專利名稱：水解的卵蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及降低卵蛋白變應(yīng)原性的方法。
背景技術(shù)：
在大部分情況下，食物變態(tài)反應(yīng)主要由與食物中蛋白質(zhì)的反應(yīng)引起， 所述食物變態(tài)反應(yīng)中最常見的是牛乳變態(tài)反應(yīng)。在生命的早幾年中，免疫 系統(tǒng)仍在發(fā)育并且可能不能識別和耐受這樣的膳食蛋白質(zhì)。結(jié)果是嬰兒或 兒童或年幼動物將膳食蛋白質(zhì)作為外源物質(zhì)對待，并對其產(chǎn)生變應(yīng)性應(yīng)答。 食物變態(tài)反應(yīng)可不僅影響人，而且影響其他動物如犬和貓。
通常，食物過敏性反應(yīng)僅出現(xiàn)在易感的嬰兒、兒童或年幼動物第一次 遭遇新食物后。人類嬰兒普遍遭遇的第 一種膳食蛋白質(zhì)至少為牛乳蛋白質(zhì)， 并且如上所述，牛乳變態(tài)反應(yīng)是最常見的食物變態(tài)反應(yīng)。普遍接受的是具 有確定的牛乳變態(tài)反應(yīng)的嬰兒具有提高的對其他膳食蛋白質(zhì)如卵蛋白和谷 物蛋白發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險，但是當(dāng)這些膳食蛋白質(zhì)被引入斷奶膳食中時， 即便是已經(jīng)成功地對牛乳蛋白質(zhì)產(chǎn)生口服耐受的那些嬰兒仍可隨后發(fā)生對 這些膳食蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)。
從膳食的觀點來看，存在治療確定的變態(tài)反應(yīng)的兩種途徑或者必須 完全避免含有變應(yīng)原的食物，或者必須處理食物以降低其變應(yīng)原能力，例 如通過充分水解進(jìn)行。為后一目的制備含有^f皮充分水解的牛乳蛋白質(zhì)(由 不多于五種氮基酸組成的肽)的嬰兒配方。
已經(jīng)提出含更少的廣泛水解的牛乳蛋白的嬰兒配方幫助降低發(fā)生牛乳 變態(tài)反應(yīng)的風(fēng)險，尤其是對于被認(rèn)為處于該風(fēng)險的兒童(即具有至少一個 親近的家庭成員遭受變態(tài)反應(yīng)的兒童)。這類產(chǎn)品通常4皮描述為低變應(yīng)原性 的，該術(shù)語在歐洲導(dǎo)則^M/EC(Eur叩ean Directive MA4/EC)中在乳的語境中被定義為含有水解蛋白質(zhì)，所述水解蛋白質(zhì)的變應(yīng)原性比未水解蛋白質(zhì)
的變應(yīng)原性低至少100倍。制^f氐變應(yīng)原性牛乳蛋白質(zhì)的一種方法描述于 美國專利號No. 5,039,532中。
已提出了降低牛乳蛋白質(zhì)變應(yīng)原性的許多其他途徑，但是通過與之比 較，對頻繁引發(fā)變應(yīng)性反應(yīng)的其他膳食蛋白質(zhì)(如卵蛋白)關(guān)注相對較少。 卵是高品質(zhì)蛋白質(zhì)的極好來源，所述高品質(zhì)蛋白質(zhì)通常占卵的可食部分按 重量計的約12%。卵不僅可以以其天然狀態(tài)被消耗(例如作為煮蛋或荷包 蛋或煎蛋)，而且也通常為了營養(yǎng)和功能兩種目的被用作其他食品中的成 分。例如，在例如意大利面(pasta)的盤裝茱里卵可被用作著色劑和結(jié)合 劑，并在例如布丁、乳蛋餅(quiche)和沙司的盤裝菜中被用作增稠劑和膠凝 劑。
然而，卵蛋白尤其是卵清蛋白已與變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生相關(guān)。事實上，考 慮到對牛乳蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)通常在2和5歲的年齡之間自發(fā)消失而對卵 蛋白的變態(tài)反應(yīng)一般較晚消失并甚至可以持續(xù)終生，卵蛋白變應(yīng)原性的降 低可以是比牛乳蛋白變應(yīng)原性降低甚至需要更大。因此，本發(fā)明的一個對 象；
p口,
發(fā)明概述
因此，本發(fā)明提供了制備酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步 驟，其中由第一蛋白酶對完整的卵蛋白進(jìn)行酶水解；中間加熱步驟，其中 第一水解的產(chǎn)物4皮加熱至不超過75。C的溫度；第二水解步驟，其中由第二 蛋白酶對中間加熱步驟的產(chǎn)物進(jìn)行酶水解；和失活步驟，其中第二水解的 產(chǎn)物被加熱至85和90'C之間的溫度，并在該溫度下維持至少30分鐘。
本發(fā)明還擴展至包含水解的卵蛋白的含卵意大利面(egg pasta)產(chǎn)品。 例如，該產(chǎn)品可含有50到85%面粉、5到15%水解全卵和10到40%水。
附圖概述


圖1顯示印水解產(chǎn)物殘余的OVA-特異的抗原性。圖2顯示功能性肥大細(xì)胞觸發(fā)(trigger)測定中降低的變應(yīng)原性。 發(fā)明詳述
在該說明書中，以下的術(shù)語具有以下的含義
蛋白質(zhì)的"水解度，，或"DH，，表示游離NH2基團(tuán)中的氮數(shù)量除以總 氮數(shù)量(NH和NH2基團(tuán))，以百分比表達(dá)；
"水解全卵"表示全卵，其中卵蛋白已^皮部分水解； "低變應(yīng)原性水解全卵"表示水解的全卵，其中水解卵蛋白具有比未 水解卵蛋白的變應(yīng)原性低至少IOO倍的變應(yīng)原性；
"低變應(yīng)原性卵蛋白"表示水解的卵蛋白，其變應(yīng)原性比未水解的卵 蛋白低至少100倍。
除非另有說明，所有涉及的百分比均是按重量計的百分比。 第一蛋白酶可選自來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和 地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)的細(xì)菌蛋白酶或其混合物、胰蛋白酶 和胰酶制劑。
第二蛋白酶可選自來自地衣芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶、來自米曲霉 (Aspergillus oryzae)的真菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶制劑。
來自解淀粉芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶的一個實例是以商標(biāo)名Neutrase 出售的酶。來自地衣芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶#:稱作枯草桿菌蛋白酶，該酶 的一個實例以商標(biāo)名Alcalase⑧出售。來自解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿 菌的細(xì)菌蛋白酶的混合物的一個實例是以商標(biāo)名Protamex 出售的酶混合 物。來自米曲霉的真菌蛋白質(zhì)的一個實例是以商標(biāo)名Flavourzyme 出售 的酶。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，胰酶制劑是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 的混合物，其可得自豬的胰腺，且胰蛋白酶自身尤其可得自胰腺。
尤其優(yōu)選的第一和第二蛋白酶的組合是來自解淀粉芽孢桿菌和地衣芽 孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶作為第一蛋白酶，和來自米曲霉的真菌蛋白酶作為第 二蛋白酶?；蛘撸墒褂每莶輻U菌蛋白酶作為第一蛋白酶和第二蛋白酶。
用于本發(fā)明方法的起始材料是任何便利的液體形式的完整卵蛋白。合適的起始材料的一個實例是巴氏滅菌的液體全卵。本發(fā)明的方法可在第一
水解步驟前包含額外的預(yù)加熱步驟。預(yù)加熱可在不超過65'C的溫度下進(jìn)行2到15分鐘。
進(jìn)行第 一和第二水解步驟的溫度和這些步驟的持續(xù)時間以及待使用的笫一和第二蛋白酶的用量將由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于下述因素決定終產(chǎn)物
的期望水解度和本領(lǐng)域公知的選定的蛋白酶的特性。然而，作為普遍性的規(guī)則，所需要的水解度越大，則蛋白酶越強，水解的持續(xù)時間越長且使用的蛋白酶濃度越大。例如，為了獲得具有20和25%之間DH的水解產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)在各水解步驟中使用2到10%的賴以待水解的起始材料重量為基礎(chǔ))且各水解步驟應(yīng)當(dāng)持續(xù)約兩個小時。特定的酶組合可包括以下(為了簡潔
的目的，僅^f吏用示例的細(xì)菌和真菌起源酶的商品名)
第一蛋白酶Protamex 5%Protamex 2%Alcalase 10%Alc由sc 5%Alcalase 5-10%Alcalase 5-10%Neutrase 5 - 10%Neutrase 5-10%Trypsin 1-5%Trypsin 1 -5%Pancreatin 1 -5%Pancreatin 1 -5%
第二蛋白酶Flavourzyme 5%Flavourzyme 2%Alcalase 10%Alc由se 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%Flavourzyme 5%Protamex 5%
Flavourzyme 5%
同樣，應(yīng)根據(jù)所使用的蛋白酶選擇進(jìn)行水解步驟的溫度，因為酶活性的最適溫度是酶特異的。酶的制造商會給出該情況的足量指導(dǎo)。
苦味可以是一些蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的問題，且發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)某些蛋白酶和蛋白酶的組合在這點上給出了尤其好的結(jié)果。將來自解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶的組合作為第一蛋白酶，和來自米曲霉的真菌蛋白酶作為第二蛋白酶是尤其優(yōu)選的就是因為這個原因。還發(fā)現(xiàn)使用這兩
種酶時，通過分次添加第二蛋白酶(從而10到60%的第二蛋白酶在中間加熱步驟期間添加，而剩余的第二蛋白酶在完成中間加熱步驟后添加)可制備下述水解產(chǎn)物，所述水解產(chǎn)物具有感官特性和降低的變應(yīng)原性的尤其好的組合。
通過Fritsch6等(Int. Arch. Aller and Appl Imm.， 93， 289-293， 1990)所
述的技術(shù)測量發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明的方法制備的水解卵蛋白具有與完整卵蛋白相比降低至少IOO倍的變應(yīng)原性。這些水解卵蛋白和含有它們的水解全卵因此4皮描述為低變應(yīng)原性的。
根據(jù)本發(fā)明的方法制備的低變應(yīng)原性水解全卵是均一液體的形式。其可作為液體^f吏用或以本領(lǐng)域已知的方式(如滾筒干燥、噴霧干燥或冷凍干燥)干燥產(chǎn)生均一粉末，所述粉末是貨架穩(wěn)定的并可儲存直至需要。當(dāng)用水重溶該粉末時，其再次形成均一的液體。
水解全卵可在常規(guī)摻入全卵的任何食品中代替全卵使用。例如，粉末或液體形式的水解全卵可代替全卵在如烘焙的蛋撻(custard)、乳蛋餅、焦糖布丁(creme caramel)、蛋糕餅干和諸如米布丁(rice pudding)的布丁的配方使用?；蛘?，水解全卵在用水重溶(如果需要的話)后用于制備盤裝菜如煎蛋和炒蛋。低變應(yīng)原性的水解全卵是尤其合適的嬰兒和幼兒食物成分，尤其是適用于斷奶早期階段的食物中。水解全卵也可以代替常規(guī)用于制備這類產(chǎn)物的全卵使用。
如上所述，對膳食蛋白質(zhì)的變態(tài)反應(yīng)不僅限于人，且通過本發(fā)明的方法制備的水解卵也可以用于制造下述食品，所述食品用于動物，尤其是伴倡動物如犬和貓。因此水解卵也可以用于代替下述食物中的全卵，所述食物旨在用于例如斷奶中的幼犬和幼貓。
本發(fā)明還擴展至包含水解的卵蛋白的含卵意大利面食(egg pastaproduct)。例如，該產(chǎn)品可含有50到85%面粉、5到15%水解全卵和10到40%水。優(yōu)選面粉是粗粒^t^小麥粉(durum wheat semolina flour )?？梢匀缦轮苽湟獯罄媸硨⒎勰┬问降乃馊雅c水摻在一起，然后將面粉與卵和水混合，并將得到的混合物擠塑為期望的形狀，如通心粉(macaroni)、意大利干面條(tagliatelle)、殼瓣(shell)、意大利式細(xì)面條(spaghetti)等。
可以將擠出的形狀漂白、用油涂布、速凍、填充進(jìn)合適的容器中并儲存在制冷器中，例如在-25'C下直至需要。本發(fā)明的冷凍意大利面的典型組成可以是56,5%粗粒硬質(zhì)小麥(粉)、6，2%水解全卵、34.6%水和2.7%葵花子油。
或者，可以將擠出的形狀漂白、用油涂布、填充進(jìn)合適的容器中并冷藏在例如5到7'C下。本發(fā)明的冷藏意大利面的典型組成可以是53.7%粗粒硬質(zhì)小麥(粉)、8.9%水解全卵、34.8%水和2.7%葵花子油。
或者，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將擠出的形狀干燥、填充進(jìn)合適的容器中并儲存于室溫下直至需要。本發(fā)明的干燥意大利面的典型組成可以是80.4。/。粗粒硬質(zhì)小麥(粉)、7.6%水解全卵和12.0%水和2.75葵花子油。
現(xiàn)在將參考以下的實施例進(jìn)一 步描述本發(fā)明。
制備卵水解產(chǎn)物
初始材料為經(jīng)巴氏滅菌的全卵，F(xiàn)T/OVO/0105 R， ABCD S. A.， AvicoleBretonne Cecab Distribution (Plogrmel，法國)。
實施例1
將30 Kg液態(tài)全卵在65'C加熱10分鐘并以250轉(zhuǎn)/分鐘攪拌。冷卻至55。C后，添加2% Protamex⑧酶(批次PW2A1006， NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麥)并將混合物在55。C保持2小時。在該第一步水解步驟后，添加1% Flavourzyme 1000 L酶(批次400904， NOVOZYMES A/SBagsvaerd,丹麥)并將混合物在75"C加熱10分鐘。然后將混合物冷卻至55°C ，再添加1 % Flavourzyme酶并將混合物在55。C保持2小時。該第二水解步驟后，將混合物在卯X:加熱30分鐘然后噴霧千燥獲得水解卵粉，所述卵粉保存于鋁袋中。
實施例2
將35Kg液態(tài)全卵在65。C加熱10分鐘并以250轉(zhuǎn)/分鐘攪拌。冷卻至55。C后，添加5% Protamex⑧酶(批次PW2A1006, NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麥)并將混合物在55。C保持2小時。在該第一步水解步驟后，添加1% Flavourzyme 1000 L酶(批次400卯4， NOVOZYMES A/SBagsvaerd，丹麥)并將混合物在75。C加熱10分鐘。然后將混合物冷卻至55°C,再添加4% Flavourzyme酶并將混合物在55。C保持2小時。該第二水解步驟后，將混合物在9(TC加熱30分鐘然后噴霧干燥獲得水解卵粉，所述卵粉保存于鋁袋中。
實施例3
將30 Kg液態(tài)全卵在65。C加熱10分鐘并以250轉(zhuǎn)/分鐘攪拌。冷卻至55。C后，添加10% Alcalase⑧2.4L酶(批號500357， NOVOZYMES A/SBagsvaerd,丹麥)并將混合物在55。C保持2小時。在該第一步水解步驟后，將混合物在75。C加熱10分鐘。然后將混合物冷卻至55°C，再添加10%Alcalase酶并將混合物在55。C保持2小時。該第二水解步驟后，將混合物在卯。C加熱30分鐘然后噴霧干燥獲得水解卵粉，所述卵粉保存于鋁袋中。
通過Dumas步驟(Carlo Erba方法)測定水解產(chǎn)物中的總氮。通過根據(jù)Adler畫Nissen的TNBS方法(J. Agric. Food. Chem. 1979 27: 1256-1262)測量水解度。發(fā)現(xiàn)實施例1的水解產(chǎn)物具有20。/。的DH，實施例2的水解產(chǎn)物具有23%的DH，且實施例3的水解產(chǎn)物具有25%的DH。
含有水解全印的產(chǎn)物實施例4
含水解印的甜卵布丁的成分的一個實例如下成分 ％
全乳(3.5 %脂肪) 62.0
水 24.3
糖 5.5
低變應(yīng)原性卵粉 2.5
玉米淀粉 3.0
木薯淀粉 2.0
香草矯味劑 0.7
可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法制備布丁 。
實施例5
含水解卵的可口卵布丁的成分的一個實例如下:
成分 ％
全乳(3.5%脂肪) 62.0
水 21.5
冷凍胡蘿卜塊 10.0
低變應(yīng)原性卵粉 1.5
玉米淀粉 3.0
木薯淀粉 2.0
可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法制備布丁 。
實施例6
含水解卵的含卵意大利面產(chǎn)物的成分的一個實例如下
成分 ％
粗粒硬質(zhì)小麥(粉) 72
水 22
低變應(yīng)原性卵粉 6
可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法制備意大利面。
10卵7JC解產(chǎn)物的殘余抗原性
用多克隆兔抗OVA蛋白抗血清通過ELISA抑制測定實施例1、 2和3 的水解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)卵清蛋白(OVA)的殘余抗原性。用碳酸鹽-碳酸氫鹽 緩沖液中50 ng/ml的OVA (100 fd)包被」微量滴定板的孔，并在4'C下孵 育24小時。將平板在PBS-Tween緩沖液中洗滌4次，通過添加200^1/孔 魚明膠(PBS-Tween中0.5% )封閉游離的反應(yīng)位點。將平板在室溫(RT) 下孵育1小時并在PBS-Tween中再次洗涂4次。
在分離的管中，將l份標(biāo)準(zhǔn)OVA制劑或測試樣品與l份兔抗OVA蛋 白抗體(1: 20'000稀釋)在RT下孵育1小時。孵育后向上述被包被和封 閉的微量滴定孔中添加100 pl該抑制混合物并在室溫下孵育2小時。將平 板在PBS-Tween中洗滌4次。然后添加山羊抗兔過氧化物酶標(biāo)記的綴合物 (0.1 ml 1:2000的稀釋液)，將平板在室溫下孵育1小時并在PBS-Tween 中洗滌4次。添加顯色底物(0.1 ml鄰苯二胺)。孵育15分鐘后，在ELISA 平板讀數(shù)器上于492 nm處讀數(shù)光密度。
結(jié)果顯示在圖1中，從圖1中可以看出來自實施例l到3的水解產(chǎn)物 的OVA特異抗原性與完整的卵蛋白相比被降低了超過10,000倍。
卵水解產(chǎn)物的殘余變應(yīng)原性
如先前所述(Fritsch6等人，J. Allergy Clin, Immunol,第100巻，第2 期，第266-273頁)，使用由致敏的大鼠肥大細(xì)騰釋放的氚標(biāo)記的5-羥色胺 的功能性體外測定法測定抗原分子(OVA)的IgE依賴的變應(yīng)原性。簡言之， 通過在含10%胎牛血清的Dulbecco's改良的Eagle's培養(yǎng)基中的腹膜洗滌 物獲得來自正常Sprague-Dawley大鼠的肥大細(xì)胞。在該培養(yǎng)基中洗滌細(xì) 胞并在4。C保持過夜。在pH 7.0的磷酸鹽-HEPES-魚明膠緩沖液(PHG)中 洗滌兩次后，將細(xì)胞以5xl()S細(xì)胞/ml重懸于相同的緩沖液中，并用一倍體 積的富含IgE抗OVA抗體的大鼠血清稀釋，所述血清含5 nCi/ml 3H 5-輕色胺。在37"C孵育2小時后，將細(xì)胞在PHG中再洗滌三次并以2.5xl05細(xì)胞/ml重懸于PHG中。致敏的肥大細(xì)胞被分配至微量滴定板(0.1 ml/ 孔)中并與0.05 ml根據(jù)實施例2制備的水解卵蛋白的連續(xù)稀釋液(從IO mg/ml開始1/10稀釋)混合。將混合物在37t:孵育60分鐘并離心。將上 清液的等分式樣(0.05 ml)與2 ml閃爍液混合并使用Packard |3-計數(shù)器測量 3H釋放。
結(jié)果顯示于圖2中，從中可以看出水解卵具有顯著降低的變應(yīng)原性(25 網(wǎng)OVA/g蛋白質(zhì)當(dāng)量)，并且當(dāng)水解卵被摻入果餡餅(flan)型甜點中時維持 該低值。
權(quán)利要求
1. 制備酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步驟，其中由第一蛋白酶對完整的卵蛋白進(jìn)行酶水解；中間加熱步驟，其中第一水解的產(chǎn)物被加熱至不超過75℃的溫度；第二水解步驟，其中由第二蛋白酶對中間加熱步驟的產(chǎn)物進(jìn)行酶水解；和失活步驟，其中第二水解的產(chǎn)物被加熱至85和90℃之間的溫度，并在該溫度下維持至少30分鐘。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中第一蛋白酶選自來自解淀粉芽孢桿菌和地 衣芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶及其混合物、胰蛋白酶和胰酶制劑。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中第二蛋白酶選自來自地衣芽孢桿菌的 細(xì)菌蛋白酶、來自米曲霉的真菌蛋白酶、胰蛋白酶和胰酶制劑。
4. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中第一蛋白酶是來自解淀粉芽孢 桿菌和地衣芽孢桿菌的細(xì)菌蛋白酶的混合物，第二蛋白酶是來自米曲霉的 真菌蛋白酶。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中10到60%的來自米曲霉的真菌蛋白酶在 中間加熱步驟期間添加，剩余的來自米曲霉的真菌蛋白酶在完成中間加熱 步驟后添加。
6. 權(quán)利要求1到3中任一項的方法，其中使用枯草桿菌蛋白,為第 一蛋白酶和第二蛋白酶。
7. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其在第一水解步驟前還包括在不超 過65。C的溫度下將完整的卵蛋白預(yù)加熱2至15分鐘。
8. 含卵意大利面食，其包含50到85。/。面粉、5到15%水解全卵，以 及10到40%水。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備酶水解的卵蛋白的方法，其包括第一水解步驟，其中由第一蛋白酶對完整的卵蛋白進(jìn)行酶水解；中間加熱步驟，其中第一水解的產(chǎn)物被加熱至不超過75℃的溫度；第二水解步驟，其中由第二蛋白酶對中間加熱步驟的產(chǎn)物進(jìn)行酶水解；和失活步驟，其中第二水解的產(chǎn)物被加熱至85和90℃之間的溫度，并在該溫度下維持至少30分鐘。本發(fā)明擴展至含水解全卵的含卵意大利面食。
文檔編號A23J3/04GK101489409SQ200780026683
公開日2009年7月22日 申請日期2007年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月15日
發(fā)明者I·卡爾圖, R·夏勒, R·弗里切 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司