伸反應(yīng)鏈長變?yōu)?倍(圖47B(1)和(m))。另外，圖47B(i)中，從脫離的第一引物開始的延伸鏈(-)通過其3，末端存在的折疊序列提供游離型的3，末端(互補鏈合成起點)(圖47B(n)),通過由此開始的延伸反應(yīng)在兩端形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，生成夾著來自于引物的序列而交互包含延伸鏈(+)和延伸鏈(-)的單鏈體核酸(圖47B(o))。該單鏈體核酸中，通過3，末端的成環(huán)依次提供互補鏈合成起點，因此不斷地發(fā)生由此開始的延伸反應(yīng)。這樣自動延長的單鏈體核酸在延伸鏈(+)和延伸鏈(-)之間包含來自于第一引物和第二引物的增目的核酸的有義鏈和反義鏈。另外，本發(fā)明的SMAP用成套引物除第一引物和第二引物以外，還可以包含第三引物。前述第三引物例如為與前述目的核酸序列或其互補序列雜交，且對目的核酸序列或其互補序列的雜交與其它引物不竟?fàn)幍囊铩１景l(fā)明中"不竟?fàn)?是指該引物與目的核酸進行雜交不妨礙其它引物的互補鏈合成起點的付與。通過第一引物和第二引物擴增目的核酸序列的情況下，如上所述，擴增產(chǎn)物為交互具有目的核酸序列和其互補序列的序列。其擴增產(chǎn)物的3，末端存在折疊序列或環(huán)結(jié)構(gòu)、由此，由提供的互補鏈合成起點不斷發(fā)生延伸反應(yīng)。第三引物在這樣的擴增產(chǎn)物部分成為單鏈體的狀態(tài)時，優(yōu)選可與存在于其單鏈體部分的目的序列進行退火的引物。由此，在擴增產(chǎn)物中的目的核酸序列內(nèi)提供新的互補鏈合成起點，發(fā)生由此開始的的延伸反應(yīng)，因此核酸擴增反應(yīng)能更迅速地進行。前述第三引物沒有限制，可以是l種，例如為了提高核酸擴增反應(yīng)的迅速性和特異性，也可以同時使用2種以上的第三引物。這些第三引物例如由與代表性的第一引物和第二引物不同的序列構(gòu)成，只要與這些的引物不竟?fàn)?，也可以在部分重疊區(qū)域進行雜交。第三引物的鏈長優(yōu)選為2100核苷酸、更優(yōu)選為5~50核苷酸、進一步優(yōu)選為730核苷酸。前述第三引物其主要目的在于發(fā)揮用于使例如第一引物和第二引物的核酸擴增反應(yīng)更迅速地進行的輔助作用。所以前述第三引物優(yōu)選具有比第一引物和第二引物各自的3，末端的Tm低的Tm的序列。另外，第三引物向擴增反應(yīng)液的添加量優(yōu)選例如比第一引物和第二引物各自的添加量少。作為前述第三引物可以列舉例如國際公開第02/24902號說明書中記載這樣的、以具有可形成環(huán)的結(jié)構(gòu)的序列為模板，在其環(huán)部分可賦予互補《連合成的起點的序列，j旦不限于此。即例如只要是目的核酸序列內(nèi)，在任意部位提供互補鏈合成起點均可。前述SMAP用成套引物中，例如前述第一引物和前述第二引物的4壬意一方或前述兩方的引物可以是前述標(biāo)記核酸，前述第三引物也可以是前述標(biāo)記核酸。另外，也可以是第一引物和第二引物的任意一方或者兩方和第三引物均為前述標(biāo)記核酸。另外，在例如后述的變異檢測方法中應(yīng)用本發(fā)明的SMAP法的情況下，優(yōu)選前述SMAP用引物如下進行i殳計。即前述SMAP用成套引物優(yōu)選如下設(shè)計；將在目的部位具有變異的核酸序列(下面，"稱為變異型核酸序列")或在前述目的部位不具有變異的核酸序列(下面，稱為"野生型核酸序列")作為目的核酸序列，產(chǎn)生目的變異的部位包含于序列(A)、序列(B)或者序列(C)或配置于序列(A)和序列(B)之間、序列(A)和序列(C)之間。作為前述成套引物，使用將在目的部位具有變異的核酸序列(變異型序列)作為目的核酸序列而設(shè)計的成套引物的情況下，例如核酸擴增反應(yīng)后存在擴增產(chǎn)物則表示變異型序列存在，不存在擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物減少則表示變異型序列不存在。另一方面，使用將在目的部位不具有變異的核酸序列(野生型序列)作為目的核酸序列而設(shè)計的成套引物的情況下，例如核酸擴增反應(yīng)后存在擴增產(chǎn)物則表示變異型序列不存在，不存在擴增產(chǎn)物或擴增產(chǎn)物減少則表示變異型序列存在。在此"擴增產(chǎn)物減少"是指得到的擴增產(chǎn)物的量比核酸試樣中存在目的核酸序列的情況下得到的擴增產(chǎn)物的量減少。作為前述成套引物，優(yōu)選例如使前述目的部位包含于前述序列(A)而設(shè)計的成套引物。只要是這樣的成套引物，例如在核酸試樣中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中，由于第一引物與序列(A)進行退火而得到擴增產(chǎn)物。另一方面，核酸試樣中包含與前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如變異型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中，第一引物難以與序列(A)退火，因此得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。第一引物所包含的序列(Ac，)優(yōu)選與前述序列(A)互補的序列。另外，作為前述成套引物，優(yōu)選例如前述目的部位包含于前述序列(C)而設(shè)計的成套引物。只要是這樣的成套引物，例如在核酸試樣中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中，由于第二引物與序列(C)進行退火得到擴增產(chǎn)物。另一方面，核酸試樣中包含與前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如變異型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中，第二引物難以與序列(C)退火，因此得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。第二引物所包含的序列(Cc')優(yōu)選與前述序列(C)互補的序列。另外，作為前述引物，優(yōu)選例如前述目的部位包含前述序列(B)而設(shè)計的成套引物。只要是這樣的成套引物，例如核酸試樣中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中第一引物與序列(A)退火、進行延伸反應(yīng)后，前述引物所包含的序列(B，)與延伸鏈上的序列(Be)進行雜交。因此，可有效地形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。通過該莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的有效形成，其它的第一引物可與模板退火，前述的圖45所示的作用機理可有效地進行而得到擴增產(chǎn)物。另一方面，核酸試樣中包含與前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如變異型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中的前述莖_環(huán)結(jié)構(gòu)的形成較難，因而阻礙前述圖45所示的作用機理而得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。另外，第一引物所包含的序列(B，)優(yōu)選與前述序列(b)相同的序列。另外，作為前述成套引物，優(yōu)選例如前述目的部位配置于前述序列(A)和前述序列(b)之間而i殳計的成套引物。通過這樣的成套引物，在核酸試樣中包含目的核酸序列(例如野生型序列)的情況下，核酸擴增反應(yīng)中，第一引物與序列(A)退火、進行延伸反應(yīng)后，前述引物所包含的序列(B，)與延伸鏈上的序列(Bc)雜交而有效地形成莖_環(huán)結(jié)構(gòu)。通過該莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的有效形成，其它的第一引物可與模板退火，前述圖45所示的作用機理有效地進行而得到擴增產(chǎn)物。另一方面，在核酸試樣中包含與前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如變異型序列)的情況下，第一引物所包含的序列(B，)和延伸鏈上的序列(Bc)不能維持適當(dāng)?shù)木嚯x，因此核酸擴增反應(yīng)中的上述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成較難。所以這種情況下，阻礙了前述圖45所示作用機理而得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。另外，作為前述成套引物優(yōu)選前述目的部位配置于前述序列(A)和前述序列(C)之間而設(shè)計的成套引物。根據(jù)這樣的成套引物，核酸試樣中包含目的核酸序列的情況下(例如野生型序列)、核酸擴增反應(yīng)中，第一引物與序列(A)退火、進行延伸反應(yīng)后，前述引物所包含的序列(B，)與延伸鏈上的序列(Bc)進行雜交，因此有效地形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。通過該莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的有效形成，其它的第一引物可與模板退火，前述圖45所示的作用機理有效地進行而得到擴增產(chǎn)物。另一方面，核酸試樣中包含與前述目的核酸序列不同的核酸序列(例如變異型序列)的情況下，得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。例如在核酸試樣中由于序列(A)和序列(C)之間中的長的序列的插入、而包含與目的核酸序列不同的核酸序列的情況下，核酸擴增的速度(效率)顯著降低而得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。另外，核酸試樣中由于序列(A)和序列(C)之間中的序列的缺失而包含與目的核酸序列不同的核酸序列且由于該缺失而丟失序列(B)的部分或全部的情況下，第一引物所包含的序列(B，)不能與延伸鏈雜交而不能或難以形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，阻礙了前述圖45所示的作用機理而得不到擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。進一步核酸試樣中由于序列(A)和序列(C)之間的序列的缺失而包含與目的核酸序列不同的核酸序列且不因該缺失序列而導(dǎo)致(B)部分缺失的情況下，核酸擴增的速度(效率)降低而得不至'J擴增產(chǎn)物或得到的擴增產(chǎn)物的量顯著減少。LAMP法前述對稱型的成套引物如前所示是具有一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)相同的對稱型的一對引物的成套引物，其優(yōu)選應(yīng)用于前述LAMP法。下面，將該成套引物稱為"LAMP用成套引物"。例如LAMP法需要4種引物，它們識別6個區(qū)域，由此可擴增目的基因。即該方法中，首先第一引物與模板鏈退火，發(fā)生延伸反應(yīng)。接著，通過被設(shè)計在比第一引物更靠近上游側(cè)的第二引物的鏈置換反應(yīng)，第一引物的延伸鏈從模板鏈分離。此時，由于脫落的第一引物延伸產(chǎn)物的構(gòu)成，在延伸鏈的5，末端部分形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。與此相同的反應(yīng)也在雙鏈體核酸的另一條鏈、或者脫落的第一引物延伸產(chǎn)物的3，末端側(cè)進行。且通過反復(fù)進行這些反應(yīng)而擴增目的核酸。LAMP法中的模板如下例如在3，末端和5，末端，在同一鏈上分別具有由末端區(qū)域互補的堿基序列形成的區(qū)域，該相互間互補的石威基序列在退火時在兩者之間形成堿基對可結(jié)合的環(huán)("也稱為啞鈴型模板核酸")。LAMP法可以按照例如國際公開第00/28082號說明書、國際公開第01/034838號說明書等進行。PCR法PCR法如前所示通過改變反應(yīng)溫度，可進行例如雙鏈核酸的解離、引物與解離的單鏈的退火、由引物開始的核酸合成、目的核酸序列的擴增。PCR法的條件沒有特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)設(shè)定。本發(fā)明的引物的熒光強度可通過例如控制結(jié)合的染料部分的激發(fā)子相互作用而有效地改變。本發(fā)明中，特別是由于通過使用激發(fā)子相互作用的方法而發(fā)揮作為on-off纟笨針的作用，可得到足夠高的猝滅性能，且例如與現(xiàn)有的檢測相比，可得到很多明顯不同的優(yōu)點。利用激發(fā)子效果的引物所顯示的光物理學(xué)性質(zhì)，不僅非常有特征而且用于DNA序列測定(序列決定)、基因型分型(基因型解析)和基因表達觀測的新型的熒光DNA引物的設(shè)計上也是適宜的。(2)第二核酸擴增方法本發(fā)明的第二核酸擴增方法為擴增核酸試樣中的目的核酸序列的方法，其特征在于，包含下述(A)工序和下述(B，)工序(A)準(zhǔn)備前述核酸試樣的工序；(B)使用引物或包含一對引物的成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序；(B，)包含下述(Bl，)工序和(B2，)工序的工序(Bl，)使用引物或包含一對引物的成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序；(B2，)前述(Bl，)工序中擴增的單鏈體核酸序列與探針進行雜交的工序，其中該探針由包含至少一個下述式(]6)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸形成。本發(fā)明的第二核酸擴增方法中，前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示的結(jié)構(gòu)是與前述同樣的標(biāo)記結(jié)構(gòu)，具體例子也可列舉前述那樣物質(zhì)。另外，本發(fā)明的第二核酸擴增方法中，將包含前述標(biāo)記結(jié)構(gòu)的前述標(biāo)記核酸稱為"標(biāo)記探針"。本發(fā)明中的前述標(biāo)記探針只要含有前述核酸結(jié)構(gòu)即可，其它構(gòu)成沒有特別限制。作為前述標(biāo)記纟笨針可以與例如前述的標(biāo)記引物同樣進行設(shè)計、制造。另外，前述探針的序列沒有特別限制，可才艮據(jù)例如纟企測目的的目的核酸序列的序列、DNA或RNA中的前述目的核酸序列的附近的序列信息等而適當(dāng)設(shè)定。本發(fā)明的第二核酸擴增方法中的引物和成套引物沒有特別限制、可以根據(jù)例如目的的目的核酸序列、核酸擴增反應(yīng)的種類等而適當(dāng)設(shè)定。另外，本發(fā)明中的核酸擴增方法的種類沒有特別限制，可列舉前述這樣的SMAP法或LAMP法等各種等溫擴增法和PCR法等，可與前述第一核酸擴增方法同樣進行。根據(jù)本發(fā)明的第二核酸擴增方法，由于使用前述標(biāo)記探針可僅檢測例如核酸擴增反應(yīng)液的焚光強度來判斷例如目的核酸序列有無擴增。這是根據(jù)例如以下這樣的理由。探針與互補的核酸序列雜交時，由于形成雙鏈體核酸，前述標(biāo)記引物的原子團(染料)嵌入或溝結(jié)合到前述雙鏈體核酸上。此時，例如不產(chǎn)生前述這樣的前述原子團(染料)的激發(fā)子效果，因而前述原子團產(chǎn)生熒光發(fā)光。另一方面，未雜交的情況下，由于產(chǎn)生激發(fā)子效果，前述原子團不產(chǎn)生熒光發(fā)光。因此，例如探針不與通過核酸擴增反應(yīng)而得到的擴增產(chǎn)物雜交的情況下和不進行擴增的情況下，看不到產(chǎn)生熒光發(fā)光的原子團或其的增加。所以，若檢測熒光強度，在增加的情況下判斷為目的核酸序列進行了擴增，在非增加的情況下判斷目的核酸序列未進行擴增。前述標(biāo)記探針可以在例如前述(Bl，)工序的核酸擴增反應(yīng)之前添加到反應(yīng)液中，也可以在前述(Bl，)工序的核酸擴增反應(yīng)之后添加到反應(yīng)液中。前者的情況下，焚光強度的檢測與例如前述(Bl，)工序的核酸擴增反應(yīng)同時進行，可以連續(xù)或間歇地進行，可以在前述(Bl，)工序結(jié)束后進行。前述(Bl，)工序在反應(yīng)結(jié)束后進行的情況下，合并作為背景，優(yōu)選在前述(Bl，)工序的反應(yīng)開始前也進行檢測。另一方，分別進行前述(Bl，)工序和(B2，)工序的情況下，優(yōu)選在前述(Bl，)工序的核酸擴增反應(yīng)之后將例如前述標(biāo)記探針添加到反應(yīng)液中。這種情況下，熒光強度的檢測在例如(Bl，)工序之后進行。此時，作為背景，優(yōu)選在例如前述(Bl，)工序之后，合并檢測前述標(biāo)記探針的添加前或者添加后的熒光強度。檢測方法的具體例子如前所述。(1)本發(fā)明中的探針可以在液相中的均質(zhì)檢測(使用96孔微孔板或毛細管等)中使用。(2)本發(fā)明的纟冢針可以用作PCRi笨4十?？勺鳛镈NA擴增反應(yīng)中的擴增曲線的檢測(realtimePCR)、代替TaqMan探針的廉價的方法來應(yīng)用。可用作引物的標(biāo)記、或者內(nèi)部標(biāo)記探針。(3)本發(fā)明的探針可用作DNA芯片中的捕捉探針或者標(biāo)記探針。其為高通量而不需要藥品的體系，不需要標(biāo)記過程-洗滌過程?？纱蟠蟊苊馊藶楫a(chǎn)生的誤差?？稍诓ＡЩ虼娌ＡУ墓滔噍d體材料(金、ITO、銅等基板、鉆石或塑料等可粘貼多樣品的材料)上，進行同時多項(高通量)的解析。(4)本發(fā)明的探針可以在玻璃珠、纖維、或水凝膠上固定化?？稍诎胍后w半固體的環(huán)境下檢測基因。具有液體樣的測定環(huán)境同時可像固體那樣搬運。(5)本發(fā)明的探針可用作印跡分析(Southernblot、Northernblot、dotblot等)用的探針?？蓛H使目的基因片段發(fā)光而進行檢測。根據(jù)本發(fā)明的方法，雜交操作之后不需要洗滌。(6)本發(fā)明的探針可用作細胞內(nèi)核酸的檢測追蹤的探針。由此可在時間空間上解析細胞內(nèi)的DNA/RNA?？梢允褂脽晒怙@微鏡或細胞分類儀(CellSorter)?？蓱?yīng)用于DNA的標(biāo)記、RNA的轉(zhuǎn)錄'拼接的追蹤、RNAi的功能解析等中。本發(fā)明的方法不必洗滌，因此適于生物細胞的功能追蹤。(7)本發(fā)明的探針可用作熒光insitu雜交(FISH)的探針。根據(jù)本發(fā)明的方法可以進行組織的染色等。本發(fā)明的方法不需要洗滌，因此人為產(chǎn)生的誤差小。即本發(fā)明的探針作為不識別目的生物分子時不發(fā)出熒光的熒光染料而發(fā)揮作用，若使用該探針，可以確立不需要復(fù)雜的洗滌工序的生物成像(bio-imaging)。這關(guān)系到以高可靠性、低勞動量實時觀測熒光。另外，本發(fā)明的熒光探針(標(biāo)記物質(zhì))的效果與現(xiàn)有的單鏈體狀態(tài)猝滅型熒光探針(分子信標(biāo)等)相比，可列舉例如以下的優(yōu)點。其中，這些也是例示不對本發(fā)明進行任何限制。(1)僅使用l種染料的情況下，合成容易。(2)本發(fā)明的DNA引物的末端為自由端的情況下，作為PCR探針容易使用。(3)引物不必形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)等特殊的高級結(jié)構(gòu)，因此不需要莖序列等與序列識別不相關(guān)的序列(沒有多余的序列，也沒有序列的約束)。(4)可以在引物的多個部位(期望的部位)導(dǎo)入熒光染料。(5)l分子中包含2個以上染料結(jié)構(gòu)的情況下，因為受染料間的位置關(guān)系的約束，S/N比(雜交前后的熒光強度比)大。本發(fā)明的探針的熒光強度可通過例如控制結(jié)合的染料部分的激發(fā)子相互作用而有效地改變。本發(fā)明中，特別是由于通過使用激發(fā)子相互作用的方法而發(fā)揮作為on-off探針的作用，可得到足夠高的猝滅性能，且與例如現(xiàn)有的檢測相比可得到很多明顯不同的優(yōu)點。這樣的on-off熒光核普酸的設(shè)計，對于確立不需要洗滌的生物成像分析來說非常重要。利用激發(fā)子放果的探針?biāo)@示的光物理學(xué)性質(zhì)，不僅非常有特征而且用于DNA序列測定(序列決定)、基因型分型(基因型解析)、DNA構(gòu)象轉(zhuǎn)變(conformationaltransition)和基因表達乂見測的新型的熒光DNA引物的設(shè)計上也是適宜的。另外，若使用本發(fā)明的探針(核酸)，通過對例如目的核酸序列進行定量，可以馬上檢測該序列發(fā)生的擴增分解蛋白結(jié)合等現(xiàn)象，同時還可以對這些現(xiàn)象的量進4亍定量。該檢測和定量通過以下的it明而成為可能，^L該il明為例示，并不限定本發(fā)明。即首先，本發(fā)明的探針(核酸)以一定的物質(zhì)量比與前述目的核酸序列進行雜交形成雙鏈體。形成的雙鏈體的物質(zhì)量與前述目的核酸序列的物質(zhì)量成正比例，因此通過測定前述雙鏈體的焚光強度，可以檢測目的核酸序列，同時可以對其物質(zhì)量進行定量。這種情況下，本發(fā)明的探針(核酸)由于被抑制熒光發(fā)光而不妨礙前述雙鏈體的熒光強度測定，使正確的測定成為可能。本發(fā)明的變異纟全測方法，其特征在于，其為^r測核酸試樣中目的核酸序列中有無變異的方法，包含下述(a)~(c)工序..(a)通過本發(fā)明的核酸擴增方法擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序；(b)分別測定前述(a)工序的前后的熒光強度的工序；(c)通過比較前述(b)工序中測定的前述(a)工序前后的熒光強度來檢測有無變異的工序。本發(fā)明的變異檢測方法只要通過使用前述本發(fā)明的引物或成套引物的核酸擴增方法擴增目的核酸序列即可，其它條件和工序沒有任何限制。熒光強度的測定方法和測定條件等可根據(jù)例如前述本發(fā)明的標(biāo)記引物的原子團的種類等而適當(dāng)設(shè)定。另外，前述(b)工序中的熒光強度的測定方法沒有特別限制，與前述同樣。本發(fā)明中"變異"是指核酸序列中相對于作為對照的核酸序列存在不同的堿基(雙鏈體核酸的情況下為堿基對)。作為前述變異可列舉例如堿基的置換、缺失或插入。作為前述對照，涉及例如某特定的堿基序列，其標(biāo)準(zhǔn)的堿基序列可列舉例如標(biāo)準(zhǔn)的基因型即野生型(wildtype;也稱為正常型(normaltype))的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的變異檢測方法，由于使用本發(fā)明的標(biāo)記引物或包含其的本發(fā)明的成套引物，僅通過檢測前述(b)和(C)工序中核酸擴增反應(yīng)液的熒光強度，比較反應(yīng)前后的熒光強度的變化即可判斷有無變異。這是根據(jù)例如以下這樣的理由。引物與包含目的核酸序列的DNA或RNA等雜交，由此形成雙鏈體核酸時，前述標(biāo)記引物的原子團(染料)嵌入或溝結(jié)合到前述雙《連核酸。這種情況下，由于不產(chǎn)生例如前述這樣的前述原子團(染料)的激發(fā)子效果，前述原子團產(chǎn)生熒光發(fā)光。另一方面，未雜交的情況下，由于發(fā)生激發(fā)子效果、前述原子團不產(chǎn)生熒光發(fā)光。因此，例如將一個引物設(shè)計成包含檢測目的變異的序列的互補序列的情況下，模板中的目的核酸序列具有變異時，前述引物與目的核酸序列雜交進行核酸合成，結(jié)果發(fā)生擴增而產(chǎn)生熒光發(fā)光。但是前述目的核酸序列不具有變異時，前述引物不與目的核酸序列雜交，結(jié)果不進行擴增而不產(chǎn)生熒光發(fā)光。因此，若檢測熒光強度，則增加的情況下可判斷為存在目的變異，在非增加的情況下則可判斷為不存在目的變異。另外將前述引物設(shè)計成與野生型互補的序列的情況下，相反地?zé)晒鈴姸仍黾拥那闆r下可判斷為不存在目的變異，非增加的情況下可判斷為存在目的變異。本發(fā)明中，任意的引物均可以為前述標(biāo)記引物。另外，本發(fā)明的成套引物可以包含例如檢測目的的堿基為變異型的引物(變異型引物)、前述堿基為野生型的引物(野生型引物)。這種情況下，變異型引物和野生型引物優(yōu)選例如分別是具有不同的檢測條件的熒光性原子團的標(biāo)記引物。由此，核酸試樣所包含的變異型DNA和野生型DNA的量的解析也成為可能。本發(fā)明的變異檢測方法可以使用前述(a)工序中例如具有檢測波長不同的熒光性原子團的2種以上的本發(fā)明的標(biāo)記引物。具體而言，檢測2種以上的目的核酸序列的變異的情況下，優(yōu)選作為用于分別擴增前述(a)工序中各目的核酸序列的引物，通過同時使用具有不同的熒光性原子團的2種以上的本發(fā)明的標(biāo)記引物，通過前述(c)工序中與前述各熒光性原子團相應(yīng)的各檢測波長測定各自的菱光強度。由此，例如在同一反應(yīng)液中進行2種以上的目的核酸序列的擴增且在與各熒光性原子團相應(yīng)的檢測波長下，可檢測各目的核酸序列的變異擴增。本發(fā)明的變異檢測方法在以檢測目的核酸序列中的變異部位的檢測為目的進行擴增的情況下，例如前述(a)工序中優(yōu)選使用具有與前述目的核酸序列中包含變異部位的區(qū)域完全互補的序列的本發(fā)明的標(biāo)記引物(標(biāo)記完全匹配引物)、具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物(錯配引物)。這樣，通過使錯配引物共存，可抑制例如完全匹配引物與模板中的錯配區(qū)域進行雜交，使更高特異性的擴增成為可能。前述錯配引物例如可以是未標(biāo)記引物，也可以是本發(fā)明的標(biāo)記引物。另外，本發(fā)明包含進一步提高引物對目的核酸序列的特異性的方法。本發(fā)明的第一的特異性提高方法，其特征在于，作為用于擴增前述目的核酸序列的前述引物使用具有本發(fā)明的熒光原子團的標(biāo)記引物。即通過將引物結(jié)構(gòu)設(shè)計成包含至少一個前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示的結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸，如前所示可提高引物對目的核酸序列的特異性。另外本發(fā)明由于前述結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸，與不含前述結(jié)構(gòu)的未標(biāo)記核酸相比，提高Tm值因此也稱為Tm值的提高方法。另外標(biāo)記引物的具體例子、使用方法等如前所述。本發(fā)明的第二的特異性提高方法，其特征在于，作為用于擴增前述目的核酸序列的前述引物，4吏用具有與前述目的核酸序列中包含變異部位的區(qū)域完全互補的序列的權(quán)利要求l所述的引物(標(biāo)記完全匹配引物)、進一步作為提高前述引物的特異性的引物，同時<吏用具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物(錯配引物)。像這樣，通過同時使用本發(fā)明的標(biāo)記完全匹配引物和錯配引物，可以抑制標(biāo)記完全匹配引物與例如模板中的錯配區(qū)域進行雜交，可以提高標(biāo)記完全匹配引物的特異性。另外標(biāo)記引物或錯配引物的具體例子、使用方法等如前所述。[試劑盒]本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒是在擴增目的核酸序列的核酸擴增方法中所使用的試劑盒，其特征在于，包含本發(fā)明的引物或成套引物。本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒只要包含本發(fā)明的引物或成套引物即可，其它構(gòu)成和含有比例等沒有任何限制。另外，應(yīng)用本發(fā)明的變異檢測用試劑盒的變異檢測方法沒有任何限制，可應(yīng)用于例如前述這樣的利用各種等溫擴增法或PCR法等的方法。本發(fā)明的變異檢測用試劑盒是檢測目的核酸序列中有無變異的變異檢測方法中所使用的試劑盒，其特征在于，包含本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒。本發(fā)明的變異檢測用試劑盒只要包含本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒即可，其它構(gòu)成和含有比例等沒有任何限制。另外，應(yīng)用本發(fā)明的變異檢測用試劑盒的變異檢測方法沒有任何限制，可應(yīng)用于例如前述這樣的利用各種等溫擴增法或PCR法等的方法。本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒以及變異檢測用試劑盒可在例如本發(fā)明的核酸擴增方法以及變異檢測方法中使用。本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒以及變異檢測用試劑盒可進一步含有例如如前所述的聚合酶、錯配識別蛋白等。另外，本發(fā)明的核酸擴增用試劑盒以及變異檢測用試劑盒可以進一步具備核酸合成手段和熒光強度測定手段等。前述核酸合成手段沒有特別限制，可列舉例如/>知的自動核酸合成儀等，前迷熒光強度測定手段也沒有特別限制，可列舉例如公知的熒光測定器等。[裝置]接著，本發(fā)明的核酸擴增裝置為用于實施本發(fā)明的核酸擴增方法的核酸擴增裝置，其特征在于，具備反應(yīng)部，實施核酸擴增反應(yīng)；溫度控制單元，控制前述反應(yīng)部的溫度；檢測單元，檢測前述反應(yīng)部的熒光強度。另外，本發(fā)明的變異檢測裝置為用于實施本發(fā)明的變異檢測方法的變異檢測裝置，其特征在于，具備反應(yīng)部，實施核酸擴增反應(yīng)；溫度控制單元，控制前述反應(yīng)部的溫度；檢測單元，檢測前述反應(yīng)部的熒光強度。另外，這些各裝置例如還可以具備向例如前述反應(yīng)部供給藥品的藥品供給單元、容納前述藥品的容納部等作為其它的構(gòu)成。以上這樣的本發(fā)明的各方法、各試劑盒和各裝置在研究、臨床、診斷等中極其有用。[實施例]通過以下的實施例對本發(fā)明進行更具體的說明，但本發(fā)明不受以下實施例的限制。另外，以下"ODN"是指寡聚DNA(DNA寡聚物)。藥品、溶劑使用一般市售的物質(zhì)。生物素的N-羥基琥珀酰亞胺酯使用PIERCE公司的制品?；衔锾峒冇玫墓枘z使用WakoGELC-200(和光純藥)。H、"C和"PNMR光譜通過JEOL(日本電子抹式會社)的JNM-a400(商品名)進行測定。耦合常數(shù)(J值)用赫茲(Hz)表示?；瘜W(xué)位移用ppm表示，內(nèi)標(biāo)使用二曱基亞石風(fēng)(5=2.48iniHNMR,5=39.5in13CNMR)和曱醇(5=3.30iniHNMR,5=49.0in13CNMR)。"PNMR測定中，作為外標(biāo)使用H3P04(S=0.00)。ESI質(zhì)譜使用Bruker公司的BrukerDaltonicsAPEC-II(商品名)進行測定。DNA自動合成儀使用AppliedBiosystems公司的392DNA/RNAsynthesizer(商品名)。反相HPLC使用Gilson公司的裝置GilsonChromatograph，Model305(商品名)和CHEMCO公司的CHEMCOBOND5-ODS-H制備柱(商品名，10x150mm)進行分離，通過UV檢測器Model118(商品名)在波長260nm下進行檢測。DNA的質(zhì)量通過MALDI-TOFMS進行測定。MALDI-TOFMS使用ApppliedByosystems公司的PerseptiveVoyagerElite(商品名)，在加速電壓21kV、負離子模式下進行測定，使用2，，3',4，-三羥基乙酰苯酮作為基質(zhì)，以T8([M.H].2370.61)和T17([M.H].5108.37)作為內(nèi)標(biāo)。UV光語和熒光光譜分別使用株式會社島津制作所的ShimadzuUV-2550(商品名)分光光度計、RF-5300PC(商品名)熒光分光光度計進行測定。熒光壽命在株式會社堀場制作所的小型高性能熒光壽命測定儀器HORIBAJOBINYVONFluoroCube(商品名)上安裝NanoLED-05A(商品名)進行測定。雙鏈體核酸的融點(Tm)的測定在包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中，在最終雙鏈體濃度2.5pM下進行。試樣的吸光度在波長260nm下測定，從10。C到90。C的范圍內(nèi)以0.5。C/min的速度加熱同時進行追蹤。從通過這樣觀測的特性，將最初產(chǎn)生變化的溫度作為融點Tm。吸收光譜、熒光光譜和CD光譜測定沒有特別限制，在鏈濃度2.5^M(單鏈體或雙鏈體)下，在包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中，使用光程長度lcm的測定i進行。激發(fā)和熒光發(fā)光的帶寬為1.5nm。熒光量子效率(Of)如下算出將9，10-二苯基蒽作為對照物質(zhì)，基于乙醇中的9,10-二苯基蒽的量子效率Of=0.95而算出。發(fā)光光譜的面積使用instrumentationsoftwar通過積分而算出。量子效率(Of)通過下述式(1)算出。①f(s)/①f(R)二[A(s)/A(R)]x[(Abs)(R)/(Abs)(s)]x[n(s)2/n(R)2](1)上述式(1)中，Of(s)為試樣(Sample)的熒光量子效率，0^R,為對照物質(zhì)(Reference)的熒光量子效率。A")為試樣的熒光光譜面積，A(R)為對照物質(zhì)的熒光光譜面積。(Abs)is)為激發(fā)波長下的試樣溶液的光密度，(Abs)(R)為激發(fā)波長下的對照物質(zhì)'溶、液的光密度。n(s)為i式才羊；容'液的4斤射率,n(R,為對照物質(zhì)溶液的折射率，作為n(s)二1.333和n(R)=1.383而計算。[實施例1~3]按照下述路線l,合成(制造)2個活性氨基分別用三氟乙?；Ｗo的化合物102和103，進而合成亞磷酰胺104。104路線1反應(yīng)藥品和反應(yīng)條件(a)(i)N-hvdroxysuccinimide,EDC/DMF，(ii)tris(2-aminoethvl)-amine/CH3CN,(iii)CF;COOEt，E"N:(b)DMTrCl/pvridine;(c)2-cyanoethyl-N,N,N，，N，-tetraisopropvlphosphoramidite,1H—tetrazole/CHUCNHO1030oCF3oo、NT對前述^各線1更詳細為如下所示。起始原料(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷((E)-5隱(2-carboxyvinyl)畫2'—deoxyuridine，^ft^^^lOl)HHTetrahedron1987,43,20,4601—4607進4亍合成的。即，首先向430mg的醋酸釔(II)(FW224.51)和1.05g的三笨基膦(FW262.29)力口入71mL的1,4—二口惡》克，再力口入7.1mL的三乙胺(FW101.19，d=0.726)，在70。C下加熱攪拌。反應(yīng)溶液從紅褐色變?yōu)楹诤稚?，加入?4.2g的2，-脫氧-5-碘代尿苷(FW354.10)和7.0mL甲基丙烯酸甲酉旨(FW86.09,d=0.956)懸浮于1，4-二噁烷后的產(chǎn)物，在125。C下進行1小時加熱回流。之后，趁熱過濾，用甲醇洗滌殘留物，回收濾液。從濾液中減壓蒸餾去除溶劑之后，用硅膠柱提純生成物(5-10%甲醇/二氯曱烷)。對富集餾分的溶劑進行減壓蒸餾，在減壓狀態(tài)下對殘留的白色固體進行干燥。向干燥的固體加入約lOOmL的超純水、3.21g的氫氧化鈉(FW40.00)，在25。C下通宵攪拌。此后，加入濃鹽酸使溶液為酸性，過濾生成的沉淀，用超純水洗滌，在減壓下進行干燥。由此，得到目的化合物(化合物101)8.10g(收率68%)的白色粉末。此外，前述白色粉末是目的化合物101由1HNMR測定值與文獻值的一致得以確認。另外，"CNMR測定值記錄如下。(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷(化合物101):13CNMR(DMSO-d6):S168.1，161.8，149.3,143.5，137.5,117.8,108,4,87.6,84.8,69.7,60.8,40.1。接下來，將1.20g的(E)-5-(2-羧基乙烯基)-2，-脫氧尿苷IOI(分子量298.25)和925mg的N-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)和1.54g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(分子量191.70)放入裝有攪拌器的梨形燒瓶，加入20mL的DMF,在25。C下才覺4半16小3寸。力口人纟々lmL的醋酉臾，力口人300mL的二氯曱烷和100mL的超純水，劇烈攪拌。除去水層，再加入lOOmL的超純水，同樣洗滌2次。過濾生成沉淀，用二氯甲烷洗滌，減壓下進行干燥。從濾液中蒸餾去除溶劑，在生成的沉淀中加入二氯甲烷，與前述方法同樣回收沉淀。使回收的全部沉淀懸浮于80mL的乙腈，進行劇烈攪拌。一次性向其中加入3.0mL的三(2-氨基乙基)胺(分子量146.23，d=0.976),在25。C下再攪拌10分鐘。之后，加入4.8mL的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194)，再加入5.6mL的三乙胺(分子量10.19，d=0.726)，在25。C下攪拌3小時。蒸餾去除溶劑后，用硅膠柱提純(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸餾去除溶劑后，將其溶解在少量的丙酮中，加入乙醚后產(chǎn)生白色沉淀。過濾，用乙醚洗滌后，在減壓下進行干燥，得到了884mg(33.5%)的目的物質(zhì)(化合物102)。此外，除使原料，溶劑等的使用量、反應(yīng)時間以及工序發(fā)生若干變化外，與前述方法同樣進行合成時，可以使收率提高到37%。即，將597mg(2.0mmo1)的(E)—5—(2—象基乙烯基)-2，-脫氧尿苷IOI(分子量298.25)和460mg(4.0mmo1)的N-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)(767mg，4.0mmo1)的1-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(分子量191.70)放入裝有攪拌器的梨形燒瓶，加入5.0mL的DMF,在2S。C下攪拌3小時。加入約0.5mL的醋酸，加入約lOOmL的二氯甲烷和100mL的超純水，進行劇烈攪拌。過濾產(chǎn)生的沉淀，用水洗滌，在減壓下進行通宵干燥。將得到的白色殘渣懸浮于50mL的乙腈，進行激烈地攪拌。一次性向其中加入3.0mL(20mmo1)的三(2-氨基乙基)胺(分子量146.23，d=0.976)，在25。C下再攪拌10分鐘。之后，加入4.8mL的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),再力口入5.6mL(40mmol)的三乙/設(shè)(分子量101.19,d=0.726),在25。C下攪拌16小時。蒸餾去除溶劑后，用硅膠柱提純(5-10%MeOH/CH2Cl2)。蒸餾去除溶劑后，使其溶解在少量的丙酮中，加入乙醚后產(chǎn)生白色沉淀。過濾，用乙醚洗滌后，在減壓下進行干燥，得到了453mg(37%)的目的物質(zhì)(化合物102)。下面示出化合物102的儀器分析值。另夕卜，圖2示出iHNMR光i普。2-[2-[N，N-雙(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基甲酰基-(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷(化合物102):丄麗MR(CD3。D):58.35(s，lH),7.22(d,H5.6Hz，1H)，7.04(d,J=15.6Hz,1H),6.26(t,J二6.6Hz,1H),4.44—4.41(m,III),3.96—3.94(m,1H),3.84(dd,J=12.2，2.9Hz,1H),3.76(dd,J=12.2,3.4Hz,1H),3.37-3.30(m,6H)，2.72-2.66(m,6H),2.38-2.23(m,2H).13CNMR(CD3OD):S169.3,163.7，159.1(q,J=36.4Hz)，151.2,143.8,134.3，122.0,117.5(q,J=286Hz)，110.9,89.1,87.0，71.9,62.5,54.4,53.9,41.7,38.9，38.7.HRMS(ESI)calcdforC22H29F6N608([M+H]+)619.1951，found619.1943?！笇嵤├?:5，-O-二曱氧基三苯曱基-(2-「2-「N,N-雙(2-三氟乙酰氨基乙基)1-氨基乙基l氨基曱?；?(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷(5，-O-DMTr-(2-「2-「N,N-bis(2一trifluoroacetamidoethvl)1-aminoethyllcarbamovl-(E)一vinvl)—2，一deoxvuridine，4匕合物103)的合成]用DMTr基保護化合物102的5，-羥基，得到了化合物103。即，首先，將618mg的化合物102(分子量618.48)和373mg的4,4'-二曱氧基三苯甲基(分子量338.83)放入裝有攪拌器的梨形燒瓶，加入10mL的吡啶，在25。下攪拌16小時。加上少量水，蒸餾去除溶劑，用硅膠柱提純(2-4%MeOH，l%Et3N/CH2Cl2)。將含有目的化合物103的餾分蒸餾去除溶劑，得到735.2mg(79.8%)的目的物質(zhì)(化合物103)。下面示出化合物103儀器分析值。此外，圖3示出'HNMR光譜圖。5，-0-二甲氧基三苯甲基-(2-[2-[N，N-雙(2-三氟乙酰氨基乙基)]-氨基乙基]氨基曱?；?(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷(化合物103):'HNMR(CD30D):57.91(s,1H)，7.39-7.11(m,9H),7.02(d，J二15.6Hz,1H),6.93(d,J=15.6Hz，1H),6.80—6.78(m,4H),6.17(t，J=6.6Hz,1H),4.38—4.35(m，1H),4.06—4.04(m,1H)，3.68(s，6H),3.32-3.22(m,8H),2.66—2.55(m，611),2.40(紙J=13.7,5.9,2.9Hz,1H)，2.33-2.26(m，1H).13CNMR(CD3OD):5168.9，163.7,160.1,159.1(q,J=36.9Hz),151.0,146.1，143.0，137.0,136.9，134.1,131.24，131.16,129.2，128.9,128.0,122.5,117.5(q,J=286.7Hz),114.2,110.9,88.1,87.9,87.6,72.6,65.0，55.7，54.2,53.9,41.7,38.9,38.6.H脂S(ESI)calcdforC43H47F6N6O10([M+H]+)921.3258,found921.3265?！笇嵤├?:5，-O-(二曱氧基三苯曱基)-(2-「2-「N，N-雙(2-三氟乙酰氨基乙基)1-氨基乙基l氨基甲?；?(E)-乙烯基)-2，-脫氧尿苷-3，-「(2-氰基乙基)-(N,N-二異丙基)1-亞磷酰胺(5，-O-DMTr-(2-「2-「N,N-bis(2-trifluoroacetamidoethyl)1—aminoethyllcarbamoyl—畫(E)_vinyl)-2，-deoxyuridine,3，-「(2-cvanoethyl)-(N,N-diisopropvl)1-phosphoramidite,化合物104)的合成]使188mg(0.20mmol)的化合物103(分子量920.85)與CH3CN共沸，力口入28.6mg(0.40mmo1)的1H-四唑(分子量70.05)，用真空泵整晚進行抽氣干燥。向該干燥物中加入5.1mL的CH3CN進行溶解后，進行攪拌，一次性加入194^L(0.60mmo1)的2-氰基乙基-N,N,N，,N，-四異丙基亞磷酰胺(分子量301.41,d=0.949)，在25°C下才覺4半2小時。力口入50mL的乙酸乙酉旨和50mL的々包和碳酸氫鈉水溶液的混合物，進4亍分液，用飽和食鹽水洗滌有機層后，用硫酸鎂對其進行千燥。通過過濾除去硫酸鎂后，蒸餾去除溶劑。假定本次分液的粗生成物與CH3CN共沸后，可按照100%的收率得到生成物(化合物104)，使其成為0.1M的CH3CN溶液，用于DNA合成。此外，得到化合物104是由前述粗生成物的"PNMR(CDC13)和HRMS(ESI)進行確認的。這些值在下面示出?；衔?04:31PNMR(CDC13)S149.686,149.430:HRMS(ESI)calcdforC52H64F6N8OuP([M+H]+)1121.4336,found1121.4342。[實施例4:DNA寡聚物的合成]路線2使用化合物104通過DNA自動合成儀合成寡聚DNA,以l(amol規(guī)模，用通常的亞磷酰胺法(DMTrOFF)來進行，合成了序列5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(13聚物，X的結(jié)構(gòu)按照化學(xué)式105)(序列號l)的DNA寡聚物。用濃氨水(質(zhì)量百分比為28%)在55。C下進行16小時脫保護。用speed—vac使氨水揮發(fā)，通過0.45iam過濾器后，用反相HPLC分析截取的DNA寡聚物，提純在約10.5分鐘出現(xiàn)的峰(CHEMCOBOND5-ODS-H(商品名)10xl50mm，3mL/min，5—30%CH3CN/50mMTEAA緩沖液pH7(20分鐘)，在260證下檢測)。通過MALDITOFMS鐠圖的負離子模式，測定提純的生成物的分子量，驗證了前述5，-d(CGCAATXTAACGC)-3'序列(13聚物，X的結(jié)構(gòu)按照化學(xué)式105)這一序列具有預(yù)測的分子量(基于〔13411176仏207612的計算值4102.8)([M-H〗的實測值41(H.9,計算值4101.8)。圖4示出MALDITOFMSi普圖的譜圖。此外，除用濃氨水進行的脫保護在55。C下進行4小時后再在25。C下進行16小時、反相HPLC的TEAA(醋酸三乙胺)緩沖液(pH7)濃度為0.1M、反相HPLC的展開時間設(shè)置為30分鐘以外，可與上述同樣合成5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(13聚物，X的結(jié)構(gòu)按照化學(xué)式105)。并且，用同樣的方法，能合成如表l所示的各ODN為原料的DNA(包含化學(xué)式105所示的核苷酸)。為了確定合成的各個DNA的濃度，通過牛腸堿性磷酸酶(50U/mL),蛇毒磷酸二酯酶(0.15U/mL)以及核酸酶P1(50U/mL)，在25。C下用16小時對提純的各DNA進行完全消化。用安裝了CHEMCOBOND5-ODS-H(商品名)柱(4.6x150mm)的HPLC對得到的消化液進行分析。此時，作為流動相使用O.IM的TEAA(pH7.0)，流速為1.OmL/min。將前述合成的DNA的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積進行比較而確定其濃度，所述標(biāo)準(zhǔn)溶液是分別含有O.lmM濃度的dA,dC,dG以及dT的溶液。并且，前述合成的DNA，還通過MALDITOFMS譜圖進行了鑒定。下面示出其質(zhì)量分析值。此外，[105]表示在該位置插入有化學(xué)式105所示的核苷酸。GCAAT[105]TAACGC,calcdforC134H177N52076P12([M+H]+)4103.8,found4107.0;TTTTTT[105]TTTTTT,calcdforC138H187N30O90P12([M+H]+)4077.8,found4076.9;TGAAGGGCTT[105]TGAACTCTG,calcdforC205H265N770122PI9([M+H]+)6348.2,found6348.7;forC285H376N108O169P27([M+H]+)8855.0，found8854.8;forC289H376N1160168P27([M+H]+)8999.1,found9002.2?！挠嬎阒?554.4—致。圖5示出MALDITOFMS的譜圖。使用該化合物6(單鏈體狀態(tài))合成雙鏈體DNA及RNA，比較單鏈體狀態(tài)和雙鏈體狀態(tài)的熒光強度。結(jié)果，確認了單鏈體狀態(tài)下熒光DNA寡聚物(引物(化合物6))的熒光發(fā)光被抑制，與互補的核酸形成雙螺旋時熒光發(fā)光強。下述的實施例6~13中，合成下述化學(xué)式b及c所示的羧基亞曱基linker的p塞唑才登書于生物，將它們以N-羥基琥珀酰亞胺酯的形式活化，通過與具有活性氨基的DNA寡聚物進行反應(yīng)(寡聚核苷酸)，制備有熒光性的各種寡聚核苷酸(熒光DNA寡聚物)。即，制造了各種寡聚核苷酸(熒光DNA寡聚物)，這些寡聚核苷酸對從染料伸出的亞曱基linker長度和含有從胸苷5位伸出的含氨基的linker進行了各種改變。結(jié)果，任意一種熒光DNA寡聚物(熒光DNA引物)均抑制單鏈體狀態(tài)DNA熒光引物的熒光發(fā)光，與互補核酸形成雙螺旋時熒光發(fā)光強。此外，下述化學(xué)式b以及c中的n表示linker長度(橋原子數(shù))?！笇嵤├?:1個分子中具有2個噻唑橙衍生結(jié)構(gòu)的化合物的合成lDNA路線4如上述路線4所示，合成了l個分子中具有2個噻唑橙衍生結(jié)構(gòu)的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。更詳細如下所示。噻唑橙衍生物107的合成參考OrganicLetters2000,6,517-519，按照下述路線5進行。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula>路線5(1)N-曱基會啉碘化物(化合物lll)的合成首先，根據(jù)前述文獻的記載合成N-曱基喹啉碘化物(化合物lll)。具體而言，在42mL無水二噁烷中，加入2.4mL喹啉和4mL曱基碘，在150。C下攪拌1小時之后，通過過濾收集沉淀，用乙醚及石油醚洗滌，干燥，得到N-曱基喹啉碘化物(化合物m)。(2)3-(4-羧基丁基)-2-甲基苯并噻唑溴化物(化合物112)的合成將8mL的2-曱基苯噻唑(FW149.21,d=1.173)和9.4g的5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)(FW181.03)在110。C下攪拌16小時。室溫下冷卻粗生成物，使生成的固體懸浮于20mL甲醇中，再加入40mL乙醚。過濾生成的沉淀，用二噁烷洗滌直到2-曱基苯并噻唑的氣味消失，再用乙醚進行洗滌，在減壓下千燥得到9.8g的白色粉末。測定該白色粉末的iHNMR,為2位^皮烷基化的目的物3-(4-羧基丁基)-2-曱基苯并漆唑溴化物(化合物112)和2位未被烷基化的3-(4-羧基丁基)-苯并噻唑溴化物的混合物。質(zhì)子峰的比為未被烷基化烷基化=10:3。將這些粗生成物直接用于下面的反應(yīng)。(3)1-曱基-4-K3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯并p塞唑亞基l曱基l壹啉溴化物(化合物107)的合成將2.18g前述(2)中得到的含有3-(4-羧基丁基)-2-曱基苯并噻唑溴化物(化合物112)的粗生成物和700mg的N-曱基奮啉缺化物(化合物lll)(FW271.10)置于10mL的二氯曱烷中，在3.6mL的三乙胺(FW101.19，d=0.726)的存在下，在25。C下攪拌2小時。之后，加入50mL乙醚，過濾回收產(chǎn)生的沉淀，用乙醚洗滌，在減壓下進行干燥。將該沉淀懸浮于50mL超純水中，過濾回收，用超純水洗滌，在減壓下進行干燥。再將前述沉淀懸浮于50mL乙腈中，過濾回收，用乙腈洗滌，在減壓下使其干燥，得到307.5mg的紅色粉末(收率25.3%)。該紅色粉末為目的物(化合物107)是將iHNMR光譜與文獻值進行對比而確iL的。此外，也可以通過下述方法合成3-(4-羧基丁基)-2-曱基苯并噻唑溴化物(化合物112)以及l(fā)-曱基-4-[{3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯并噻唑亞基}曱基]喹啉溴化物(化合物107)。即，首先，將11.7mL(92mmo1)的2-曱基苯并口塞口坐(FW149.21,d=1.173)牙口13.7g(76mmol)的5—澳4戈戊酸(5-溴代戊酸)(FW181.03)在150。C下攪拌1小時。在室溫下冷卻粗生成物，將產(chǎn)生的固體懸浮于50mL甲醇中，再加入乙醚200mL。過濾生成的沉淀，用乙醚洗滌，在減壓下進行干燥，得到19.2g的淡紫色粉末。該粉末是目的化合物112(3-(4-羧基丁基)-2-曱基苯并噻唑溴化物和2-曱基笨并噻唑溴化物的混合物。ijINMR(inDMSO-d6)測定該混合物，通過將8.5ppm的峰(來自目的化合物112)和8.0ppm的峰(來自2-曱基苯并噻唑溴化物)的峰面積比，計算出目的化合物112的收量為9.82g(14mmo1,32%)。不提純該混合物(粗生成物)直接用于下面的反應(yīng)。此外，除將5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變成4-溴代丁酸(4-溴代丁酸)以外，同樣合成了linker(與羧基相連的聚亞甲基鏈)的碳原子數(shù)n二3的3-(4-羧基丙基)-2-曱基苯并噻唑溴化物，收率為4%。另外，除將5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變成6-溴代已酸以外，同樣合成了linker(與羧基相連的聚亞甲基鏈)的碳原子數(shù)11=5的3-(4-羧基戊基)-2-甲基苯并噻唑溴化物，收率為35%。并且，除將5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變成7-溴代庚酸以外，同樣合成了linker(與羧基相連的聚亞曱基鏈)的碳原子數(shù)11=6的3-(4-羧基丙基)-2-曱基苯并噻唑溴化物，收率為22%。接下來，在3.24g含有化合物112即(3-(4-羧基丁基)-2-曱基苯并噻唑溴化物和2-曱基苯并噻唑溴化物的前述混合物(粗生成物)中，力口入1.36g(5.Ommo1)的N-曱基口全啉石典化物(化合物lll)(FW271.10)、7.0mL(5Ommo1)的三乙胺(FW101.19,d=0.726)和100mL的二氯曱烷，得到透明溶液。將該溶液在25。C下攪拌16小時。之后，減壓蒸餾去除溶劑。向殘渣中加入丙酮(200mL)，過濾回收得到的沉淀，用丙酮洗滌。然后將得到的殘渣進行減壓干燥，用蒸餾水(50mL)洗滌干燥后的紅色殘渣。對其再進行過濾回收，用蒸餾水洗滌，在減壓下使之干燥，得到目的物(化合物107)紅色粉末(654mg,1.39mmo1,28%)。紅色粉末為目的物(化合物107)是將'HNMR光譜與文獻值進行對比而確認的。下面示出'HNMR以及13CNMR(DMSO-d6)峰值和HRMS(ESI)的測定值。此夕卜，圖6中示出化合物107的^NMR光i普(DMSO-d6)。化合物107:iHNMR(DMSO-d6):58.74(d,J=8.3Hz，1H)，8.51(d,J=7.3Hz,1H)，7.94-7.89(m,3H),7.74-7.70(m，1H),7.65(d，J=8.3Hz,1H)，7.55-7.51(m，1H),7.36-7.32(m,1H),7.21(d,J=7.3Hz,1H)，6.83",1H)，4.47(t,J=7.1Hz,2H),4.07(s,3H),2.22(t,J=6.6Hz,1H),1,77—1.63(m，4H):13CNMR(DMSO—d6,60。C)5174.6，158.8,148.4,144.5,139.5,137.6,132.7,127.9,126.8，125.5，124.1,123.7,123.6，122.4,117.5,112.6,107.6,87.4,45.6，42.0，35.5,26.2,22.3:HRMS(ESI)calcdforC23H23N202S([M.Br]+)391.1480,found391.1475。此外，用與上述化合物107同樣的方法，由3-(4-羧基丙基)-2-曱基苯并噻唑溴化物和2-甲基苯并噻唑溴化物的混合物，合成了linker(與羧基相連的聚亞曱基鏈)碳原子數(shù)n二3的4-((3-3-(4-羧基丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基-1-曱基喹啉溴化物，收率為43%。下面示出儀器分析值。4-((3-3-(4-羧基丙基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基-1-甲基喹啉溴化物力NMR(DMSO-d6)S8.85(d,J=8.3Hz，1H),8.59(d,J=7.3Hz,1H),8.02.7.93(m,3H),7.78.7.70(m，2H),7.61.7.57(m，1H),7.42.7.38(m,1H),7.31(d,J=6.8Hz,m),7.04",1H)，4.47",J=8.1Hz，2H),4.13"，3H)，2.52.2.48(m，2H),1.99.1.92(m,2H):13CNMR(DMSO-d6,60。C)S174.3，158.9,148.6，144.5，139.5，137.7，132.7,127.9，126.7，125.6,124.1,124.0,123.7,122.5,117.5，112.5,107.6,87.7，45.6,42.0,31.6，22.4:HRMS(ESI)calcdforC22H21N202S([M.Br]+)377.1324，found377.1316。此外，用與前述化合物107同樣的方法，由前述3-(4-羧基戊基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2-曱基苯并噻唑溴化物的混合物，合成了linker(與羧基相連的聚亞曱基鏈)碳原子數(shù)n二5的4-((3-(3-羧基戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基)_1-甲基喹啉溴化物，收率為26%。下面示出儀器分析值。4-((3-(3-羧基戊基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基)-1-曱基喹啉溴化物'HNMR(DMSO-d6)38.70(d，J二8,3Hz,1H)，8.61(d,J=6.8Hz,1H),8.05.8.00(m，3H)，7.80.7.73(m,2H)，7.60.7.56(m，1H)，7.41.7.35(m,2H)，6.89(s,1H),4.59(t,J二7.3Hz,2H),4.16"，3H),2.19",J二7.3Hz，III),1.82.1.75(m,2H),1.62.1.43(m,4H):13CNMR(DMSO-d6，60。C)5174.5,159.0,148.6,144.7,139.7，137.8，132.9,127.9,126.9,125.2,124.2,123.8,123.6,122.6，117.8，112.6,107.7，87.4，45.6，42.1，36.0，26.3，25.9，24.9:HRMS(ESI)calcdforC24H25N202S([M.Br]+)405.1637,found405.1632。接下來，用與前述化合物107同樣的方法，由前述3-(4-羧基已基)-2-甲基苯并噻唑溴化物和2_曱基苯并噻唑溴化物的混合物，合成了linker(與羧基相連的聚亞甲基鏈)碳原子數(shù)n二6的4-((3-(3-羧基已基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-1-曱基喹啉溴化物，收率為22%。下面示出儀器分析值。4-((3-(3-羧基已基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基)-1-甲基喹啉溴化物i麗MR(DMSO-d6)38.72(d,J=8.3Hz,1H)，8.62(d,J=6.8Hz,1H),8.07.8.01(m,3H)，7.81.7.75(m,2H),7.62.7.58(m，1H),7,42.7.38(m,2H),6.92",1H)，4.61(t，J=7.3Hz，2H),4.17(s,3H)，2.18(t,J=7.3Hz,1H),1.82.1.75(m,2H),1.51.1.32(m,6H):13CNMR(DMSO-d6,60°C)S174.0，159.1，148.6,144.7，139.8，137.8,132.9，127.9,126.8,125.0，124.2,123.8，123.6，122.6，118.0,112.7,107.8，87.4,45.5,42.1,33.4,27.9,26.4，25.5，24.1:HRMS(ESI)calcdforC25H27N202S([M.Br]+)419.1793,found419.1788。(4)N-羥基琥珀酰亞胺酯109合成將9.4mg(20jiimo1)的1-甲基-4-[{3-(4-羧基丁基)-2(3H)-苯并噻唑亞基}曱基]喹啉溴化物(化合物107)(FW471.41)、4.6mg(40(amo1)的N—幾基3虎5白醜亞胺(4匕合物108)(FW115.09)、以及7.6mg(40(imol)的EDC(1-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)(FW191.70)在lmL的DMF中于25。C下攪拌16小時，得到染料(化合物107)的羥基被活化的N-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)。不對此反應(yīng)生成物進行提純，將反應(yīng)溶液(染料20mM)直接用于與寡聚DNA(寡聚核苦酸)105的反應(yīng)。接下來，除使用改變linker(聚亞曱基linker)碳原子數(shù)的的方法，合成了linker(聚亞曱基linker)碳原子數(shù)n二3的4-((3-(4-(琥珀酰亞胺基氧)-4-氧代丁基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基)-1-曱基喹啉溴化物。并且，同樣合成了linker(聚亞曱基linker)碳原子數(shù)n-5的4-((3-(4-(琥珀酰亞胺基氧)_4-氧代已基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)曱基)-1-曱基喹啉溴化物和linker(聚亞甲基linker)碳原子數(shù)n二6的4-((3-(4-(琥珀酰亞胺基氧)-4-氧代庚基)苯并[d]噻唑-2(3H)-亞基)甲基)-1-甲基喹啉溴化物。(5)用2分子噻唑橙修飾的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110的合成與前述實施例4同樣，通過DNA自動合成4義以常^L方法，合成具有兩個活性氨基的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)105?；衔?05的序列與實施例4同樣使用5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(X為前述化合物104)。接下來，使DNA寡聚物(寡聚核普酸)105與N-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)進行反應(yīng)，合成在1個分子中存在2個由噻唑橙衍生的結(jié)構(gòu)的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。即，首先，將30jiL的5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(化合物105,鏈濃度320pM)、10[iL的Na2C03/NaHC03緩沖液(1M，pH9.0)和60^^的1120混合，加入100iiLN-羥基琥珀酰亞胺酯(化合物109)的DMF溶液(20mM)，充分混合。在25。C下靜置16小時之后，力。入80(^L的H20,通過孔徑0.45pm的過濾器，以反相HPLC提純出現(xiàn)在約14.5分鐘的峰(CHEMCOBOND5-ODS-H10x150mm,3mL/min,5-30%CH3CN/50mMTEAA緩沖液(20分鐘)，在260nm下檢測)。圖7示出反相HPLC的圖。分離提純箭頭指向的峰所表示的餾分。將用HPLC提純得到的生成物通過MALDITOFMS的負離子才莫式進行測定，在4848.8處出現(xiàn)峰，確認其為DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110。圖8示出DNA寡聚物(寡聚核苷酸)IIO的MALDITOFMS語圖。該圖中，箭頭指向的是來自前述提純的生成物的質(zhì)量峰(4848.8)。該峰的值與從帶2個正電荷的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)110的分子M(C18。H22。N56078P12S2)去掉3個質(zhì)子的[^/[2+-3H+]—計算的計算值4848.8—致。此外，左右的峰是來自作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而加入的DNA的T8聚體和T18聚體的峰?！笇嵤├?:DNA寡聚物(寡聚核苷酸)IIO作為熒光引物的使用1對實施例6中提純的DNA寡聚物(寡聚核苷酸110)(帶有兩分子染料的DNA)進行脫鹽，冷凍干燥之后，制成水溶液，通過UV吸收確定濃度(X與T近似)。之后，在鏈濃度2.5^iM、磷酸緩沖液50mM(pH7.0)、NaCl1OOmM的條件下，對熒光引物(DNA寡聚物llO)處于單鏈體狀態(tài)、DNA-DNA雙螺旋、DNA-RNA雙螺旋的各種狀態(tài)進行UV測定。圖9中示出這3個樣品的譜圖。如圖所示，由于形成雙螺旋，500nm附近的UV吸收的最大波長發(fā)生了移動。接下來，同樣在鏈濃度2.5(iM、磷酸緩沖液50mM(pl17.0)、NaCllOOmM的條件下，通過488nm的激發(fā)光(帶寬1.5nm)激發(fā)后進行熒光測定。圖10分別示出熒光引物(熒光DNA寡聚物)是單鏈體狀態(tài)時、DNA-DNA雙螺旋時、DNA-RNA雙螺旋時的3個樣品各自的光譜。如圖所示，發(fā)現(xiàn)與單鏈體狀態(tài)的熒光引物的530nm的熒光強度相比，DNA-DNA中觀察到15倍的熒光強度的增加，DNA-RNA中觀察到22倍的熒光強度的增加。此外，使用510nm的激發(fā)光代替488nm的激發(fā)光也能得到同樣的結(jié)果。在圖ll中示出其光譜。及其作為熒光引物的使用l化合物(DNA寡聚物)。合成中，除將原料5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變?yōu)橄鄳?yīng)于linker長度而改變碳原子數(shù)(鏈長)的化合物以夕卜，與前述實施例l~4及6采用同樣進行。在本實施例中，下述化合物113的序列為5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(X為染料導(dǎo)入部分)。并且，將各化合物與實施例7—樣作為熒光引物使用，通過熒光測定評價性能。其結(jié)果可確認只要在如下所示的linker長度范圍內(nèi)，通過與目的核酸的雜交可獲得比引物單鏈體接近約10倍或超過10倍的熒光增大。此外，通過引物和目的核酸得到的雙鏈體表現(xiàn)出比天然序列的雙鏈體更高的熱穩(wěn)定性。113<table>tableseeoriginaldocumentpage121</column></row><table>200810006572.5<table>tableseeoriginaldocumentpage122</column></row><table>5'-d(CGCAATTTAACGC)-3'/5'-d(GCGTTAAATTGCG)-3'Tm(。C)585'-d(CGCAATTTAACGC)-3V5'-r(GCGUUAAAUUGCG)陽3'Tm(。C)46測定條件引物(化合物113)2.5jiM，磷酸緩沖液50mM(pH7.0),NaCl100mM,互補鏈2.5一焚光的最大波長是用488nm(1.5nm寬度)的光激發(fā)時的值。量子效率以9,10-二苯基蒽為參照物質(zhì)進行計算。圖12中示出實施例8中l(wèi)inker長度n二4時的吸收光i普。關(guān)注在400~600nm下的吸收，單鏈體狀態(tài)時的吸收帶與雜交后的吸收帶相比出現(xiàn)在短波長一側(cè)，明確顯示單鏈體狀態(tài)下的染料二聚物導(dǎo)致形成H締合體。此外，圖13中同時示出實施例8中的linker長度r^4時的激發(fā)光譜和熒光發(fā)光光譜。該圖中，左側(cè)(短波長一側(cè)))的曲線表示激發(fā)光譜，右側(cè)(長波長一側(cè))的曲線表示熒光發(fā)光光譜。此外，該圖中，附注的括號內(nèi)分別表示激發(fā)光諳下參照的熒光發(fā)光的波長，熒光發(fā)光光譜下參照的激發(fā)波長。由激發(fā)光譜可知熒光發(fā)光的吸收，只在圖12的長波長一側(cè)的吸收帶，短波長一側(cè)的吸收不參與焚光發(fā)光。就是說，明確顯示激發(fā)子效果發(fā)揮控制熒光發(fā)光的作用。因此，熒光發(fā)光在雜交后加強，在單鏈體狀態(tài)下極弱。由此，能明確區(qū)別雜交前后的狀態(tài)?！笇嵤├?1分子中僅包含l個染料結(jié)構(gòu)的化合物(DNA寡聚物)。合成中，除將原料5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變?yōu)殒滈L與linker長度相應(yīng)的碳原子數(shù)(鏈長)的化合物和使用雙(2-氨基乙基)曱基胺代替化合物102的合成中使用的三(2-氨基乙基)胺以外，與前述實施例1~4及6同樣進行分別用同樣的方法進行合成。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage123</formula>更具體而言，按照下述路線合成。下述路線是r^4的情況n為其它數(shù)值的情況也同樣合成。(E)—5—(3—(2-(N-曱基—N-(2—(2，2,2-三氟乙酸纖維)乙基)胺基)乙氨基)-3-氧代丙基-1-烯基)-2，-脫氧尿苷((E)-5-(3-(2-(N-Methyl-N-(2-(2,2,2-trifluoroacetamido)ethyl)amino)ethylamino)-3-oxoprop-1一enyl)—2'—deoxyuridine)(102,)的合成將1.19g(4.0mmo1)的(E)-5—(2—羧基乙烯基)一2，-脫氧尿苷101(分子量298.25)和921mg(8.0mmo1)的N-羥基琥珀酰亞胺(分子量115.09)和1.53g(8.0mmo1)的l-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺(分子量191.70)放入裝有攪拌器的梨形燒瓶，加入1.OmL的DMF，在25。C下攪拌8小時。力口入約lmL的醋酸，力口入250mL的二氯甲烷和250mL的超純水，劇烈攪拌。過濾產(chǎn)生的沉淀，用水洗滌，在減壓下通宵干燥。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage124</formula>將得到的白色殘渣懸浮于100mL的乙腈中，劇烈攪拌。向其中一次性加入2.34g(20mmo1)的N-曱基-2，2，-二胺基二乙基胺(分子量146.23,d=0.976),在25°C下再攪拌10分鐘。之后，力口入4.8mL(40mmo1)的三氟醋酸乙酯(分子量142.08,d=1.194),5.6mL(40mmol)的三乙胺(分子量101.19,d=0.726)以及50mL的乙醇，在25。C下攪拌16小時。從得到的混合物中減壓蒸餾去除溶劑，用硅膠柱提純(10-20%MeOH/CH2Cl2)。從含有目的物的餾分中減壓蒸餾去除溶劑，使其溶解于少量的丙酮中，加入乙醚后產(chǎn)生白色沉淀。過濾，用乙醚洗滌后，在減壓下進行干燥，得到750mg(76。/。)的目的物(化合物102')的白色粉末。下面示出儀器分析值。化合物102':力麗R(CD30D)S8.29(s，1H),7.17(d,J=15.6IIz,1H),6.97(d,J=15.6Hz,1H)，6.21(t，J=6.3Hz,1H)，4.40.4.36(m，1H)，3.92.3.90(m，1H)，3.80(dd，J=11.7,2.9Hz，1H),3.72(dd,H1.7，3.4Hz，1H),3.37.3.25(m，511)，2.60.2.53(m,5H),2.33.2.19(m,5H):13CNMR(CD3OD)5169.2,158.7(q，J二36.4Hz)，151.2，143.7,143.6,134.1,122.2,117.5(q，J二286.2Hz)，111.0，89.2,87.0,72.1,62.6，57.4，56.7,42.4,41.8,38.5,38.3:HRMS(ESI)calcdforC19H27F3N507([M+H]+)494.1863，found494.1854。首先，將296mg(0.60mmo1)的化合物102，(分子量494.19)與224mg(0.66mmo1)的4,4'-二甲氧基三苯曱基氯化物(分子量338.83)放入裝有攪拌器的梨形燒瓶，加入4mL的吡啶，在25。C下攪拌2小時。加入lmL水，減壓蒸餾去除溶劑，用硅膠柱進行提純(1.5%MeOH以及l(fā)。/。Et3N/CH2Cl2)。濃縮含有作為目標(biāo)物102，的三苯曱基化物(104，的中間體)的餾分，向殘渣中加入飽和碳酸氫鈉水溶液。用乙酸乙酯萃取前述混合物，再用飽和食鹽水洗滌，在減壓下進行干燥，得到了白色泡狀三苯曱基化物(366mg,77%)。]HNMR(CD30D)S7.94(s,1H)，7.42.7.17(m，9H),7.01(d,J=15.6Hz，1H),6.95(d,J=15.6Hz,1H),6.86.6.83(m,4H),6.21(t,J=6.3Hz,1H),4.41.4.38(m，1H)，4.09.4.06(m,1H),3.75(s,6H),3.40.3.30(m,6H),2.59(t,J=6.8Hz，2H),2.53(t,J=6.8Hz,2H)，2.46.2.31(m,5H):13CNMR(CD3OD)5169.2,158.7(q,J=36.4Hz),151.2,143.7,143.6,134.1,122.2，117.5(q,J=286.2Hz)，111.0,89.2,87.0,72.1,62.6,57.4,56.7，42.4，41.8，38.5,38.3:HRMS(ESI)calcdforC40H45F3N5O9([M+H]十)796.3169,found796.3166。將159mg(0.20mmol)前述102，三苯曱基化物(分子量920.85)以及28.6mg(0.40mmol)1H-四哇(分子量70.05)置于圓底燒瓶內(nèi)，用真空泵整晚進行抽氣千燥。再向其中加入4.0mL的CH3CN溶解試劑后，進行攪拌，一次性加入191^L(0.60mmol)的2-氰基乙基-N,N,N，，N，-四異丙基亞磷酰胺(分子量301.41,d=0.949),在25。C下攪拌2小時。用TLC確認反應(yīng)結(jié)束后，加入飽和碳酸氫鈉水溶液，用乙酸乙酯進行萃取，用飽和食鹽水洗滌有機層后，用硫酸鎂進行干燥。通過過濾除去硫酸鎂，減壓蒸餾去除溶劑后得到包含目的化合物104，的粗生成物。不對此組成物進行提純直4妄用于DNA合成。此外，得到了化合物104，由前述粗生成物"PNMR(CDC13)和HRMS(ESI)來確認。下面示出這些值?；衔?04，31PNMR(CDC13)S149.686,149.393:HRMS(ESI)calcdforC49H61F3N7O10P([M+H]+)996.4248,found996,4243。dna105，的合成與前述化合物105同樣進行。下面示出儀器分析值。DNA105，CGCAAT[105，]TAACGC,calcdforC133H174N51076P12([M+H]十)4074.8,found4072.0;CGCAAT[105，][105，]AACGC，calcdforC140H187N54O77P12([M+H]+)4230.0,found4228.9。導(dǎo)入了p塞唑橙的DNA114的合成與前述化合物113同樣進行。下面示出儀器分析值。CGCAAT[114](4)TAACGC，calcdforC156H194N53077P12S(m+)4447.3,found4445.6;cgcaat[114](4)[114](4)aacgc,calcdforC186H228N58079P12S2([M,H]十)4976.0,found4976.9。對合成的DNA寡聚物(ODN)中具有5，-d(CGCAAT[114|u)TAACGC)-3'序列的ODN(僅包含l個染料的引物)，與實施例7及8同樣觀測熒光情況。在下述表2、圖14及15示出其結(jié)果。圖14表示吸收光譜，圖15表示激發(fā)光譜及發(fā)光光譜。圖15中，左側(cè)(短波長一側(cè))的曲線表示激發(fā)光譜，右側(cè)(長波長一側(cè))的曲線表示焚光發(fā)光光譜。此外，該圖中，附注的波長分別表示激發(fā)光譜中參照的熒光發(fā)光的波長、熒光發(fā)光光譜中參照的激發(fā)波長。按照圖示，因為化合物114在1個分子中只有1個染料結(jié)構(gòu)，不形成H締合體，因此不產(chǎn)生激發(fā)子效果(吸收光譜中觀察不到向短波長一側(cè)的移動)。因此，單鏈體狀態(tài)下的熒光淬滅比具有2個染料結(jié)構(gòu)的化合物弱，雙鏈體和單鏈體的熒光強度比lds/U匕較小。但是，由于形成雙鏈體所導(dǎo)致的染料嵌入，使得染料的結(jié)構(gòu)平坦化，如下述表2所示，雙鏈體狀態(tài)比單鏈體狀態(tài)得到更大的熒光強度。此外，對于單鏈體，將激發(fā)波長從488nm變?yōu)樵赨V吸收光諮中的Xmax(有2個^^時為長波長一側(cè))，得到量子效率①產(chǎn)0.120的測定結(jié)果。并且，對于DNA-DNA雙鏈體，將激發(fā)波長從488nm變?yōu)樵赨V吸收光譜中的、ax(有2個Uax時為長波長一側(cè))，得到量子效率(D產(chǎn)0.307,雙鏈體和單鏈體的熒光強度比為Ids/1ss=3.4的測定結(jié)果。<table>tableseeoriginaldocumentpage128</column></row><table>測定條件引物2.5iiM,磷酸緩沖50mM(pH7.0),NaCllOOmM，互補鏈2.5(iM熒光的最大波長是用488nm(1.5nm寬)的光進行激發(fā)時的值。以9，10-二苯基蒽為參照物計算量子效率。[實施例101除用下述化學(xué)式115所示的化合物代替前述化合物107作為染料以外，與實施例9同樣合成1分子中僅含有1個染料結(jié)構(gòu)的化合物(DNA寡聚物)。使鏈長n從l~4發(fā)生各種變化地進行合成。序列與前述化合物105的序列5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(X為染料導(dǎo)入部分)相同。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage129</formula>下述化合物116是r^2時的情況。對化合物116與實施例7~9同樣進行熒光強度的評價，發(fā)現(xiàn)DNA-RNA雙鏈體的狀態(tài)下比單鏈體狀態(tài)下的熒光強度增加。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage129</formula>r熒光壽命測定i對實施例8(染料2個)以及實施例9(染料l個)的DNA寡聚物(寡聚核苷酸)，分別測定單鏈體和雙鏈體狀態(tài)下熒光強度的壽命。作為測定對照的DNA寡聚物在下述序列X的位置插入導(dǎo)入有染料的核苷酸。5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，(序歹'J號1)5，-d(GCGTTAAATTGCG)-3，(序歹ll號2)下述表3示出前述熒光壽命測定的結(jié)果。表中，T為熒光壽命(ns)。CHISQ為測定誤差。Tl表示從激發(fā)完成開始的經(jīng)過時間。T2表示實施例8的染料2個的引物經(jīng)過時間Tl后進一步經(jīng)過的時間，實施例9的染料1個的引物從激發(fā)完成開始的經(jīng)過時間。T3表示經(jīng)過時間T2后進一步經(jīng)過的時間。表中，"％"所表示的數(shù)值為分別經(jīng)過時間Tl,T2或T3期間的熒光衰減率(將激發(fā)完成后的熒光強度設(shè)為100%)，對各引物(DNA寡聚物)合計為100%。按照表3所示，包含染料2個的引物(實施例8)單鏈體狀態(tài)下，為極短的猝滅過程(激發(fā)后經(jīng)0.0210ns熒光衰減率81.54%),顯示出激發(fā)子效果的存在。其它情況下沒有發(fā)現(xiàn)。該用2個染料標(biāo)記的ODN的單鏈體狀態(tài)下的熒光猝滅，在熒光強度隨雜交特異性且急劇的變化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。另外，按照表3可知，熒光猝滅特性與二次函數(shù)或三次函數(shù)特性一致。另外，對下述表3的染料2個的雙鏈體再次在相同條件下測定(其中，省略了Tl測定)時，T2=2.05中的熒光衰減率為44%，T3=4.38的熒光衰減率為56%,T=3.33(ns)，CHISQ=1.09，得到與下述表3極相近的值。即，可知該實施例的引物在該熒光壽命測定中的再現(xiàn)性優(yōu)異。<table>tableseeoriginaldocumentpage130</column></row><table>在鏈2.5pM、磷酸緩沖液50mM(pH7.0)、NaC1100mM、455證(prompt)600nm(decay)下測定除用下述化學(xué)式115，所示化合物代替前述化合物107作為染料以外，與實施例8同樣合成下述化學(xué)式117所示的DNA寡聚物。n=3、4、5、6的化合物可分別用同樣的方法進行合成。進一步與實施例8同樣作為熒光引物使用，通過熒光測定對性能進行評價。在下述表4中示出其結(jié)果。按照表4所示，化合物117與實施例8的DNA寡聚物(化合物113)吸收帶不同，但同樣顯示出良好的激發(fā)子效果。這表明在本發(fā)明中使用吸收帶不同的熒光引物可進行多色下的檢測。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage132</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>合成下述序列所示DNA寡聚物(化合物118)。X為具有與實施例9同樣染料結(jié)構(gòu)的核苷酸(下述式作為化學(xué)式118)。按照下述序列所示，該DNA寡聚物是2個導(dǎo)入有染料的核苷酸連續(xù)排列。染料的導(dǎo)入和DNA寡聚物的合成通過與前述各實施例同樣的方法來進4亍。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage133</formula>(序歹'J號3)進一步，將該DNA寡聚物與前述各實施例同樣作為熒光引物使用，通過熒光測定對性能進行評價。引物2.5(iM(鏈濃度)，磷酸緩沖液50mM(pH7.0)，NaCl100mM,互補鏈2.5jiM(鏈濃度)。在圖16和17中示出其結(jié)果。圖16為表示吸收光譜的圖，圖17為同時表示激發(fā)光譜和熒光發(fā)光光譜的圖。圖17中，左側(cè)(短波長側(cè))的曲線表示激發(fā)光謙，右側(cè)(長波長側(cè))的曲線表示熒光發(fā)光光鐠。按照圖示，像這樣，2個導(dǎo)入有染料的核苷酸連續(xù)排列的情況下，染料間距離可以靠近而顯示激發(fā)子效果，可通過熒光強度明確地對與目的核酸雜交前后的狀態(tài)進行區(qū)分。[實施例13]對linker長度n和核酸序列進行各種改變來合成前述化學(xué)式113或114所示的化合物(DNA寡聚物)即下述表5所示的各ODN。另外"ODN"如前所述是指寡聚DNA(DNA寡聚物)。合成中，除將原料即5-溴代戊酸(5-溴代戊酸)變?yōu)榕clinker長度相應(yīng)的碳原子數(shù)(鏈長)的化合物、在寡聚DNA合成中適當(dāng)改變序列以外，與前述實施例14、6、8、9或12同樣進行。另夕卜ODNl與實施例8中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同，ODN4和ODN5與實施例9中合成的寡聚DNA(DNA寡聚物)相同。在合成中，瘞唑橙的N-幾基琥珀酰亞胺酯(化合物109)使用活性氨基的50當(dāng)量或其以上。合成后，反相HPLC的展開時間根據(jù)需要為20~30分鐘或其以上。另夕卜，下面例如[113:卜n)或[114j(n,表示在該位置插入化學(xué)式113或114所示的核苷酸。n為linker長度。另外，下述表5中0DN1，表示與0DN1互補的DNA鏈。同樣，ODN2，表示與ODN2互補的DNA鏈，ODN3，表示與ODN3互補的DNA鏈。ODN(anti4,5S)GCCTCCT[113](4)CAGCAAATCC[113]'4)ACCGGCGTG(序列號9)ODN(antiBl)CCTCCCAAGH13")GCTGGGATfH3L^AAAGGCGTG(序列號10)合成的各ODN與前述實施例4同樣通過酶消化來決定濃度。進一步，合成的各ODN通過MALDITOFMS譜圖進行鑒定。以下示出其質(zhì)量分析值。0DN1(n=3)，CGCAAT[U3〗(3>TAACGC,calcdforC178H213N56078P12S2([M.H〗+)4820.7,found4818.9;ODNl<table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table>(n=4),CGCAAT[113](4)TAACGC,calcdforC18。H217N56078P12S2([M.H]+)4848.8，found4751.4;ODN1(n=5),CGCAAT[113](5)TAACGC,calcdforC182H221N56078P12S2([M.H]十)4876.8,found4875.6;ODN1(n=6)，CGCAAT[U3](6>TAACGC,calcdforC184H225N56078P12S2(([M.H]+)4904.9，found4903.6;ODN2,TTTTTT[113](4)丁TTTTT,calcdforC184H227N34092P2S2([M.H]+)4822.8，found4821.4;ODN3，TGAAGGGCTT[113](4)TGAACTCTG,calcdforC251H305N81O124P19S2([M.H]+)7093.2,found7092.3;ODN(anti4.5S),GCCTCCT[113〗(4)CAGCAAATCC[l13〗(4)ACCGGCGTG，calcdforC377H456N1160173P27S4(LM.3H]+)10344.9,found10342.7;ODN(antiBl)，CCTCCCAAG[l13](4)GCTGGGAT[l13](4)AAAGGCGTG，calcdforC381H456N1240172P27S4([M.3H]十)10489.0，found10489.8。在前述表5的ODN中，對于包含序列和linker長度進行各種變化的[113]u、的ODN(ODNl、ODN2、ODN3),在與互補鏈雜交前后，分別對吸光譜圖，激發(fā)光譜和發(fā)光光譜進行測定。將結(jié)果綜合在下述表6、圖18和圖19中示出。<table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table>測定條件在2.5iiMDNA，50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0),100mM氯化鈉下以b488nm激發(fā)，以lmax激發(fā)(有2個Xmax時，以長波長側(cè)的人眼x激發(fā))，d雙鏈體狀態(tài)和單鏈體狀態(tài)的Xw的熒光強度比。另夕卜，表6中，ODN1(n=3~6)為與前述實施例8的寡聚DNA(5，-d(CGCAATXTAACGC)-3，，X為染料U3導(dǎo)入部分)相同的結(jié)構(gòu)。其中，實施例8中，熒光量子效率OF和雙鏈(雙鏈體)狀態(tài)和單鏈(單鏈體)狀態(tài)的熒光強度比(Ids/Iss)以波長488nm激發(fā)進行測定，但該實施例(實施例13)中，如上所述，以UV吸收光譜中的、ax激發(fā)進行測定。因此，前述表1(實施例8)和前述表6(實施例13)中即4吏是相同物質(zhì)，Of和lds/Iss也不同。圖18是表示含有[113](4)的ODN的吸收光譜，激發(fā)光語和發(fā)光光譜的圖表。該圖(a)、(b)和(c)中左側(cè)的圖表表示吸收光i普，橫軸為波長，縱軸為吸光度。右側(cè)的圖表表示激發(fā)光譜和發(fā)光光語，橫軸為波長，縱軸為發(fā)光強度。各測定是以包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中的含[113〗u)的ODN作為試樣，在25。C下進行。圖18中的各圖表中，黑線表示單鏈體ODN(ss)的測定結(jié)果，灰線表示與對應(yīng)的互補鏈DNA雜交的ODN(w的測定結(jié)果。圖18(a)表示ODNl(n=4)(2.5pM)的測定結(jié)果。激發(fā)光譜中，ss中測定波長534nm的發(fā)光強度，ds中測定波長528nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長519nm激發(fā)進行測定，ds中以波長514nm激發(fā)進行測定。圖18(b)表示0DN2的測定結(jié)果。左側(cè)的圖表中鏈濃度為2.5|iM,右側(cè)的圖表中鏈濃度為lpM。激發(fā)光"i普中，ss中測定波長534nm的發(fā)光強度，ds中測定波長537nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長517nm激發(fā)進行測定，ds中以波長519nm激發(fā)進行測定。圖18(c)表示ODN3的測定結(jié)果。鏈濃度為2.5^M。激發(fā)光傳中，ss中測定波長535nm的發(fā)光強度，ds中測定波長530nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長518nm激發(fā)進行測定，ds中以波長516nm激發(fā)進4亍測定。圖19為表示0DN1(n=3、5和6)的吸收光i普，激發(fā)光^普和發(fā)光光語的圖表。該圖(a)、(b)和(c)中，左側(cè)的圖表表示吸收光語，橫軸為波長，縱軸為吸光度。右側(cè)的圖表表示激發(fā)光譜和發(fā)光光譜，橫軸為波長，縱軸為發(fā)光強度。各測定將包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pHN7.0)中的0DN1(n=3、5或6)作為試樣，在25。C下進行。圖19中的各圖表中，黑線表示單鏈體ODN(ss)的測定結(jié)果，灰線表示與對應(yīng)的互補鏈DNA雜交的ODN(ds)的測定結(jié)果。圖19(a)表示ODNl(n=3)(2.5pM)的測定結(jié)果。激發(fā)光i普中，ss中測定波長537nm的發(fā)光強度，ds中測定波長529nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長521nm激發(fā)進行測定，ds中以波長511nm激發(fā)進行測定。圖19(b)表示ODNl(n二5)(2.5jiM)的測定結(jié)果。激發(fā)光i普中，ss中測定波長538nm的發(fā)光強度，ds中測定波長529nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長520nm激發(fā)進行測定，ds中以波長512nm激發(fā)進行測定。圖19(c)表示0DN1(n=6)的測定結(jié)果。鏈濃度為2.5pM。激發(fā)光i普中，ss中測定波長536nm的發(fā)光強度，ds中測定波長528nm的發(fā)光強度。發(fā)光光譜中，ss中以波長523nm激發(fā)進行測定，ds中以波長514nm激發(fā)進行測定。按照表6、圖18和圖19所示，各含有[113](n)的ODN試樣，在400~550nm范圍內(nèi)觀測到2個吸收帶。短波長側(cè)(~480nm)的吸收帶在含有l(wèi)(n)的ODN試樣為單鏈體狀態(tài)時更強，長波長側(cè)(~510nm)的吸收帶在含有l(wèi)(n)的ODN試樣與互補鏈雜交時明顯(優(yōu)勢性)顯現(xiàn)。長波長側(cè)(~510nm)的吸收帶為P塞唑橙單體的代表性的吸收帶。發(fā)光光譜中，在~530nm觀測到單一的寬的吸收帶。通過含有[113](n)的ODN試樣與互補鏈雜交，發(fā)光強度明顯變化。即與目的DNA鏈雜交的含有[113](n)的ODN試樣顯示強的熒光，雜交前的含有[113](n)的ODN試樣僅顯示與雜交后相比極弱的熒光。特別是由多嘧啶序列形成的0DN2的熒光在單鏈(單鏈體)狀態(tài)下基本完全猝滅。最大發(fā)光波長下的0DN2的雙鏈(雙鏈體)狀態(tài)和單鏈(單鏈體)狀態(tài)的熒光強度比(Ids/Iss)達到160。使20—mer的通常的ODN3，鏈與ODN3進行雜交的情況下，雜交前后發(fā)光強度明顯不同。進一步按照表6、圖18(a)和圖19可知，將該實施例的ODNl中l(wèi)inker長度n從3變?yōu)?的情況下，任意的linker長度都得到大的Ids/IsJi。這樣，表6所示的ODN由于引物的序列和linker長度而在猝滅性能上存在差異，但均顯示出良好的猝滅性能。另夕卜，按照前述表6所示，ODNl(n=4)/ODNl，的融點(Tm)比天然雙《連體5，-CGCAATTTAACGC-3VODNl，上升7~9°C。該Tm值的上升表明引物中的2個陽離子性染料有效地結(jié)合在與目的序列一起形成的雙鏈體上。進一步，按照圖18和19可知，激發(fā)光譜與化合物的結(jié)構(gòu)無關(guān)，在510nm附近顯示單一的寬峰。該波長與吸收帶的一個波長顯示出良好的一致。即與熒光發(fā)光相關(guān)的吸收僅在510nm附近的吸收帶，480nm附近的吸收帶基本不影響發(fā)光。另外，從染料締合導(dǎo)致吸收帶從510nm的附近移動到480nm附近，可預(yù)測激發(fā)耦合能量為1230cm—1。這與被報道的花青染料的H締合體的耦合能量同等。其中，這些理論的考察并不限定本發(fā)明。[吸收光譜]在各種溫度和濃度下，測定前述ODNl(n=4)的吸收光譜以確認溫度和濃度對吸收帶的影響。圖20的吸收光譜中表示出該結(jié)果。該圖(a)和(b)中，橫軸為波長，縱軸為吸光度。各測定將包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH==7.0)中的ODNl(n=4)作為試樣來進行。圖20(a)表示改變?nèi)芤簻囟葧r的吸收光譜變化。ODN濃度為2.5[iM。謙圖從10。C起，至90。C,每隔1(TC進行測定。圖20(b)表示改變?nèi)芤簼舛葧r的吸收光譜變化。測定溫度為25。C。ODN濃度為0.5，0.75，1.0,1.2,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0和5.0iiM。另外，插入圖為表示波長479nm下的吸光度的對數(shù)(縱軸)與波長509nm下的吸光度的對數(shù)(橫軸)的關(guān)系的圖表。按照圖20(a)所示，改變試樣溫度進行測定時，2個吸收帶的吸光度比發(fā)生若千變化。即隨著試樣溫度的上升，479nm的吸收帶逐漸減少，509nm的吸收帶增大。但是，該變化按照該圖可知極微弱。這表明，在本發(fā)明的引物的0DN1(n=4)中，伴隨溫度變化的結(jié)構(gòu)變化極微弱，可基本上不受溫度影響地使用。另外，按照該圖所示，487nm下，觀測到等吸收點，該點顯示2個光語構(gòu)成要素的存在。另一方面，按照圖20(b)所示，增加ODN1(n=4)的試樣濃度時，在兩方的吸收帶中觀測到吸光度的增加。另外，按照插入圖所示，以log(Abs479)對log(Abs5。9)作圖，即各吸收帶中的吸光度的對數(shù)的比顯示為直線。這表明2個光譜構(gòu)成要素的比與ODN濃度無關(guān)，而是基本為一定。即，本發(fā)明的引物的0DN1(n=4)由于即使改變?nèi)芤褐械臐舛龋Y(jié)構(gòu)也基本不變，可在濃度上不受影響地使用。另外，圖20(a)和(b)的譜圖變化的主要原因可進行如下說明，但這些說明為理論考察的一例，并不限定本發(fā)明。即，首先，0DN1(n=4)通過雙色性系統(tǒng)而形成分子內(nèi)H締合體。圖20(a)中的鐠圖變化推測為是由于溫度上升，導(dǎo)致H締合體的結(jié)構(gòu)發(fā)生若千松弛。另外，認為前述分子內(nèi)H締合體已在分子內(nèi)完成(在分子內(nèi)未形成H締合體)，因此即使?jié)舛壬仙?，也基本沒有分子間相互作用等導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變化，如圖20(b)和插入圖所示，2個光譜構(gòu)成要素的比基本為一定。另外，認為在ODNl(n=4)的試樣溶液中存在分子內(nèi)H締合體和染料單體(染料部分未締合)的2個構(gòu)象模式。短波長側(cè)(479nm)的吸收帶推測來自于分子內(nèi)H締合體。長波長側(cè)的吸收帶(509nm)由于加熱而增大，因此推測其來自于染料單體。[CD光謙]對0DN1(n=4)/0DN1，的CD光語進行測定。鏈濃度為2.5(iM，在包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中、25。C下進行測定。在圖21的CD光語中示出其測定結(jié)果。該圖中，橫軸為波長(nm)，縱軸為角度e。按照圖示，0DN1(n=4)/0DN1"又《連體表示450~550nm中分裂型的Cotton戔文果(split-effect)。即，進行測定的CD對顯示出噻唑橙染料嵌入DNA雙鏈體時的代表性的圖案。即ODN1(n=4)的染料部分嵌入形成的雙鏈體DNA,強烈阻礙二色性締合體(H締合體)的形成。該CD測定的結(jié)果加上前述Tm測定結(jié)果表明ODN1(n=4)中的染料部分與雙鏈體DNA結(jié)合時，2個染料部分都嵌入大溝，形成熱學(xué)上穩(wěn)定的雙鏈體結(jié)構(gòu)。但是，該理論的考察不對本發(fā)明進行限定。形成的雙鏈體結(jié)構(gòu)在熱學(xué)上穩(wěn)定，這表明本發(fā)明的引物(核酸)可在互補的序列的檢測中有效地使用。對前述ODN5(CGCAAT[114](4)[114](4)AACGC)雙鏈體狀態(tài)和單鏈體狀態(tài)的吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)光光譜進行測定。其結(jié)果在下述表7和圖22中示出。A隨/nm(e)吖7n,/。CODN5483(123000)511(118000)5450.059ODN5/ODN1'509(180000)5280.27510.371測定條件在2.5(iMDNA,50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0),lOOmM氯化鈉下，以b488nm激發(fā)，以lma,x激發(fā)(有2個Xmax時，以長波長側(cè)的Xmax激發(fā))，d雙鏈體狀態(tài)和單鏈體狀態(tài)的Xem的熒光強度比。圖22是表示ODN5即含有[114]u)的ODN的吸收光譜、激發(fā)光譜和發(fā)光光譜的圖表。ODN5的鏈濃度為2.5jaM,在包含100mM氯化鈉的50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7.0)中、25。C下進行測定。黑線表示單鏈體ODN5(ss)的測定結(jié)果，灰線表示與ODNl，雜交的雙鏈體ODN5(ds)的測定結(jié)果。(a)為吸收光譜，橫軸為波長，縱軸為吸光度。(b)為激發(fā)光譜和發(fā)光光譜，橫軸為波長，縱軸為發(fā)光強度。激發(fā)光譜中，對ss測定了波長534nm的發(fā)光強度，對ds測定了波長514nm的發(fā)光強度。發(fā)光光語中，對ss以波長528nm進行激發(fā)，對ds以波長519nm激發(fā)。按照前述表7和圖22所示，2個[114](4)核苷酸相連的序列的ODN5的發(fā)光抑制與僅包含一個含有[114](4)核苷酸的單鏈體ODN4(前述實施例9的表2)相比，顯示出更有效的熒光猝滅。ODN5的吸收光譜，在單鏈體狀態(tài)下，吸收帶向短波長側(cè)移動。這表明ODN5所包含的2個[114](4)核苷酸形成分子內(nèi)H締合體。該締合與用含有[113](n)的ODN觀測的相同，關(guān)系到單鏈體ODN5的猝滅。即，認為ODN5內(nèi)的2個[114](4)核苷酸的染料部分由于H締合而在前述染料間發(fā)生激發(fā)耦合，這是熒光發(fā)光抑制(猝滅)的原因。由此確認包含2個[114](4)核苷酸的ODN5與含有[113]u,的ODN同樣在互補鏈檢測有用。用肉眼對ODNl(n=4)與互補的0DN1，雜交時的焚光進行測定。圖23示出其測定結(jié)果。該圖左組是包含ODNl(n=4)單鏈體的組，該圖右組是包含ODNl(n=4)/0DN1，雙鏈體的組，分別表示照射150W卣素?zé)艉蟮臓顟B(tài)。各組中的鏈濃度分別為2.5pM,磷酸緩沖液(磷酸鈉緩沖液)50mM(pH7.0)并包含NaCl100mM。按照圖示，照射150W卣素?zé)艉?，包?DN1(n=4)單鏈體的圖左組基本未發(fā)出熒光，但包含0DN1(n二4)/0DN1，雙鏈體的圖右組顯示極明顯的淡綠色的熒光。另外，即使將互補的DNA鏈0DN1，換成對應(yīng)的互補的RNA鏈也得到同樣的結(jié)果。進一步，ODN2和ODN2，也得到同樣的結(jié)果。進一步，在ODN2和ODN2，的情況下，即使將ODN2，換成對應(yīng)的互補的RNA(A13聚體)也得到同樣的結(jié)果。另外，這些情況下的鏈濃度為5pM。另外，此外對前述表6的全部ODN得到相同的結(jié)果。這樣，^^艮據(jù)該實施例的ODN，由于依賴熒光強度而明顯變化，可雜交的目的序列通過^^果眼可容易地判定。這表明這些ODN在可視性基因分析中有用。[實施例16]除使用下述化學(xué)式119所示化合物代替前述化合物107作為染料以外，與實施例8同樣合成下述化學(xué)式120所示DNA寡聚物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage144</formula>可以分別用同樣的方法合成上述式120中N:3、4、5和6的化合物(寡聚DNA)。進一步，將序列5，-d(CGCAAT[120](5)TAACGC)-3'所示ODN(ODN6(n=5))用作熒光引物，測定吸收光譜和熒光發(fā)光光錯進行性能評價。測定條件與實施例7同樣。在圖24中示出其測定結(jié)果。圖24(a)為吸收光譜，橫軸為波長(nm),縱軸為吸光度。圖24(b)為熒光發(fā)光光謙，橫軸為波長(nm),縱軸為發(fā)光強度。黑線表示單鏈體ODN的譜圖，灰色的線表示互補的ODN雜交形成的雙鏈體ODN的譜圖。按照圖24(a)所示，雙鏈體ODN通過雙螺旋形成，600nm附近的UV吸收的最大波長發(fā)生移動。另外，按照圖24(b)所示，雙鏈體ODN比單鏈體熒光強度大幅度增加。由這些事實，可認為單鏈體狀態(tài)下表現(xiàn)出激發(fā)子效果。即該實施例的ODN(化合物120)與實施例8的ODN(化合物113)和實施例U的ODN(化合物117)吸收帶不同但同樣顯示出良好的激發(fā)子效果。這表明本發(fā)明中使用吸收帶不同的熒光引物，可用多色檢測。在溫箱中，使前述ODN2(序列5，-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3，)與其對應(yīng)的互補的RNA鏈(RNAA13mer)形成雙鏈體ODN，測定熒光發(fā)光光語。進一步，在其中添加RNaseH,觀察譜圖的變化。在圖25中示出其結(jié)果。該圖中，橫軸為時間，縱軸為熒光強度。圖中，黑線表示在中途添加RNaseH的前述雙鏈體ODN的謙圖變化，灰色的線表示對照，即表示未添加RNaseH的前述雙《連體ODN的i普圖變化。在37。C下邊攪拌邊使用前述熒光分光器進行測定。按照圖示，當(dāng)添加RNaseH后，與前述ODN2雜交的RNA被消化，前述ODN2重新成為單鏈體，由此焚光強度逐漸減少。[實施例18]改變相對于前述ODNl(n=4)(序列5，-d(CGCAAT[113J(4、TAACGC)-3，)為互補DNA鏈的ODNl，(序列5，-d(GCGTTAAATTGCG)-3')的濃度比，觀測熒光發(fā)光強度的變化。作為測定條件，將ODNl(n=4)的纟連濃度固定在l.OjiM,磷酸緩沖液50mM(pH7.0)、NaCl100mM、激發(fā)波長為488nm(1.5nm寬度)。在互補鏈0DN1，的濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0或3.0fiM的各濃度下，分別進行測定。在圖26中示出其測定結(jié)果。該圖中橫軸表示相對于ODNl(n=4)的ODNl，的當(dāng)量數(shù)?？v軸表示熒光Xmax(529nm)下的熒光發(fā)光強度(相對值)。按照圖示，熒光發(fā)光強度在ODNl，的當(dāng)量數(shù)為l以下時，相對于前述當(dāng)量數(shù)以極高的精度顯示正比例關(guān)系，在前述當(dāng)量數(shù)超過1后沒有變化。這表明ODNl(n=4)于ODNl，正確地以1:1的物質(zhì)量比(分子數(shù)比)進行雜交。如上所述，ODNl，(目的DNA)的物質(zhì)量與ODNl(n=4)為同量以下時，熒光強度對目的DNA的濃度成比例地增大。ODNl(n=4)由于也可以作為例如探針使用，在存在ODNl，(目的DNA)的體系中，若添加過量的ODNl(n=4)(探針)，則通過熒光強度測定可對前述目的DNA進行定量。另外，通過追蹤前述熒光強度的增加和減少還可測定前述目的DNA的增加和減少。為了對體系中的前述目的DNA進行定量，可以例如圖26那樣，預(yù)先制作工作曲線。例如，ODNl，(目的DNA)濃度未知的試樣與該實施例在相同條件下進行測定時的熒光強度為80,則從圖26可知前述ODNl，(目的DNA)濃度為約0.55fiM。實際應(yīng)用中，通過在上述方法中，對核酸中的ODNl，(目的DNA)序列進行定量，在馬上檢測該序列發(fā)生擴增分解.蛋白結(jié)合等現(xiàn)象的同時，可以對這些現(xiàn)象量進行定量。為了觀察此次合成的新型熒光DNA寡聚物的、雜交引起的熒光特性變化，使用前述ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S),通過點印跡進行DNA解析。目的DNA序列使用包含BlRNA序列的短鏈DNA片段。該序列是嚙齒類基因組中的一個短分散型核內(nèi)折疊序列。另夕卜，前述短鏈DNA片段包含4.5SRNA序列。該序列是從嚙齒類細胞分離的一個低分子核內(nèi)RNA，與Bl家族具有廣泛的同源性。該參考例中制備ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S)作為印跡用的DNA寡聚物，通過在這些中整合2個[113](4)核苷酸而具有高靈敏度和高熒光強度。另外DNA寡聚物ODN(antiBl)和ODN(anti4.5S)的結(jié)構(gòu)按照前述實施例13的表5中的記載。該參考例的點印跡解析更具體而言如以下這樣進行。即，首先通過前述DNA自動合成儀制備下述(1)和(2)的2個DNA片段。(1)包含下述4.5SRNA序列和其互補DNA的DNA雙鏈體。5，—d(CCTGGGCTACACATTTTTTT)-3，(序歹ll號11)(2)包含下述B1RNA序列和其互補DNA的DNA雙鏈體。5，_d(GCCTGGTCTACAGAGTGAG)-3，(序歹'J號12)前述DNA雙4連體在含有0.5M氫氧化鈉和1M氯化鈉的水溶液中變性。將一定分量該變性DNA點在正電荷尼龍膜(Roche公司)上(點樣)。將該正電荷尼龍膜片在含有0.5M磷酸鈉和1M氯化鈉水溶液中浸濕后，在含0.5M磷酸鈉、1M氯化鈉和100jig/mL鮭魚精子DNA的水溶液中、50。C下孵育30分鐘。然后，將前述正電荷尼龍膜片在包含0.5M磷酸鈉和1M氯化鈉的DNA寡聚物水溶液(DNA寡聚物為150pmol的ODN(anti4.5S)或ODN(antiBl))中在50。C下孵育1小時。將其冷卻到室溫后，除去雜交緩沖液，并加入新的磷酸緩沖液，通過BioRad公司的VersaDocimagingsystem(商品名)觀測前述正電荷尼龍膜片所發(fā)出的熒光。作為激發(fā)光，使用和研藥抹式會社的UV透射照明器(trans—illuminator)Model—2270(商品名)所發(fā)出的光通過UV/藍色光轉(zhuǎn)換板(ConverterPlate)(UVP)而變換的光。在圖27中示出測定結(jié)果。圖27(a)為表示在尼龍膜上不同序列的DNA印跡的狀態(tài)的示意圖。上l爻的4個斑點顯示含4.5SRNA序列的DNA，下段的4個的斑點表示含BlRNA的DNA。圖27(b)為表示在含ODN(anti4.5S)溶液中孵育后的熒光發(fā)光的圖。圖27(c)為表示在含ODN(antiBl)溶液中孵育后的熒光發(fā)光的圖。按照圖27所示，印跡斑點的熒光在印跡分析后，可不進行反復(fù)洗滌而在室溫下用熒光成像裝置讀取。孵育前述探針的結(jié)果，若添加了ODN(anti4.5S)則得到來自4.5S序列的斑點的強的熒光發(fā)光，但來自Bl序列的斑點的熒光發(fā)光為可忽視的程度。對照性地，通過ODN(antiBl)添加，Bl斑點顯示強的熒光，從4.5S斑點僅觀測到極弱的熒光。像這樣，通過該參考例中制備的DNA寡聚物在印跡后在不需要多級的復(fù)雜的洗滌工序和抗體或酶處理工序這點上，可實現(xiàn)與現(xiàn)有的印跡分析明顯不同的分析。另外，與分子信標(biāo)等on-Off寡聚物不同，本發(fā)明中的DNA寡聚物容易導(dǎo)入多個熒光性染料標(biāo)記部分，由此可進一步提高熒光強度。這是本發(fā)明較大的優(yōu)點。前述熒光性染料標(biāo)記部分例如可以像該參考例那樣包含[113](4)核苷酸。這樣，通過該參考例對組合有2個[113]u,核苷酸的DNA寡聚物通過與目的DNA片段的雜交導(dǎo)致熒光特性變化進行了確認，同樣可知還可將組合2個[113](4)核苷酸的DNA寡聚物用作引物。[參考例2]將包含實施例8中的linker長度n=4的染料的多聚TDNA寡聚物(前述ODN2)通過使用小玻璃管的微注射(microinjection)法導(dǎo)入細胞，通過具備汞燈和冷卻CCD照相機和焚光濾鏡(YFP用)的倒立型顯微鏡測定熒光發(fā)光。圖28~30中示出其結(jié)果。圖28為微分干涉測定時的照片，圖29為熒光觀察時的照片，圖30為圖28和圖29的疊加。按照圖示，本發(fā)明的熒光DNA寡聚物(標(biāo)記物質(zhì))與在細胞內(nèi)表達的mRNA的多聚A末端序列結(jié)合而發(fā)光。即，本發(fā)明中的標(biāo)記DNA寡聚物不僅檢測試管內(nèi)基因有效，檢測生物體內(nèi)基因也有效。[參考例3]進一步，通過常規(guī)方法使常用的熒光染料Cy5結(jié)合到前述ODN2(序列5，-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)-3')上，進而用前述方法將其導(dǎo)入細胞。這里，在合成前述ODN2的過程中，通過DNA自動合成^(義將Cy5追加到前述ODN2的5，末端而結(jié)合(序歹ll5，-Cy5-d(TTTTTT[l13](4)TTTTTT)-3，)。焚光發(fā)光通過激光掃描共聚焦顯微鏡進行測定。在圖31中示出其結(jié)果。圖31A表示通過633nm激發(fā)、獲得650nm以上的熒光、且為來自Cy5的熒光。圖31B表示通過488nm激發(fā)而獲得505-550nm的熒光、且來自2個噻唑橙部分的熒光。按照圖示，ODN2與在細胞內(nèi)表達的mRNA的多聚A末端序列結(jié)合而發(fā)光。由此可追蹤細胞內(nèi)mRNA的分布。本發(fā)明的化合物或核酸可以像這樣導(dǎo)入多種的染料(顯示熒光性的原子團)。像這樣例如由于各染料的焚光的Xm^不同，還可通過多色進行檢測。用前述的方法將前述ODN2(序列5，-d(TTTTTT[113](4)TTTTTT)一3,)注入纟田月包核，,人即刻(0秒后)到約4分半鐘后通過前述激光掃描共聚焦顯微鏡追蹤熒光發(fā)光(激發(fā)488nm,獲得熒光505-550nm)。在圖32中示出其結(jié)果。該圖分成11個圖，從左到右、從上向下表示ODN2注入后的經(jīng)過。各圖中的經(jīng)過時間(ODN2注入后)按照下述表8。按照圖示可確認ODN2注入后即刻集中在細胞核中但隨著雜交的mRNA(多聚A)逐漸分散到細胞整體。根據(jù)本發(fā)明還可像這樣追蹤mRNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage150</column></row><table>[參考例5]合成將前述ODN2中[113](4,的兩側(cè)的T分別增加到24個的ODN。將其設(shè)為ODN7。合成與ODN2合成方法同樣進行。另夕卜，ODN76勺序歹'J為5，一d(TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[l13](4)TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT)-3，)(序歹'J號13)。將其用與實施例22同樣的方法注入細胞核，測定熒光強度定。在圖33中表示經(jīng)過一定時間后的熒光照片。ODN7注入后即刻集中在細胞核，但與實施例22同樣隨著雜交的mRNA(多聚A)逐漸分散到細胞整體，最終像圖33那樣在細胞核周圍呈現(xiàn)分散的狀態(tài)。按照實施例11、16等的敘述，本發(fā)明中的熒光DNA寡聚物通過改變吸收波長、發(fā)光波長等，由此可通過多色進行互補鏈檢測。該通過多色的檢測可以像例如前述化合物113、117和120那樣通過改變?nèi)玖?顯示熒光性的原子團)部分的結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)。該參考例中進而合成多種熒光DNA寡聚物進行通過多色的互補鏈檢測。首先，合成包含下述式(121)所示核苷酸結(jié)構(gòu)的DNA鏈(熒光DNA寡聚物)且這些DNA鏈對染料(顯示熒光性的原子團)部分的結(jié)構(gòu)進行了各種改變。下述式(121)中"Dye"是指染料部分。(121)具體而言，合成了前述式(121)中"Dye"的部分分別為下述式所示化合物(DNA鏈)113、120、122、123和124的DNA鏈。n分別為linker長度(碳原子數(shù))。分別合成化合物113、120、122、123和124中11=3、4、5和6的化合物。合成方法除分別用對應(yīng)的結(jié)構(gòu)的染料代替前述染料107以外，與前述實施例l~4、6、8、9、12、13或16同樣進行。代替前述染料107的染料合成也除了適當(dāng)改變原料的結(jié)構(gòu)以外與前述染料107合成(前期實施例6的路線5)同樣進行。另外，化合物113和120分別為與前述各實施例的化合物113和120相同的結(jié)構(gòu)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage152</formula>U24)對上述化合物113、120、122、123和124分別合成序列5，—d(CGCAATX(n)TAACGC)—3'所示的ODN。X為113、120、122、123或124。n為linker長度。序列5，-d(CGCAAT[l13](n)TAACGC)—3，所示的ODN與前述ODNl相同。序歹115,—d(CGCAAT[120](n)TAACGC)-3'所示的ODN與前述0DN6相同。將序列5，-d(CGCAAT[122](n)TAACGC)-3'所示的ODN設(shè)為ODN8。將序列5，—d(CGCAAT[123](n)TAACGC)-3，所示的ODN設(shè)為ODN9。序歹'J5，—d(CGCAAT[l24](n)TAACGC)-3'所示的ODN設(shè)為ODN10。分別合成0DN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10中n=3、4、5和6的ODN。ODN1(n=4)、ODN6(n=4)、ODN8(n=4)、ODN9(n=4)和ODN10(n=4)分別與作為互補鏈的ODNl，形成雙鏈體后，對熒光發(fā)光光譜進行測定。除激發(fā)波長以外的測定條件與前述各實施例同樣。其結(jié)果在下述表9中示出。下述表9中，Ex表示激發(fā)波長，Em表示熒光發(fā)光的最大波長。另外，激發(fā)波長Ex與吸收的最大波長X目x基本相等。[表9]雙鏈體的結(jié)構(gòu)__Em一514腿528雄650nm654nm436nm456nm-d(CGCAAT[113〗(4)TAACGC)-3'(ODN1(n=4))/ODNl，-d(CGCAAT[120](4)TAACGC)-3'(ODN6(n=4))/ODN1'-d(CGCAAT[122](4)TAACGC)-3，(ODN8(n=4))/ODN1,-d(CGCAAT[123](4)TAACGC)-3，(ODN9(n=4))/ODNl，534謹550雄-d(CGCAAT[124](4)TAACGC)-3，(ODN10(n=4))/ODNl，541誰563謹/人表9可知，各ODN在形成^又4連體日于，在乂人456nm到654nm的較寬波長范圍內(nèi)，分別顯示出不同的熒光發(fā)光的最大波長Em。即，使用該實施例(實施例24)中合成的ODN可進行通過多色的互補鏈DNA的檢測。進一步，確認該實施例的化合物(DNA鏈)113、120、122、123和124、ODN1、ODN6、ODN8、ODN9和ODN10可以與前述各實施例同樣使用，可用多色進行所有的互補鏈RNA的檢測、點印跡解析、細胞內(nèi)mRNA的檢測等。1[實施例19]使用包含本發(fā)明的標(biāo)記引物的SMAP用成套引物進行EGFRexon21的突變L858R(2573T〉G)的才全觀'J。(1)才莫4反DNA、細胞系才莫板DNA從包含exon21點突變L858R的肺癌細胞系NCL-H1975中^是耳又(AmericanTypeCultureCollection)。前述細月包系為對各突變具有1個正常的等位基因的雜合子(heterozygote)。從前述細胞系按照常規(guī)方法進行基因組DNA的提取，并稀釋至40ng/pL。將其稱為完全匹配檢測用的模板DNA。另外，作為錯配檢測用的模板DNA^f吏用對exon21等位基因為野生型純合子的人基因組DNA(Promega公司生產(chǎn))。另夕卜，使用將這些模板DNA在98°C下進行加熱處理3分鐘然后迅速冷卻物質(zhì)，用于后述的分析。(2)引物作為SMAP用成套引物準(zhǔn)備4種引物。將這些引物再加上包含exon21中的目的核酸序列的區(qū)域(目的區(qū)域)在圖34中示出。該圖中，A為前述目的區(qū)域(序列號14)、B為FoldingPrimer(FP;第2引物；序列號15)、Turn-backPrimer(TP;第l引物；序列號16)、BoostPrimer(BP;第三引物；序列號17)和OuterPrimer2(OP2;序列號18)。在該圖A中，下劃線FP中的小寫"g"為檢測目的的突變，在野生型的情況下，該部位為小寫"t"。該圖A中，下劃線處FP為FoldingPrimer的3，末端所包含的序列。該圖A中，虛線框TPl為Turn-backPrimer的5，末端所包含的序列，虛線框TP2的互補4連為Turn—backPrimer的3，末端所包含的序列。另夕卜，該圖A中下劃線處BP為BoostPrimer的序列，該圖B中下劃線處BP的用粗體表示的核苷酸殘基(T)為用后述的熒光性原子團標(biāo)記的堿基(標(biāo)記結(jié)構(gòu))。另外，該圖A中，下劃線處OP2的互補鏈為OuterPrimer2的序列。前述FP設(shè)計為突變檢測用探針，其3，末端的第3個核苷酸殘基與目的的突變部位具有同源性。模板DNA上存在目的的變異的情況下，包含前述變異的區(qū)域與突變檢測用的FP在變異堿基部位同源，發(fā)生從該引物FP起始的延伸不會被阻礙。該實施例中，如前所述，將BoostPrimer作為標(biāo)記引物。該標(biāo)記引物，在圖34B的BoostPrimer中，前述標(biāo)記化的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)用前述式(121)表示，前述式(121)中"Dye"部分分別用前述參考例6中的前述式(113)表示(噻唑橙)。前述式(113)中，linker長度為n=4。前述式(113)所示的熒光性原子團的檢測波長為激發(fā)波長510nm/熒光波長530nm。該標(biāo)記引物除作為序列號17的寡聚物以外，用與前述實施例8和參考例6同樣的方法進行合成。(3)SMAP反應(yīng)制備25iuL下述組成的反應(yīng)液，使其在60。C下進行反應(yīng)。前述反應(yīng)中，邊維持60。C的等溫狀態(tài)，邊通過Mx3005Psystem(商品名、Stratagene公司生產(chǎn))實時監(jiān)視反應(yīng)液的熒光強度。另外，作為比較例，使用相同序列的未標(biāo)記BoostPrimer來代替進行標(biāo)記的BoostPrimer(標(biāo)記引物)，且下述反應(yīng)液中除添加牙全測用的作為嵌入劑SYBR(注冊商標(biāo))GreenI(MoleculorProbes,Inc)以外，同樣實時監(jiān)視熒光強度。另外，前述嵌入劑添加到反應(yīng)液中，使其成為10萬倍稀釋。反應(yīng)液組成Tris-HC1(PH8.0)20mMKC110mM(NH4)2S0410mM硫酸鎂8mMTween200.1%氨基乙酸甜菜堿0.6MdNTPs1.4mM引物4種FP2.0jiMTP2.0jiMBPl.O^MOP0.25^iMAacDNA聚合酶5556單位基因組DNA40ng共25jiL*KabushikiKaishaDNAFORM生產(chǎn)熒光強度的檢測以結(jié)合FAM的波長(激發(fā)波長492nm/熒光波長516nm)和Hex的波長(激發(fā)波長535nm/熒光波長555nm)的波長范圍進行。由此，對標(biāo)記引物的熒光強度(實施例)和SYBR(注冊商標(biāo))Greenl的焚光強度的兩方進行測定。將這些結(jié)果在圖35和圖36中示出。(在圖中，1循環(huán)表示1分鐘。)圖35為其部分的放大圖。該圖A和B中，a-*為使用完全匹配檢測用的模板DNA和標(biāo)記引物(標(biāo)記BP)的等溫擴增反應(yīng)的結(jié)果；b-匪為使用錯配檢測用的模板和標(biāo)記引物(標(biāo)記BP)的等溫擴增反應(yīng)的結(jié)果；c-▲為使用完全匹配檢測用的模板DNA和SYBR(注冊商標(biāo))Greenl的等溫擴增反應(yīng)的結(jié)果；d-令為使用錯配檢測用的模板和SYBR(注冊商標(biāo))Greenl的等溫擴增反應(yīng)的結(jié)果。如該圖所示，可以確認使用SYBR(注冊商標(biāo))Greenl的比較例(A、令)從25循環(huán)附近開始，在完全匹配(A)和錯配()之間熒光強度有顯著性差異。具體而言，比較達到平臺的熒光強度，完全匹配(▲)為錯配()的約1.4倍左右的焚光強度。與此相反，可以確認使用標(biāo)記引物的實施例(、■)中，從36循環(huán)附近開始，完全匹配的熒光強度的急劇增加，可以確認完全匹配()和錯配(■)之間有極大的差異。具體而言，例如比較50循環(huán)附近的焚光強度時，完全匹配(*)為錯配(■)的約7.3倍左右的焚光強度。這即使通過目視也可充分確認其不同。根據(jù)本發(fā)明，如該圖所示，完全匹配的熒光強度極高，因此可以說也可通過'目視確認變異。另外，如圖35的放大圖即圖36所示，實施例的錯配(■)的熒光強度比比較例的錯配()的焚光強度低，因此根據(jù)實施例可知可降低背景。認為這是由于可以排除在使用SYBR(注冊商標(biāo))Greenl等嵌入劑時也可以看出的，核酸試樣所包含的DNA引起的熒光；不包含目的序列的區(qū)域的非特異性地擴增引起的熒光。另外，錯配即使通過60分鐘的反應(yīng)也沒確認其擴增。從以上的結(jié)果，可以說根據(jù)本發(fā)明可以極高的靈敏度確認目的核酸序列的擴增以及有無變異。[實施例20]使用包含本發(fā)明的標(biāo)記引物的SMAP用成套引物，進行人流感H3N2亞型中的野生型和Tamiflu耐性變異型的4全測。(1)模板DNA從東京大學(xué)medicalcenter獲得具有H3N2亞型的野生型復(fù)制片段的質(zhì)粒和具有119號的谷氨酸變成纈氨酸的變異型復(fù)制片段的質(zhì)粒。且由H3N2亞型的RNA通過RT-PCR擴增作為模板的質(zhì)粒DNA。得到的質(zhì)粒DNA在95。C下加熱5分鐘，作為模板DNA以供后述分析。(2)引物準(zhǔn)備以下所示的6種引物作為SMAP用成套引物。這些引物再加上包含H3N2亞型中的目的核酸序列的區(qū)域(目的區(qū)域)在圖37中示出。該圖中，A為表示野生型的目的區(qū)域(序列號19)和變異型的目的區(qū)域(序歹'j號20)的簡圖。該圖中，B為Turn—backPrimer(TP;第l引物；序歹'J號21)、FoldingPrimer(FP;第2引物；序列號22)、野生型用BoostPrimer(BPw;第三引物；序歹'J號23)、變異型用BoostPrimer(BPm;第三引物；序歹寸號24)、OuterPrimer1(OP1;序歹'J號25)和OuterPrimer2(OP2;序列號26)。該圖A中，在野生型的情況下，119E(wild)的下劃線BPw處的小寫"a"為檢測目的的堿基；在變異型的情況下，119V(mutant)的下劃線處BPm中的小寫"t"為檢測目的的堿基。該圖B中，119E(野生型)的BPw中從3，末端開始的第2個堿基"T"為與檢測目的的突變(A)互補的堿基，119V(變異型)的下劃線BPm中從3，末端開始的第2個堿基"A"為與檢測目的的突變(T)互補的石咸基。該圖A中虛線框TP1的互補鏈為Turn-backPrimer的5，末端所包含的序列，虛線框TP2為Tum-backPrimer的3，末端所包含的序列。該圖A中，下劃線處FP的互補鏈為FoldingPrimer的3，末端所包含的序列。另外，該圖A中，下劃線處BPw的互補《連為野生型用BoostPrimer的序列，下劃線處BPm的互補鏈為變異型用BoostPrimer序列。另夕卜，該圖A中，下劃線處OPl為OuterPrimerl序列，下劃線處OP2的互補鏈為OuterPrimer2序歹寸。該實施例中，將野生型和變異型的BoostPrimer作為標(biāo)記引物。圖37中，BPw和BPm的劃有下劃線的粗體字的核苷酸殘基(T)分別為用熒光性原子團進行標(biāo)記的堿基(標(biāo)記結(jié)構(gòu))。前述野生型BoostPrimer中，前述標(biāo)記的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)用前述式(121)表示，前述式(121)中，"Dye"部分分別用前述參考例6中的前述式(113)表示。前述式(113)中，linker長度為11=4。前述式(113)所示的熒光性原子團的檢測波長為激發(fā)波長510nm/焚光波長530nm。另夕卜，前述變異型BoostPrimer中，前述標(biāo)記的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)用前述式(121)表示，前述式(121)中，"Dye"部分分別用前述參考例6中的前述式(120)表示。前述式(120)中，linker長度為n-4。前述(120)所示的熒光性原子團的檢測波長為激發(fā)波長630nm/熒光波長650nm。這些標(biāo)記引物除分別將堿基序列設(shè)為序列號23(BPw)和序列號24(BPm)以外，用與前述實施例8或參考例6同樣的方法進4于合成。(3)SMAP反應(yīng)在冰上制備25juL下述組成的反應(yīng)液，并在6(TC下反應(yīng)。前述反應(yīng)中，邊維持60。C的等溫狀態(tài)，邊通過Mx3005Psystem(商品名，Stratagene公司生產(chǎn))實時監(jiān)視反應(yīng)液的熒光強度。熒光強度的才企測以FAM的波長(492nm-516nm)和Cy5的波長(635nm-665nm)作為檢測波長范圍。由此對標(biāo)簽化的各BoostPrimer的熒光強度進行測定。通過FAM波長可以檢測野生型檢測用的BPw的焚光原子團，通過Cy5波長可以檢測變異型檢測用的BPm的焚光原子團。前述反應(yīng)液中的模板DNA的種類和比例以及BoostPrimer的種類和比例在下述表12中示出(實施例20-1~20-2)。下述表12中示出前述反應(yīng)液中的BoostPrimer中的野生型檢測用和變異型檢測用的濃度、模板DNA中的野生型和變異型的拷貝數(shù)。這些結(jié)果在圖3841中示出。在圖中，1循環(huán)表示l分鐘。[表ll]<table>tableseeoriginaldocumentpage160</column></row><table>KC110mM(NH4)2S0410mM硫酸鎂8mMTween200.1%氨基乙酸甜菜堿0.6MdNTPs1.4mM引物FP2.0|iMTP2都MBPI.OjiM0P10.25(iM0P20.25一AacDNA聚合酶承6單位才莫板DNA(質(zhì)粒)6000拷貝*KabushikiKaishaDNAFORM生產(chǎn)[表12]<table>tableseeoriginaldocumentpage161</column></row><table>圖38為表示實施例20-1的反應(yīng)液a到d進行等溫擴增時的擴增概況的圖表。該圖A為對使用野生型檢測用BoostPrimer的實施例20-l的反應(yīng)液a和b分別用FAM的波長(492nm/516nm)和Cy5的波長(635nm/665nm)的才全測熒光強度的結(jié)果；該圖B為對使用變異型一全測用BoostPrimer的實施例20-l的反應(yīng)液c和d分另'J用FAM的波長(492nm/516nm)和Cy5的波長(635nm/665nm)的檢測焚光強度的結(jié)果。該圖A和B中畫和口表示野生型DNA(野生型質(zhì)粒)的結(jié)果，,和o表示變異型DNA(變異型質(zhì)粒)的結(jié)果。如該圖A所示可以確認使用野生型檢觀'l用BoostPrimer的情況下，與野生型檢測用BoostPrimer為完全匹配的野生型DNA(■)從27循環(huán)附近開始在FAM的波長下，熒光強度急劇增加。與此相對，與野生型檢測用BoostPrimer為錯配的變異型DNA()即使到45循環(huán)也不能確認熒光強度的增加。另外，這些2個反應(yīng)液中，在Cy5的波長下沒能確認熒光強度的增加(口和o)。另一方、如該圖B所示，可以確認使用變異型檢測用BoostPrimer的情況下，與變異型檢測用BoostPrimer為完全匹配的變異型DNA(o)從27循環(huán)附近開始在Cy5的波長下，熒光強度的急劇增加。與此相對，與變異型檢測用BoostPrimer為錯配的野生型DNA(□)即使到45循環(huán)也沒能確認熒光強度的增加。另外，這2個反應(yīng)液情況下，在FAM的波長下沒能確認熒光強度的增加(《和*)。由這些結(jié)果可知，使用野生型檢測用BoostPrimer在FAM的波長下可進行野生型DNA的檢測，進而使用變異型檢測用BoostPrimer在Cy5的波長下可進行變異型DNA的檢測。另外，這些結(jié)果即使通過目視也可充分確認其不同(下面同樣)。圖39為表示對實施例20-l的反應(yīng)液e和f,進行等溫擴增時的擴增概況的圖表。前述反應(yīng)液中，作為BoostPrimer,包括野生型檢測用和變異型檢測用的兩方。該圖中國、□、參和o表示與圖38同樣的結(jié)果。如圖39所示，可以確認包含野生型DNA的反應(yīng)液e在FAM的波長下、從27循環(huán)附近開始，熒光強度的急劇增加(國)。與此相對，可以確認在Cy5的波長下、即使在45循環(huán)也沒能確認熒光強度的增加(□)。另一面，可確認包含變異型DNA的反應(yīng)液f，在Cy5的波長下，/人29循環(huán)附近焚光強度急劇增加(o)。與此相對，F(xiàn)AM的波長下，即使45循環(huán)也沒有熒光強度的急劇增加，根本不能確認擴增(*)。由這些結(jié)果可知，可通過使用野生型檢測用BoostPrimer和變異型檢測用BoostPrimer兩方，在一個反應(yīng)液中實施FAM波長下野生型的才全測和Cy5的波長下變異型的檢測。圖40為表示對實施例20-l的反應(yīng)液b、c、e、f進行等溫擴增時的擴增概況的圖表?？梢源_認使用野生型檢測用BoostPrimer的反應(yīng)液b,從50循環(huán)附近開始野生型一全測用BoostPrimer的變異型DNA的錯配的擴增(■)。另夕卜，可以確認使用變異型檢測用BoostPrimer的反應(yīng)液c,,人52循環(huán)附近開始變異型檢測用BoostPrimer的野生型DNA的錯配的擴增(□)。與此相對，使用野生型檢測用和變異型4企測用的BoostPrimer兩方的反應(yīng)液e和f，沒有熒光強度的急劇增加，即使90循環(huán)也沒能確認錯配的擴增。這是由于在反應(yīng)液中野生型#r測用BoostPrimer和變異型檢測用BoostPrimer的兩方共存，由此在完全匹酉己的BoostPrimer和錯酉己的BoostPrimer之間發(fā)生竟?fàn)?，作為錯配的BoostPrimer與DNA的結(jié)合被抑制。由這些結(jié)果可知，通過使用野生型檢測用BoostPrimer和變異型檢測用BoostPrimer兩方可以抑制錯配的擴增。圖41為表示對實施例20-2的反應(yīng)液gk進行等溫擴增時的擴增概況的圖表。前述反應(yīng)液，作為BoostPrimer使用野生型檢測用和變異型檢測用的兩方；另外，模板DNA包括野生型DNA和變異型DNA的兩方。該圖A中A表示對實施例20-2的反應(yīng)液i在FAM的波長下4企測的結(jié)果；A表示對前述反應(yīng)液i在Cy5的波長下^企測的結(jié)果。如該圖A所示，可以確認FAM和Cy5的兩方的波長熒光強度的急劇增加。從該結(jié)果可知，即使兩方BoostPHmer共存，各BoostPrimer可以擴增完全匹配的DNA,進而可在各自的波長下4企測擴增。該圖B表示對實施例20-2的反應(yīng)液g~k在FAM的波長斗全測的結(jié)果，該圖C表示對前述反應(yīng)液g~k在Cy5的波長下檢測熒光強度的結(jié)果。前述各反應(yīng)液如前述表12所示，改變了作為模板DNA的野生型DNA和變異型DNA的含量。如該圖B所示，即使減少與野生型檢測用BoostPrimer完全匹配的野生型DNA的比例，也可以確認FAM的波長下熒光強度的增加。另夕卜，如該圖C所示，即使減少與變異型^r測用BoostPrimer完全匹配的變異型DNA的比例，也可以確認Cy5的波長下熒光強度的增加。從這些的結(jié)果可知，使用野生型檢測用BoostPrimer和變異型4企測用BoostPrimer兩方的情況下，即使減少反應(yīng)液中所包含的野生型DNA的含量，F(xiàn)AM的波長下野生型的檢測也可以進行；即使減少反應(yīng)液中所包含的變異型DNA的含量，Cy5的波長下變異型的檢測也可以進行。[實施例21]通過使用包含本發(fā)明的標(biāo)記引物的成套引物的PCR,進行EGFR基因的exon21的擴增。(1)模板DNA<吏用HumanGenomicDNA(Promega,》司生產(chǎn))。(2)引物使用由未標(biāo)記正義(forward)引物(Fl)和標(biāo)記反向引物(reverseprimer)(Labeled-Rl)組成的成套引物。另夕卜，標(biāo)記Rl如下進行標(biāo)記將劃下劃線的核苷酸殘基(T)用熒光原子團進行標(biāo)記。前述標(biāo)記的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)如前述式(121)所示，前述式(121)中"Dye"部分如前述參考例6中的前述式(113)所示。前述式(113)中，linker長度為n=4。前述式(113)所示的焚光性原子團的檢測波長為激發(fā)波長510nm/熒光波長530nm。除將該標(biāo)記Rl石威基序列i殳為序列號28以外，用與前述實施例8或參考例6同樣的方法進行合成。Fl:5，-AAACACCGCAGCATGTC-3，(序歹'J號27)Labeled-R1:5，—TAAAGCCACC工CCTTAC—3，(序列號28)另夕卜exon21的區(qū)i或(序歹'J號30)中的F1禾口labeled—FU的4立置關(guān)系按照以下的下劃線處所示。labeled-Rl使用由前述F1和labeled-Rl組成的成套引物。且使用PrimeSTAR(注冊商標(biāo))HSDNAPolymerase(Takara),按照產(chǎn)品說明書中記載的方法進行PCR。并且，使用Mx3000Psystem(Stratagene公司生產(chǎn))對PCR反應(yīng)液的焚光強度全進行實時監(jiān)視。具體而言，98。C預(yù)熱10秒(Pre-heating)后，將98。C10秒、69。C10秒、72。C10秒作為l循環(huán)，進行40循環(huán)的PCR。其結(jié)果在圖42A中示出。該圖為表示PCR擴增曲線的圖表，擴增中使用包含labeled-Rl的前述成套引物。另外，PCR結(jié)束后，對9pl反應(yīng)液，使用4%NuSieveGTGAgarose(TakaraBioInc)在100V下進行電泳。并對電泳后的凝膠用溴乙錠(EtBr)進行染色，由此檢測核酸。其電泳照片的結(jié)果如圖42B所示。該圖中泳道l表示通過^f吏用包含標(biāo)記引物(labeled-Rl)的成套引物的PCR的核酸擴增物，泳道2表示每階梯差25bp的laddermarker進4亍電泳的結(jié)果。如圖42A所示，可以確認，標(biāo)記引物即使PCR也進行擴增。這點即使通過目4見也可充分確認其不同。另夕卜，如圖42B所示，用電泳確認的使用標(biāo)記引物的核酸擴增物時，確認了目的條帶目的。從以上可以明確用前述焚光原子團(510/530)進行標(biāo)記的引物在PCR中也可有效發(fā)揮作用。[實施例22]通過使用包含本發(fā)明的標(biāo)記引物的成套引物的PCR進行EGFR基因的exon21的擴增，進行融解曲線解析。(1)模板DNA<吏用HumanGenomicDNA(Promega乂>司生產(chǎn))。(2)引物使用由未標(biāo)記正義(forward)引物(Fl)和標(biāo)記反向引物(reverseprimer)(Labeled—Rl)組成的成套引物(實施例)以及未標(biāo)記正義引物(Fl)和未標(biāo)記反向引物(Rl)組成的成套引物(對照例)。前述標(biāo)記Rl(labeled-Rl)與前述實施例21同樣。另外，exon21的區(qū)域(序列號30)中的Rl的位置關(guān)系與標(biāo)記Rl相同。Fl:5，-AAACACCGCAGCATGTC-3，(序歹'J號27)Rl:5'-TAAAGCCACCTCCTTAC-3'(序歹'J號29)Labeled—Rl:5'—TAAAGCCACC工CCTTAC-3'(序歹'J號28)使用SYBR(注冊商標(biāo))PremixEXTaq(注冊商標(biāo))(Takara公司生產(chǎn))，按照產(chǎn)品說明書中記載的方法進行PCR,所述SYBR使用由F1、Rl組成的通常的成套引物和由Fl、Labeled-Rl組成的標(biāo)記成套引物。并用Mx3000Psystem(Stratagene公司生產(chǎn))實時監(jiān)視PCR反應(yīng)液的焚光強度。具體而言，95。C10秒的預(yù)熱后，將95。C30秒、60。C1分和72。C30秒作為l循環(huán)，進行40循環(huán)的PCR。PCR結(jié)束后，接著在融解曲線測定步驟中進行95。C1分、55。C30秒的處理，以升溫速度2。C/1分鐘使溫度上升至至95。C,進行95。C30秒鐘的處理，實時監(jiān)—見55。C~95。C的熒光強度。將這些結(jié)果示于圖43。該圖為融解曲線的圖表，該圖中國(labeled-primer)為^f吏用由Fl、labeled-Rl組成的標(biāo)記成套引物的實施例的結(jié)果(FAM的波長492nm/516nm),(regularprimer)為使用由F1、Rl組成的成套引物的對照例的結(jié)果(FAM的波長492nm/516nm)。如圖43所示，1吏用標(biāo)記引物的PCR的融解曲線(實施例)與使用未標(biāo)記引物的PCR的融解曲線(對照例)相比，在高的溫度下顯示出峰。由該結(jié)果可知本發(fā)明中的標(biāo)記核酸(引物)比未標(biāo)記引物提高了Tm值。從這樣Tm值提高可知，本發(fā)明中的標(biāo)記核酸比通常的未標(biāo)記引物更牢固地與互補的DNA結(jié)合。即，可知本發(fā)明的標(biāo)記核酸與例如一^:所4吏用的LNA或PNA等提高Tm值的寡聚核苷酸具有同樣的功能。由該結(jié)果可以說本發(fā)明的標(biāo)記核酸可發(fā)展為稱為例如提高擴增的特異性的應(yīng)用技術(shù)。另外，本發(fā)明中的標(biāo)記核酸由于提高了Tm值，當(dāng)然可應(yīng)用于使用LNA或PNA的實驗體系中，使例如LNA或PNA具有所不具備的發(fā)出熒光的能力，因此，可以推測其在分子生物學(xué)的方法中，比LNA或PNA更容易拓寬使用用途?！笇嵤├?3]使用包含本發(fā)明的標(biāo)記引物的LAMP用成套引物，對包含EGFRexon21的突變L858R的區(qū)域進行擴增。(1)模板DNA模板DNA與實施例19同樣從包含exon21點突變L858R的肺癌細胞系NCL-H1975中進行提耳又(AmericanTypeCultureCollection)。(2)成套引物制備與包含前述突變的區(qū)域完全匹配的LAMP用成套引物。成套引物包含下述LF(序列號31)、LR(序歹'J號32)、標(biāo)記或未標(biāo)記的BP(序列號33)、和OP(序列號34)。成套引物中的各引物的比例為LF:LR:BP:OP=8:8:4:1。LF(EGFRex21(M)LFPrimer)5，-CCAAAATCTGGGAACGTACTGGTGAAACA-3，LR(EGFRex21(M)LRPrimer)5'-CGAGCCAAACGCCTCCTTCTGCATGGTATT-3'BP(BoostPrimer;EGFRexon21BP3)5'-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3，OP(OuterPrimer2;EGFRexon21OP3)5，_TAAAGCCACCTCCTTAC-3'前述標(biāo)記BP通過下述焚光原子團對i殳定的核普酸進行標(biāo)記。下述表的序列中劃有粗下劃線的核苷酸為標(biāo)記部位。下述BP-l中，前述標(biāo)記的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)用前述式(121)表示，前述式(121)中"Dye"部分分別用前述參考例6中的前述式(113)表示。前述式(113)中的linker長度為n-4。前述式(113)所示熒光性原子團的檢測波長是激發(fā)波長510nm/熒光波長530nm。另外，下述BP-2中，前述標(biāo)記的核苷酸殘基的結(jié)構(gòu)用前述式(121)表示，前述式(121)中"Dye"部分分別用前述參考例6中的前述式(123)表示。前述式(123)中的linker長度為n-4。前述式(123)所示熒光性原子團的檢測波長是激發(fā)波長530nm/熒光波長550nm。這些標(biāo)記引物除堿基序列分別為序列號33(BP)以外，用與前述實施例8或參考例6同樣的方法進行合成。<table>tableseeoriginaldocumentpage168</column></row><table>對照例——FAMfilter(SYBRGreenI)492nm/516nm制備25jiL下述組成的反應(yīng)液，使其在6(TC下反應(yīng)l小時。前述反應(yīng)中，邊維持60。C的等溫狀態(tài)，邊通過Mx3000P(商品名、Stratagene公司生產(chǎn))實時監(jiān)視反應(yīng)液的熒光強度。另夕卜，對照例使用未標(biāo)記的成套引物，進一步使SYBR(注冊商標(biāo))Greenl(MoleculorProbes,Inc)在反應(yīng)液中的濃度為10萬倍稀詳奪地添加SYBR,同樣進4亍測定。[表14]反應(yīng)液組成Tris-HC1(PH8.0)20mMKC110mM(NH4)2S0410mM硫酸鎂8mMTween200.1%氨基乙酸甜菜磁<0.6MdNTPs1.4mM引物L(fēng)F2.0jiMLR2.0(iMBPorlabeled-BPl都MOP0.25|iMAacDNA聚合酶*6單位基因組DNA術(shù)s共25(iL*KabushikiKaishaDNAFORM生產(chǎn)在圖44中示出這些結(jié)果。該圖為表示通過LAMP法進行等溫擴增時的擴增概況的圖表，參為使用BP-l的實施例23-l的結(jié)果，畫為使用BP-2的實施例23-2的結(jié)果，A為對照例的結(jié)果。在圖中，l循環(huán)表示為l分鐘。如該圖所示，根據(jù)使用本發(fā)明的標(biāo)記引物的實施例23-1~23-2可知，其與對照例同樣，在LAMP法中也可以確認擴增。另外，使用用前述式(113)的熒光原子團(510/530)進行標(biāo)記的BP-l的實施例23-l比使用用前述式(123)的熒光原子團(530/550)進行標(biāo)記的BP-2的實施例23-2,在平臺中的熒光值非常高。這即使通過目視也可充分確認其不同。由此可知前述熒光原子團作為本發(fā)明的引物中的標(biāo)記檢測靈敏度非常優(yōu)異。按照以上，本發(fā)明的引物為包含前述式所示的結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸，用于例如目的核酸序列的擴增方法時，可有效檢測前述目的核酸序列的擴增。另外，由于可以如此有效地;險測擴增，進一步還可以以優(yōu)異的靈敏度檢測目的核酸序列中有無目的的變異等。本發(fā)明由于在核酸的檢測靈敏度等上優(yōu)異，可以用于例如研究、臨床、診斷、試管內(nèi)基因檢測、生物體內(nèi)基因檢測等廣泛的用途中。序列表<110>獨立行政法人理化學(xué)研究所(RIKEN)<110〉達納福股份有限公司(KABUSHIKIKAISHADNAF0固)〈120〉引物、成套引物、使用其的核酸擴增方法和變異檢測方法〈130〉TF08002-04〈150〉JP07/059921〈151〉2007-03-09<150〉JP07/246253〈151〉2007-09-21〈150〉JP07/248257<151〉2007-09-25〈150〉JP07/335352<151>2007-12-26<150〉JP08/035325<151〉2008-02-15〈160〉34〈170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉13〈212〉廳<213>人工的〈220〉<223〉DNA寡聚物〈220〉<221〉misc一feature〈222〉(7).(7)〈223>n表示被修飾的嘧啶〈400〉1cgcaatntaacgc〈210〉2〈211〉13〈212〉DNA〈213〉人工的<22()〉〈223〉DNA寡聚物<400>2gcgttaaattgcg〈210>3<211〉13<212>DNA〈213〉人工的<220〉〈223>DNA寡聚物<220>〈221〉misc—feature〈222〉(7).(8)<223>n表示被修飾的嘧啶<400>3Utttt皿ttttt<210>4〈211〉13〈212〉DNA<213>人工的<220>〈223〉DNA寡聚物<220〉〈221〉misc—feature<222>(7)..(7)<223>n表示被修飾的嘧啶<400>4ttttttntUttt〈210〉5<211〉13<212〉DNA<213>人工的〈220〉<223〉DNA寡聚物〈400>5〈210>6〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉<223〉DM寡聚物〈220〉<221〉misc—feature<222〉(ll)..(ll)<223〉n表示被修飾的嘧啶〈400〉6tgaagggcttntgaactctg<210〉7<211〉20〈212〉DNA<213〉人工的〈220〉〈223〉DNA寡聚物<400〉7cagagttcaaaagcccttca<210>8<211〉13<212>腿<213〉人工的<220><223〉DNA寡聚物<220〉<221>misc一feature〈222〉(7).(8)<223〉n表示被修飾的嘧啶<400>8cgcaat皿a.acgc〈210〉9<211〉28<212>醒<213>人工的<220〉〈223>DNA寡聚物<220><221〉misc—feature<222〉(8)..(8)<223〉n表示被修飾的嘧啶〈220><221〉misc一feature〈222>(19)..(19)〈223〉n表示被修飾的嘧啶<400〉9gcctcctncagcaaatccnaccggcgtg<210>10<211>28<212〉DNA〈213〉人工的<220〉〈223〉DNA寡聚物〈220〉<221>misc—feature〈222>(IO)..(IO)〈223〉n表示被修飾的嘧啶〈220><221>misc—feature〈222〉(19)..(19)<223>n表示被修飾的嘧啶<400〉10cctcccaagngctgggatnaaaggcgtg28<210〉11〈211〉95<212>DNA<213>人工的〈220〉〈223〉DNA片段<400〉11gccggtagtggtggcgcacgccggtaggatttgctgaaggaggc卿ggcaggaggatca60cgagttcgaggccagcctgggctacacattttttt%<210〉12〈211>95<212〉DNA<213>人工的<220〉〈223〉DNA片段〈400〉12gccgggcatggtggcgcacgcctttaatcccagcacttgggaggcagaggcaggcggatt60tctgagttcgaggccagcctggtctacagagtgag95<210>13<211>49<212〉腿〈213>人工的<220〉〈223〉DNA寡聚物〈220〉<221〉misc一feature〈222〉(25)..(25)<223>n表示被修飾的嘧啶<400>13ttttttttttttttttttttttUntttttttttUttttttttttttt49〈210〉14〈211〉120<212〉腿〈213〉智人(Homosapiens)〈400〉14tga肌acaccgcagcatgtca卿tcacagattttgggcgggccaaactgctgggtgcgg60aa.gagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggctttaggtcagccagc120<210〉15<211〉40<212〉DNA<213>人工的〈220〉〈223〉引物〈400〉15aggacgctgagatgcgtcctgatcacagattttgggcgag176〈210〉16<211>30〈212〉腿〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400〉16cgagccaaacgcctccttctgcatggtatt<210〉17<211〉18〈212〉DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物〈400〉17tgggtgcgga卿gaaag〈210〉18<211>17〈212〉DNA〈213〉人工的<220〉〈223〉引物<400>18taaagccacctccttac〈210>19〈211>183<212>DNA〈213>智人(Homosapiens)<400>19咖att織ggatttgcacccttttctaaggacaattcgatt鄉(xiāng)ctttccgctggtggg60gacatctgggtgacaagagaaccttatgtgtcatgcgatcctgacaagtgttatcaattt120gcccttggacagggaacaacactaaacaacgtgcattcaaatgacacagtacgtgatagg180acc183〈210〉20<211〉183〈212〉DNA〈213〉智人(Homosapiens)<400>20aacattacaggatttgcacccttttctaaggacaattcgattaggctttccgctggtggg(30gacatctgggtgacaagagtaccttatgtgtcatgcgatcctgacaagtgttatcaattt120gcccttggacagggaacaacactaaacaacgtgcattcaaatgacacagtacgtgatagg180acc183<210>21〈211〉33<212〉DNA〈213〉人工的<220><223>引物〈400〉21gtcaggatcgcgctggtggggacatctgggtga33<210>22<211>44〈212〉■〈213〉人工的<220><223〉引物〈400〉22accttctgtaccctcagaaggttccctgtcc肪gggcaaattga44<210>23<211〉17〈212〉DNA〈213>人工的<220>〈223〉引物<400〉23catgacacataaggttc<210>24〈211>17〈212〉腿<213>人工的<220〉〈223〉引物<400>24catgacacataaggtac<210>25〈211〉18<212〉薩<213>人工的<22()><223〉引物<400>25agga.tttgcacccttttc<210>26〈211〉18<212>腿<213>人工的〈220>〈223〉引物<400>26tcatttgaatgcacgttg18<210>27<211>17〈212〉DNA<213〉人工的<220〉〈223〉引物<■>27aaacaccgcagcatgtc17<210〉28<211〉17<212>DNA〈213〉人工的〈220〉〈223〉引物<400〉28taaagccacctccttac17<210〉29〈211>17<212>腿〈213〉人工的〈220><223〉引物〈400〉29taaagccacctccttac"<210〉30〈211〉i06〈212〉腿〈213>智人(Homosapiens)<400>30aaacaccgcagcatgtcaagatcacagattUgggcgggccaaactgctgggtgcggaag60agaa卿ataccatgcagaaggaggcaaagtaaggaggtggcttta106〈210〉31<211>29<212〉DNA<213>人工的<220〉<223>引物〈400〉31ccaaaatctgggaacgtsctggtgaaaca〈210>32<211>30〈212>歸<213>人工的<220>〈223〉引物<400>32cgagccaaacgcctccttctgcatggtatt〈210>33<211>18<232〉DNA〈213〉人工的<220>〈223>引物<400〉33tgggtgcgga卿g咖g<210>34<211>17<212〉醒〈213〉人工的<220><223>引物<400〉34taaagccacctccttac權(quán)利要求1.引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的引物，該引物是包含至少一個下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸，式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中，B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團，Z11和Z12分別為顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同，L1、L2和L3分別為linker(橋原子或原子團)，主鏈長(主鏈原子數(shù))為任意，主鏈中可以分別含有或不含有C、N、O、S、P和Si，主鏈中可以分別含有或不含有單鍵、雙鍵、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、L2和L3相互間可以相同也可以不同，D為CR、N、P、P＝O、B或者SiR，R為氫原子、烷基或任意的取代基，b為單鍵、雙鍵或者三鍵，或者，前述式(16)和(16b)中，可以是L1和L2為前述linker，L3、D和b不存在，L1和L2直接與B結(jié)合，其中，式(16)、(17)和(18)中，E為前述(i)的原子團，磷酸橋中的至少一個O原子可以用S原子取代，式(16b)、(17b)和(18b)中，E為前述(ii)的原子團，式(17)和(17b)中，各B可以相同也可以不同，各E可以相同也可以不同。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，L1、1/和L3的主鏈長(主鏈原子數(shù))分別為2以上的整數(shù)。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，Z"和Z"為顯示激發(fā)子效果的原子團。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中，Z"和Z"各自獨立為由噻唑橙、噁唑黃、花青、半花菁、其它花青染料、甲基紅、偶氮染料或這些的衍生物衍生的基團。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的引物，Z"和Z"各自獨立為下述式(7)~(9)的任意一個所示的原子團，1.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>2.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(9)式(7)~(9)中，X'和X2為S或O,n為0或正的整數(shù)，r1r10、r"r"各自獨立為氫原子、囟原子、低級烷基、低級烷氧基、硝基、或氨基，R"和RU之中，一方為與前述式(16)、(17)、(16b)、(17b)、(18)和(18b)中的匸或者l7結(jié)合的連接基，另一方為氫原子或低級烷基，R"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同，R"在式(7)、(8)或(9)中存在多個的情況下，可以相同也可以不同、Z"中的X1、X2和R11121、Z"中的X1、X2和RR"相互間可以相同也可以不同。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物，前述式(7)~(9)中，R1~R"中，前述低級烷基為碳原子數(shù)l~6的直鏈或支鏈烷基，前述低級烷氧基為碳原子數(shù)l~6的直鏈或支鏈烷氧基。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物，前述式(7)~(9)中，R"和R"中前述連接基為碳原子數(shù)2以上的聚亞甲基羰基，以羰基部分與前述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中的1^或者L^吉合。8.根據(jù)權(quán)利要求l~7任一項所述的引物，進一步包含具有與前述標(biāo)記核酸相同的堿基序列的未標(biāo)記核酸作為引物。9.成套引物，其特征在于，其為用于擴增目的核酸序列的成套引物，包含一對引物，前述一對引物的至少一個引物為權(quán)利要求l~7任一項所述的引物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的成套引物，前述成套引物為等溫擴增法中所使用的成套引物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的成套引物，前述等溫擴增法為選自SDA(stranddisplacementamplification)法；改良SDA法；NASBA(nucleicacidsequencebasedamplification,依賴核酸序列的擴增)法；LAMP法；ICAN(IsothermalandChimericprimer—initiatedAmplificationofNucleicacids)法；自主序歹'J復(fù)制系統(tǒng)(3SR;self—sustainedsequencereplication)法；TMA(transcription_mediatedamplification)法；Q卩復(fù)制酉爭(Q(3replicase)法；SMAP(SmartAmplificationProcess)法、Invader法、RCA(rollingcycleamplification,滾環(huán)擴增)法中的至少一種。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的成套引物，進一步包含具有鏈置換能力的聚合酶。13.根據(jù)權(quán)利要求1012任一項所述的成套引物，進一步包含錯配識別蛋白。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的成套引物，前述錯配識別蛋白為選自MutS、MSH2和MSH6中的至少一個蛋白質(zhì)。15.根據(jù)權(quán)利要求1014任一項所述的成套引物，前述一對引物為一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)不同的非對稱型。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的成套引物，前述一對引物包含第一引物和第二引物，前述第一引物，在3，末端部分包含與目的核酸序列的3，末端部分的序列(A)雜交的序列(Ac，)，且在前述序列(Ac，)的5，側(cè)包含序列(B，)，該序列(B，)與在前述目的核酸序列中比前述序列(A)更靠近5，側(cè)的序列(B)的互補序列(Bc)雜交，前述第二引物，在3，末端部分包含與前述目的核酸序列的互補序列的3，末端部分的序列(C)雜交的序列(Cc，)，且在前述序列(Cc，)的5，側(cè)包含折疊序列(D-Dc，)，該折疊序列(D-Dc，)在同一《連上含有相互雜交的2個核酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的成套引物，前述第一引物和前述第二引物的4壬意一個為前述標(biāo)記核酸。18.根據(jù)權(quán)利要求1517任一項所述的成套引物，其中，前述成套引物進一步包含第三引物，前述第三引物為與前述目的核酸序列或其互補序列雜交的引物，且該第三引物對目的核酸序列或其互補序列的雜交與其它引物不竟?fàn)帲笆龅谌?，在前述第一引物或第二引物的擴增產(chǎn)物的一部分為單鏈體的狀態(tài)時，可以與其單纟連體部分存在的目的核酸序列退火，由此在前述擴增產(chǎn)物中的目的核酸序列上提供新的互補鏈合成起點。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的成套引物，其中，前述第一引物和前述第二引物的任意一個、以及前述第三引物為前述標(biāo)i己核酉交；或者，代替前述第一引物和前述第二引物的任意一個，前述第三引物為前述標(biāo)記核酸。20.根據(jù)權(quán)利要求1014任一項所述的成套引物，前述一對引物為一個引物的形態(tài)和另一個引物的形態(tài)相同的對稱型。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的成套引物，前述成套引物為LAMP法中所使用的成套引物。22.根據(jù)權(quán)利要求9所述的成套引物，前述成套引物為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法中所使用的成套引物。23.根據(jù)權(quán)利要求922任一項所述的核酸擴增方法，其包含具有檢測波長不同的熒光性原子團的2種以上權(quán)利要求1~8任一項所述的引物。24.核酸擴增用試劑盒，其特征在于，其為擴增目的核酸序列的核酸擴增方法中所使用的核酸擴增用試劑盒，該核酸擴增用試劑盒包含權(quán)利要求l~8任一項所述的引物或權(quán)利要求9~23任一項所述的成套引物。25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸擴增用試劑盒，其為用于等溫擴增法中的核酸擴增用試劑盒，該核酸擴增用試劑盒包含權(quán)利要求10~21任一項所述的成套引物。26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的核酸擴增用試劑盒，其為用于PCR法中的核酸擴增用試劑盒，該核酸擴增用試劑盒包含權(quán)利要求22所述的成套引物。27.根據(jù)權(quán)利要求24~26任一項所述的核酸擴增用試劑盒，其包含具有檢測波長不同的熒光性原子團的2種以上權(quán)利要求l~8任一項所述的引物。28.變異檢測用試劑盒，其特征在于，其為檢測目的核酸序列中有無變異的變異檢測方法中所使用的變異檢測用試劑盒，該變異檢測用試劑盒包含權(quán)利要求24~27任一項所述的核酸擴增用試劑盒。29.核酸擴增方法，其特征在于，其為擴增核酸試樣中的目的核酸序列的方法，包含下述(A)工序、下述(B)或(B，)工序(A)準(zhǔn)備前述核酸試樣的工序，(B)使用權(quán)利要求l~8任一項所述的引物或權(quán)利要求9~23任一項所述的成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(B，)包含下述(Bl，)工序和(B2，)工序的工序(Bl，)使用引物或包含一對引物的成套引物擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(B2，)前述(Bl，)工序中擴增的單鏈體核酸序列與探針進行雜交的工序，其中該探針由包含至少一個下述式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)或(18b)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸形成，1.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>1.<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(18)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>(18b)式(16)、(16b)、(17)、(17b)、(18)和(18b)中，B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團，E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團，Z"和Z"分別為顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同，L1、1^和I^分別為linker(橋原子或原子團)，主鏈長(主鏈原子數(shù))為任意，主鏈中可以分別含有或不含有C、N、O、S、P和Si,主鏈中可以分別含有或不含有單鍵、雙鍵、三鍵、酰氨鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵和硫酯鍵，L1、L^和lS相互間可以相同也可以不同、D為CR、N、P、P=0、B或者SiR,R為氫原子、烷基或任意的取代基，b為單鍵、雙鍵或者三鍵，或者，前述式(16)和(16b)中，可以是I^和L2為前述linker，l3、D和b不存在，！^和l2直接與B結(jié)合，其中，式(16)、(17)和(18)中，e為前述(i)的原子團，磷酸橋中的至少一個O原子可以用S原子取代，式(16b)、(17b)和(18b)中，e為前述(ii)的原子團，式(17)和(17b)中，各B可以相同也可以不同，各e可以相同也可以不同。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的核酸擴增方法，前述(B)或(B，)工序中的核酸擴增為利用等溫擴增法的核酸擴增反應(yīng)。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的成套引物，前述等溫擴增法為選自SDA(stranddisplacementamplification)法；改良SDA法；NASBA(nucleicacidsequencebasedamplification,依賴核酸序列的擴增)法；LAMP法；ICAN(IsothermalandChimericprimer-initiatedAmplificationofNucleicacids)法；自主序歹'j復(fù)制系統(tǒng)(3SR;self—sustainedsequencereplication)法；TMA(transcription—mediatedamplification)法；Q(3復(fù)制酉每(Q(3replicase)法；SMAP(SmartAmplificationProcess)法、Invader法、RCA(rollingcycleamplification,滾環(huán)擴增)法中的至少一種。32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的核酸擴增方法，前述等溫擴增法為使用具有鏈置換能力的聚合酶的擴增法。33.根據(jù)片又利要求3032任一項所述的核酸擴增方法，前述(B)或(B，)工序中，在錯配識別蛋白的存在下進行核酸擴增。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的核酸擴增方法，前述錯配識別蛋白為選自MutS、MSH2和MSH6中的至少一個蛋白質(zhì)。35.根據(jù)權(quán)利要求29~34任一項所述的核酸擴增方法，前述(B)工序中的前述成套引物為權(quán)利要求1021任一項所述的成套引物。36.根據(jù)權(quán)利要求3034任一項所述的核酸擴增方法，前述(B)工序中的成套引物為權(quán)利要求15~19任一項所述的成套引物。37.根據(jù)權(quán)利要求3034任一項所述的核酸擴增方法，前述(B)工序中的成套引物為權(quán)利要求20或21所述的成套引物。38.根據(jù)權(quán)利要求29所述的核酸擴增方法，前述(B)或(B，)工序中的核酸擴增為利用PCR法的核酸擴增反應(yīng)。39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的核酸擴增方法，前述(B)工序中的成套引物為權(quán)利要求22所述的成套引物。40.根據(jù)權(quán)利要求2939任一項所述的核酸擴增方法，前述(B)工序中，使用具有檢測波長不同的熒光性原子團的2種以上權(quán)利要求l~7任一項所述的引物。41.根據(jù)權(quán)利要求2940任一項所述的核酸擴增方法，前述目的核酸序列為具有變異的核酸序列，前述(B)工序中，^使用具有與前述目的核酸序列中包的引物、和具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物。42.變異^r測方法，其特征在于，其為^r測核酸試樣中的目的核酸序列中有無變異的方法，該變異檢測方法包含下述(a)~(c)工序(a)通過權(quán)利要求2941任一項所述的核酸擴增方法擴增核酸試樣中的目的核酸序列的工序，(b)分別測定前述(a)工序的前后的熒光強度的工序，(c)通過比較前述(b)工序中測定的前述(a)工序前后的熒光強度來檢測有無變異的工序。43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的變異纟全測方法，前述變異為減^基的置換、缺失或插入。44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的變異檢測方法，前述(a)工序中，使用具有檢測波長不同的熒光性原子團的2種以上權(quán)利要求1~8任一項所述的引物來擴增目的核酸，前述(c)工序中，通過與前述各熒光性原子團相應(yīng)的各檢測波長測定各自的熒光強度。45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的變異檢測方法，前述(a)工序中，使用具有與前述目的核酸序列中包含變異部位的區(qū)域完全互補的序列的權(quán)利要求l~8任一項所述的引物、和具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物。46.特異性的提高方法，其特征在于，其為提高引物對目的核酸序列的特異性的方法，作為用于擴增前述目的核酸序列的前述引物，使用權(quán)利要求l~8任一項所述的具有熒光原子團的引物。47.特異性的提高方法，其特征在于，其為提高引物對目的核酸序列的特異性的方法，作為用于擴增前述目的核酸序列的前述引物，使用具有與利要求l~8任一項所述的引物，進一步，作為提高前述引物的特異性的引物，同時使用具有與前述包含變異部位的區(qū)域除前述變異部位外完全互補的序列的引物。48.核酸擴增裝置，其特征在于，其為用于實施權(quán)利要求29~41任一項所述的核酸擴增方法的核酸擴增裝置，該核酸擴增裝置具備反應(yīng)部，其用于實施核酸擴增反應(yīng)；溫度控制單元，其用于控制前述反應(yīng)部的溫度；檢測單元，其用于檢測前述反應(yīng)部的熒光強度。49.變異檢測裝置，其特征在于，其為用于實施權(quán)利要求42~45所述的變異檢測方法的變異檢測裝置，該變異檢測裝置具備反應(yīng)部，其用于實施核酸擴增反應(yīng)；溫度控制單元，其用于控制前述反應(yīng)部的溫度；檢測單元，其用于檢測前述反應(yīng)部的熒光強度。全文摘要本發(fā)明涉及引物、成套引物、使用其的核酸擴增方法和變異檢測方法。提供可有效地檢測核酸的雙螺旋結(jié)構(gòu)的引物。該引物是包含至少一個右述式(16)所示結(jié)構(gòu)的標(biāo)記核酸。B為具有核酸堿基骨架的原子團；E為具有脫氧核糖骨架、核糖骨架或者由這些的任意一個衍生的結(jié)構(gòu)的原子團，或具有肽結(jié)構(gòu)或者肽類似物結(jié)構(gòu)的原子團；Z¹¹和Z¹²分別為顯示熒光性的原子團，可以相同也可以不同。文檔編號C12N15/11GK101285094SQ20081000657公開日2008年10月15日申請日期2008年3月10日優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日發(fā)明者亞歷山大·雷扎瓦,岡本晃充,向后泰司,林崎良英申請人:獨立行政法人理化學(xué)研究所;達納福股份有限公司