專利名稱：改進的細胞培養(yǎng)方法
改進的細胞培養(yǎng)方法. 本發(fā)明涉及在反應器中于細胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細胞的工藝。
此類工藝例如從WO04/099396已知。該文中描述了如何通過優(yōu)化補料 分批工藝中的生長條件來提高細胞培養(yǎng)物的細胞密度和想要的生物材料的 產率。
此外，WO05/095578公開了一種培養(yǎng)細胞的工藝，其通過對包含細胞 培養(yǎng)基和細胞的細胞培養(yǎng)物進行連續(xù)灌注培養(yǎng)來實現(xiàn)，其中，向細胞培養(yǎng) 物中加入細胞培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)物在包含中空纖維的過濾器模塊上循環(huán)， 導致產生比細胞培養(yǎng)物細胞密度更低的液體流出物，并且過濾器模塊內部 的流是交互切向流(alternating tangential flow)，其中，所述細胞產生生 物物質。在WO05/095578的實施例中顯示，生產了 0.9 g/L/天的產物，這 對應于流出物中大約0.3 g/L的產物濃度。
含生物物質的液體體積越大，對生物物質的純化就越費力。 WO04/099396和WO05/095578公開的工藝中，獲得的生物物質的濃度并 不高。因此，對該生物物質的下游加工是麻煩的，因為需要在應用后續(xù)純 化步驟之前對生物物質加以濃縮，或者需要對大體積、低濃度的生物物質 加以純化。因此，以較低的細胞密度培養(yǎng)細胞導致體積生產力 (productivity)較低，因此對給定的生產水平需要更大和/或更多的培養(yǎng)容 器以及由此需要在裝備上投入更多。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種工藝，其中，以更高的濃度從細 胞培養(yǎng)物獲得產物。
本發(fā)明的另 一 目的是使得能夠在延長的時間段內培養(yǎng)細胞和生產生物 材料。
這些目的通過在反應器中于細胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細胞的如下 工藝來實現(xiàn)，其中，所述細胞產生生物物質，其中，向細胞培養(yǎng)物補料至 少一種細胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含細胞、生物物質和細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將生物物質 與比所述生物物質分子量更低的物質分開，并且，其中，所述生物物質保 留在反應器中或被回送進反應器。
例如，本發(fā)明涉及在反應器中于細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的工藝，其 中，所述細胞產生生物物質，其中，向所述反應器補料營養(yǎng)物和/或細胞培 養(yǎng)基，并且，其中，包含細胞和細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物在孔徑或分子量
分離點在5至50Q kD之間的過濾器上循環(huán)。
已經發(fā)現(xiàn)，通過使用將生物物質與分子量比生物物質低的物質相分離 的分離系統(tǒng)，可以在細胞培養(yǎng)物中以更高濃度積累生物物質。
因此，本發(fā)明不同于現(xiàn)有技術描述的細胞培養(yǎng)，其允許想要的生物材 料與細胞物質一起積累。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，更低分子量的物質的一部分持續(xù) 從細胞培養(yǎng)物中移出。
本發(fā)明的工藝的另一優(yōu)點在于，較之例如分批或補料分批工藝，可以 達到更高的存活細胞濃度。此外，較之例如分批或補料分批工藝，生產時 間(即細胞產生生物物質的時間段)可被延長。此外，較之分批或補料分 批工藝，有可能使用更小的反應器。使用更小的反應器是有益的，因為這 降低了裝備和設施相關的投入。
此外，可在更短的時間內獲得更高濃度的生物物質。
我們發(fā)現(xiàn)，可在反應器內獲得高濃度的生物物質，而不會顯著減少細 胞存活性以及因此不需限制生產時間。本領域技術人員將能預計到，將可 能發(fā)生產物抑制，即，生物物質自身對生物物質生產的抑制，或者細胞產 生的其它大分子(例如，宿主細胞蛋白、酶或細胞殘骸)造成的抑制。此 外，我們發(fā)現(xiàn)，想要的生物材料的積累不會損害分離系統(tǒng)的功能。
本發(fā)明的工藝在細胞密度、細胞培養(yǎng)物中產物濃度以及延長的培養(yǎng)時 間等方面，較之根據(jù)WO05/095578和WO04/099396的工藝提供了相當大 的好處。由此，本發(fā)明的工藝導致了對想要的生物材料的改進的生產。
可用于生產生物物質的細胞原則上是本領域技術人員已知的能生產生 物產物的所有細胞。所述細胞可以是真核的，例如，有絲真菌，例如，
5c/ 3^oge做m ， 酵母，例如 Sacc/zaromyce5 cerev/w'ae 、 i^/w_yveraw_ycas /ad尸Aaj(T^3 rAot/oz戸a， 來自/Vc/n'a屬的酵母，例如，i^.c/n'a ，加n's， 或原核的，例如,五scAen'c/n'a co//、萬aa7/"5 ^， 例如，5. /z'cAem/orm&、萬. swZ ft7z's 、 萬.aw少/o/z々M咖c/e/i 、 5. a/A:a/o/ / 7i 、 /SVre/ tow;^ces s/ .、 Co/^we^acten'wm g/wtowz'cwm、尸sew(iomowas >s^。 真核纟田胞的例子還例如描 述于Chu, L.， Robinson, D. K.， (2001) Curr. Opinion Biotechn.， vol. 12, p. 180-187中。優(yōu)選地，用于本發(fā)明工藝中的細胞是動物細胞，特別是哺乳動物 細胞。哺乳動物細胞的例子包括CHO (中華倉鼠卵巢)細胞、雜交瘤、 BHK (幼倉鼠腎)細胞、骨髓瘤細胞、人細胞(例如HEK-293細胞、人 淋巴母細胞)、E1永生化的HER細胞、小鼠細胞(例如NS0細胞)。更 優(yōu)選地，使用E1永生化的HER細胞，最優(yōu)選使用？￡11(6細胞。
可從胎兒分離初級人胚視網(wǎng)膜(HER)細胞(Byrd P， Brown KW, Gallimore PH. 1982. Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71， Byrd PJ, Grand RJA， Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484)。培養(yǎng)若干傳代后，初級細胞將死亡。就本發(fā)明的目的而言，El永 生化的HER細胞得自初級HER細胞，這是通過在其中表達編碼腺病毒 E1A和E1B蛋白的DNA，來獲得永生化細胞的。這類經永生化的細胞可 培養(yǎng)超過100次傳代。用于獲得El永生化HER細胞的方法例如已被描述 于美國專利5，994，128，描述于Byrd P, Brown KW, Gallimore PH. 1982 Malignant transformation of human embryo retinoblasts by cloned adenovirus 12 DNA. Nature 298: 69-71，描述于Byrd PJ， Grand RJA, Gallimore PH. 1988. Differential transformation of primary human embryo retinal cells by adenovirus El regions and combinations of E1A + ras. Oncogene 2: 477-484， 且描述于 Gallimore， P.H.， Grand, R丄A. and Byrd， P.J. (1986). Transformation of human embryo retinoblasts with simian virus 40, adenovirus and ras oncogenes. Anticancer Res. 6, p499-508中。例如，通過用含腺病毒血清型5 (Ad5)ElA-和ElB-編碼序列(Ad5核苷酸459-3510)的質粒(處于人磷酸甘油 酸激酶("PGK")啟動子控制下)轉染初級HER細胞，來產生永生化 的HER細胞，包括PER.C1、 PER.C3、 PER.C4、 PER.C5、 PER.C6、 PER,C8禾口 PER.C9纟田胞(見，美國專利5,994,128)。
在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明工藝中的細胞是El-永生化的HER 細胞，更優(yōu)選地，是PER.C6細胞(見美國專利5,994,128) 。 PER.C6細 胞的例子是以ECACCNo. 96022940保藏的細胞(見，例如，美國專利 5,994,128、 EP 0833934 Bl)。
在本發(fā)明的工藝中，可以在懸浮液中對任何形式的細胞進行培養(yǎng)，例 如，作為被固定的細胞、單個細胞或在細胞簇中或者作為其組合。優(yōu)選 地，細胞作為單個細胞和/或作為不超過100個細胞(更優(yōu)選不超過20個 細胞)的小細胞簇被培養(yǎng)。細胞例如可被固定到微載體上，例如，可從例 如GE Healthcare商業(yè)獲得的微載體(Cytodex)。
反應器在本文中被定義為包含細胞培養(yǎng)物的系統(tǒng)，所述細胞培養(yǎng)物進 而包含細胞和細胞培養(yǎng)基。其優(yōu)選提供無菌屏障，例如空氣過濾器，以防 止其它細胞污染想要的細胞，并且，其通過提供正確的培養(yǎng)條件(例如， 混合、溫度、pH、氧濃度等)來保持對細胞有利的環(huán)境。
反應器例如可以是更為永久的性質的，例如，反應器可以是不銹鋼或 玻璃的，或者例如可以是可棄置的，例如，反應器可以是塑料瓶或塑料 袋。適合用于本發(fā)明的反應器的例子包括但不限于攪拌槽容器、空運用 (airlift)容器和可棄置容器，它們可通過搖動、振蕩運動或攪拌來進行混 合。優(yōu)選使用可棄置(生物)反應器，因為它們僅需要相對低的投資成 本，具有強大的操作靈活性、短的周轉時間，并且易于針對工藝對其加以 配置。可棄置(生物)反應器可商業(yè)獲得，例如從Hyclone、 Sartorius、 Applil髓或Wave獲得。
術語"分離系統(tǒng)"在本發(fā)明上下文中被定義為能基于分子量進行分離 的系統(tǒng)。用于本發(fā)明工藝中的分離系統(tǒng)能將生物物質與分子量比所述生物 物質低的物質分開。換句話說，分子量分離點被選擇為使得所述分子量
分離點(MWCO)小于所述生物物質的分子量，更優(yōu)選以至少2的因子，
7最優(yōu)選以至少3的因子小于所述生物物質的分子量。典型地，分離系統(tǒng)的
MWCO優(yōu)選為至少5 kDa，更優(yōu)選至少10 kDa，最優(yōu)選至少30 kDa，優(yōu) 選至多500 kDa，更優(yōu)選至多300 kDa，最優(yōu)選至多100 kDa,但是當然這 將取決于本發(fā)明的工藝所生產的生物物質的分子量。例如，對于分子量為 150 kDa的IgG來說，具有至多50 kDa的MWCO的分離系統(tǒng)是最優(yōu)選 的。
分離系統(tǒng)的例子包括但不限于過濾器、離心機和水性兩相萃取系統(tǒng)。
術語"過濾器"在本文中使用時表示包括具有基于分子量或大小來分 離顆粒的能力的所有設備。原則上，在本發(fā)明的工藝中，任何過濾器都可
使用，只要選用的孔徑或MWCO能使得生物物質與分子量比生物物質低 的物質分開即可，典型地，這將是5至500 kDa之間的MWCO或孔徑。 適合用于本發(fā)明的過濾器的例子包括膜過濾器、陶瓷過濾器和金屬過濾 器。過濾器可以以任何形式來使用，過濾器可以例如是螺旋巻繞狀(spiral wound)或管狀的，或者可以以片狀形式使用。優(yōu)選地，在本發(fā)明的工藝 中，所用的過濾器是膜過濾器，優(yōu)選地，中空纖維過濾器。術語"中空纖 維"表示管狀的膜。所述管的內徑為至少0.1 mm，更優(yōu)選為至少0.5 mm，最優(yōu)選為至少0.75 mm，優(yōu)選地，管的內徑至多10 mm，更優(yōu)選至 多6 mm，最優(yōu)選至多1 mm。包含中空纖維的過濾器模塊可從例如 General Electric (GE,以前的Amersham)商業(yè)獲f導。
通過將包含生物物質、細胞和細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上 循環(huán)，生物物質和細胞留在反應器中，液體流出物因此比具有比細胞培養(yǎng) 物更低的生物物質含量和更低的細胞密度。通常，在本發(fā)明的工藝中，液 體流出物不含或很少含任何生物物質和細胞。通常，液體流出物基本上僅 含分子量比所述生物物質低的組分。因此，基本上所有細胞和基本上所有 生物物質通常都留在反應器中。
優(yōu)選地，過濾器的孔徑或MWCO被選擇為使得過濾器的孔徑或 MWCO比產物的直徑或分子量要小，更優(yōu)選以至少2的因子，最優(yōu)選至少 3的因子小，以確保產物的高駐留。典型地，分離系統(tǒng)的孔徑或MWCO優(yōu)選為至少5kDa，更優(yōu)選至少10kDa，最優(yōu)選至少30 kDa，和/或所述過濾 器/膜的孔徑或MWCO優(yōu)選至多500 kDa，更優(yōu)選至多300 kDa，最優(yōu)選至 多100kDa，但是當然這將取決于本發(fā)明的工藝所生產的生物物質的分子
分子量分離點(MWCO)表示分子量大于其的顆粒中至少90%都留 在分離系統(tǒng)中。
將細胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)(例如過濾器)上循環(huán)表示細胞培養(yǎng)物經 過分離系統(tǒng)(例如過濾器)，產生液體流出物和其中內含物被保持在反應 器中或回送進反應器的流。其中內含物被保持在反應器中或回送進反應器 的流通?；旧蟽H含分子量至少等于生物物質或分子量更高的組分，因此 所述的流將比液體流出物包含更多的生物物質。
原則上，在本發(fā)明的工藝期間，細胞培養(yǎng)物何時在分離系統(tǒng)上循環(huán)并 非關鍵。細胞培養(yǎng)物的循環(huán)可例如從工藝開始時直接開始，或者當細胞的 存活細胞密度達到某個水平時才開始。
細胞培養(yǎng)物在過濾器上的循環(huán)可以是相對過濾器表面來說基本垂直的 流，這也被稱為盡頭(dead-end)流，或其可以是與過濾器表面基本平行 的流，這也被稱為切向流，例如單向切向流(TFF)或交叉流(cross-flow) 。交叉流的一種優(yōu)選例子是交互切向流(ATF)，因為采用ATF時 發(fā)現(xiàn)，不會(迅速)發(fā)生過濾器阻塞，即使是在非常高的細胞密度下。通 常公知，在深度過濾中，需要通過漸進的前過濾器來保護最后的小孔徑過 濾器免受阻塞。該實踐基于下述公知常識具有較小孔或較小MWCO的 的過濾器更容易阻塞，由此限制了生產時間。如果使用ATF，那么就不必 要使用前過濾器了。
可通過移動細胞培養(yǎng)物，或者通過移動過濾器，或者移動兩者，來引 導流。例如可通過旋轉(旋轉式過濾器)或振動(振動式過濾器)來移動 過濾器?；蛘?，如果僅通過移動細胞培養(yǎng)物來引導流，那么過濾器是靜止 的，例如可以通過泵或壓力來移動細胞培養(yǎng)物。
"交互切向流"表示，有一條與過濾器表面同樣方向(即，與其切 向)的流，所述的流往復運動，并且，還有一條與所述過濾器表面方向基本垂直的流。交互切向流可根據(jù)本領域技術人員己知的方法來獲得(例
如，如US 6,544,424所述)。
在對細胞的培養(yǎng)期間，至少一種細胞培養(yǎng)基組分，例如， 一種或多種 營養(yǎng)物和/或細胞培養(yǎng)基，可被補料給細胞。在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，部分 補充，或者優(yōu)選地，全部補充消耗的營養(yǎng)物中的至少一種是有好處的，這 通過將該營養(yǎng)物或這些營養(yǎng)物補料至反應器來實現(xiàn)。例如，可向反應器補 料完全細胞培養(yǎng)基，這是有好處的，因為這樣就無須再分別制備單獨的補 料了。細胞培養(yǎng)基例如還可以更濃縮的形式補料給細胞，這是有好處的， 因為較小的體積更易于操作。此外，可向反應器補料一種或多種營養(yǎng)物。 例如，碳水化合物，例如葡萄糖或果糖；氨基酸，例如谷氨酰胺；和/或肽 可有利地補料至反應器。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，選用這樣的細胞培養(yǎng)條件，使得 細胞生長速率和/或細胞的比生產力不受限制，更優(yōu)選地，使得細胞培養(yǎng)基 組分中的至少一種的濃度保持基本上恒定。限制細胞培養(yǎng)條件的例子是營 養(yǎng)物限制和抑制性代謝物(例如氨、二氧化碳和乳酸鹽)的形成。例如， 細胞培養(yǎng)條件(例如，補料)可被選擇為使得細胞生長速率不受限制， 這例如通過提供足夠的營養(yǎng)物以補償消耗和/或避免抑制性代謝物(例如如 酸鹽或氨)的產生來實現(xiàn)。例如，可選用通氣條件，使得二氧化碳形成不 會限制細胞生長速率。從Good Manufacturing Practice (GMP)的觀點來 看，在非限制性條件下培養(yǎng)細胞是高度有好處的，因為，1)這能提供恒 定的細胞培養(yǎng)環(huán)境，在很多情況下還會提供恒定、良好的產物品質，以及 2)這可導致高的細胞存活率，在一些情況下，導致細胞存活率超過 98%。高細胞存活率降低了細胞相關污染物(例如宿主細胞蛋白)的釋 放，這有助于對產物的純化。此外，以不受限制的細胞培養(yǎng)速率和/或不受 限制的比生產力來培養(yǎng)細胞具有商業(yè)優(yōu)點，從而得以在進一步更短的時間 內生產出更多的生物物質，因為，在所述工藝中可更早達到更高的細胞密 度。
細胞的"比生產力"是每時間單位每個細胞產生的給定生物物質的 量，其通常被表示為pg.細胞"天—、向細胞培養(yǎng)物添加至少一種細胞培養(yǎng)基組分(例如營養(yǎng)物和/或細胞培養(yǎng)基)的速率(流入速率或灌注速率)影響細胞的存活性和密度。在本發(fā)明的工藝中，細胞培養(yǎng)基組分(例如營養(yǎng)物和/或細胞培養(yǎng)基)可例如以連
續(xù)的流、半連續(xù)的流(例如分步的流)或間隔的(staggered)流來補料。優(yōu)選地，細胞培養(yǎng)基組分(例如營養(yǎng)物和/或細胞培養(yǎng)基)以連續(xù)的流添加。
細胞培養(yǎng)基組分，例如完全細胞培養(yǎng)基和/或營養(yǎng)物，原則上可以在所述工藝期間的任何時候補料至反應器。優(yōu)選地，補料在谷氨酰胺和葡萄糖等底物達到低至導致細胞停止生長的水平前啟動，或在抑制性代謝物(例如乳酸鹽或氨)達到高至生長將停止的水平前啟動。從該時起，細胞培養(yǎng)基組分(例如營養(yǎng)物和/或完全細胞培養(yǎng)基)優(yōu)選以使得達到底物需求的速率補料至反應器。
在本發(fā)明的一種實施方式中，細胞培養(yǎng)基以根據(jù)式(1)的補料速率添加
補料速率SFRX (總細胞培養(yǎng)物體積)X (存活細胞密度)(1)
其中，補料速率以每天的升數(shù)表示，其中，SFR是比補料速率，艮卩，以每時間單位相對于每個存活細胞添加的培養(yǎng)基體積表示的細胞培養(yǎng)基補
料至細胞培養(yǎng)物的速率，其中，存活細胞密度是每體積單位存活細胞的數(shù)量。存活細胞的數(shù)量可由本領域技術人員來測定，例如，通過臺盼藍(Trypan Blue)排除方法。比補料速率優(yōu)選被選擇為0.01至0.3 nL/細胞/天之間，更優(yōu)選在0.01至0.2 nL/細胞/天之間。
調節(jié)補料速率時考慮到其它參數(shù)可能是有好處的，例如，向培養(yǎng)物補料的葡萄糖的量和/或氧吸收速率。例如，對于PER.C6而言，細胞培養(yǎng)基和/或營養(yǎng)物的補料速率優(yōu)選被選擇為使得葡萄糖濃度保持在3至20mmol/L之間，更優(yōu)選在5至15 mmol/L之間。優(yōu)選地，葡萄糖濃度為至少3 mmol/L，更優(yōu)選至少5 mmol/L，優(yōu)選至多20 mmol/L，更優(yōu)選至多15mmol/L。
在本發(fā)明的一種特別的實施方式中，至少一次從反應器移出細胞培養(yǎng)物(包含細胞、生物物質和細胞培養(yǎng)基)，并向反應器中加入液體(例如，細胞培養(yǎng)基或營養(yǎng)物補料)，以補償細胞培養(yǎng)物的移出。細胞培養(yǎng)物的移出可導致更高細胞密度下進行更長的處理時間，并且組合高的細胞存活率，這導致了更高的生產力。細胞培養(yǎng)物可連續(xù)或分步移出。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，只要達到想要的細胞密度，例
如，至少10Xl()S個存活細胞/ml，優(yōu)選至少20Xl()S個存活細胞/ml，更優(yōu)選至少30Xl()S個存活細胞/ml，例如，至多200Xl()S個存活細胞/ml的細胞密度，就從反應器中移出細胞培養(yǎng)物(包含細胞、生物物質和細胞培養(yǎng)基)，并且向反應器中加入液體(例如細胞培養(yǎng)基或營養(yǎng)物補料)，以補償細胞培養(yǎng)物的移出。優(yōu)選地，以使得細胞密度保持在想要的細胞密度范圍內的速率來移出細胞培養(yǎng)物。較之傳統(tǒng)的分批或補料分批工藝，本發(fā)明的該實施方式是高度有利的，因為其將本發(fā)明工藝的優(yōu)點與可被保持更長時間的高存活率組合起來，使得得以實現(xiàn)進一步更高的總體積生產力。"體積生產力"表示每單位時間每單位反應器體積產生的生物物質的量，其通常被表示為g丄".天—、較之傳統(tǒng)灌注工藝，本發(fā)明的該實施方式是高度有好處的，因為其將本發(fā)明工藝的優(yōu)點和具有高濃度生物物質的細胞培養(yǎng)物移出流組合到一起。細胞培養(yǎng)物移出流中高濃度的生物物質使得從其中收獲生物物質具有商業(yè)價值。在其中移出細胞培養(yǎng)物的傳統(tǒng)灌注工藝中，細胞培養(yǎng)物移出流含有的生物物質并不足以使得收獲所述生物物質具有商業(yè)價值，因此細胞培養(yǎng)物移出流通常被認為是廢料。因此，本發(fā)明的該實施方式中，理論上可以以直接、經濟可行且簡單的方式收獲產生的所有生物物質。
在本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的實施方式中，選用這樣的細胞培養(yǎng)條件，使得細胞的細胞生長速率和/或比生產力不受限制，更優(yōu)選地，還使得細胞培養(yǎng)基的至少一種組分(例如葡萄糖或谷氨酰胺)的濃度保持恒定，并且，只要達到想要的細胞密度，至少進行一次從反應器移出細胞培養(yǎng)物的操作，并且，向反應器加入液體(例如細胞培養(yǎng)基)，以補償細胞培養(yǎng)物的移出。
優(yōu)選地，流出物的速率被選擇為使得其與至少一種細胞培養(yǎng)基組分(例如營養(yǎng)物和/或細胞培養(yǎng)基)的添加速率減去任選的細胞培養(yǎng)基移出速
12率基本等同。
產生生物物質的細胞例如是能表達編碼生物物質的基因的細胞?？衫缤ㄟ^用含有編碼生物物質的基因和編碼合適的選擇標記的基因(例如，
編碼新霉素抗性的基因(Neo標記基因))的質粒轉染細胞，從而制備能
表達編碼生物物質的基因的細胞。然后可通過選擇壓力來選出經穩(wěn)定轉染
的細胞，例如，在Neo標記基因的情況下，通過在存在G418 (genericin)的情況下培養(yǎng)經轉染的細胞以及針對展示出生物物質高水平表達的細胞對細胞加以立即篩選。用于制備表達蛋白的El-永生化HER細胞的克隆的方法以及用于培養(yǎng)此類細胞以生產所述蛋白的方法都是技術人員公知的，例如可在US 6，855，544中找到。
可通過細胞產生的生物物質，例如通過表達編碼(重組)基因編碼來產生的生物物質，因此例如是(重組)蛋白，特別是受體、酶、融合蛋白、血蛋白(例如來自凝血級聯(lián)的蛋白)、多功能蛋白(例如促紅細胞生成素)、病毒或細菌蛋白(例如用于疫苗的)、免疫球蛋白(例如抗體，例如IgG或IgM)等；優(yōu)選地，通過細胞產生蛋白，更優(yōu)選地，產生抗體。優(yōu)選地，通過細胞產生的生物物質，例如蛋白或疫苗可用作為藥物制劑中的活性成分。在本發(fā)明的上下文中，術語"產物"和"生物物質"可交換使用。
在本發(fā)明的上下文中，藥物制劑表示可用作為藥品(特別是用于人的藥品)的任何制劑。此類藥品可以例如用于診斷或用于預防目的(例如，疫苗)和/或用于治療目的，例如患者缺乏的酶或蛋白，或者用于殺死不想要的細胞的抗體。藥物制劑還可含有可藥用載體或賦形劑，它們的例子是本領域技術人員公知的。
PER.C6細胞系可用于生產生物物質，例如El-缺失的腺病毒(見，例如美國專利6，994，128; Nichols et al， 2002, Propagation of adenoviral vectors:use of PER.C6 cells. In: Curiel D, Douglas JT, editors. Adenoviral vectors forgene therapy. San Diego: Elsevier, p 129-167)、其它病毒(見，例如，WO01/38362)或重組蛋白(見，例如美國專利6,855,544; Yallop et al, 2005,PER.C6 cells for the manufacture of biopharmaceutical proteins, Modern
13Biopharmaceuticals: Design, Development and Optimization, 4 Volumes, 779-807, J6rg Kr^blein (編輯))。
可用作為藥物制劑中活性成分的蛋白的例子包括(括號內是商品名)Tenecteplase ( TN KaseTM )、(重組)抗血友病因子
(ReFacto )、淋巴母細胞干擾素a-nl (Wellferon )、(重組)凝血因子 (Novo Seven ) 、 Etanercept ( Enbrel ) 、 Trastuzumab
(HerceptinTM) 、 Infliximab (Remicade ) 、 Palivizumab (Synagis )、Basiliximab ( Simulect ) 、 Daclizumab ( Zenapaz ) 、 Rituximab
(Rituxan )，(重組)凝血因子IX ( Benefix )和干擾素/3-la
(Avonex )。
可用作為藥物制劑中活性成分的疫苗的例子包括經分離的蛋白抗原，其例子包括但不限于活的、口服的、四價的輪狀病毒疫苗(RotaShield )、狂犬病疫苗(RanAvert )、流感疫苗和滅活甲肝疫苗(VAQTA )。
細胞培養(yǎng)基的pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩(osmolality)原則上并非關鍵，它們取決于所選用的細胞的類型。優(yōu)選地，pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩被選擇為使得對于細胞的生長和生產力來說是最佳的。本領域技術人員知道如何找到培養(yǎng)物的最佳pH、溫度、溶解氧濃度和同滲容摩(見，例如WO 2004/099396)。優(yōu)選地，對于本發(fā)明的工藝而言，當使用El永生化的HER細胞時，選用6.6至7.6之間的pH，禾口/或選用30至39°C之間的溫度和/或選用260至400 mOsm/kg之間的同滲容摩。為保持最佳工藝條件，對工藝條件控制的自動化是人們想要的。為了對工藝條件進行優(yōu)化，例如為了獲得生長阻礙用于增加細胞生產力，在培養(yǎng)期間，可應用培養(yǎng)條件的變更。這可例如通過溫度變更(例如從37至32°C) 、 pH變更或同滲容摩變更來實現(xiàn)。
本發(fā)明的工藝原則上可以在適于培養(yǎng)細胞的任何類型的細胞培養(yǎng)基上進行。選擇細胞培養(yǎng)基和細胞培養(yǎng)條件的指導是公知的，例如被提供于Freshney, R. I. Culture of animal cells (a manual of basic techniques),她edition 2000, Wiley-Liss and in Doyle, A.， Griffiths, J. B., Newell， D. G. Cell&Tissue culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons的第8禾口 9章中。
例如，細胞培養(yǎng)基可例如包含碳水化合物來源、鹽和/或氨基酸和/或 維生素和/或脂類和/或去垢劑和/或緩沖劑和/或生長因子和/或激素和/或細 胞因子和/或痕量元素作為細胞培養(yǎng)基組分。碳水化合物來源的例子包括葡
萄糖、果糖、半乳糖和丙酮酸鹽。鹽的例子包括鎂鹽，例如
MgCl2.6H20、 MgS04和MgS04.7H2Q，鐵鹽，例如FeS04.7H20，鉀鹽， 例如KH2P04、 KC1;鈉鹽，例如NaH2P04、 Na2HP04，和f丐鹽，例如 CaCl2.2H20。氨基酸的例子包括所有已知的形成蛋白質的氨基酸，例如組 氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、甲硫氨酸。維生素的例子包括抗壞血酸鹽、 生物素、膽堿氯、肌醇、D-泛酸鹽、核黃素。脂類的例子包括脂肪酸， 例如，亞油酸和油酸；去垢劑的例子包括Tween⑧80和Pluronic F68。緩 沖劑的例子包括HEPES和Na2C03。生長因子/激素/細胞因子的例子包括 IGF (胰島素樣生長因子)、腎上腺皮質素和(重組)胰島素。痕量元素 的例子是本領域技術人員已知的，其包括Zn、 Mg和Se。細胞培養(yǎng)基還可 例如包含其它細胞培養(yǎng)基組分，例如大豆蛋白胨或乙醇胺。
為按照本發(fā)明來生產生物物質，特別是如果生物物質將要用作為藥物 制劑中的活性成分的話，不含血清的培養(yǎng)基相對含血清來源的培養(yǎng)基是優(yōu) 選的。其理由是血清來源的培養(yǎng)基可能被病毒污染，存在朊性
(prionic)感染的風險，并且可能對生物藥物產品的下游加工(即，從細 胞培養(yǎng)物中對生物物質的進一步純化)造成大的障礙。因此，本發(fā)明的工 藝優(yōu)選在不包含來自動物(包括人)來源的血清的細胞培養(yǎng)基中進行。鑒 于來自哺乳動物來源的化合物也存在感染風險，因此，優(yōu)選地，細胞培養(yǎng) 基是非哺乳動物來源的，即，細胞培養(yǎng)基不包含來自哺乳動物來源的血清 或組分。更優(yōu)選地，細胞培養(yǎng)基是非動物來源的，S卩，細胞培養(yǎng)基不包含 來自動物(包括人)來源的血清或組分?？捎糜谂囵B(yǎng)PER.C6細胞的不含 血清的培養(yǎng)基的例子包括可商業(yè)獲得的培養(yǎng)基，例如，EX Cell VPRO培 養(yǎng)基(SAFC ) 、 HyQ CDM4RetinoTM (HyClone) 、 IS ProVec CD
(Irvine scientific) 、 293-SFMII (invitrogen)。在一些優(yōu)選實施方式中，從其中內含物被保持在反應器中或優(yōu)選被回 送進反應器的流來收獲本發(fā)明的工藝中產生的生物物質，或從由反應器移 出的細胞培養(yǎng)物中收獲，或者從兩者中收獲。還可在所謂的下游加工中使 用取決于生物物質的方法(所述方法是技術人員公知的)，從細胞培養(yǎng)物 中收獲本發(fā)明工藝中產生的生物物質。下游加工通常包含以各種組合和順 序進行的若干純化步驟。下游加工中純化步驟的例子是分離步驟(例如， 通過親和色譜和/或離子交換色譜和/或通過水性兩相系統(tǒng)萃取和/或通過例 如硫酸銨沉淀)、用于濃縮生物物質的步驟(例如通過超濾或滲濾)、用 于更換緩沖液的步驟和/或用于移出或滅活病毒的步驟(例如，通過病毒過
濾、pH變更或溶劑去垢劑處理)。
在一個方面，本發(fā)明涉及包含哺乳動物細胞，優(yōu)選El-永生化的HER 細胞，更優(yōu)選PER.C6細胞的細胞培養(yǎng)物，其具有至少50乂106個細胞 /mL，優(yōu)選至少60Xl()S個細胞/mL，特別是至少90X 106個細胞/mL的存 活細胞密度以及至少5g/L，更優(yōu)選至少10g/L,特別是至少llg/L的生物 物質濃度。原則上生物物質的濃度可高達至生物物質的溶解度所允許的程 度。存活細胞的濃度典型地不超過200Xl(^個細胞/mL，優(yōu)選在80-150X 1()S個細胞/mL的范圍內。
存活細胞密度例如可這樣來測定使用臺盼藍排除方法，例如通過使 用細胞計數(shù)器(可從例如Innovatis (Cedex細胞計數(shù)器)商業(yè)獲得)來進 行。
細胞培養(yǎng)物表示包含細胞培養(yǎng)基、細胞和生物物質的液體，所述液體 是在反應器中在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞的工藝的結果，其中，所述細胞產 生所述生物物質。
現(xiàn)在將通過下述實施例來闡述本發(fā)明，但下述實施例并不對本發(fā)明加 以限制。
附圖描述


圖1顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和Cl (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (10S.mr1)對工藝時間X (天)的作圖。圖2顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和Cl (本發(fā)明的工
藝)的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝A中的IgG濃度的。/。)對工藝 時間X (天)的作圖。
圖3顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C2 (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (10氣mr1)對工藝時間X (天)的作圖。
圖4顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C2 (本發(fā)明的工 藝)的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝A中的IgG濃度的。/。)對工藝 時間X (天)的作圖。
圖5顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C3 (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (106.1111—1)對工藝時間X (天)的作圖。
圖6顯示了針對工藝A和C3的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝 A3中的IgG濃度的。/。)對工藝時間X (天)的作圖。
圖7顯示了針對工藝A、 B和C3的累積產率Q (相對于工藝A中的 產率的％，每升反應器體積)對工藝時間X (天)的作圖。
圖8顯示了針對工藝C4 (本發(fā)明的工藝)的細胞數(shù)量Y (10氣mr1) 對工藝時間X (天)的作圖。
圖9顯示了針對工藝C4 (本發(fā)明的工藝的一種實施方式)的反應器Z 中的IgG濃度(相對于達到的最大IgG濃度的。/。)對工藝時間X (天)的 作圖。
實施例
實施例l:對分批工藝、補料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較 在該實施例中，將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補料分批工藝相 比較。
圖1顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和Cl (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (1()S.mr1)對工藝時間X (天)的作圖。
圖2顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和Cl (本發(fā)明的工 藝)的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝A中的IgG濃度的。/。)對工藝 時間X (天)的作圖。所有發(fā)酵都采用SartoriusBiostatB控制器，將溫度控制為36.5°C， pH 控制為7.2至6.8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200 rpm條件下進 行。在所有實驗中都使用相同的產生IgG的PER.C6細胞系(見WO 2004/099396)。
分批工藝A
分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以3X 10e5個細胞/mL接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基 (SAFC)中，隨后培養(yǎng)17天。
補料分批工藝B
補料分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以 3X10e5個細胞/mL接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基 (SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超 過15 mM和1 mM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補充消耗的氨基酸。
本發(fā)明的工藝Cl
本發(fā)明的工藝在2 L Applikon容器中進行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有100 kDa分子量分離點(MWCO) 的中空纖維膜(從General Electric (GE)獲得)被用于保留細胞和IgG產 物。培養(yǎng)以補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X 10e5個細胞/mL開始。使用0.05至0.2 nL/細胞/天之間的比流速 (SFR)，經由懸浮細胞培養(yǎng)物灌注補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培 養(yǎng)基(SAFC)。獲得的最高產物濃度為1.4g/L。
本發(fā)明的工藝較之前文提到的培養(yǎng)模式而言，以較少的時間產生了增 加的存活細胞密度以及增加的產物濃度，這可從圖1和圖2中看到。
實施例2:對分批工藝、補料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較 在該實施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的工藝的表現(xiàn)與分批和補料分批工
18藝相比較；在工藝C2中，C02壓力被控制，并且使用50 kDa的分離系統(tǒng)。
圖3顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C2 (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (1()S.mr1)對工藝時間X (天)的作圖。
圖4顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C2 (本發(fā)明的工 藝)的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝A中的IgG濃度的。/。)對工藝 時間X (天)的作圖。
所有發(fā)酵都采用SartoriusBiostatB控制器，將溫度控制為36.5°C， pH 控制為7.2至6.8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200 rpm條件下進 行。在所有實驗中都使用相同的產生IgG (大約150kDa)的PER.C6細胞 系(見WO 2004/099396)。
分批工藝A
分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以3X 1()S個細胞.mi;1接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC) 中，隨后培養(yǎng)17天。
補料分批工藝B
補料分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以 3X 105個細胞.mL—1接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基 (SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超 過15 mM和1 mM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補充消耗的氨基酸。
本發(fā)明的工藝C2
本發(fā)明的工藝在2 L Applikon容器中進行。用ATF-2系統(tǒng)(Refme Technology)以ATF流模式操作的具有50 kDa分子量分離點(MWCO) 的中空纖維膜(GE)被用于保留細胞和IgG產物。培養(yǎng)以補充有6mML-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X10e5個細胞/mL開始。使用 0.05至0.2 nL.細胞".天"之間的SPR，經由懸浮細胞培養(yǎng)物灌注補充有6mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC) 。 C02壓力被控制為低于 15%。
結果
如從圖3和圖4可見，根據(jù)本發(fā)明的工藝在相等或更短的時間(分批 時間的100%;補料分批時間的81%)內產生了顯著增加的存活細胞密度 和增加的產物濃度(2415。/。x分批的產率；690。/。x補料分批的產率)。
本發(fā)明工藝總生產力(以g丄".天-1)的增加是分批生產力(以g丄—1. 天—"的23.9倍，是補料分批生產力(以g丄—.天—1)的8.5倍。在本發(fā)明的 工藝C2中，產生了 11.1g產物/L。 17天期間沒有發(fā)生駐留設備的阻塞， 即使是非常高細胞密度的情況下。
實施例3:對分批工藝、補料分批工藝和根據(jù)本發(fā)明的工藝之間的比較
在該實施例中，再次將根據(jù)本發(fā)明的采用細胞培養(yǎng)物移出的工藝的表 現(xiàn)與分批和補料分批工藝相比較；在工藝C3中，移出了細胞培養(yǎng)物。
圖5顯示了針對工藝A (分批)、B (補料分批)和C3 (本發(fā)明的工 藝)的存活細胞密度Y (10氣mr1)對工藝時間X (天)的作圖。
圖6顯示了針對工藝A和C3的反應器Z中的IgG濃度(相對于工藝 A3中的IgG濃度的。/。)對工藝時間X (天)的作圖。
圖7顯示了針對工藝A、 B和C3的累積產率Q (相對于工藝A中的 產率的％，每升反應器體積)對工藝時間X (天)的作圖。
所有發(fā)酵都采用SartoriusBiostatB控制器，將溫度控制為36.5°C， pH 控制為7.2至6.8之間，在DO為50%空氣飽和度以及200 rpm條件下進 行。在所有實驗中都使用相同的產生IgG (大約150kDa)的PER.C6細胞 系(見WO 2004/099396)。
分批工藝A
分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以3X 1()S個細胞.mL"接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)
20中，隨后培養(yǎng)17天。 補料分批工藝B
補料分批工藝以4 L的工作體積在Sartorius B5容器中進行。將細胞以 3X 105個細胞.ml/1接種于補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基 (SAFC)中。在培養(yǎng)期間，加入葡萄糖和谷氨酰胺，以保持濃度分別超 過15 mM和1 mM。從第5天起添加氨基酸和肽，以補充消耗的氨基酸。
本發(fā)明的工藝C3
本發(fā)明的工藝在2 L Applikon容器中進行。用ATF-2系統(tǒng)(Refme Technology)以ATF流模式操作的具有100 kDa分子量分離點(MWCO) 的中空纖維膜(GE)被用于保留細胞和IgG產物。培養(yǎng)以補充有6 1111^]:-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)中的3X10e5個細胞/mL開始。使用 0.05至0.2 nL.細胞".天"之間的SPR，經由懸浮細胞培養(yǎng)物灌注補充有6 mM L-谷氨酰胺的VPRO培養(yǎng)基(SAFC)。當存活細胞密度大于10X106 個細胞.mL—4寸，每天以工作體積的10%移出細胞培養(yǎng)物，當存活細胞密度 超過30Xl(^個細胞.mL"時，每天以工作體積的30%移出細胞培養(yǎng)物。
結果
如可從圖5看到的，采用本發(fā)明的工藝，快速達到了更高的存活細胞 密度。此外，圖5還顯示，采用本發(fā)明的工藝細胞的存活性可保持更長時 間，例如工藝C3保持運行了接近40天，因為即使在高細胞密度的情況下 也不會發(fā)生對駐留設備的阻塞。
圖6顯示，本發(fā)明工藝的產物濃度要比分批工藝中的產物濃度高得 多。以分批工藝A中終濃度的大約200%至250%倍從工藝C3收獲了含有 產物的產物流。
圖7顯示，本發(fā)明的工藝形成了最多的產物，并且本發(fā)明的工藝能比 分批工藝A和補料分批工藝B保持更長的時間。在第17天，工藝C3的累 積產率為分批工藝(A3)累積產率的8.1倍，是補料分批工藝(B)累積產率的2.1倍。此外，在第17天，分批工藝終止。在第21天，工藝C3的 累積產率是補料分批工藝B的累積產率的3.0倍。在第21天，補料分批工 藝終止。39天后，工藝C3的總累積產率是分批工藝A累積產率的25 倍，是補料分批工藝B產率的6倍。
從該實驗可以推斷出，在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，當細胞密度超過一定 高水平后，可通過應用細胞培養(yǎng)物的移除，來進一步提高想要的生物材料 的總產率。
實施例4:培養(yǎng)和生產CHO細胞
在該實施例中，采用生產IgG的CHO細胞系來進行了根據(jù)本發(fā)明的 工藝，其中包括溫度降低以減少細胞生長。
圖8顯示了針對工藝C4 (本發(fā)明的工藝)的細胞數(shù)量Y (106.1111—1) 對工藝時間X (天)的作圖。
圖9顯示了針對工藝C4 (本發(fā)明的工藝的一種實施方式)的反應器Z 中的IgG濃度(相對于達到的最大IgG濃度的。/。)對工藝時間X (天)的 作圖。
發(fā)酵采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36.5°C， pH控制 為7.1至6.9之間，在DO為40%空氣飽和度以及100 rpm條件下進行。溫 度在第5天降低至32°C。
本發(fā)明的工藝C4
本發(fā)明的工藝在2 L Applikon容器中進行。用ATF-2系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有50 kD分子量分離點(MWCO)的 中空纖維膜(General Electric)被用于保留細胞和IgG產物。培養(yǎng)以 MTCM-49培養(yǎng)基(Hyclone)中的5 X 1()6個細胞/mL開始。使用0.1至0.4 nL.細胞—、天"之間的SPR,經由懸浮細胞培養(yǎng)物灌注培養(yǎng)基。C02壓力被 控制為低于15%。
結果數(shù)據(jù)顯示，使用產生蛋白的CHO細胞系時，本發(fā)明的工藝同樣能夠 工作。獲得的細胞密度和產物濃度較之分批培養(yǎng)有所增加。數(shù)據(jù)還顯示， 在根據(jù)本發(fā)明的工藝中，細胞生長可被阻礙(例如，通過溫度降低)，而 培養(yǎng)系統(tǒng)中的產物積累能夠繼續(xù)。
實施例5:采用骨髓瘤細胞系進行的本發(fā)明的工藝 根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應用到骨髓瘤細胞系上。為達到此目的，發(fā)酵
采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為36.5°C， pH控制為7.2至 6.8之間，在DO為40%空氣飽和度以及100 ipm條件下進行。培養(yǎng)以在5 L Sartorius容器中的SFM4Mab培養(yǎng)基(Hyclone)中以3X10e5個細胞 /mL接種骨髓瘤細胞開始。細胞和產物駐留設備是用ATF-4系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操作的具有30 kD分子量分離點(MWCO)的 中空纖維膜(General Electric)。使用0.1至0.4 1^.細胞-1.天-1之間的 SPR，經由懸浮細胞培養(yǎng)物灌注SFM4Mab培養(yǎng)基(Hydone) 。 (302壓力 被控制為低于15%。
實施例6:采用MDCK細胞系進行的本發(fā)明的工藝 根據(jù)本發(fā)明的工藝還可應用到懸浮液中的經轉化的MDCK細胞系 上。為達到此目的，發(fā)酵采用Sartorius Biostat B控制器，將溫度控制為 36.5°C， pH控制為7.2至6.8之間，在DO為40%空氣飽和度以及100 rpm 條件下進行。培養(yǎng)以在5 L Sartorius容器中的VP-SFM培養(yǎng)基 (Invitrogen)中以3 X 10e5個細胞/mL接種經轉化的MDCK細胞開始。細 胞和產物駐留設備是用ATF-4系統(tǒng)(Refine Technology)以ATF流模式操 作的具有30 kD分子量分離點(MWCO)的中空纖維膜(General Electric)。使用0.1至0.4 nL.細胞".天—1之間的SPR，經由懸浮細胞培養(yǎng) 物灌注VP-SFM培養(yǎng)基(Invitrogen) 。 (302壓力被控制為低于15%。
2權利要求
1. 在反應器中于細胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細胞的工藝，其中，所述細胞產生生物物質，其中，向細胞培養(yǎng)物補料至少一種細胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含所述細胞、所述生物物質和所述細胞培養(yǎng)基的所述細胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將所述生物物質與比所述生物物質分子量更低的物質分開，并且，其中，所述生物物質保留在所述反應器中或被回送進所述反應器。
2. 根據(jù)權利要求1的工藝，其中，分子量更低的所述物質的一部分持 續(xù)從所述細胞培養(yǎng)物中移出。
3. 根據(jù)權利要求1-2的工藝，其中，所述細胞是哺乳動物細胞，優(yōu)選 是E1-永生化的HER細胞，更優(yōu)選是PER,C6細胞。
4. 根據(jù)權利要求1-3的工藝，其中，所述生物物質是重組蛋白，優(yōu)選 是抗體。
5. 根據(jù)權利要求1-4中任意一項所述的工藝，其中，所述分離系統(tǒng)是 過濾器，優(yōu)選是膜過濾器，更優(yōu)選是中空纖維過濾器。
6. 根據(jù)權利要求5的工藝，其中，所述細胞培養(yǎng)物在所述過濾器上以 交叉流循環(huán)，優(yōu)選以交互切向流循環(huán)。
7. 根據(jù)權利要求1-6中ffit—項所述的丄藝，其中，至少進行一次從 所述反應器移出細胞培養(yǎng)物的操作，并且，向所述反應器添加液體，優(yōu)選 添加細胞培養(yǎng)基，以補償所述細胞培養(yǎng)物的移出。
8. 根據(jù)權利要求1-7中任意一項所述的工藝，其中，細胞培養(yǎng)條件被 選擇為使得所述細胞的比生產力和/或細胞生長速率不受限制。
9. 根據(jù)權利要求8的工藝，其中，所述細胞培養(yǎng)條件被選擇為使得 所述細胞培養(yǎng)基的所述組分中的至少一種的濃度保持恒定。
10. 根據(jù)權利要求l-9中任意一項所述的工藝，其中，至少消耗的營養(yǎng) 物被部分補充或優(yōu)選全部補充，這通過向所述反應器補料這些營養(yǎng)物來實 現(xiàn)。
11. 根據(jù)權利要求1-10中任意一項所述的工藝，其中，任選地，從所 述細胞和/或從所述細胞培養(yǎng)物收獲所述生物物質。
12. 包含哺乳動物細胞的細胞培養(yǎng)物，其具有至少50 X 1()S個細胞/mL 的存活細胞密度以及至少5 g/L的生物物質濃度。
13. 根據(jù)權利要求12的細胞培養(yǎng)物，其中，所述生物物質濃度為至少 10g/L，優(yōu)選至少11 g/L。
14. 根據(jù)權利要求12-13的細胞培養(yǎng)物，其中，所述哺乳動物細胞是 E1-永生化的HER細胞，優(yōu)選是PER,C6細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及在反應器中于細胞培養(yǎng)基中于懸浮液中培養(yǎng)細胞，優(yōu)選E1-永生化的HER細胞，更優(yōu)選PER.C6細胞的工藝，其中，細胞產生生物物質，優(yōu)選產生抗體，其中，向細胞培養(yǎng)物補料至少一種細胞培養(yǎng)基組分，并且，其中，包含細胞、生物物質和細胞培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物在分離系統(tǒng)上循環(huán)，并且，其中，所述分離系統(tǒng)將生物物質與比所述生物物質分子量更低的物質分開，并且，其中，所述生物物質保留在反應器中或被回送進反應器。優(yōu)選地，更低分子量的物質的一部分持續(xù)從細胞培養(yǎng)物中移出。
文檔編號C12M1/12GK101490239SQ200780026810
公開日2009年7月22日 申請日期2007年7月4日 優(yōu)先權日2006年7月14日
發(fā)明者格本·梅勒·茲吉爾斯特瑞, 羅伯特·帕特里克·浩弗, 雅各布·史德勒 申請人:帝斯曼知識產權資產管理有限公司