專利名稱：通過可逆的磷酸三酯電荷中和保護(hù)基轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)輸核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的組合物和方法。
背景技術(shù)：
聚陰離子低聚物不容易跨細(xì)胞膜擴(kuò)散。為了克服培養(yǎng)細(xì)胞的這個(gè)問題，通 常使用與陰離子寡核苷酸結(jié)合的陽(yáng)離子脂幫助攝取。不幸的是，該復(fù)合物對(duì)細(xì) 胞通常是有毒的，這意味著必須小心地控制陽(yáng)離子脂的暴露時(shí)間和濃度，以保 證活細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
已經(jīng)用各種重組的病毒載體和電穿孔進(jìn)行體外和體內(nèi)的核酸到細(xì)胞的運(yùn) 輸。這些技術(shù)通過敲除基因表達(dá)或提供用于基因治療的遺傳構(gòu)建物設(shè)法治療各 種疾病和病癥。
作為選擇性降解mRNA的細(xì)胞機(jī)理的RNA干擾的發(fā)現(xiàn)使得能夠靶向操作 細(xì)胞培養(yǎng)物的表型和發(fā)展定向治療技術(shù)(Behlke， Mol. Ther. 13, 644-670， 2006; Xie爭(zhēng)乂， Drug Discov. Today 11 ， 67-73， 2006)。盡管短的干擾 RNA(siRNA)具有操作細(xì)胞表型的巨大潛能，由于它們的大小和負(fù)(陰離子)電荷 的性質(zhì)，siRNA是不能進(jìn)入細(xì)胞的大分子。實(shí)際上，siRNA超過了 Lipinski的細(xì) 胞運(yùn)輸膜擴(kuò)散分子的5s規(guī)則(Rule5s)的25倍，在該規(guī)則中，通常膜擴(kuò)散分子限 定大小為小于500Da。因此，在不存在運(yùn)輸載體或轉(zhuǎn)染劑時(shí)，棵露的siRNA不 進(jìn)入細(xì)胞，即使在毫摩爾的濃度下也不能(Barquinero爭(zhēng)乂， Gene Ther. 11 Suppll， S3-9， 2004)。重要的關(guān)注集中在使用陽(yáng)離子脂上，其凝聚siRNA并 在細(xì)胞膜上打孔來解決siRNA的運(yùn)輸問題。盡管已經(jīng)廣泛使用，但轉(zhuǎn)染劑不能 實(shí)現(xiàn)有效地運(yùn)輸?shù)皆S多細(xì)胞類型，尤其是原代細(xì)胞和造血細(xì)胞系中(T細(xì)胞和B 細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)。而且脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)常導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞毒性，從腫瘤細(xì)
ii胞中的輕度到原代細(xì)胞中的高度的細(xì)胞毒性。
近來的針對(duì)細(xì)胞的靼向方法，其使用抗體與凝聚DNA的魚精蛋白的融合物 (Song爭(zhēng)乂， Nat. Biotechnol. 23， 709-717, 2005)和siRNA與受體耙向的 RNA適體的融合物(McNamara等人，Nat. Biotechnol. 24, 1005-1015， 2006),提供了將siRNA運(yùn)輸?shù)竭x擇細(xì)胞中的潛能。

發(fā)明內(nèi)容
本公開內(nèi)容提供了用于將掩蔽寡核苷酸或多核苷酸運(yùn)輸?shù)交罴?xì)胞中的方法 和組合物。帶減少陰離子電荷的、中性的或帶陽(yáng)離子電荷的寡核苷酸或多核苷 酸單獨(dú)或綴合到轉(zhuǎn)導(dǎo)分子比帶陰離子電荷的核酸分子更好地橫向跨過細(xì)胞膜。 包括保護(hù)基/電中和基的短暫保護(hù)的寡核苷酸或多核苷酸(如，綴合陽(yáng)離子肽的 中性磷酸三酯基的寡核苷酸或多核苷酸和帶正電荷的磷酸三酯寡核苷酸或多核 苷酸)能夠通過自動(dòng)的亞酰胺(amidite)方法合成。
這些化合物能夠通過胞吞或大胞飲機(jī)理進(jìn)入活細(xì)胞的細(xì)胞溶質(zhì)。在一個(gè)方 面，所述磷酸三酯保護(hù)/中和基團(tuán)當(dāng)暴露于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境時(shí)，設(shè)計(jì)成通過酶活性或 通過被動(dòng)的細(xì)胞內(nèi)方法(齊如，高細(xì)胞內(nèi)濃度的谷胱甘肽)除去，以產(chǎn)生能夠誘發(fā) RNAi應(yīng)答的磷酸二酯寡核苷酸或多核苷酸。因此，本公開內(nèi)容提供了用作治療 劑，診斷劑和作為研究工具的寡核苷酸前藥。
本公開內(nèi)容進(jìn)一步提供了肽RNA/DNA雜合體前藥，其中通常在生理?xiàng)l件 下發(fā)現(xiàn)以負(fù)電荷狀態(tài)存在的沿著寡核苷酸或多核苷酸骨架的磷酸酯被短暫地作 為非離子的電荷中性的磷酸三酯保護(hù)。在一個(gè)方面，電荷中和的磷酸三酯基團(tuán) 通過加入任意數(shù)目的不同的磷酸保護(hù)基團(tuán)(辨如，硫代異戊?；蚧掖?SPTE) 基團(tuán))形成。在可選的實(shí)施方式中，磷酸骨架用含有正電荷的生物學(xué)可逆的R 基團(tuán)例如，胍鹽基團(tuán)通過酶不穩(wěn)定的接頭(RNB)保護(hù)，使構(gòu)建物產(chǎn)生凈陰電核特 征。所述帶有凈正電荷的本公開內(nèi)容的寡核苷酸前藥，通過肽連接或通過合成 增加正電荷到所迷寡核苷酸的磷酸骨架，使細(xì)胞膜穿透。
本公開內(nèi)容提供了核酸構(gòu)建物，包括a)寡核苷酸或多核普酸結(jié)構(gòu)域，其 包括減少所述寡核苷酸或多核普酸骨架的凈陰離子電荷的磷酸二酯和/或硫代磷 酸酯保護(hù)基團(tuán)；和b)包括膜運(yùn)輸功能的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其可操作地連接到所述 寡核苷酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)方面，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù) 基團(tuán)具有通式
12R-X-或Q-X-
其中X是O， S或NR1， W是H，甲基，乙基，硫代新戊?；虼掖?， 羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基， 烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代 的雜環(huán)基；
其中R是選自
R2,
其中f是烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán) 烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基， 或取代的雜環(huán)基，
其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，鹵素，氰基，或硝基，
其中V和八2各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中W是H,鞋基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中八3和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中AS是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中^和X"各自獨(dú)立地是0， S或NR7， f是H,鞋基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔
基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和 x4
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，M，或硝基，
其中八6和八6各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中XS和X"各自獨(dú)立地是0， S或NR8， R8是H，羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基；
其中Q是選自
Q1,
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
、a8 、z \
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中八8和八9各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， Q3 a11
<formula>formula see original document page 14</formula>
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， x5
其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中XS和XS各自獨(dú)立地是0, S或NR9, W是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔
基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和 X8
其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中X7和X8各自獨(dú)立地是0， S或NR10， R^是H,羥基，烷基，取代的 烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基， 炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基。在另一方 面所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)是選自MeO-， EtO-, iPrO，
本公開內(nèi)容也提供了核酸構(gòu)建物，包括包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保 護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或多核苷酸，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)減少所 述寡核苷酸或多核苷酸骨架的凈陰離子電荷或提供了所述寡核苷酸或多核苷酸 骨架的凈陽(yáng)離子電核。在一個(gè)方面，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)具 有通式
R-X-或Q-X-
其中X是O， S或NR1， W是H，甲基，乙基，硫代新戊?；虼掖?， 幾基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基， 烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代 的雜環(huán)基；
其中R是選自R2,
其中f是烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán) 烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基， 或取代的雜環(huán)基，
、a1 、z \
其中rS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氡基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，鹵素，tt，或硝基，
其中V和八2各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
r4 a a4
s\ \
s——aj ,
其中R"是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中八3和八4各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， xi
其中RS是H,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，鹵素，M，或硝基，
其中AS是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中^和乂2各自獨(dú)立地是0， S或NR7， f是H,羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和 x4
x3
r6
a7、
16其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中八6和AS各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中XS和X"各自獨(dú)立地是0， S或NR8, RS是H，羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基；
其中Q是選自
<formula>formula see original document page 17</formula>,
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
<formula>formula see original document page 17</formula>
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中八8和八9各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 、 /<formula>formula see original document page 17</formula>
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A^和AU各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， <formula>formula see original document page 17</formula>
其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)， 其中八12是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中xs和xs各自獨(dú)立地是0， S或NR9， RS是H,幾基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔
基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和 x8<formula>formula see original document page 17</formula>其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"和八14各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中X7和X8各自獨(dú)立地是0， S或NR10， R^是H，羥基，烷基，取代的 烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基， 炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基。在另一方 面，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)是選自MeO-， EtO-, iPrO,
本公開內(nèi)容也提供了藥物組合物，其包括本文所述的核酸構(gòu)建物。
本公開內(nèi)容描述了包括將一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接到核酸構(gòu)建物的 方法。在一個(gè)方面，所述一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含2-5蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
本公開內(nèi)容也提供了產(chǎn)生核酸構(gòu)建物的方法，包括基本純化蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域；合成寡核苷酸；用磷酸三酯基團(tuán)電荷中和所述寡核苷酸的陰離子電荷； 和將所述寡核苷酸連接到一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
也提供轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，包括用本公開內(nèi)容的核酸構(gòu)建物接觸細(xì)胞。所述 接觸能夠在體內(nèi)或體外。核酸構(gòu)建物能夠包含反義分子。
本公開內(nèi)容也提供了治療疾病或病癥的方法，包括向研究對(duì)象施用本公開 內(nèi)容的核酸構(gòu)建物，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包括治療或診斷分子。


圖1顯示TAT和帶陰離子電荷寡核苷酸的相互作用。TAT連接缺乏磷酸二 酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的寡核苦酸形成復(fù)合物，其中陽(yáng)離子電荷被中和。 圖2描述了電荷中和的寡核苷酸刺激大胞飲作用。 圖3顯示在寡核苷酸攝取過程中磷酸三酯保護(hù)和電荷中和的通常方案。 圖4顯示PTD綴合保護(hù)寡核苷酸和可逆的去保護(hù)的實(shí)施方式。圖5顯示磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)化學(xué)式的實(shí)施方式。 圖6顯示核苷酸亞磷酰胺合成路線本公開內(nèi)容。
圖7描述了可逆的電荷中和的還原反應(yīng)。
圖8描述了帶陰離子電荷的核酸的RNB磷酸三酯保護(hù)和去保護(hù)。 圖9顯示DTG保護(hù)的尿嘧啶的層析的DTT還原。 圖10顯示DTG- DTG-亞磷酰胺的氧化還原敏感性。 圖11顯示DTG- DTG-亞磷酰胺到二 TBS尿香的二聚體偶聯(lián)反應(yīng)。 圖12顯示用野生型磷酸二酯，甲基磷酸三酯或SPTE-磷酸三酯合成含有2， 氟基插入物的聚尿苷低聚物(SEQ ID NO: 22)。該圖顯示合成含有2，-氟(F)磷 酸三酯基團(tuán)RNA寡核苦酸的能力。在尿素變性條件下然后通過溴乙錠染色(右 板)進(jìn)行凝膠分析。
圖13A-D顯示合成含有磷酸三酯修飾的雙鏈siRNAs(SEQ ID NOs: 23-24)。 A:野生型石粦酸二酯和磷酸三酯基團(tuán)，曱基和SPTE的結(jié)構(gòu)是可逆的， 然而異丙基基團(tuán)是不可逆的，作為對(duì)照。B:序列eGFPsiRNAs顯示野生型有意
義鏈(S)(在板的上部線條)和反義(AS)(也稱為指導(dǎo)鏈)(在板的底線)，其用含有或 野生型，甲基，異丙基或SPTE磷酸三酯的六DNA胸苷插入物合成，如所示。 C:含有所示的磷酸三酯修飾的全長(zhǎng)反義(AS)寡核香酸的單鏈RNA分析。凝膠 分析在尿素變性條件然后通過溴乙錠染色進(jìn)行。D:雙鏈RNA分析合成的含有 磷酸三酯修飾的雙鏈體。有意義(S)鏈(上部線條)是野生型RNA。反義(AS)鏈(底 線)含有6x野生型DNA胸苷(AS-6T), 6x曱基-磷酸三酯胸苷(AS-Met6T)， 6x異 丙基-磷酸三酯胸苷(AS-Iso6T), 6xSPTE-磷酸三酯胸普(AS-SPTE6T)，如所示。 凝膠分析分析在非變性條件然后通過溴乙錠染色進(jìn)行。該數(shù)據(jù)顯示能夠制備穩(wěn) 定，全長(zhǎng)的含有磷酸三酯修飾的siRNAs。
圖14A-B顯示分析GFP報(bào)告RNA干涉(RNAi)應(yīng)答。A:流式細(xì)胞術(shù)(FACS) 分析穩(wěn)定表達(dá)eGFP的報(bào)告H1299細(xì)胞，然后用所示的siRNA雙鏈體處理。細(xì) 胞用50nM所示的siRNAs加脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000轉(zhuǎn)染4 h接著通過FACS在24 h 分析GFP表達(dá)。未處理的對(duì)照細(xì)胞顯示高水平GFP表達(dá)。不可逆的S/AS-Iso6T RNA轉(zhuǎn)染顯示GFP表達(dá)沒有變化，表明連續(xù)存在6x異丙基磷酸三酯基團(tuán)阻斷 或不能誘導(dǎo)RNAi應(yīng)答。該觀察說明要求磷酸三酯反向(分解)為磷酸二酯以誘導(dǎo) RNAi應(yīng)答。重要的是，S/AS-Met6T或S/AS-SPTE6T siRNAs的轉(zhuǎn)染分別誘導(dǎo) 顯著的RNAi應(yīng)答，其接近野生型對(duì)照A/AS-6T(灰色)RNAi應(yīng)答。這些觀察說
19明磷酸二酯在反義(指導(dǎo))鏈上的使用和在載入RNAi機(jī)器前，可逆的Met6T和 SPTE6T磷酸三酯基團(tuán)能夠在細(xì)胞內(nèi)分解。B:來自A所示的siRNAs劑量曲線 顯示在不同濃度的RNAi效率。表達(dá)GFP報(bào)告分子的H1299細(xì)胞用siRNA加脂 質(zhì)轉(zhuǎn)染胺2000處理4小時(shí)。RNAi效率在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)通過FACS分析。
圖15A-B顯示PTD介導(dǎo)的電荷中和的dsDNA的運(yùn)輸。A:在每條鏈含有 15x電荷中性的甲基-磷酸三酯(15N)和在有意義(S)鏈5'端含有硫羥基交聯(lián)基序 和在反義(AS)鏈5，端含有Cy3染色標(biāo)記的dsDNA被化學(xué)交聯(lián)到2xTAT PTDs(左 4反)或3xTAT-PTDs(右+反)，如所示，純化為dsDNA分子，加到細(xì)胞中4h，胰蛋 白酶消化，洗滌，通過Cy3標(biāo)記通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析siRNA攝取。 dsDNAis只有當(dāng)通過二硫鍵(2x/3xPTD-S-S-15N/15N-Cy3)綴合到或2x或3xPTD 肽才被攝取，然而肽加到dsDNA但不綴合(2x/3xPTD+15N/15N-Cy3)的對(duì)照， 是不被細(xì)胞攝取的。B:上述的4小時(shí)FACS處理的H1299細(xì)胞的 PTD-dsDNA-Cy3寡綴合物劑量曲線圖，如所示。

發(fā)明內(nèi)容
如本文和在所附權(quán)利要求所用，單數(shù)形式"一""和，以及"，和"該，所述" 包括復(fù)數(shù)事物，除非上下文另外清楚地說明。因此，例如，參照"一個(gè)PTD"包 括幾個(gè)這種PTD,參照"所述細(xì)胞"包括本技術(shù)領(lǐng)域人員所知的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞 參照，等等。
除非另外說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本公開內(nèi)容屬于的本 領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的相同意思。但是類似于或等同那些本文所述的方法和 材料能夠被用于實(shí)施所公開的方法和組合物，本文描述了示例性方法，裝置和 材料。
上述和全文所述的出版物，它們的公開內(nèi)容是在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗涨?。此處絕 不應(yīng)理解為本發(fā)明人無權(quán)利用這些公開內(nèi)容認(rèn)為本公開內(nèi)容無新穎性。
運(yùn)輸一些生物活性劑到細(xì)胞內(nèi)的能力是存在問題的，因?yàn)榇嬖诩?xì)胞膜產(chǎn)生 的生物利用率的限制。細(xì)胞胞質(zhì)膜產(chǎn)生屏障，細(xì)胞內(nèi)攝取的分子局限在那些足 夠的非極性和小于大約500道爾頓的分子。以前的提高蛋白細(xì)胞內(nèi)化的努力集 中在與受體配體的融合蛋白(Ng爭(zhēng)乂， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 99: 10706-11， 2002)或通過將它們包裝進(jìn)籠形脂質(zhì)載體(Abu-Amer爭(zhēng)乂， J.Biol.
20Chem. 276: 30499-503， 2001)。然而，這些技術(shù)常導(dǎo)致弱的細(xì)胞攝取和細(xì)胞內(nèi) 螯合進(jìn)入胞吞途徑。
由于它們的陰離子電荷和大尺寸 14, 000道爾頓，運(yùn)輸siRNAis在哺乳動(dòng) 物，包括人中是很大的挑戰(zhàn)。在體內(nèi)通過蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域運(yùn)輸siRNA的能力開 啟了治療許多疾病的能力。本公開內(nèi)容提供了方法和組合物以幫助和改善細(xì)胞 通過"保護(hù)"與寡核苷酸或多核苷酸有關(guān)的電荷攝取核酸分子。
其它高度帶電的具有治療能力的核酸分子面臨相同的運(yùn)輸屏障。例如， RNA適體具有大的能力結(jié)合，螯合和抑制在>10, 000道爾頓和高度帶電的蛋 白，它們自己不具有或具有有限的能力到進(jìn)入細(xì)胞。本公開內(nèi)容的方法和組合 物允許細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸RNA適體，siRNA和DNA載體。
因此，序列特異的寡核苷酸或多核苷酸選擇治療人疾病的能力能夠更有效 地向研究對(duì)象和細(xì)胞運(yùn)輸有用的寡核苦酸和多核苷酸，包括siRNAs, RNA適 體，和DNA載體。本公開內(nèi)容克服這種RNAi構(gòu)建物運(yùn)輸困難或不能運(yùn)輸?shù)拇?小和電荷的限制。通過可逆的中和在核酸(例如，dsRNA)，包括根據(jù)本公開內(nèi) 容的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的構(gòu)建物上的陰離子電荷能夠運(yùn)輸核酸 進(jìn)入體外和體內(nèi)的細(xì)胞。
本公開內(nèi)容提供了包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的核酸構(gòu)建物。 構(gòu)建物能夠進(jìn)一步包括用于細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)節(jié)的組合物。這種組合物能夠包 括包含膜運(yùn)輸功能的轉(zhuǎn)導(dǎo)部分結(jié)構(gòu)域和可以進(jìn)一步包含足以可逆的中和核酸上 的陰離子電荷的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
例如，通過磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))的陰離子核酸 (辨>，RNA分子)的電荷中和促進(jìn)攝取。在實(shí)施方式中，其中電荷中和的陰離 子核酸連接到PTD上，帶陰離子電荷的核酸的電荷中和釋放陽(yáng)離子PTD跨膜以 及阻止綴合物的聚集。PTD的暴露的自由陽(yáng)離子電荷能夠接著與細(xì)胞表面有效 地相互作用，誘導(dǎo)大胞飲作用和從大胞飲體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。 一旦在細(xì)胞內(nèi)， 所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))能夠通過細(xì)胞內(nèi)過程除 去，諸如還原二硫鍵或酯水解，允許從細(xì)胞質(zhì)中的構(gòu)建物除去。核酸構(gòu)建物包 括，例如，dsRNA能夠接著通過切酶，RNA酶III類似的核糖核酸酶水解，由 此釋放沉默耙基因的siRNA。
本文提供的數(shù)據(jù)說明，向核酸加入一個(gè)或多個(gè)可除去的(例如，可逆的結(jié)合) 磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))能夠有效地幫助細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)。任何核酸，不管序列組成，能夠通過磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多 個(gè)"務(wù)飾。
本公開內(nèi)容提供了寡核苷酸或多核苷酸，在一些實(shí)施方式中，其具有一個(gè) 或多個(gè)生物可逆的保護(hù)基團(tuán)，這些保護(hù)基團(tuán)導(dǎo)致了提高細(xì)胞膜的穿透和抵抗外 切和內(nèi)切核酸酶降解的化學(xué)和生物物理性質(zhì)。本公開內(nèi)容進(jìn)一步提供酰胺試劑 用于合成生物可逆的保護(hù)寡核苷酸或多核苷酸。而且，這些保護(hù)基團(tuán)在合成的 過程中是穩(wěn)定的。
具有一個(gè)或多個(gè)生物可逆的保護(hù)基團(tuán)的本公開內(nèi)容的所述寡核苷酸或多核 普酸有時(shí)稱為前寡核苷酸或前多核苷酸。在本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中，前寡核 苷酸能夠增加細(xì)胞脂雙層穿透能力以及對(duì)體內(nèi)外切和內(nèi)切核酸酶降解的抗性。 在細(xì)胞中，生物可逆的保護(hù)基團(tuán)在細(xì)胞溶質(zhì)中通過還原條件，酶活性(斧/如，內(nèi) 源羧酸酯酶)等除去，以產(chǎn)生生物活性的寡核苷酸化合物，所述化合物能夠雜交 到具體的內(nèi)源核酸和/或?qū)ζ渚哂杏H合力。
所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)能夠與合成的DNA的反義寡核苷 酸或RNA或與靶序列的互補(bǔ)序列的混合分子使用，所述靶序列屬于基因或RNA 信使，其表達(dá)被特定設(shè)計(jì)為阻斷或下調(diào)。反義寡核苷酸可以針對(duì)耙信使RNA序 列或者，可選地針對(duì)靶DNA序列，并雜交到它們互補(bǔ)的核酸。因此，這些分子 有效地阻斷或下調(diào)基因表達(dá)。
保護(hù)的寡核苷酸或多核苷酸也可以針對(duì)一些雙鏈DNA區(qū)(同聚嘌呤/同聚嘧 啶序列或富含嘌呤/嘧啶的序列)，并因此形成三鏈螺旋。在特定序列的三鏈螺旋 的形成，能夠阻斷調(diào)節(jié)或否則調(diào)控基因表達(dá)的蛋白因子的相互作用，和/或可以 促進(jìn)不可逆的傷害引入到具體的核酸位點(diǎn)，條件是得到的寡核苷酸具有反應(yīng)官 能基團(tuán)。
本文提供了核酸構(gòu)建物，和產(chǎn)生這種構(gòu)建物的方法，它們能夠用于幫助運(yùn) 輸寡核苷酸或多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建物包括一個(gè)或 多個(gè)磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))到中和與核酸諸如RNA和 /或DNA相連的所述磷酸二酯陰離子電荷。 一旦進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)基團(tuán)能夠從構(gòu) 建物通過細(xì)胞內(nèi)過程除去，所述細(xì)胞內(nèi)過程包括二辟u鍵還原，酯水解或其它酶-介導(dǎo)的過程。在其它實(shí)施方式中，包括一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保 護(hù)基團(tuán)的核酸構(gòu)建物進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域諸如蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (PTD)。例如，PTD能夠通過自由的硫羥基基團(tuán)直接綴合到包括核酸構(gòu)建物的寡核苷酸(例如，RNA或DNA)，諸如5，和/或3，端。例如，通過生物學(xué)上敏感和可 逆的方式，諸如二硫鍵，PTD能夠連接到構(gòu)建物。該方法能夠應(yīng)用到任何寡核 苷酸或多核苷酸長(zhǎng)度和允許運(yùn)輸RNA(*如，siRNA， RNA適體)或DNA進(jìn)入細(xì) 胞。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，核酸構(gòu)建物能夠包括堿性基團(tuán)，諸如胍鹽基團(tuán)(類 似于到頭部基團(tuán)精氨酸，PTD的活性組分)，它們連接到可逆的保護(hù)基團(tuán)和由此 限制對(duì)PTD的需要。
因此，本文提供核酸構(gòu)建物，其被合成以包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保 護(hù)基團(tuán)(一個(gè)或多個(gè))，以用于運(yùn)輸核酸序列通過細(xì)胞膜。構(gòu)建物也能夠包括，例 如， 一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或含有堿性基團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)。 一旦進(jìn)入細(xì)胞，所 述核酸構(gòu)建物的寡核普酸/多核苷酸通過水解或其它酶活性，基于還原環(huán)境回復(fù) 到未保護(hù)/野生型的寡核香^/多核苷酸。
分離的核酸構(gòu)建物指結(jié)合包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的分子 或化合物的寡核苷酸或多核苷酸。例如，核酸構(gòu)建物包括，但不限于，寡核苷 酸或多核苷酸，其通過氫鍵，電荷結(jié)合，共價(jià)結(jié)合等與陰離子電荷還原基團(tuán)(一 個(gè)或多個(gè))或分子(一個(gè)或多個(gè))結(jié)合，以促進(jìn)細(xì)胞的攝取。陰離子電荷還原分子 能夠連接本公開內(nèi)容的核酸構(gòu)建物的寡核香酸或多核苷酸的實(shí)例包括融合多肽 或肽，還原寡核苷酸或多核苷酸的凈陰離子電荷的化學(xué)部分和其結(jié)合。
本文提供的核酸構(gòu)建物的應(yīng)用包括選擇治療癌，病毒感染，遺傳疾病，用 于研究的核酸運(yùn)輸?shù)取?br> 術(shù)語多核普酸(一個(gè)或多個(gè))和寡核苷酸(一個(gè)或多個(gè))通常指任何多核糖核 苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未^^飾的RNA或DNA或修飾的RNA或 DNA。因此，例如，如本文所用的寡核香酸指包括，單和雙鏈DNA,是單和 雙鏈區(qū)域混合物的DNA,單和雙鏈RNA，是單和雙鏈區(qū)混合物的RNA，包括 DNA和RNA的雜合體分子，所述DNA和RNA可以是單鏈的或者，更典型的， 雙鏈的或單和雙鏈區(qū)的混合物，等。因此，寡核苷酸能夠包含siRNA,反義分 子，核酶等。
另夕卜，多核苷酸或寡核苷酸也包括包含包括RNA或DNA或RNA與DNA 的三鏈區(qū)。在這種區(qū)的鏈可以來自相同的分子或不同的分子。所述區(qū)可以包括 所有一個(gè)或多個(gè)分子，但是更典型的只涉及一些分子的 一個(gè)區(qū)域。
23在一些方面多核苷酸或寡核苷酸包括上述的DNAs或RNAs,其含有一個(gè) 或多個(gè)修飾的堿基。因此，骨架包括不常見堿基，諸如肌香，或修飾的堿基， 諸如三苯曱基化的堿基的DNA或RNA，是本文術(shù)語所用的多核苷酸或寡核苷 酸。
本公開內(nèi)容的一個(gè)方面包括核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物包括寡核苷酸， 所述寡核香酸具有還原的陰離子電荷和包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán) 或電荷中和基團(tuán)。然而，構(gòu)建物能夠進(jìn)一步包括轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和/或核酸結(jié)合結(jié)構(gòu) 域。這些方法可以包括設(shè)計(jì)在核酸構(gòu)建物(辦如，包括磷酸二酯保護(hù)基團(tuán)的 siRNA)之間的二硫鍵(或者酯鍵，等)和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)或PCT和雙鏈 RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DRBD)(辦如，TAT-DRBD)融合蛋白，以進(jìn)一步增加結(jié)合親合 力，攝取，陰離子電荷還原，和/或增加陽(yáng)離子電荷。 一旦被細(xì)胞(體外或在體 內(nèi))攝取，所述復(fù)合物能夠被還原(例如，通過二硫還原)并被釋放進(jìn)入細(xì)胞。
如本文所用陰離子電荷中和的分子或基團(tuán)指分子或化學(xué)基團(tuán)，其能夠還原 與其連接的寡核苷酸或多核苷酸的總凈陰離子電荷。本文所述的磷酸二酯和/或 硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)是陰離子電荷中和基團(tuán)。所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保 護(hù)基團(tuán)能夠是可逆的或不可逆的。 一個(gè)或多個(gè)陰離子電荷中和的分子或基團(tuán)能 夠連接寡核苷酸或多核苷酸，其中每個(gè)獨(dú)立地導(dǎo)致還原構(gòu)建物的陰離子電荷和 或增加構(gòu)建物的陽(yáng)離子電荷。例如， 一個(gè)或多個(gè)磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù) 基團(tuán)能夠連接寡核苷酸和"保護(hù)的寡核苷S臾"連接一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (辦如，PTDs)，使得相對(duì)于沒有所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)和/或 PTD的所述寡核苷酸，構(gòu)建物的總凈陰離子電荷還原或總凈電荷中性或構(gòu)建物 的總凈電荷是陽(yáng)離子。
本公開內(nèi)容提供了磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)和包括這種磷酸二 酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的寡核普酸或多核香酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述 磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)具有通式
R-X-或Q誦X-
其中X是O， S或NR1， R^是H,曱基，乙基，硫代新戊?；虼掖?， 羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基， 烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代 的雜環(huán)基；
其中R是選自
24r2，
其中W是烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán) 烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基， 或取代的雜環(huán)基，
R、A,S、,A、，
其中W是h，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中V和八2各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
R4 A4
S——AJ ,
其中r"是h,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，面素，tt，或硝基，
其中八3和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， xi
5人2/A5\
R5 、X2 \ ,
其中rS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，tt，或硝基，
其中AS是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中^和乂2各自獨(dú)立地是0， s或nr7, W是h，羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的歸基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和<formula>formula see original document page 26</formula>
其中W是h,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，
其中八6和八6各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，
其中XS和X"各自獨(dú)立地是0， s或nr8, r8是H，鞋基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基；
其中Q是選自
Q1,
其中Qi是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
Q2YS\Z\,
其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中八8和八9各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， Q3 a11
s——a1q
其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"和AH各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， x5
其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)， 其中八12是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中XS和Xe各自獨(dú)立地是0， s或nr9, W是h,羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和X8
A1、4
X7Q5、
13
-A'
其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，
其中A"和八14各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中X7和X8各自獨(dú)立地是0， S或NR10， R"是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)是選自MeO國(guó)，EtO-, iPrO，
和
在其它的實(shí)施方式中，所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)包括其選自以下的結(jié)構(gòu)
(a) V\(b)RZnS-Szn x、
X々A
， 和
在另一個(gè)實(shí)施方式中，RNB保護(hù)基團(tuán)包括結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)選自
27<formula>formula see original document page 28</formula>(e) n 。
烷基基團(tuán)包括直鏈的，支鏈的和環(huán)狀烷基基團(tuán)。烷基基團(tuán)包括那些具有1到20個(gè)碳原子的基團(tuán)。烷基基團(tuán)包括小的烷基基團(tuán)含有1到3個(gè)碳原子的小的烷基基團(tuán)。烷基基團(tuán)包括具有4-10個(gè)碳原子的中等長(zhǎng)度的烷基基團(tuán)。烷基基團(tuán)包括具有多于IO個(gè)碳原子，尤其是那些具有10-20個(gè)碳原子的長(zhǎng)烷基基團(tuán)。環(huán)狀烷基基團(tuán)包括那些具有一個(gè)或多個(gè)環(huán)的基團(tuán)。環(huán)狀烷基基團(tuán)包括那些具有3-,4_， 5_， 6-， 7-， 8-， 9-或10-元碳環(huán)和特別是那些具有3-， 4-， 5-, 6-,或7-元環(huán)的基團(tuán)。在環(huán)狀烷基基團(tuán)的碳環(huán)也能夠攜帶烷基基團(tuán)。環(huán)狀烷基基團(tuán)能夠包括二環(huán)和三環(huán)烷基基團(tuán)。烷基基團(tuán)任選地包括取代的烷基基團(tuán)。取代的烷基基
團(tuán)包括那些芳基基團(tuán)取代的基團(tuán)以及其它基團(tuán)，其反過來能夠被任選地取代。具體的烷基基團(tuán)包括曱基，乙基，正丙基，異丙基，環(huán)丙基，正丁基，硫代丁基，叔丁基，環(huán)丁基，正戊基，支鏈的戊基，環(huán)戊基，正己基，支鏈的己基，和環(huán)己基基團(tuán)，所有這些被任選地取代。
烯基基團(tuán)包括直鏈的，支鏈的和環(huán)狀烯基基團(tuán)。烯基基團(tuán)包括那些具有l(wèi)，2或更多的雙鍵和那些其中兩個(gè)更多的雙鍵是綴合的雙鍵。烯基基團(tuán)包括那些具有2到20個(gè)碳原子的烯基基團(tuán)。烯基基團(tuán)包括具有2到3碳原子的小的烷基基團(tuán)。烯基基團(tuán)包括具有4-10個(gè)碳原子的中等長(zhǎng)度的烯基基團(tuán)。烯基基團(tuán)包括具有多于10個(gè)碳原子，特別是那些具有10-20個(gè)碳原子的長(zhǎng)烯基基團(tuán)。環(huán)狀烯基基團(tuán)包括那些具有一個(gè)或多個(gè)環(huán)的基團(tuán)。環(huán)狀烯基基團(tuán)包括那些其中雙鍵在環(huán)中或在結(jié)合環(huán)的烯基基團(tuán)中。環(huán)狀烯基基團(tuán)包括那些具有3-， 4-， 5-， 6-， 7-，8-， 9-或10-元碳環(huán)和特別是那些具有3-， 4-， 5-, 6-或7-元環(huán)的基團(tuán)。在環(huán)狀烯基基團(tuán)中的碳環(huán)也能夠攜帶烷基基團(tuán)。環(huán)狀烯基基團(tuán)能夠包括二環(huán)和三環(huán)烷基基團(tuán)。烯基基團(tuán)被任選地取代。取代的烯基基團(tuán)包括那些被烷基或芳基基團(tuán)取代的基團(tuán)等，該基團(tuán)反過來能夠被任選地取代。具體的烯基基團(tuán)包括乙基，丙-l-烯基，丙-2-烯基，環(huán)丙-l-烯基，丁-l-烯基，丁-2-烯基，環(huán)丁-l-烯基，環(huán)丁-2-烯基，戊-l-烯基，戊-2-烯基，支鏈的戊烯基，環(huán)戊-l-烯基，己-l-烯基，支鏈的己烯基，環(huán)己烯基，所有這些被任選地取代。
芳基基團(tuán)包括基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)5-或6-元芳族的或雜芳族環(huán)。芳基基團(tuán)能夠含有一個(gè)或多個(gè)稠合的芳族環(huán)。雜芳族環(huán)能夠在環(huán)中包括一個(gè)或多個(gè)N,0,或S石友原子。雜芳族環(huán)能夠包括那些具有一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)N的環(huán)，那些具有一個(gè)兩個(gè)O的環(huán)，和那些具有一個(gè)兩個(gè)S的環(huán)。芳基基團(tuán)被任選地取代。取代的芳基基團(tuán)包括那些被烷基或烯基基團(tuán)取代的基團(tuán)，該基團(tuán)反過來能夠任選地取代。具體的芳基基團(tuán)包括苯基基團(tuán)，聯(lián)苯基基團(tuán)，吡啶基基團(tuán)，和萘基基團(tuán)，所有這些被任選地取代。
芳基烷基基團(tuán)被一個(gè)或多個(gè)芳基基團(tuán)取代，其中烷基基團(tuán)任選地?cái)y帶另外取代基，并且芳基基團(tuán)被任選地取代。具體的烷基芳基基團(tuán)是苯基取代的烷基基團(tuán)，評(píng)如，苯基甲基基團(tuán)。
烷基芳基基團(tuán)是被一個(gè)或多個(gè)烷基基團(tuán)取代的芳基基團(tuán)，其中烷基基團(tuán)任選地?cái)y帶另外取代基并且芳基基團(tuán)被任選地取代。具體的烷基芳基基團(tuán)是烷基-取代的苯基基團(tuán)諸如曱基苯基。
可以從兩個(gè)或更多的Rl-R5 —起形成的環(huán)可以是任選取代的環(huán)烷基基團(tuán)，任選取代的環(huán)烯基基團(tuán)或芳族的基團(tuán)。The環(huán)可以含有3， 4， 5, 6， 7或更多的碳。環(huán)可以是雜芳族的，其中芳族環(huán)的一個(gè)，兩個(gè)或三個(gè)碳被N， O或S取代。環(huán)可以是雜烷基或雜烯基，其中環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)CH2基團(tuán)被O， N,NH，或S耳又代。
任選地取代任何烷基，烯基和芳基基團(tuán)包括被一個(gè)或多個(gè)以下取代基的取代卣素，—CN , --COOR , —OR ， —COR , --OCOOR , —CON(R)2 ，—OCON(R)2， —N(R)2,瞬-N02， 一SR， —S02R,誦-S02N(R)2或--SOR基團(tuán)。任
選地取代烷基基團(tuán)包括被一個(gè)或多個(gè)烯基基團(tuán)，芳基基團(tuán)或兩者取代，其中烯基基團(tuán)或芳基基團(tuán)被任選地取代。任選地取代烯基基團(tuán)包括被一個(gè)或多個(gè)烷基基團(tuán)，芳基基團(tuán)，或兩者取代，其中烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)被任選地取代。任選地取代芳基基團(tuán)包括用一個(gè)或多個(gè)烷基基團(tuán)，烯基基團(tuán)，或兩者取代芳基環(huán)，其中烷基基團(tuán)或烯基基團(tuán)被任選地取代。
烷基，烯基和芳基基團(tuán)的任選的取代基包括以下以及其它
-COOR其中R是氫或烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)，和更具體地，其中R是甲基，
29乙基，丙基，丁基，或苯基基團(tuán)，所有這些被任選地取代；
-COR其中R是氫，或烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中R是曱基，乙基，丙基，丁基，或苯基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)^皮任選地取代；
-CON(R)2其中每個(gè)R，獨(dú)立于每個(gè)其它的R，是氫或烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中R是曱基，乙基，丙基，丁基，或苯基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)尋皮任選地取代；R和R能夠形成環(huán)，其可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵；
-OCON(R)2其中每個(gè)R,獨(dú)立于每個(gè)其它的R，是氫或烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中R是甲基，乙基，丙基，丁基，或苯基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)被任選地取代；R和R能夠形成環(huán)，其可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵；
-N(R)2其中每個(gè)R，獨(dú)立于每個(gè)其它的R,是氫，或烷基基團(tuán)，?；鶊F(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中R是甲基，乙基，丙基，丁基，或苯基或乙?；鶊F(tuán)，所有這些被任選地取代；或R和R能夠形成環(huán)，該環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。
—SR, —S02R，或-SOR其中R是烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中R是甲基，乙基，丙基，丁基，苯基基團(tuán)，所有這些被任選地取代；對(duì)-SR， R可以是氫；
-OCOOR其中R是烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)；
—S02N(R)2其中R是氮，烷基基團(tuán)，或芳基基團(tuán)，R和R能夠形成環(huán)；—OR其中R=H,烷基，芳基，或?；?；例如，R能夠是產(chǎn)生酰基的—OCOR*其中11*是氫或烷基基團(tuán)或芳基基團(tuán)和更具體地，其中P是甲基，乙基，丙基，丁基，或苯基基團(tuán)，所有這些基團(tuán)被任選地取代。
具體的取代的烷基基團(tuán)包括卣素烷基基團(tuán)，尤其是三卣素曱基基團(tuán)和特別是三氟曱基基團(tuán)。具體的取代的芳基基團(tuán)包括一，二，三，四-和五卣素取代的苯基基團(tuán)；一，二，三-，四-，五-,六-，和七-鹵素取代的萘基團(tuán)；3-或4-鹵素-取代的苯基基團(tuán)，3-或4-烷基-取代的苯基基團(tuán)，3-或4-烷氧基-取代的苯基基團(tuán)，3-或4-RCO-取代的苯基，5-或6-卣素取代的萘基團(tuán)。更具體地，取代的芳基基團(tuán)包括乙酰苯基基團(tuán)，特別是4-乙酰苯基基團(tuán)；氟苯基基團(tuán)，特別是3-氟苯基和4-氟苯基基團(tuán)；氯苯基基團(tuán)，特別是3-氯苯基和4-氯苯基基團(tuán)；甲基苯基基團(tuán)，特別是4-甲基苯基基團(tuán)，和曱氧基苯基基團(tuán)，特別是4-曱氧基苯基基團(tuán)。
使用含有連接到可逆的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的堿性基團(tuán)(例如，胍鹽基團(tuán))還沒有用于核酸運(yùn)輸。其他人也沒有包括使用含有保護(hù)基團(tuán)的
30dsRNA和/或使用綴合到包括電荷中和基團(tuán)的寡核苷酸或多核苷酸的PTD，以用于運(yùn)輸核酸構(gòu)建物通過細(xì)胞膜。
當(dāng)寡核苷酸或多核苷酸連接到PTD時(shí)，帶陰離子電荷的寡核苷酸或多核苷酸的電荷中和釋放帶正電荷的PTD，以與細(xì)胞表面相互作用，并且也阻止了綴合物的聚集。例如，暴露的陽(yáng)離子帶電的PTD與細(xì)胞表面相互作用和誘導(dǎo)大胞飲作用。所述寡核普酸被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。 一旦進(jìn)入細(xì)胞，保護(hù)基團(tuán)能夠通過細(xì)胞過程裂解除去，所述細(xì)胞過程，諸如還原酶，氧化酶，還原劑，氧化劑或酯酶，脫保護(hù)所述寡核苷酸或多核苷酸，使核酸到回復(fù)到其自然構(gòu)型。
如本文所用，核酸結(jié)構(gòu)域，與寡核苷酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域互換使用，能夠是任何寡核苷酸或多核苷酸(辨如，核酶，反義分子，多核苷酸，寡核苷酸等)。寡核苷酸或多核苷酸通常含有磷酸二酯鍵，但是在一些情況，包括可以具有替代骨架，包括，辨余，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磚酸酯，或O-甲基亞石粦酰胺連4妄的核酸類4以物(見Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: APractical Approach, Oxford University Press);和肽^t臥殳骨架和連4妄。其它類4以才亥酸包括那些具有正電荷的骨架；非離子骨架，和非核糖骨架，包括在U.S. Pat.Nos. 5,235,033 and 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.4苗述的那些。含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)狀糖的核酸也包括在核酸的一個(gè)定義中?？梢詾榱硕喾N原因修飾核糖-磷酸骨架，例如增加這種分子在生理環(huán)境的穩(wěn)定性和半衰期。自然發(fā)生的核酸和類似物的混合物也包括在術(shù)語寡核苷酸和多核苷酸中；可選地，不同核酸類似物的混合物，和自然發(fā)生的核酸和類似物的混合物能夠被制備。而且，RNAN， RNB， DNA， RNA的雜合體能夠被使用。dsDNA,ssDNA， dsRNA, siRNAre包括在術(shù)語寡核苷酸和多核普酸中。
多核苷酸指由任意數(shù)目的共價(jià)結(jié)合核苷酸單體構(gòu)成的聚合化合物，包括核酸分子諸如DNA和RNA分子，包括單、雙和三鏈的這種分子，并且特別旨在包含通常稱為"寡核苷酸"的多核苷酸基團(tuán)，寡核苷酸通常被區(qū)分為具有相對(duì)小數(shù)目的(不多于大約30， 大約5-10， 10-20或20-30)核苷酸組分。
如本文所用，術(shù)語"siRNA"是"短干擾RNA"的縮寫，有時(shí)也稱為"小的干擾RNA"或"沉默RNA",指一類大約19-25核普酸長(zhǎng)的雙鏈核糖核酸分子，在真核生物中，其參與RNA干涉(RNAi)途徑，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的，序列特異的基因沉默。術(shù)語"dsRNA"是"雙鏈RNA"的縮寫，和如本文所用是指具有兩個(gè)互補(bǔ)RNA鏈的核糖核酸分子，并且其與siRNA不同在于，至少大約26核苷酸長(zhǎng)度，和更典型的是至少大約50到大約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。
如上述，核酸可以是DNA(基因組和cDNA)， RNA或雜合體，其中核酸可以含有脫氧核糖和核糖核普酸，和堿基的組合，所述堿基包括尿嘧啶，腺。票呤，胸腺嘧咬，胞嘧啶，鳥嘌呤，肌普，黃噤呤，次黃嘌呤，異胞嘧啶，異鳥噪呤，等。如本文所用，術(shù)語"核苷"包括核苷酸和核苷以及核苷酸類似物，和修飾的核苷諸如氨基修飾的核香。另外，"核苷"包括非自然發(fā)生的類似結(jié)構(gòu)。因此，例如肽核酸的每個(gè)單元，每個(gè)含有堿，本文稱為核苷酸。
本文所述的核酸構(gòu)建物的核酸結(jié)構(gòu)域不被限制為任何特定序列。用于診斷劑，治療劑和研究的任意數(shù)目的寡核苷酸或多核苷酸能夠被用于本公開內(nèi)容的方法和組合物。不同來源寡核苷酸和多核苷酸對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是可得的。例如，基因組片段可以是分離的和根據(jù)本公開內(nèi)容修飾的分離的多核苷酸以使用磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)還原總凈陰離子電荷或可以使用例如，本領(lǐng)域已知的核酸合成技術(shù)作為所述寡核苷酸或多核普酸延伸的來源。
從M. Caruthers和S. Beaucage以及他人的出版著作中知道實(shí)施亞磷酰胺化學(xué)以制備寡核苷酸。美國(guó)專利Nos. 4,458,066, 4,500,707, 5,132,418, 4,415,732,4,668,777, 4,973,679, 5,278,302, 5,153,319, 5,218,103, 5,268,464, 5,000,307,5,319,079, 4,659,774, 4,672,110,4,517,338, 4,725,677和Re. 34,069，每個(gè)通過參考并入，描述了寡核苷酸合成的方法。另外，實(shí)施亞磷酰胺化學(xué)已被以下系統(tǒng)地綜述Beaucage和Iyer in Beaucage, S. L.禾n Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48,2223-2311禾卩Beaucage, S. L.和Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194,或者其中的參考文獻(xiàn)，所有這些^f皮本文通過參考并入。
核酸合成儀可商業(yè)獲得，它們的使用通常^f皮本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為有效地產(chǎn)生幾乎任何期望的合理長(zhǎng)度的寡核芬酸。
在實(shí)施亞磷酰胺化學(xué)中，圖中縮寫為有用的5，OH糖阻斷基團(tuán)的DMT是三苯曱基，單曱氧基三苯甲基，二曱氧基三苯曱基和三曱氧基三苯曱基，尤其是二甲氧基三苯甲基(DMTr)。在實(shí)施亞磷酰胺化學(xué)有用的亞磷酸激活基團(tuán)，即，NR2,是二烷基取代的氮基團(tuán)和氮雜環(huán)。 一個(gè)方法包括使用二異丙基氨基激活基團(tuán)。
32不同核苷單元能夠能夠-皮激活為本公開內(nèi)容的酰胺和并摻入本公開內(nèi)容的 所述寡核苷酸或多核苷酸。這些包括脫氧核苷酸，即，其中上述的結(jié)構(gòu)中的W
是H，核糖核苦酸，在一些實(shí)施方式中W是F，伊，其中W是上述結(jié)構(gòu)的 OH， 2'-烷氧基核苷酸，伊，其中W是上述的結(jié)構(gòu)中的O-烷基，或取代的2'-0-烷基核苷酸，伊，其中W是上述的結(jié)構(gòu)中的取代的-O-烷基。2'-0-烷基核苷酸 敘述在U.S.Pat.No.5,466,786，本文通過參考并入。特定有用的取代的2'-0-烷基 基團(tuán)，甲氧乙氧基團(tuán)，被描述在Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504，其也被本文通過參考并入。
寡核苷酸能夠通過Mermade-6固相自動(dòng)化寡核苷酸合成儀或任何常見的自 動(dòng)化寡核苷酸合成儀合成。三酯，亞磷酰胺，或膦酸氫偶聯(lián)化學(xué)，它們?cè)诶?^口， M. Caruthers, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression., pp, 7-24, J. S. Cohen, ed. (CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla., 1989)或Oligonucleotide synthesis, a practical approach, Ed. M.丄Gait， IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991描述，被這 些合成儀用于提供期望的寡核香酸.Beaucage試劑，如在Journal of American Chemical Society, 1990, 112, 1253-1255所述，或元素石克，如在Beaucage等人, Tetrahedron Letters,1981， 22, 1859-1862所述，是與亞磷酰胺或膦酸氫化學(xué)使用 以提供取代的硫代磷酸酯寡核苦酸。例如，包括本文所述的保護(hù)基團(tuán)的試劑能 夠被用于許多期望保護(hù)的應(yīng)用。這種應(yīng)用包括，但不限于，固相和液相的，寡 核普酸合成，多核苷酸合成等。使用核苷酸和核香酸類似物也被本公開內(nèi)容包 括，以提供攜帶本公開內(nèi)容的保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或寡核苷類似物。因此術(shù)語 核普，核苷酸，脫氧核苷和脫氧核苷酸通常包括如本文所述的類似物。這些類 似物是那些具有與自然發(fā)生的核香或核苷酸共同的一些結(jié)構(gòu)特征的分子，使得 當(dāng)摻入寡核苷酸或寡核苷酸序列，它們?cè)试S與溶液中的自然發(fā)生的寡核苦酸序 列雜交。典型的，這些類似物通過取代和/或修飾堿基，核糖或所述磷酸二酯部 分衍生于自然發(fā)生的核苷和核苷酸。變化能夠^皮:沒計(jì)以穩(wěn)定或去穩(wěn)定雜合體形 成或提高與所期望的互補(bǔ)核酸序列的雜交特異性。
例如，結(jié)構(gòu)基團(tuán)被任選地加到核糖或核苷的堿基上以摻入到寡核苷酸，諸 如在核糖2'-0位置的曱基，丙基或烯丙基基團(tuán)，或取代2'-0基團(tuán)的氟基團(tuán)，或 在核糖核苷堿基的溴基團(tuán)。為了和亞磷酰胺化學(xué)使用，可商業(yè)獲得不同酰胺試 劑，包括2'-脫氧酰胺，2'-0-曱基酰胺和2'-0-羥基酰胺。用于這種合成的任何其它方法也可以使用。實(shí)際合成所述寡核苷酸為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。使用類似 于技術(shù)制備其它寡核苷酸諸如硫代磷酸酯，曱基膦酸酯和烷基化的衍生物也是 公知的。也是公知的是。使用類似的技術(shù)和可商業(yè)獲得的修飾的酰胺和可控孔
徑玻璃產(chǎn)品，諸如生物素，Cy3，熒光素，吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的酰胺和/或 CPG(可購(gòu)買于Glen Research, Sterling Va.)以合成熒光標(biāo)記的，生物素化的或其 它綴合的寡核普酸。
但是本文所述的所述磷酸三酯中和/保護(hù)基團(tuán)用于中和核酸結(jié)構(gòu)域的陰離 子電荷，另外連接到保護(hù)核酸結(jié)構(gòu)域的帶正電荷的部分能夠被用于進(jìn)一步幫助 攝取寡核苷酸和多核苷酸。最近能夠有效地穿過真核細(xì)胞的胞質(zhì)膜的幾個(gè)蛋白 的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致識(shí)別新一類蛋白，該蛋白得出了肽轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
一些蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域/肽為本領(lǐng)域已知，并且已經(jīng)證明幫助攝取連接到轉(zhuǎn)導(dǎo) 結(jié)構(gòu)域的外源分子(辨如，貨物分子)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域幫助通過稱為大胞飲作 用的過程攝取。大胞飲作用是所有細(xì)胞進(jìn)行的非選擇形式的胞吞作用。
這些蛋白最好表征的是果蠅同源異型蛋白觸足轉(zhuǎn)錄蛋白(Drosophila homeoprotein antennapedia transcription protein) (AntHD) (Joliot等人，New Biol. 3:1121-34, 1991; Joliot等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:1864-8, 1991; Le Roux 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:9120-4， 1993)，單純性皰療病毒結(jié)構(gòu)蛋白 VP22 (Elliott and O，Hare, Cell 88:223-33, 1997)， HIV陽(yáng)l轉(zhuǎn)錄激活劑TAT蛋白 (Green and Loewenstein, Cell 55:1179-1188, 1988; Frankel and Pabo， Cell 55:1189-1193,1988)，和更最近的朊病毒蛋白的陽(yáng)離子N端結(jié)構(gòu)域。這些蛋白不 但能夠穿過胞質(zhì)膜，而且其它蛋白的結(jié)合，諸如酶P-半乳糖苷酶，足以刺激細(xì) 胞攝取這些復(fù)合物。這種嵌合蛋白以生物活性形式存在于細(xì)胞質(zhì)和核。該過程 的特征顯示攝取這些融合多肽是快速的，以受體獨(dú)立的方式，常發(fā)生在幾分鐘 內(nèi)。而且，這些蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)看上去不受細(xì)胞類型的影響，并且能夠有效地轉(zhuǎn)導(dǎo) 在培養(yǎng)物中的100%細(xì)胞，而沒有明顯的毒性(Nagahara等人，Nat. Med. 4:1449-52, 1998)。除了全長(zhǎng)蛋白，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域也已經(jīng)成功地用于誘導(dǎo)細(xì)胞 內(nèi)攝取DNA(Abu-Amer, supra)，反義寡核苷酸(Astriab國(guó)Fisher等人，Pharm. Res, 19:744-54, 2002),小的分子(Polyakov等人，Bioconjug. Chem. 11:762-71, 2000)和甚至是無機(jī)的40納米的鐵粒子(Dodd等人，J. Immunol. Methods 256:89-105, 2001; Wunderbaldinger等人，Bioconjug. Chem. 13:264-8, 2002; Lewin 等人，Nat. Biotechnol. 18:410-4, 2000; Josephson等人，Bioconjug., Chem.
3410:186-91, 1999),這表明對(duì)該過程沒有明顯的大小限制。使用轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的有 效的轉(zhuǎn)導(dǎo)，部分受到在PTD-貨物構(gòu)建物上的總分子電荷的限制。
蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)與外源分子(辦如，多核苷酸，小的分子，或蛋白) 的融合足以導(dǎo)致以濃度依賴的方式將它們轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入多種不同的細(xì)胞。而且，該 蛋白運(yùn)輸?shù)募夹g(shù)似乎避免與DNA和藥物基的技術(shù)有關(guān)的許多問題。
PTD本性是典型的陽(yáng)離子。這些陽(yáng)離子蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進(jìn)入攜帶其所連接 的貨物的脂膜我內(nèi)體，通過破壞內(nèi)體小泡釋放它們的貨物進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)。PTD 的實(shí)例包括AntHD, TAT， VP22,陽(yáng)離子朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)域，聚精氨酸， AGRKKRRQRRR(SEQ ID NO: 15)， YARKARRQARR(SEQ ID NO: 16)， YARAAARQAR(SEQ ID NO: 17)， YARAARRAARR(SEQ ID NO: 18)， YARAARRAAR(SEQ ID NO: 19)， YARRRRRRRRR(SEQ ID NO: 20)， YAAARRRRRRR(SEQ ID NO: 21)和官能片段及其變體。本公開一個(gè)方面內(nèi)容 提供了，與電荷中和的核酸結(jié)合使用PTD諸如TAT和聚精氨酸的方法和組合 物。通過電荷中和是指核酸(辨^，寡核苷酸或多核苷酸)的陰離子電荷被還 原，中和或比不存在磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的相同的核酸、或磷酸 二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)和能夠中和核酸(伊，"貨物")結(jié)構(gòu)域上的陰離子 電荷的結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有更多的陽(yáng)離子。
通常，本公開內(nèi)容的核酸構(gòu)建物的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可以是幾乎任何合成的或自 然發(fā)生的氨基酸序列，該氨基酸序列能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或幫助轉(zhuǎn)導(dǎo)融合分子。典型的， 轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是帶正電荷的。例如，轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠根據(jù)本公開內(nèi)容通過使用核酸構(gòu)建 物實(shí)現(xiàn)，所述核酸構(gòu)建物包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)和蛋白序列諸 如HIV TAT蛋白或其片段，所述蛋白序列在N端或C端連接到包括磷酸二酯和 /或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)的寡核苷酸或多核苷酸。在一些方面，核酸可以包含磷 酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)和也可以包含核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如， DRBD)。轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域，例如，可以是觸足同源異型結(jié)構(gòu)域或HSVVP22序 列，朊病毒蛋白N端片段或其合適的轉(zhuǎn)導(dǎo)片段諸如那些本領(lǐng)域已知的片段。
PTD的類型和大小將通過包括期望轉(zhuǎn)導(dǎo)程度的幾個(gè)參數(shù)指導(dǎo)。PTD能夠轉(zhuǎn) 導(dǎo)至少大約20%, 25%， 50%， 75%, 80%, 90%, 95%， 98%， 99%或100%的 細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，典型的表達(dá)為轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的百分比，能夠通過幾個(gè)常規(guī)的方法 確定。PTD會(huì)顯示細(xì)胞進(jìn)出率(有時(shí)分別稱為^和&)，其支持至少皮摩爾的量細(xì) 胞內(nèi)的融合分子。通過標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)力學(xué)分析使用可沖企測(cè)地標(biāo)記融合分子，PTD和 任何貨物的進(jìn)出率能夠容易確定，或至少被近似。典型的，進(jìn)入率比出來率的 比在范圍大約5到大約100到大約1000的范圍。
在一個(gè)方面，用于本公開內(nèi)容的方法和組合物的PTD包含特征為大量a螺 旋的肽。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PTD顯示顯著的a螺旋時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)被優(yōu)化。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，PTD包括含有堿性氨基酸殘基的序列，所述氨基酸殘基基本沿著至少一 個(gè)肽面排列。本公開內(nèi)容的PTD結(jié)構(gòu)域可以是自然發(fā)生的肽或合成的肽。
在本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方式中，PTD包括包含強(qiáng)a螺旋結(jié)構(gòu)的氨基酸序 列，在螺旋柱的下方為精氨酸(Arg)殘基。在其它的實(shí)施方式中，PTD結(jié)構(gòu)域包 括以下通式表示的肽B廣X廣X2-XrB2-X4畫X5-B3(SEQ ID NO: l)其中B" B2， 和B3各自獨(dú)立地是堿性氨基酸，相同或不同；X2， X3， X4和Xs各自獨(dú)立 地是a螺旋增強(qiáng)的氨基酸，相同或不同。在另一個(gè)實(shí)施方式中，PTD結(jié)構(gòu)域由 以下通式表示B廣X廣X2誦B2-B3畫X3畫X4-B4(SEQ ID NO: 2)其中B" B2， B3,和 B4各自獨(dú)立地是堿性氨基酸，相同或不同；X2, X3,和X4各自獨(dú)立地是 a螺旋增強(qiáng)的氨基酸，相同或不同。
另外PTD結(jié)構(gòu)域包含堿性殘基，辨如，賴氨酸(Lys)或精氨酸(Arg),并進(jìn) 一步包括至少一個(gè)脯氨酸(Pro)殘基以足以將"扭結(jié)"引入到結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域 的實(shí)例包括朊病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。例如，這種肽包括KKRPKPG(SEQ ID NO: 3)。
在 一 個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)構(gòu)域是以下序列表示的肽 X-X-R-X-(P/X)曙(B/X)-B-(P/X)國(guó)X-B國(guó)(B/X) (SEQ ID NO: 4)，其中X是任何a螺旋 促進(jìn)殘基，諸如丙氨酸；P/X是脯氨酸或X如前面所定義；B是堿性氨基酸殘 基，*余，精氨酸(Arg)或賴氨酸(Lys); R是精氨酸(Arg)和B/X是上面所定義的 B或X。
在另一個(gè)實(shí)施方式中，PTD是陽(yáng)離子的，由7和IO個(gè)之間的氨基酸構(gòu)成， 具有式K-X廣R-X2-X"SEQ ID NO: 5)其中&是R或K和X2是任何氨基酸。這 種肽的實(shí)例包括RKKRRQRRR(SEQ ID NO: 6)。
另外的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括TAT片段，其包括TAT的至少氨基酸49到56到 大約全長(zhǎng)的TAT序列(見，辨如，SEQIDNO: 7)。 TAT片段可以包括一個(gè)或多 個(gè)氨基酸變化，以足以增加片段的a螺旋。在一些情況，引入的氨基酸變化將包括增加加入識(shí)別的a螺旋增強(qiáng)的氨基酸?？蛇x地，氨基酸變化會(huì)涉及從TAT 片段除去阻礙a螺旋形成或穩(wěn)定性的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在更具體的實(shí)施方式 中，TAT片段將包括被a螺旋增強(qiáng)的氨基酸取代的至少一個(gè)氨基酸。典型的 TAT片段或其它PTD會(huì)通過標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)制備，但是在一些情況，重組 DNA方法可以-使用。
另外的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(PTD)能夠被用于本公開內(nèi)容的核酸構(gòu)建物包括TAT片 段，其中TAT 49-56序列已被修飾，使得序列中的至少兩個(gè)堿性tt酸沿著TAT 片段的至少一個(gè)面^^本對(duì)齊。示例性的TAT片段包括在TAT的至少氨基酸 49-56的一個(gè)指定的氨基酸取代，該取代與49-56序列的堿性氨基酸殘基沿著該 片段的至少一個(gè)面，典型的TAT 49-56序列對(duì)齊。
另外的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括TAT片段，其中TAT49-56序列包括至少一個(gè)被a螺 旋增強(qiáng)的氨基酸的取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，取代被選擇使得在TAT片段的至 少兩個(gè)堿性氨基酸殘基沿著TAT片段的至少一個(gè)面基本排列。在更具體的實(shí)施 方式中，選擇取代，使得在TAT 49-56序列的至少兩個(gè)堿性氨基酸殘基沿著序 列的至少 一個(gè)面祐羞本對(duì)齊。
也包括嵌合的PTD結(jié)構(gòu)域。這種嵌合轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白包括至少兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋 白的部分。例如，嵌合轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白能夠通過融合兩個(gè)不同的TAT片段形成，* 如， 一個(gè)來自HIV-1和另一個(gè)來自HIV-2或一個(gè)來自朊病毒蛋白，另一個(gè)來自 HIV。
PTD能夠與任意數(shù)目的包括寡核苷酸或多核普酸的其它分子連接或融合。 可選地，核酸構(gòu)建物或PTD能夠結(jié)合到包括核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，靶向作用部分等 的其它分子實(shí)體。例如，兩個(gè)更多的PTD(例如，1-5， 2-4,典型的3)能夠被連 續(xù)連接或被一個(gè)或多個(gè)其它結(jié)構(gòu)域(W^，核酸結(jié)構(gòu)域或肽接頭)分開。通過還 原陰離子電荷使得PTD結(jié)構(gòu)域的陽(yáng)離子電荷足以轉(zhuǎn)導(dǎo)/跨細(xì)胞膜，核酸結(jié)合結(jié)構(gòu) 域能夠促進(jìn)攝取包括核酸(包括包含保護(hù)基團(tuán)的寡核香酸或多核香酸)的融合構(gòu) 建物?？梢岳斫獾氖?，PTD可以融合到包括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán) 的寡核苷酸或多核香酸，并可以進(jìn)一步連接到核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。示例性的RNA 結(jié)合蛋白(辨如，DRBD)包括組蛋白，RDE-4蛋白，或魚精蛋白。另外的 dsRNA結(jié)合蛋白(和它們的登錄號(hào)在括號(hào)內(nèi))包括PKR (AAA36409, AAA61926, Q03963), TRBP (P97473, AAA36765), PACT (AAC25672, AAA49947, NP609646): Staufen (AAD17531, AAF98119, AAD17529, P25159), NFAR1 (AF167569),
37NFAR2 (AF167570, AAF31446, AAC71052, AAA19960， AAA19961， AAG22859), SPNR (AAK20832, AAF59924, A57284), RHA (CAA71668, AAC05725, AAF57297), NREBP (AAK07692, AAF23120, AAF54409, T33856), kanadaptin (AAK29177, AAB88191, AAF55582, NP499172, NP198700, BAB19354), HYL1 (NP563850),偏下性葉(hyponastic leaves) (CAC05659, BAB00641), ADAR1 (AAB97118, P55266, AAK16102, AAB51687, AF051275), ADAR2 P78563, P51400, AAK17102, AAF63702), ADAR3 (AAF78094, AAB41862, AAF76894), TENR (XP059592, CAA59168), RNA 酶 III (AAF80558, AAF59169, Z81070Q02555/S55784, P05797),和切酶(BAA78691, AF408401, AAF56056, S44849, AAF03534, Q9884), RDE-4 (AY071926), FLJ20399 (NP060273, BAB26260), CG1434 (AAF48360, EAA12065, CAA21662), CG13139 (XP059208, XP143416, XP110450, AAF52926, EEA14824), DGCRK6 (BAB83032, XP110167) CG1800 (AAF57175, EAA08039), FLJ20036 (AAH22270, XP134159), MRP-L45 (BAB14234, XP129893), CG2109 (AAF52025), CG12493 (NP647927), CG10630 (AAF50777), CG17686 (AAD50502), T22A3.5 (CAB03384)和登錄號(hào)EAA14308。
注意的是，本文公開的兩個(gè)更多的組分，辨如，PTD，核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 寡核芬酸/多核苷酸結(jié)構(gòu)域，和肽接頭，能夠以幾乎任何方式組織，只要構(gòu)建物 具有其意欲的功能(辨如，足夠的陽(yáng)離子或具有減少的陰離子電荷)。構(gòu)建物能 夠包括包括一個(gè)或多個(gè)PTD的融合多肽或嵌合蛋白，所述PTD被直接或間接地 連接到寡核普酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域(辨咖，治療或診斷DNA， RNA, siRNA 等)。幾個(gè)結(jié)構(gòu)域之一可以被直接連接或可以被接頭肽分開。結(jié)構(gòu)域可以任何順 序存在。另外，融合多肽可以包括標(biāo)簽，辦如，以幫助融合多肽的識(shí)別和/或純 化，諸如6xHIS標(biāo)簽。
能夠被用于本公開內(nèi)容的融合多肽和方法的肽接頭典型地包含達(dá)大約20 或30個(gè)氨基酸，通常達(dá)到大約IO或15個(gè)氨基酸，和更常見的大約1到5個(gè)氨 基酸。接頭序列是通常柔性的，使得不將融合分子保持一個(gè)剛性構(gòu)象。接頭序 列能夠被使用，辨如，以將PTD結(jié)構(gòu)域與核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或核酸結(jié)構(gòu)域隔 開。例如，肽接頭序列能夠位于蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和核酸結(jié)構(gòu)域之間，辨如，以 提供分子柔性。選擇接頭部分的長(zhǎng)度以優(yōu)化包括PTD結(jié)構(gòu)域融合構(gòu)建物的多肽 的生物學(xué)活性并能夠通過經(jīng)驗(yàn)不用過多的實(shí)驗(yàn)確定。接頭部分應(yīng)該足夠長(zhǎng)和足 夠柔性，以允許核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與核酸自由地相互作用，或反之亦然。接頭部 分的實(shí)例是-畫Gly--Gly--, GGGGS (SEQ ID N0:8), (GGGGS)N (SEQ ID N0:9),GKSSGSGSESKS (SEQ ID NO:IO), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO:ll), GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 12), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO:13),或EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:14)。連接部分例如在Huston 等人，Proc. Nat，l Acad. Sci 85:5879, 1988; Whitlow等人，Protein Engineering 6:989, 1993;和Newton等人，Biochemistry 35:545, 1996中被敘述。其它合適的 肽接頭描述在U.S. Pat. Nos. 4,751,180和4,935,233，這些通過參考并入。
本公開內(nèi)容的方法，組合物，和融合多肽提供了細(xì)胞在體外和在體內(nèi)攝取 釋放核酸分子。
術(shù)語"治療"是以一般的意義使用，包括治療劑，預(yù)防劑，置換劑。治療分 子的實(shí)例包括，但不限于，細(xì)胞周期調(diào)控劑；抑制周期蛋白劑，諸如周期蛋白 Gl和周期蛋白Dl基因的反義多核苷酸；能夠裂解以提供針對(duì)具體的生長(zhǎng)因子 的siRNA分子的dsRNA，所述生長(zhǎng)因子諸如，例如，表皮生長(zhǎng)因子(EGF),血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，促紅細(xì)胞生成素，G-CSF, GM-CSF， TGF-a， TGF-(3,和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；細(xì)胞因子，包括，但不限于，白細(xì)胞介素1 到13和腫瘤壞死因子；抗凝劑，抗血小板劑；TNF受體結(jié)構(gòu)域等。
使用這種方法和組合物，不同疾病和病癥能夠被治療。例如，在運(yùn)輸抗腫 瘤siRNA后，肺瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能夠被抑制，阻止，或破壞。
因此，可以理解的是本公開內(nèi)容不局限于任何特定的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域或寡核苷 酸/多核苷酸。任何帶陰離子電荷的核酸(辨如，dsRNA， siRNA等)能夠使用本 公開內(nèi)容的方法運(yùn)輸。
在本公開內(nèi)容使用的多肽(辨咖，關(guān)于融合多肽或全長(zhǎng)融合多肽的特定結(jié) 構(gòu)域)能夠包含氨基酸的L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體或兩者的組合。能夠在 本公開內(nèi)容使用的多肽包括修飾的序列諸如糖蛋白，反向-倒位多肽，D-氨基酸 ^f務(wù)飾的多肽，等。多肽包括自然發(fā)生的蛋白，以及那些^f皮重組或合成方法合成 的多肽。"片段"是多肽部分。術(shù)語"片段"指多肽部分，其顯示至少一個(gè)有用的表 位或官能結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"官能片段"指保留多肽活性的多肽片段。例如，PTD官 能片段包括保留轉(zhuǎn)導(dǎo)活性的片段。生物學(xué)上的官能片段，例如，其大小能夠從 小到能夠結(jié)合抗體分子的表位的多肽片段，到大到能夠參與細(xì)胞內(nèi)的特性誘導(dǎo) 或程序化表型變化的大多肽。"表位，，是的能夠結(jié)合應(yīng)答接觸抗原產(chǎn)生的免疫球 蛋白的多肽區(qū)域。在一些實(shí)施方式中，反向-倒位肽被使用。"反向-倒位"指氨基-羧基倒位以 及在一個(gè)或多個(gè)氨基酸中的對(duì)映異構(gòu)體變化(即，左旋(L)到右旋(D))。本公開內(nèi)
容的多肽包括，例如，氨基酸序列的氨基-羧基倒位，含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基 酸的氨基-羧基倒位，和含有一個(gè)或多個(gè)D-氨基酸的非倒位序列。穩(wěn)定的和保 留生物活性的反向-倒位模擬肽能夠根據(jù)Bmgidou等人(Biochem. Biophys. Res. Comm. 214(2): 685-693, 1995)和Chorev等人(Trends Biotechnol. 13(10): 438-445,1995)所述設(shè)計(jì)。
在另一方面，本公開內(nèi)容提供了產(chǎn)生包括PTD結(jié)構(gòu)域，核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (辦如，DRBD)和核酸分子的融合多肽的方法，其通過在允許表達(dá)多核苷酸的條 件下生長(zhǎng)包括編碼融合多肽的多核苷酸的宿主細(xì)胞并收集融合多肽進(jìn)行。編碼 本公開內(nèi)容的融合多肽多核苷酸的能夠可操作地連接到啟動(dòng)子上，以在原核或 真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。例如，這種多核苷酸能夠被整合在表達(dá)載體上以產(chǎn)生融 合構(gòu)建物。
因此，本公開內(nèi)容也提供了編碼本公開內(nèi)容的融合蛋白構(gòu)建物的多核苷酸。 這種多核苷酸包含編碼一個(gè)或多個(gè)PTD結(jié)構(gòu)域，和/或核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(辨如， DRBD)的序列。多核苷酸也可以編碼接頭結(jié)構(gòu)域，其將一個(gè)或多個(gè)PTD和/或核 酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開。在一個(gè)方面包括兩個(gè)更多的PTD結(jié)構(gòu)域的融合多肽被產(chǎn)生 和接著連接到電荷還原的/保護(hù)的寡核苷酸或多核苷酸。
運(yùn)輸本公開內(nèi)容的多核苷酸能夠通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法 將多核苷酸引入到細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。例如，包括這種多核苷酸的構(gòu)建物能夠使用膠體 分散系統(tǒng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞?？蛇x地，多核苷酸構(gòu)建物能夠整合(伊，克隆)進(jìn)入合 適的載體。為了表達(dá)，編碼本公開內(nèi)容的融合多肽的多核苷酸可以插入重組表 達(dá)載體。術(shù)語"重組表達(dá)載體"指質(zhì)粒，病毒，或本領(lǐng)域已知的其它載體，其已被 通過插入或整合編碼本公開內(nèi)容的融合多肽的多核苷酸進(jìn)行操作。表達(dá)載體典 型的含有復(fù)制原點(diǎn)，啟動(dòng)子，以及允許表型選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的具體的基因。適于 這種使用的載體包括，但不限于，用于在細(xì)菌表達(dá)的T7-基的表達(dá)載體 (Rosenberg等人，Gene, 56:125, 1987)，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的pMSXND表 達(dá)載體(Lee and Nathans, J. Biol. Chem., 263:3521, 1988)，用于在昆蟲細(xì)胞表達(dá)的 桿狀病毒衍生的載體，用于在植物表達(dá)的花椰菜花葉病病毒，CaMV，和煙草 花葉病病毒，TMV。
40根據(jù)使用的載體，任意數(shù)目的合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件(調(diào)節(jié)序列)，包括組 成性和誘導(dǎo)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子，等可以用于表達(dá)載體(見，
辨如，Bitter爭(zhēng)乂， Methods in Enzymology， 153: 516-544， 1987)。這些元件為 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知。
術(shù)語"可操作地連接"和"可操作地結(jié)合，，互換使用，本文廣義指化學(xué)或物理 偶聯(lián)兩個(gè)在其它方面不同的結(jié)構(gòu)域，每個(gè)具有獨(dú)立的生物學(xué)功能。例如，可操 作地連接指在調(diào)節(jié)序列序列和受調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)的多核苷酸之間的功能連接。在 另一方面，可操作地連接指核酸結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，使得每個(gè)結(jié)構(gòu)域 在合適的條件下保留其獨(dú)立的生物學(xué)活性?？刹僮鞯剡B接進(jìn)一步指融合多肽的 編碼結(jié)構(gòu)域之間的連接，使得每個(gè)結(jié)構(gòu)域在框內(nèi)連接，以產(chǎn)生期望的多肽序 列。
在酵母，含有組成性或誘導(dǎo)啟動(dòng)子的一些載體可以使用(見，例如， Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel等人，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Grant等人，"Expression and Secretion Vectors for Yeast," in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544, 1987; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; "Bitter, Heterologous Gene Expression in Yeast," Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684,1987; and The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern等人，Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982)?？梢允褂媒M成性酵母啟動(dòng)子，如ADH 或LEU2,或誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如GAL ("Cloning in Yeast," Ch. 3, R. Rothstein In: DNA Cloning Vol.11, A Practical Approach, Ed. DM Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986)?？蛇x地，可以使用促進(jìn)外源DNA序列整合進(jìn)入酵母染色體的載體。
表達(dá)載體能夠被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。通過"轉(zhuǎn)化"是指將細(xì)胞外源的多核苷 酸整合進(jìn)入細(xì)胞后在細(xì)胞中誘導(dǎo)的永久性遺傳變化。當(dāng)細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞 時(shí)，永久性遺傳變化通常是通過引入多核苷酸進(jìn)入細(xì)胞的基因組實(shí)現(xiàn)的。通過 "轉(zhuǎn)化細(xì)胞"或"重組宿主細(xì)胞"意思是通過分子生物學(xué)技術(shù)，已引入編碼本公開內(nèi) 容的融合多肽的多核苷酸的細(xì)胞(或者其祖先)。轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可以通過本技術(shù) 領(lǐng)域人員所知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是原核，諸如E.coli時(shí)，這些能夠攝取 多核苷酸的感受態(tài)細(xì)胞能夠如下制備收集指數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞和然后通過本領(lǐng)域已知的程序通過CaC12方法處理。可選地，MgC12或RbCl能夠使用。轉(zhuǎn)化 也能夠在形成宿主細(xì)胞的原生質(zhì)體后或通過電穿孔進(jìn)行。
本公開內(nèi)容的融合多肽也能夠產(chǎn)生通過在原核生物表達(dá)編碼融合多肽的多 核香酸。這些包括，但不限于，微生物，諸如用編碼本公開內(nèi)容的融合多肽的 重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA，或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌。構(gòu)建物能夠 在E.coli大規(guī)模表達(dá)。當(dāng)序列包括用于通過鎳-螯合層析一步純化的標(biāo)簽時(shí)，簡(jiǎn) 化了從細(xì)菌的純化。因此，編碼融合多肽的多核苷酸也能夠包含標(biāo)簽以簡(jiǎn)化融 合多肽的分離。例如，聚組氨酸標(biāo)簽，辦如，六組氨酸殘基，能夠被整合在融 合多肽的氨基端。聚組氨酸標(biāo)簽允許通過鎳-螯合層析方便的一步分離蛋白。本 公開內(nèi)容的融合多肽也能夠設(shè)計(jì)為含有裂解位點(diǎn)以幫助蛋白回收。裂解位點(diǎn)可 以是上述的部分接頭部分。編碼期望狀接頭的DNA序列能夠以相同的讀框插入 其中，所述讀框如多核苷酸編碼PTD,或其片段，其后接著核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域，PTD 也可以使用任何合適的常規(guī)技術(shù)連接到期望核酸(辨如，dsRNA， DNA， siRNA， 等)。例如，編碼接頭的化學(xué)合成的寡核苷酸能夠連接在兩個(gè)編碼的多核苷酸之 間。在具體的實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容的多核苷酸編碼包括通過接頭分開的兩 個(gè)四個(gè)單獨(dú)的結(jié)構(gòu)域(辨如， 一個(gè)或多個(gè)PTD結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)核酸結(jié)構(gòu)域) 的融合多肽。在一些實(shí)施方式中， 一旦純化，包括幾個(gè)PTD的融合多肽就與包 括磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)或其它陰離子電荷還原基團(tuán)的寡核苷酸相 連或連接。
當(dāng)宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞時(shí)，可以使用轉(zhuǎn)染DNA方法如鈣磷酸共沉淀，常 規(guī)的機(jī)械程序，諸如顯微注射，電穿孔，插入包埋在脂質(zhì)體中的質(zhì)粒，或病毒 載體。真核細(xì)胞也能夠用編碼本公開內(nèi)容的PTD-融合多肽的多核苷酸，和編碼 可篩選表型的第二多核苷酸分子，諸如單純性皰滲胸苷激酶基因共轉(zhuǎn)染。另一 個(gè)方法是使用真核病毒載體，諸如猿猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒，短暫地 感染或轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞和表達(dá)融合多肽(見，例如，Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982).
真核系統(tǒng)，和典型的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，允許發(fā)生適當(dāng)?shù)姆g后修飾表達(dá) 的哺乳動(dòng)物蛋白。具有用于適當(dāng)?shù)募庸ぴ蹀D(zhuǎn)錄物，糖基化，磷酸化，和有利 地分泌融合產(chǎn)物的細(xì)胞機(jī)器的真核細(xì)胞能夠用作宿主細(xì)胞以表達(dá)本公開內(nèi)容的 PTD-融合多肽。這種宿主細(xì)胞系可以包括，但不限于，CHO, VERO， BHK， HeLa, COS, MDCK， Jurkat, HEK-293,和WI38。長(zhǎng)期，大量生產(chǎn)重組蛋白，需要穩(wěn)定表達(dá)。不使用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表
達(dá)載體，宿主細(xì)胞能夠用編碼本公開內(nèi)容的融合多肽的cDNA轉(zhuǎn)化，所述融合
多肽通過合適的表達(dá)調(diào)控元件(辨如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，多 聚腺苷酸化位點(diǎn)，等)，和可篩選的標(biāo)志調(diào)控。在重組質(zhì)粒中的可篩選的標(biāo)志給 予選擇性(評(píng)如，通過細(xì)胞毒素抗性)和使細(xì)胞穩(wěn)定地整合質(zhì)粒進(jìn)入它們的染色體
和生長(zhǎng)形成灶，其反過來，能夠克隆和擴(kuò)張進(jìn)入細(xì)胞系。例如，引入外源DNA 后，工程細(xì)胞可以被允許在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，接著轉(zhuǎn)到選擇培養(yǎng)基。 一些選擇系統(tǒng)可以使用，包括，但不限于，單純性皰滲病毒胸苷激酶(Wigler爭(zhēng) 乂， Cell, 11: 223， 1977)，次黃噪呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 48:2026, 1962)，和腺噪呤石粦酸核糖基轉(zhuǎn)移 酶(Lowy等人，Cell, 22:817, 1980)基因能夠被分別用于tk-， h即rt-或aprt-細(xì)胞。 抗代謝藥抗性也能夠用作以下系統(tǒng)的選擇基礎(chǔ)dhfr，其給予氨甲喋呤的抗性 (Wigler等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3567, 1980; O'Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:1527, 1981); gpt，其給予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 78:2072, 1981)， neo其給予氨基糖苷G-418抗性 (Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol., 150:1, 1981);和hygro，其給予潮霉素基 因抗性(Santerre等人，Gene, 30:147, 1984)。已經(jīng)敘述了另外的可篩選的基因， 即trpB，其允許細(xì)胞到使用吲哚取代色氨酸；hisD，其允許細(xì)胞使用組氨醇取 代組氨酸(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047, 1988);和 ODC(鳥氨酸脫羧酶)，其給予鳥氨酸脫羧酶抑制劑抗性，2-(二氟甲基)-DL-鳥氨 酉臾，DFMO(McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed.， 1987)。
分離和純化微生物或真核表達(dá)的本公開內(nèi)容的PTD-融合多肽的技術(shù)可以 通過任何常規(guī)的方法，諸如，例如，制備層析分離和免疫分離，諸如那些涉及 使用單克隆或多克隆抗體或抗原的方法。
本公開內(nèi)容的融合多肽可用于運(yùn)輸帶陰離子電荷的核酸分子(辦如， dsRNA, siRNA， DNA,反義，核酶等)，以用于治療和/或診斷一些疾病和病 癥。例如，融合多肽能夠被用于治療細(xì)胞增生病癥，其中保護(hù)的寡-或多核苷酸 被可逆的修飾，使得其單獨(dú)或結(jié)合PTD跨細(xì)胞膜到誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的靶基因。 PTD結(jié)構(gòu)域增加核酸構(gòu)建物的總凈陰電核電荷或減少核酸構(gòu)建物的總凈陰離子 電荷，幫助細(xì)胞的攝取。因此，構(gòu)建物用于治療具有細(xì)胞增生病癥細(xì)胞。同樣的，本公開內(nèi)容的構(gòu)建物能夠^皮用于治療炎癥疾病和病癥，感染，血管疾病和 病癥等。
在一個(gè)方面，本7>開內(nèi)容的構(gòu)建物可以可選地包含，或除了以上還可以包
含，PTD,靶向作用結(jié)構(gòu)域。靶向作用的結(jié)構(gòu)域能夠是受體，受體配體或抗體， 其用于將構(gòu)建物導(dǎo)入表達(dá)關(guān)聯(lián)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定細(xì)胞類型。
本公開內(nèi)容的典型的構(gòu)建物可以用藥學(xué)上可接受的載體制備，但是融合多 肽可以作為藥物組分單獨(dú)施用。
根據(jù)本公開內(nèi)容的藥物組合物能夠包括本公開內(nèi)容的融合多肽，用載體， 賦形劑，和添加劑或助劑，制備成適于施予研究對(duì)象的形式。經(jīng)常使用的載體 或助劑包括碳酸鎂，二氧化鈦，乳糖，甘露醇和其它糖，滑石，乳蛋白，明膠， 淀粉，維生素，纖維素及其衍生物，動(dòng)物和植物油，聚乙二醇和溶劑，諸如無 菌水，醇，甘油，和多元醇。靜脈內(nèi)載體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。防腐劑包括 抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體。其它藥學(xué)上可接受的載體包括 水溶液，無毒的賦形劑，包括鹽，防腐劑，緩沖液等，如在以下所述，例如， Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th ed., Easton: Mack Publishing Co., 1405-1412, 1461-1487 (1975), and The National Formulary XIV., 14th ed" Washington: American Pharmaceutical Association (1975), 其內(nèi)容通過參考包含 在此。藥物組合物的pH和不同組分的準(zhǔn)確濃度根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)調(diào)節(jié)。見 Goodm和Gilman's, The Pharmacological Basis for Therapeutics (7th ed.)。
根據(jù)本公開內(nèi)容的藥物組合物可以局部或系統(tǒng)施用。"治療有效劑量"是 指預(yù)防，治療，或至少部分抑制疾病的癥狀或病癥(辦如，到抑制細(xì)胞增殖)需 要的根據(jù)本公開內(nèi)容的融合多肽的量。該使用的有效的量，當(dāng)然，取決于疾病 的嚴(yán)重性和研究對(duì)象的重量和通常的狀態(tài)。典型的，在體外使用的劑量可以對(duì) 用于原位施用藥物組合物的量提供有用的指導(dǎo)，動(dòng)物^=莫型可以使用以決定治療 特定病癥的有效的劑量。在以下文獻(xiàn)中敘述了不同考慮因素，例如，Langer, Science, 249: 1527, (1990); Gilman等人(eds,) (1990)，它們通過參考并入。
如本文所用，"施用治療有效的量"是旨在包括對(duì)研究對(duì)象給予或施用本公 開內(nèi)容的藥物組合物的方法，其允許組合物發(fā)揮其意欲的治療功能。治療有效 的量將根據(jù)因子，諸如在研究對(duì)象的感染程度，個(gè)體的年齡，性別，和重量變 化。劑量方案能夠被調(diào)節(jié)以提供最優(yōu)的治療應(yīng)答。例如，幾個(gè)分劑量能夠每日 施用或劑量能夠按照緊急治療情況按比例地減少。
44藥物組合物能夠以方便的方式施用，諸如通過注射(例如，皮下，靜脈 內(nèi)，等)，口服，吸入，經(jīng)皮施用，或直腸施用。根據(jù)施用路線，藥物組合物能 夠用材料包衣以保護(hù)藥物組合物免受酶，酸，和其它可以失活藥物組合物的自 然條件的作用。藥物組合物也能夠胃腸外或腹膜內(nèi)施用。分散液也能夠在甘 油，液體聚乙二醇，和它們的混合物，和在油中制備。在通常的貯存和使用條 件中，這些制劑可以含有防腐劑以阻止微生物的生長(zhǎng)。
適于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶的)或分散液和用于臨時(shí) 制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。組合物典型的是無菌的和存在容易注 射性能的流動(dòng)性。典型的組合物在制造和貯存條件下是穩(wěn)定的，并且可以保存 防止微生物的污染作用，諸如細(xì)菌和真菌。載體能夠是溶劑或分散介質(zhì)，其含 有例如，水，乙醇，多元醇(例如，甘油，丙二醇，和液體聚乙二醇，等)，它 們合適的混合物，和才直物油。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性能夠維持，例如，通過使用包衣， 諸如卵磷脂，在分散液的情況下通過保持所需要的顆粒大小，和通過使用表面 活性劑維持。阻止微生物的作用能夠通過不同抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如，對(duì)羥 基苯甲酸酯，氯丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳汞，等實(shí)現(xiàn)。在許多情況，等滲 劑，例如，糖，多元醇，諸如甘露醇，山梨醇，或氯化鈉被用于組合物。長(zhǎng)時(shí) 間的吸收注射組合物能夠通過在組合物中包括延遲吸收劑，例如，單硬脂酸鋁 和明膠獲得。
無菌注射溶液能夠根據(jù)需要，通過在合適的溶劑中摻入所需要量的藥物組 合物和以上列舉的組分之一或組合，然后通過過濾滅菌制備。通常，分散液通 過將藥物組合物摻入到含有堿性分散介質(zhì)和所需要的以上列舉的其它組分的無 菌載體中制備。
藥物組合物能夠例如，和惰性稀釋劑或可吸收的食用載體一起口服施用。 藥物組合物和其它組分也能夠封裝在硬或軟殼明膠膠囊，壓縮成片劑，或直接 摻入研究對(duì)象的膳食。對(duì)于口服治療施用，藥物組合物能夠和賦形劑摻和并以 可攝取的片劑，含片，錠劑，膠嚢，酏劑，懸浮液，漿液，糯米紙嚢劑等形式 施用。這種組合物和制劑應(yīng)該含有至少1%重量的活性化合物。當(dāng)然，組合物
和制劑的百分比能夠變化和能夠適宜地在大約5%到大約80%的單位重量。
片劑，錠劑，丸劑，膠嚢，等也能夠含有以下粘合劑，諸如黃蓍膠，金 合歡膠，玉米淀粉，或明膠；賦形劑諸如磷酸二鈣；崩解劑，諸如玉米淀粉， 馬鈴薯淀粉，藻酸，等；潤(rùn)滑劑，諸如硬脂酸鎂；和增甜劑，諸如蔗糖，乳糖或糖精，或增香劑諸如薄荷油，冬青油，或櫻桃香精。當(dāng)劑量單位形式是膠 嚢，除了以上類型的材料外，其能夠含有，液體載體。不同其它材料能夠作為 包衣存在或否則改變劑量單位的物理形式。例如，片劑，丸劑，或膠囊能夠用 紫膠，糖，或兩者包衣。漿液或酏劑能夠含有藥劑，蔗糖作為增甜劑，對(duì)羥基 苯曱酸曱酯和丙酯作為防腐劑，染料，和增香劑，諸如櫻桃或橙子香料。當(dāng) 然，用于制備任何劑量單位形式的任何材料應(yīng)該藥學(xué)純和在使用的量基本無毒 的。另外，藥物組合物能夠摻入緩釋制劑和配方。
因此，"藥學(xué)上可接受的載體"是旨在包括溶劑，分散介質(zhì)，包衣，抗細(xì)菌 和抗真菌劑，等滲和吸收延遲劑，等。使用這種介質(zhì)和用于藥學(xué)活性物質(zhì)的試 劑是本領(lǐng)域已知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥物與藥物組合物是不相容的，它 們?cè)谥委熃M合物和方法中的使用被包括。補(bǔ)充的活性化合物也能夠摻入本組合 物。
尤其有益的是，以劑量單位的形式配制胃腸外組合物，以易于施用和劑量 均一。"劑量單位形式"如本文所用，指適合作為用于所治療的研究對(duì)象的單位 劑量的物理分散單位；每個(gè)單位含有預(yù)定量的藥物組合物，其被計(jì)算以與所需 要的藥物載體一起產(chǎn)生期望的治療效果。本公開內(nèi)容的劑量單位形式的規(guī)格與 藥物組合物的特性和所要獲得的特定治療效果有關(guān)。
與合適的藥學(xué)上可接受的載體以可接受的劑量單位復(fù)合主要的藥物組合 物，以有效的量方便和有效地施用。在含有補(bǔ)充活性組分的組合物的情況下， 通過參照所述組分的常規(guī)的劑量和施用方式確定劑量。
實(shí)施例
RNB合成實(shí)例。
,、 & 、CI,、人叉X1 d。叉義 SH H2N NH2 -* O N Nhg O H fj
四異丙基
/\^OHi| "if 『 ^ II If '|「國(guó)
、0入N入n"^S、S^^"磷酰胺氯化物，(te'a) ^^0入N入nT^S、S-^"P一卜
H H H H 、 f
方案I
苯基氯曱酸在堿性條件下被加到鹽酸胍中。Thirane的選擇性的打開環(huán)是 在路易斯酸性條件下完成的以提供自由的硫羥基。硫羥基化材料通過二硫鍵連 接到|3巰基乙醇以提供游離醇。游離醇與四異丙基亞磷酰胺氯化物的反應(yīng)提供
46了能夠與任何核苷酰胺前體的自由3'OH反應(yīng)的二酰胺。寡核苷酸通過使用本 文所述的本技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)合成。
RNN亞磷酰胺保護(hù)。
<formula>formula see original document page 47</formula>W=H, F, OH ,O-烷基 已=適當(dāng)保護(hù)的核堿基或雜環(huán)
Phosphate Protecting Groups (Pg)
11=烷基，雜無環(huán)基，芳基，環(huán)基，雜環(huán)基， 任何任意結(jié)構(gòu)，環(huán)或氫
r^l到7個(gè)原子的連接，可以是烷基，
烯基或烷基雜原子連接組合
X=0, S, N
環(huán)可以被烷基，芳基，雜無環(huán)或雜環(huán)側(cè)鏈取代，以增加空間 位阻或改變極性
主要的側(cè)鏈可以在任何位點(diǎn)與環(huán)連接
核糖核酸堿基RNB保護(hù)基團(tuán)
v叫
他H，F(xiàn)，OH，O-烷基
o w
/~ B—=適當(dāng)保護(hù)的核堿基或雜環(huán) Pg NR2
Phosphate Protecting Groups (Pg)
<formula>formula see original document page 47</formula>
c^Vy^ ^烷基，雜無環(huán)基，芳基，環(huán)基，雜環(huán)基， _S X 、任何任意結(jié)構(gòu)，環(huán)或氫
X
11=1到7個(gè)原子的連接，可以是烷基，
烯基或烷基雜原子連接組合
X=0, S, N
環(huán)可以被烷基，芳基，雜無環(huán)或雜環(huán)側(cè)鏈取代，以增加空間位阻或改變極性 主要的側(cè)鏈可以在任何位點(diǎn)與環(huán)連接
(2=通過接頭連接的堿性取代，胍鹽，胺，脲，并以與固相寡核苷酸合成 一致的方式被保護(hù)反應(yīng)在氬氣中進(jìn)行。在無水系統(tǒng)中使用前，玻璃器皿在KOH/EtOH堿浴中 清潔過夜，用MeOH沖洗和在真空下火焰千燥。用購(gòu)買的通過分子篩sure密封 的溶劑或使用在Purification of Laboratory Chemicals 4th ed所列舉的方案蒸餾的 并過篩貯藏的溶劑進(jìn)行反應(yīng)。
四氫呋喃(THF)從金屬鈉和二苯甲酮，三乙胺(Et3N), 二異丙胺(DIEA)蒸 餾，并且吡啶(py)金屬鈉蒸餾。二氯甲烷(CH2Cl2)，曱醇(MeOH)和曱苯氫化鈣蒸 餾。所有其它溶劑試劑購(gòu)買于Fisher Chemical Co., Aldrich Chemical Co., EMD 或Acros Organics和沒有進(jìn)一步純化使用。反應(yīng)通過干冰-丙酮浴冷卻到-78。C。
Merck grade 60硅膠(230-400目)快速柱層析，并用Merck 60F-254預(yù)包衣硅 板進(jìn)行TLC分析。使用紫外光，在乙醇和硫酸中的對(duì)甲氧苯甲醛，在EtOH和 H2S04的聚石粦鉬酸和石克酸鈰，在EtOH和H2S04的茚三酮，高錳酸鉀或石典觀察 TLC板。通過配置干水異丙醇冷指夾的Biichi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行溶劑的除去，使 用1120吸氣器真空濃縮。樣品在高真空管道在減少壓力下通過P20s和KOH被 進(jìn)一步千燥。除非另外說明在Varian Unity Inova 400在CDC13或苯中在環(huán)境 溫度下獲得iHNMR光譜。Mestre-C被使用以觀察和測(cè)量J偶聯(lián)。在CDCl3中的 'H化學(xué)位移以ppm報(bào)道；(S單元)低磁場(chǎng)四甲基硅烷。！HNMR分裂譜圖被指定 為單線態(tài)(一個(gè)或多個(gè))，雙線態(tài)(d),三線態(tài)(t)或四線態(tài)(q)?；谕ㄟ^程序所解 析的外觀多線態(tài)指定所有一級(jí)分裂譜圖。不容易解釋的分裂譜圖被指定為多線 態(tài)(m)或(br)。在寬的或多線態(tài)分裂譜圖清楚地集中在一個(gè)峰的情況，報(bào)告該峰 的化學(xué)位移而非范圍。在2.49的溶劑峰用作在DMSO-d6的內(nèi)標(biāo)，和在3.30的溶 劑峰被用作在CD3OD的內(nèi)標(biāo)。溶劑峰被用作所有13CNMR的內(nèi)標(biāo)。NMR光譜 的數(shù)據(jù)表格如下被制成化學(xué)位移，多峰，偶聯(lián)常數(shù)和質(zhì)子數(shù)。"PNMR化學(xué) 位移以相對(duì)于磷酸標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)量，和在^苯測(cè)量光譜，除非另外說明。當(dāng)產(chǎn)物是 外消旋的混合物時(shí)，不報(bào)道NMR 13C和&數(shù)據(jù)。質(zhì)譜在HHMI Analytical
長(zhǎng)17-21 nt的寡核苦酸在Mer Made 6自動(dòng)化DNA/RNA合成儀合成。Glen Research Q CPG支持物和乙基硫羥基四唑在3個(gè)偶聯(lián)步驟每個(gè)5分鐘的過程中 作為偶聯(lián)試劑使用。通過標(biāo)準(zhǔn)的碘方法膦被氧化為磷酸和用苯氧乙酸酸酐進(jìn)行 加帽。在MerMade 6合成儀上使用的所有酰胺和材料是合成的或購(gòu)買于 EMD， ChemGenes或Glen Research 。堿基*
D ,N)2PCi ,N(R)2 l.乙基硫羥翻唑，MeCN DMTO}^
K9 -^ pg—p\ 站動(dòng)， >—^
(iPr)2 NH CeHg N(R>2 2 DMTD 卷 P ;
CHsCN Pg-F(
方案II
醇合成實(shí)例(方案n)。通過制備如下所示的構(gòu)型的游離醇或硫羥基合成修 飾的酰胺。
AcO v 、S 、OH
2-((羥基甲基)二硫基)乙酸乙酯
VIJ)19: 2羥乙基二硫(1.2ml， lOmmol)，咪唑(1.23g, 10mmol)和DMF放 置在室溫下的配置攪拌棒燒瓶。乙酰氯(639.4g, 9mmol)溶解在DMF和在2h內(nèi) 通過注射泵加入到攪拌的溶液。6h后溶液溶解在EtOAc和并用飽和碳酸氫鈉， 鹽水萃取并用硫酸鈉千燥。除去乙酸乙酯并且通過硅膠柱分餾得到的油?；旌?br> 含有產(chǎn)物的餾分和除去溶劑以產(chǎn)生635mg的36%的無色油。
((2-Gfe丁基二甲基硅氣基)乙基)二硫)甲醇
VI—139: 2羥乙基二硫(19.17g. 160mmo1),咪唑(20.7g, 304mmol)和
DMF(100ml)放置在室溫下的配置攪拌棒的燒瓶。TBSCl(38.9ml， 152mmol)溶
解在DMF(60ml)中，并在2h內(nèi)通過注射泵加入到攪拌的溶液。15h后溶液溶解
在EtOAc中和用碳酸氬鈉，鹽水萃取和硫酸鈉干燥。蒸發(fā)產(chǎn)生用于硅膠柱的
油。含有產(chǎn)物的餾分被混合和蒸發(fā)以產(chǎn)生在31%的18.8g淺琥珀色油。
(M+H)=268.74. lHNMR(500MHz，溶劑)Sppm 3.92-3.80(m， 4H), 2.90誦2.75(m，
4H)， 2.50(s, 1H), 0.92-0,82(m， 9H), 0.05(m, 6H)。 tbdpso^\s,s^\oh
2-((2-(叔丁基二苯基硅氧基)乙基)二硫基)乙醇
VIJ)63: 2羥基乙基二硫(2.4ml， 20mmo1),咪唑5.8g， 85.5mmol)和 20mlDMF放置在室溫下的配置撹拌棒的燒瓶中。TBDPSCl(4.9ml， 19mmol)溶 解在DMF中并在2h內(nèi)通過注射泵和加入到攪拌的溶液。15h后溶液溶解在 EtOAc并萃取。硅層析產(chǎn)生1.79g 24%的淺琥珀色油。& NMR (500 MHz,
49CDC/;) S ppm 7.82-7.64 (m, 1H), 7.50-7.38 (m, 1H), 5.32-5.30 (m, 1H), 3.99-3.91 (m, 1H), 3.91-3.84 (m, 1H), 2.93-2.87 (m, 1H), 2.81-2.77 (m, 1H), 2.34-2.31 (m， 1H), 1.13-1.08 (m, 1H)。VI_183:巰基乙醇(10ml， 142.6 mmol)和三乙胺(19.9ml， 142.6mmol)溶解 在二氯曱烷275ml并冷卻到-78。C。新戊?；然?17.56ml， 142.6mmol)逐滴 加入到攪拌的溶液。允許反應(yīng)在-78。C進(jìn)行一個(gè)小時(shí)，接著加熱到室溫并攪拌另 外lh，然后用150ml水猝滅。洗滌水相(3x100 ml DCM)和硫酸鎂干燥。通過 TLC觀察到大量的轉(zhuǎn)化，粗產(chǎn)物用己烷稀釋，并上短硅膠柱，產(chǎn)生19.6g85。/o無 色油。1H NMR (400 MHz, CDC13) Sppm 3.61 (dd, J = 11.79 Hz, 2H), 3.05 (t, J = 5.46 Hz, 1H), 2.95 (td, J = 12.60, 3.42 Hz， 2H), 1.14 (d, J = 6.18 Hz, 9H). 13C NMR (101固z, CDC13 S ppm (207.2, 61.4, 46.3, 31.0, 27.1 ppm。VI_269:在干THF中的硫代丁內(nèi)酯(5.1g, 50mmol)逐滴加入到攪拌的二異 丙酰胺鋰溶液。(在-78。C下的二異丙基胺(5.1mg, 50.5mmol)和在己烷中的正丁 基鋰(31.3ml, 50mmo1))。得到的溶液攪拌10分鐘，在此時(shí)加入在氬氣流攜帶的 甲醛(31.3g)(通過加熱多聚甲醛到150。C形成曱醛)。允許反應(yīng)在-78。C進(jìn)行2.5h。 除去曱醛流，允許反應(yīng)進(jìn)行另外的30分鐘。通過加入( 100ml)-78。C的1MHC1 猝滅反應(yīng)，接著加熱到室溫并通過硅藻土床過濾。濾液用乙酸乙酯5X100ml萃 取干燥(Na2S04)結(jié)合的有機(jī)層和濃縮到油。層析分離油以產(chǎn)生l.lg 17%的分離 物。S-2-羥乙基2，2-二甲基硫代丙酸酯3-(羥基甲基)二氫噻吩-2 (3H)-酮<formula>formula see original document page 51</formula>N-((2-羥基乙基硫)甲基)乙酰胺IV_185:乙酰胺(890mg， 10mmol)溶解在室溫中的TFA(10ml)。巰基乙醇 (700mg， 10mmol)逐滴加入到攪拌的溶液。反應(yīng)被允許進(jìn)行30m。蒸發(fā)TFA和 得到的油從水性2丙醇被再結(jié)晶。二酰胺形成的實(shí)例VI_173:正丁醇(190ul， l.Ommol)，三乙胺(418ul， 3mmo1),和苯放置在 室溫下配置攪拌棒的燒瓶。氯膦(292mg, l.lmmol)被加到攪拌的溶液中，反應(yīng) 被允許進(jìn)行2h。從得到的混合物中除去溶劑，油直接加到三乙胺預(yù)處理的柱。 蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分，以產(chǎn)生64%的311 mg油。VI_257:四異丙基氨基磷酸氯化物(2.0g， 7.5mmol)在氬氣流中轉(zhuǎn)移到室溫 下配置攪拌棒的火焰干燥的反應(yīng)管。三乙胺(1.05ml， 7.5mmol)和苯(7ml)通過注 射器加入。通過注射器加入2，2，二甲基丁醇(700mg, 6.84mmol)開始反應(yīng)。在 2.5h的過程中通過TLC監(jiān)控反應(yīng)以完全轉(zhuǎn)化。溶劑混合物除去，得到的油直接 加到TEA預(yù)處理柱。從含有產(chǎn)物的餾分除去溶劑，和2X的甲苯共蒸發(fā)得到的 油和從苯過夜凍千以產(chǎn)生1.6g 71 %的無色固體。l-丁氧基-N，N,N'，N'-四異丙基膦二胺l-(3,3二甲基丁氧基)-N，N,N，,N，-四異丙基膦二胺VI_253 SPTE:四異丙基氨基磷酸氯化物(5.0g, 18.81mmol)在氬氣流被轉(zhuǎn) 移到室溫的火焰干燥的配置攪拌棒的反應(yīng)管中。三乙胺(2.6ml， 18.8mmol)和苯 (20ml)通過注射器加入。通過注射器加入發(fā)u酯VI—183(2.77g, 17.1mmol)開始反 應(yīng)。在2.5h的過程中通過TLC監(jiān)控反應(yīng)以完全轉(zhuǎn)化。除去混合物的溶劑，得到 的油直接加到TEA預(yù)處理柱。從含有產(chǎn)物的餾分除去溶劑，得到的油與2X的 甲苯共蒸發(fā)，苯過夜凍干產(chǎn)生91%的6.08g無色固體。31P NMR (162 MHz, d6Benzene 5 ppm 123.5 ppm. 13C NMR (101 MHz, CDC13 5 ppm 205.2, 63.6， 63,4, 44,7, 44.6, 30.8, 30.7, 27.4, 24.7, 24.6, 24.0, 24.0 ppm. 1H NMR (400 MHz, Solvent S ppm 3.70 (dd, J = 13.46 Hz, 2H), 3.48 (dq, J = 13.44 Hz, 4H), 3.14 (t, J = 6,34 Hz, 2H), 1.25-1.11 (m, 33H)。>1凡懺,>^-四異丙基-11,11-二甲基-10,10-聯(lián)苯基-2,9-二氧雜-5,6-二硫雜-1-磷雜-10-硅雜十二烷-1，1-二胺VI—167:雙(二異丙基氨基)氯膦(2g, 7.5mmol) IV—139(3,02g, 7.7mmol)和 二異丙胺(2ml， 15mmol)在10ml苯中反應(yīng)。層析后收集到86%的4.0g油。4-(二異丙基氨基)-3-異丙基-2-甲基-5-氧雜-8,9-二硫雜-3-氮雜-4-磷雜十一烷-ll-基苯甲酸酯VI_171: 2羥基乙基二硫(910ml， 7.6mmol)，三乙胺(3.2ml， 22.8mmol), 和苯放置在室溫的配置攪拌棒的燒瓶中。到攪拌的溶液加入苯甲酰氯化物 (970ul， S.36mmo1)。通過TLC監(jiān)控反應(yīng)以完全轉(zhuǎn)化二硫。用10ml醚稀釋反應(yīng) 物，在無水條件下過濾入新鮮的反應(yīng)管。在氬氣流干加入氯膦(lg, 3.76mmol) 到攪拌的溶液，允許反應(yīng)進(jìn)行另外2h。除去溶劑，得到的油直接加到TEA預(yù)處 理柱。從收集的餾分除去溶劑以產(chǎn)生35%的648mg無色油。VI_147:核苷酸(132.2mg, 0.2mmol)和二異丙基乙胺(105ul， 0.6mmol)用 DCM稀釋。該溶液緩慢地逐滴加入到在二氯曱烷(100ul)中的稀釋液三氯化磷 2M。燒瓶配置通氣針。通過TLC觀察起始材料的完成轉(zhuǎn)化。溶劑和多余的三氯 化磷從反應(yīng)混合物通過蒸發(fā)除去。反應(yīng)物重懸在無水醚和過濾以除去胺鹽和未52反應(yīng)的反應(yīng)膦。蒸發(fā)醚，得到的粗產(chǎn)物固體直接由于自發(fā)降解進(jìn)入下一步反應(yīng) 系列。1((2R^4R,5R)-5-((雙(4-甲氧苯基X苯基)甲氧基)甲基)-4-(雙(二異丙基氨基)膦氧基) 四氫呋喃-2-基)-5-甲基嘧啶-2,4(lH,3H)-二酮VI—179:核普(1.53g， 2.81mmol)和二異丙基乙胺胺(1.0ml， 5.63mmol)用 10ml 二氯曱烷稀釋。該溶液被緩慢地逐滴加到在10ml 二氯曱烷的氯酰胺 (997mg， 3.75mmo1)稀釋液。反應(yīng)允許進(jìn)行30min,此時(shí)通氣針放置在燒瓶中， 以允許HC1和氬氣流的逃逸。反應(yīng)管被用熱風(fēng)槍加熱，除去通風(fēng)口。通過TLC 觀察起始材料的完全轉(zhuǎn)化。溶劑從反應(yīng)混合物中除去，反應(yīng)物被重懸在無水醚 中，并過濾以除去胺鹽和未反應(yīng)的氯酰胺。在4h,反應(yīng)用lmlTEA猝滅，蒸發(fā) 產(chǎn)生油，該油直接負(fù)載到1% TEA預(yù)處理的硅塞?；旌虾挟a(chǎn)物的餾分，并蒸 發(fā)產(chǎn)生85%的2.86g淺黃色固體。31PNMR(162MHz， ^苯)5ppml15.1。核苷激活為磷酸三酯酰胺用于固相合成的實(shí)例以適于Caruthers方法固相 寡核苷酸合成的方式制備核普酰胺。核苷和激活劑加到火焰干燥的小瓶中。亞 磷酰胺是加到攪拌的溶液中，反應(yīng)允許進(jìn)行最少3h。溶劑從反應(yīng)中除去，得到 的泡沫或油被直接加到運(yùn)行緩沖液的三乙胺預(yù)處理硅膠柱。混合只含有產(chǎn)物的 餾分和除去溶劑。得到的泡沫溶解在乙腈中，注射器過濾(0.45um)。除去乙腈， 得到的泡沫溶解在苯中，凍干以除去所有微量三乙胺和殘余的水。在氬氣下樣 品被密封在玻璃容器，在自動(dòng)化寡核苷酸合成儀使用前貯藏在-20。C。OH W
a
二異丙基乙胺， 二氯乙垸
艮
三乙胺，苯
OK, ,N、
乙基硫羥基四挫，MeCN
方案III:通過3條路線的酰胺合成
在一些方面，在合成過程中使用苯氧乙酸堿基保護(hù)。在其它，用于裂解的 受阻堿基形成固體支持物，其不使用對(duì)光不穩(wěn)的接頭。本公開內(nèi)容的一個(gè)優(yōu)點(diǎn) 是能使用 一種或兩種DNA和RNA核苷酸。
合成的路線，其使用2'F和2'2'二曱基丁醇磷酸保護(hù)
(2民3S，4S,5R)-5-(4-乙酰胺基-2-氧代嘧啶-l(2H)-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基M-氟 四氫呋喃-3-基3,3-二甲基丁基二異丙基亞磷酰胺
VI_261:保護(hù)的胞嗜啶(840mg， 1.43mmol)和2'2，二甲基亞磷二酰胺 VI—257(498.5mg， 1.5mmol)溶解在5.7ml 二氯曱烷。加入乙腈(5.7ml)中的乙硫基 四唑0.45M加入和發(fā)現(xiàn)在2.5h反應(yīng)完全。層析和過濾獲得68.4°/。的800mg凍干物。O
(2&38，48,511)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(211)-基)-4-氟四氫呋喃-3-基3,3-二甲基丁基二異丙基亞磷酰胺
VI—261:保護(hù)的尿嘧啶(782mg, 1.43mmol)和2,2，二曱基亞磷二酰胺 VI—257(498.5mg， 1.5mmol)溶解在5.7ml 二氯甲烷。加入在乙腈(5.7ml)中的乙硫 基四唑0.45M和發(fā)現(xiàn)在2.5h反應(yīng)完全。層析和過濾獲得77.4o/。的860mg凍干物。
2，F(xiàn)甲基亞磷酰胺的合成路線
可商業(yè)獲得的，(Carbosynth, R丄Chemical)自由的3'OH核堿基直接與氯膦 在堿性條件下在苯中反應(yīng)。
(2R,3S,4S,5R)-5-(4-乙酰胺基-2-氧代嘧啶-l(2H)-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟 四氫呋喃-3-基甲基二異丙基亞磷酰胺
VI—245， 237:保護(hù)的胞嘧咬核苷(1.0g， 1.7mmol)和D正A(1.42ml， 8.2mmol)被加到火焰干燥的小瓶中。向攪拌的溶液加入亞磷酰胺氯化物(1.34g, 6.79mmol)和反應(yīng)允許進(jìn)行3h。反應(yīng)被濃縮到油中，并直接加到TEA預(yù)處理柱。 通過層析DCM:乙酸乙酯TEA 45: 45: 10實(shí)現(xiàn)分離。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分然后通過通過0.45um濾器在乙腈中轉(zhuǎn)移/過濾。從苯凍干產(chǎn)生80.4%的1.02g凍干物。
隱、'o^ o
(2民35,48,511)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2印-基)-4-氟四氫呋喃-3-基甲基二異丙基亞磷酰胺
VI_251:保護(hù)的尿普核苷(2.74g, 5.0mmol)和D正A(4.2ml， 24mmol)被加 到火焰干燥的小瓶中。向攪拌的溶液加入亞磷酰胺氯化物(3.94g， 20.0mmo1), 反應(yīng)允許進(jìn)行3h。反應(yīng)物被濃縮成油，直接加到TEA預(yù)處理柱上。通過層析己 烷DCM:乙酸乙酯TEA45: 45: 45: IO實(shí)現(xiàn)分離。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分然 后通過0.45um濾器在乙腈通過轉(zhuǎn)移/過濾。從苯凍干，產(chǎn)生84%的2.46g凍干物。
用SPTE生物不穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)合成的路線
<formula>formula see original document page 56</formula>
方案IV:用SPTE膦4呆護(hù)基團(tuán)的2，脫氧合成
<formula>formula see original document page 56</formula>
5-(211,3]1，511)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(5-甲基-2,4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1(211)-萄-四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
VI—247:保護(hù)的核苷(2.07g， 3.08mmol)和乙硫基四唑(15.2ml)用DCM稀 釋。向攪拌的溶液加入磷二酰胺VI_253(1.57g， 4.0mmol),反應(yīng)允許進(jìn)行30m。通過將粗產(chǎn)物灌注飽和碳酸氫鈉溶液和和用鹽水洗滌3X10ml，猝滅反應(yīng)。有機(jī) 物NaS04干燥并蒸發(fā)。通過層析己烷DCM:乙酸乙酯TEA 40: 40: 20: 7.5實(shí)現(xiàn)分離。蒸發(fā)含有產(chǎn)物的餾分，然后通過0.45mn濾器在苯通過轉(zhuǎn)移/過濾 和苯過夜凍千，以保證完全除去水。收集到86%的2.74g凍干物。3IP NMR(162MHz， ^萄5ppml48.7, 148.2。
.S-(2IUR,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5-(6-苯氧基乙酰胺)-9H-嘌呤-9-基)-四氫呋 '喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
VI—267: 5'DMT苯氧?；撗跸佘?3.92g， 5.7mmol)和乙硫基四唑激活劑 (22.8ml, 5.7毫摩爾)被力口到火焰干燥的小瓶中，在二氯甲烷(22.8ml)稀釋。向 攪拌的溶液加入石粦二酰胺VI—253(2.36g， 6.0mmo1)，反應(yīng)允許進(jìn)行3h。從反應(yīng) 管除去溶劑，直接負(fù)載到TEA預(yù)處理柱。含有產(chǎn)物R^0.5的餾分混合，蒸發(fā)成 油。油懸浮在乙腈中，用0.45um注射器濾器過濾，蒸發(fā)成泡沫，溶解在苯中， 并凍千產(chǎn)生71%的3.98g無色凍干物。
2'OTBS膦SPTE保護(hù)的核苷
S-(2R,3S,4S,5R)-2-((m(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(6-(2-苯氧基 乙酰胺)-9H-嘌呤-9-萄-四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
VI—199:保護(hù)的核苷(2.33g， 2.85mmol)和氳四唑(488mg, 2.85mmo1)用 DCM稀釋。向攪拌的溶液加入磷二酰胺(1.18g, 3.0mmo1)，反應(yīng)允許進(jìn)行30m。 通過將粗產(chǎn)物灌注到飽和碳酸氫鈉溶液，用鹽水洗滌3X10ml猝滅反應(yīng)。NaS04 千燥有機(jī)物和蒸發(fā)。通過層析DCM:乙酸乙酯TEA 45: 45: IO實(shí)現(xiàn)分離。 蒸發(fā)含有餾分的產(chǎn)物然后在苯中通過0.2um濾器通過轉(zhuǎn)移/過濾和苯過夜凍千以 保證完全除去水。收集到67%的2.1g凍干物。31P NMR(162MHz, ^萄5 ppm 150.34， 148.79。S-2-(((2艮3S,4S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基M-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(6-氧代-2-(2-苯氧基乙酰 胺)-lH-嘌呤-9(6H)-基)-四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
VI_201:保護(hù)的核苷(2.38g， 2.85mmol)和氫四唑(448mg， 2.85mmol)用DCM 稀釋。向攪拌的溶液加入磷二酰胺VI_253(1.18g， 3mmo1)，反應(yīng)允許進(jìn)行30m。 通過將粗產(chǎn)物灌注到飽和碳酸氫鈉溶液，用鹽水洗滌3X10ml猝滅反應(yīng)。NaS04 干燥有機(jī)物和蒸發(fā)。通過層析DCM:乙酸乙酯TEA45: 45: IO實(shí)現(xiàn)分離。 蒸發(fā)含有餾分的產(chǎn)物然后通過0.45um濾器在苯中轉(zhuǎn)移/過濾，苯過夜凍干以保證 完全除去水。收集815mg凍干物，回收率為25.4%。 31PNMR(162MHz， ^萄S ppm 149.22,149.15。
8:2:((&^8)&55)57( (4'>載基來基)(來基)爭(zhēng)敘*)甲'基>4"(叔丁基三申*運(yùn)氧:基)-5-(2:氧代"4-(2-*氧基乙酰
胺)-l(2H)-基)-四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2,2-二甲基硫代丙酸酯
VI_207:保護(hù)的胞嘧啶(3.77g， 4.75mmol)和SPTE亞磷二酰胺VI—253(1.96g， 5.0mmol)溶解在19ml 二氯曱烷。加入在乙腈(19ml)中的乙硫基四唑0.45M發(fā)現(xiàn) 在2.5h反應(yīng)完全。層析和過濾獲得4.3g凍干物，回收率為83.4%。 31P NMR(162MHz, ^萄5 ppm 150.5， 147.6。
S-2-(((2民3S,4S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基X苯基)甲氧基)甲基)-4-(叔丁基二甲基硅氧基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶 -1(2H)-基)-四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2,2-二甲基硫代丙酸酯
58VI—205 : 保護(hù)的尿嘧啶(3.42g ， 5.18mmol)和SPTE亞磷二酰胺 VI_253(2.139g， 545mmol)溶解在20.7ml 二氯甲烷。加入在乙腈(20.7)中的乙硫 基四唑0.45M,發(fā)現(xiàn)在2.5h反應(yīng)完全。層析和過濾獲得4.7g凍千物，收率在95%。 31PNMR(162MHz, A萄Sppm 149.9， 149.1。
S-2-(((2艮3S,4S,5R)-5-(4-乙酰胺基-2-氧代嘧啶-l(2H)-基)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-4-氟四氫 呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
含有SPTE膦保護(hù)基團(tuán)的2T核苷
VI_239:保護(hù)的胞嘧啶(2.0g， 3.39mmol)和SPTE亞磷二酰胺(14.02g， 3.57mmol)溶解在13.6ml 二氯曱烷。加入在乙腈(13.6ml)中的乙硫基四唑0.45M 發(fā)現(xiàn)在2.5h反應(yīng)完全。層析和過濾獲得2.22g凍干物，收率在74%。 31P NMR(162MHz， ^萄Sppm 150.3， 150.2ppm。
Vl—249:保護(hù)的尿嘧啶(2.08g,3.9mmol)和SPTE亞磷二酰胺(15.7g，4.0mmo1) 溶解在15.2ml 二氯甲烷。加入在乙腈(15.2ml)中的乙硫基四唑0.45M,發(fā)現(xiàn)在2.5h 反應(yīng)完全。層析和過濾獲得2.6g凍千物，收率在82%。
含有SPTE磷酸保護(hù)基團(tuán)的2，0Me修飾的寡核苷酸
丫r
S-2-(((2fUS/JS,5R)-2-((雙W-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)-5"(2+二氧代-3,4-二氫嘧咬-l(2H)-基)-氟四氫呋喃-3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2,2-二甲基硫代丙酸酯<formula>formula see original document page 60</formula>S-2-(((2R,3S,4S,5R)-2-((雙(4-甲氧基苯基X苯基)甲氧基)甲基)-5-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-l(2H)-基)-4-甲氧基四氫呋喃 -3-基氧)(二異丙基氨基)膦氧基)乙基2, 2-二甲基硫代丙酸酯
VI—243: 5，DMT 2，0甲基尿香(lg， 1.8mmol)和乙基硫羥基四唑0.45M(7.1ml) 被加到火焰千燥的配置攪拌棒的小瓶中。向攪拌的溶液加入7ml 二氯曱烷和磷 二酰胺VI—253(738.lmg, 1.88mmo1)，反應(yīng)允許進(jìn)行3h。反應(yīng)物濃縮成粘性油， 通過TEA預(yù)處理硅層析實(shí)現(xiàn)分離。蒸發(fā)含有餾分的產(chǎn)物，然后通過0.45um濾 器在乙腈中通過轉(zhuǎn)移/過濾和苯過夜凍千，以保證完全除去水和殘余的三乙胺。 收集到1.3g凍干物，收率為85.4%。
可選的磷酸三酯的后寡核苷酸合成路線
Oligo 6lig。
Oligo 6lig。
RI，堿基
RX ，堿基
Oligo Oligo
Oligo
X=0，N或S
O
w
以上所列的通常結(jié)構(gòu)的甲基膦酸酯也提供了獲得含有電荷中性骨架的寡核 苷酸，其附加地提供了核酸酶抗性。
提供上述的實(shí)施例，以給予本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全的公開內(nèi)容和說明， 以如何制備和使用本公開內(nèi)容的實(shí)施方式中的裝置，系統(tǒng)和方法，其不旨在限 制發(fā)明人認(rèn)為的其公開內(nèi)容的的范圍。上述的才莫式改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員以進(jìn) 行本公開內(nèi)容是顯而易見的，其意在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在說明書中提到內(nèi)容引用的所有參考文獻(xiàn)引用通過參考并入，它們各自以其全部?jī)?nèi)容以相同的
程度通過參考并入。
本公開內(nèi)容的一些實(shí)施方式已經(jīng)敘述。然而，可以理解的是可以作出不同的改動(dòng)，但不脫離本公開內(nèi)容的精神和范圍。因此，其它實(shí)施方式也在以下權(quán)利要求的范圍。
權(quán)利要求
1. 核酸構(gòu)建物包括a)寡核苷酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域，其包括在一個(gè)或多個(gè)位置的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)，所述保護(hù)基團(tuán)減少所述寡核苷酸或多核苷酸骨架的凈陰離子電荷；和b)至少包括膜運(yùn)輸功能的一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，其可操作地連接到所述寡核苷酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域。
2. 權(quán)利要求l的核酸構(gòu)建物，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是帶陽(yáng)離子電 荷的結(jié)構(gòu)域。
3. 權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建物，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié) 構(gòu)域(PTD)。
4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中相對(duì)于非保護(hù)的寡核苷酸 或多核香酸，核酸構(gòu)建物的總電荷是中性的或帶正電荷的。
5. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫代磷 酸酯保護(hù)基團(tuán)具有通式R畫X-或Q國(guó)X-其中X是O, S或NR1, R/是H,甲基，乙基，硫代新戊?；虼掖?， 羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基， 烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代 的雜環(huán)基；其中R是選自R2,其中f是烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán) 烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基， 或取代的雜環(huán)基，R、A,S、,A、，其中R 是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中V和八2各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中W是H,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中八3和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中AS是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中W和XS各自獨(dú)立地是0， S或NR7, R"是H,羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，tt，或硝基，其中八6和A 各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中XS和X"各自獨(dú)立地是0， S或NR8， RS是H,羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基；其中Q是選自<formula>formula see original document page 3</formula>Q1,其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，<formula>formula see original document page 4</formula> 其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中八8和八9各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，<formula>formula see original document page 4</formula>其中Q3lpKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中A^和八u各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， x5其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中A"是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中XS和XS各自獨(dú)立地是0， S或NR9, R"是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和 x8<formula>formula see original document page 4</formula>其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中A"和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中X"和XS各自獨(dú)立地是0， S或NR， R^是H，羥基，烷基，取代的 烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基， 炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基。
6.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫代磷 酸酯保護(hù)基團(tuán)是選自MeO-, EtO-， iPrO,禾，:口
7.權(quán)利要求5中任一個(gè)核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫' 護(hù)基團(tuán)包括選自以下的結(jié)構(gòu)巧保<formula>formula see original document page 5</formula>
8. 權(quán)利要求5的核酸構(gòu)建物，進(jìn)一步包括通過接頭連接所述磷酸二酯和/或 硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)以形成RNB保護(hù)基團(tuán)的堿性取代，胍鹽，胺，或脲基。
9. 權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建物，其中RNB保護(hù)基團(tuán)包括選自以下的結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 5</formula>
10.權(quán)利要求3的核酸構(gòu)建物，其中所述至少一個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域選自由以 下基團(tuán)構(gòu)成的組包括皰瘆病毒VP22結(jié)構(gòu)域的多肽；包括人免疫缺陷病毒 (fflV)TAT結(jié)構(gòu)域的多肽；包括同源異型結(jié)構(gòu)域觸足蛋白(AntpHD)結(jié)構(gòu)域的多 肽；N端陽(yáng)離子朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)域；聚精氨酸；及其官能片段。
11. 權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建物，其中所述寡核苷酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域包括dsRNA或siRNA。
12. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建物和藥學(xué)上可接受的載體。
13. 核酸構(gòu)建物，包括寡核苷酸或多核苷酸，所述寡核苷酸或多核苷酸包括在一個(gè)或多個(gè)位置的 磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)，所述保護(hù)基團(tuán)減少所述寡核苷酸或多核苷 酸骨架的凈陰離子電荷或提供所述寡核苷酸或多核苷酸骨架的凈陽(yáng)離子電核。
14. 權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基 團(tuán)具有通式R誦X-或Q-X-其中X是O, S或NR1, W是H,甲基，乙基，^琉代新戊?；虼掖?， 羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基， 烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代 的雜環(huán)基；其中R是選自其中R"是烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán) 烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基， 或取代的雜環(huán)基，<formula>formula see original document page 6</formula>其中RS是H，羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中V和八2各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中R"是H，鞋基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)坑基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中八3和八4各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈,其中RS是H,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，鹵素， ，或硝基，其中八5是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中^和乂2各自獨(dú)立地是0， S或NR7， f是H，羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和其中rS是H,羥基，烷基，取代的烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基， 取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基， 雜環(huán)基，取代的雜環(huán)基，卣素，氰基，或硝基，其中八6和A 各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中乂3和乂4各自獨(dú)立地是0， S或NR8, R8是H，羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基；其中Q是選自Q1，其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，<formula>formula see original document page 7</formula> ，其中(^是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中八8和八9各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，S——A10其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中A^和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈，其中Q"是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)， 其中A^是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中xs和xs各自獨(dú)立地是0， S或NR9， ！^是H,羥基，烷基，取代的烷 基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基，炔 基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基，和05義 / \——乂13其中QS是pKa大于或等于10的堿性基團(tuán)，其中A"和A"各自獨(dú)立地是一到七個(gè)原子鏈，或取代的一到七個(gè)原子鏈， 其中X7和X8各自獨(dú)立地是0， S或NR10， R"是H，羥基，烷基，取代的 烷基，烷氧基，取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，烯基，取代的烯基， 炔基，取代的炔基，芳基，取代的芳基，雜環(huán)基，或取代的雜環(huán)基。
15.權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基 團(tuán)是選自MeO-, EtO-, iPrO，
16.權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基 團(tuán)包括選自以下的結(jié)構(gòu) <formula>formula see original document page 9</formula>(e) n 。
17. 權(quán)利要求14的核酸構(gòu)建物，包括堿性取代，胍鹽，胺，或脲基，它們 通過接頭連接到所述磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)以形成RNB保護(hù)基團(tuán)。
18. 權(quán)利要求17的核酸構(gòu)建物，其中RNB保護(hù)基團(tuán)包括選自以下的結(jié)構(gòu) <formula>formula see original document page 9</formula>
19. 權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建物，進(jìn)一步包括可操作地連接到所述寡核苷酸 或多核苷酸的靶向作用結(jié)構(gòu)域。
20. 權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建物，其中靶向作用的部分是結(jié)合細(xì)胞表面蛋白 的抗體。
21. 權(quán)利要求19的核酸構(gòu)建物，其中靶向作用的結(jié)構(gòu)域包括細(xì)胞表面受體 的受體配體。
22. 權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建物，進(jìn)一步包括帶陽(yáng)離子電荷的多肽或肽。
23. 權(quán)利要求22的核酸構(gòu)建物，其中帶陽(yáng)離子電荷的多肽或肽包括蛋白轉(zhuǎn) 導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
24. 包括權(quán)利要求13-23任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物和藥學(xué)上可接受的載體的 藥物組合物。
25. —種方法，包括將一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域連接到權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建物。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含2-5個(gè) 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)蛋 白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
28. 產(chǎn)生核酸構(gòu)建物的方法，包括 基本純化蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域； 合成寡核苷酸；用磷酸三酯基團(tuán)電荷中和所述寡核苷酸上的陰離子電荷；和 將所述寡核香酸連接到一個(gè)或多個(gè)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
29. 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，包括 用權(quán)利要求1或13的核酸構(gòu)建物接觸細(xì)胞。
30. 權(quán)利要求28的，其中所述接觸是在體內(nèi)。
31. 權(quán)利要求30的，其中核酸構(gòu)建物包括反義分子。
32. 治療疾病或病癥的方法，包括給研究對(duì)象施用權(quán)利要求1或13的核酸 構(gòu)建物，其中所述寡核苷酸或多核苷酸包括治療或診斷分子。
33. 權(quán)利要求5或14的核酸構(gòu)建物，其中W是甲基，乙基或硫代新戊?；?硫代乙醇。
34. 權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建物，其中所述磷酸三酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基 團(tuán)存在于包括2'-W的核苷酸上，其中W是H， F, OH， O-Me，或O-Akyl。
35. 權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建物，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)或 更多的轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。
36. 權(quán)利要求1或35的核酸構(gòu)建物，其中所述至少一個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可逆地 或不可逆地綴合到所迷寡核普酸或多核苷酸結(jié)構(gòu)域的5'， 3'或兩端。
37. 權(quán)利要求的核酸構(gòu)建物，其中2'-W是-OH。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及經(jīng)修飾具有減少凈陰離子電荷的核酸構(gòu)建物。在一些方面構(gòu)建物包含磷酸二酯和/或硫代磷酸酯保護(hù)基團(tuán)。本公開內(nèi)容也提供了制造和使用這種構(gòu)建物的方法。
文檔編號(hào)C12P19/00GK101506368SQ200780030587
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月12日
發(fā)明者史蒂文·F·道蒂, 布萊恩·R·米德, 斯科特·G·彼得森 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)