專利名稱：治療腫瘤疾病的抗體組合物和方法
治療腫瘤疾病的抗體組合物和方法 與相關(guān)申請的交叉參考本申請要求2006年4月7日提交的美國臨時申請No. 60/790,512 的優(yōu)先權(quán)，該臨時專利申請的內(nèi)容以其全文引為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明總的來說涉及在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的抗體組合 物和方法。分離的人類單克隆抗體結(jié)合胰島素樣生長因子I或結(jié)合胰島 素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II 二者。本發(fā)明還涉及在哺乳動 物對象中診斷癌癥的方法。發(fā)明背景癌癥治療是建立在分裂和增殖速度加快的細胞傾向于發(fā)展成癌癥 的理論基礎(chǔ)上的。最近，許多流行病學研究已經(jīng)一致地顯示，在高循 環(huán)水平的強效的有絲分裂原，胰島素樣生長因子(IGF) -1，與幾種常 見癌癥的風險增加有關(guān)，這些癌癥包括乳腺、前列腺、肺和結(jié)腸直腸 的癌癥。在大多數(shù)情況下抑制IGF-I的促有絲分裂作用的血清中的主要 IGF-I結(jié)合蛋白——IGF結(jié)合蛋白(IGFBP) -3的水平，與這些癌癥的 風險成反相關(guān)。從功能上說，IGF-I不僅剌激細胞的增殖，而且抑制凋亡。這些促 有絲分裂和抗凋亡效應的組合可能對腫瘤的生長有影響。除了對與癌 癥相關(guān)的細胞活動的直接影響之外，IGF家族的成員還與參與癌癥發(fā)生 和發(fā)展的多種不同的分子相互作用，這些分子包括性類固醇激素、腫 瘤抑制基因的產(chǎn)物以及其它生長因子。此外，參與調(diào)節(jié)人類生長和發(fā) 育的肽類激素IGF-I的表達和生產(chǎn)，受營養(yǎng)和身體活動的影響。為了解 IGF家族成員的分子結(jié)構(gòu)和生理功能而進行的實驗，對促有絲分裂生長因子在致癌中的作用提供了了解。Yu和Rohan, J. Natl. Cancer Inst. 92: 1472-1489, 2000。IGF刺激培養(yǎng)的人類乳腺癌細胞的增殖。這種刺激是通過受體胰 島素樣生長因子受體1 (IGFR-1)介導的，該受體是受體酪氨酸激酶家 族的成員。當被其配體(IGF-I或IGF-II)激活時，IGFRl將兩個主要 底物IRS-I和She上的酪氨酸殘基磷酸化，隨后通過Ras/Raf和磷脂酰 肌醇3'-激酶/AKT途徑進行信號發(fā)送。IGFR1在轉(zhuǎn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵的作 用。來自敲除了 IGFR1的小鼠的細胞對抗多種不同的病毒和細胞癌基 因、包括SV40大T抗原和活化的ras的轉(zhuǎn)化，但是來自野生型小鼠的 成纖維細胞容易被這些癌基因轉(zhuǎn)化。有越來越多的流行病學證據(jù)將血漿IGF-I水平升高與前列腺、乳 腺和結(jié)腸癌風險關(guān)聯(lián)起來。來自患者的乳腺癌組織顯示出比鄰近的正 常組織更高的IGFR1表達，表明在IGFR1和乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化之間有 關(guān)聯(lián)。據(jù)報道，當使用受體的反義方略、中和抗體(抗IR3或抗IGF-I) 或顯性失活平截抑制IGFR1時，腫瘤細胞的轉(zhuǎn)化能力減弱了。Hailey, J. 等，Molecular Cancer Therapeutics 1: 1349-1353,2002; Maloney E.K.等， Cancer Res. 63: 5073-5083， 2003; Burtrum D.等，Cancer Res.， 63: 8912-8921, 2003; Lu等，J. Biol. Chem. 279: 2856-2865， 2004; Miyamoto 等，Clin. Cancer Res. 11: 3494-3502， 2005; Goya等，Cancer Research 64: 6252-6258,2004。在本技術(shù)領(lǐng)域中，存在著對治療腫瘤疾病和轉(zhuǎn)移癌的 改進的多耙點療法的需求。發(fā)明概述總的來說，本發(fā)明涉及在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的抗體組 合物和方法。本發(fā)明還涉及在哺乳動物對象中診斷腫瘤疾病的方法。 抗體組合物是結(jié)合胰島素樣生長因子I的分離的單克隆抗體。另一組抗 體組合物是結(jié)合胰島素樣生長因子I并與胰島素樣生長因子II交叉反 應并結(jié)合的單克隆抗體。分離的單克隆抗體是例如人類、非人類靈長動物、兔、大鼠或小鼠的抗體。與胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體組合物是例如m705和m706。與胰島素樣生長因子I和 胰島素樣生長因子II都能結(jié)合的分離的人類單克隆抗體組合物是m708 和m708.2。單克隆抗體m705、 m706、 m708禾B m708.2不結(jié)合人類胰 島素。m705具有包含SEQ ID NO: 1的VH鏈氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 2的VL鏈氨基酸序列。m706具有包含SEQ ID NO: 3的VH鏈氨 基酸序列和包含SEQ ID NO: 4的VL鏈氨基酸序列。m708具有包含SEQ ID NO: 5的VH鏈氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 6的VL鏈氨基酸序列。 m708.2具有包含SEQ ID N0:7的VH鏈氨基酸序列和包含SEQ ID NO: 8的VL鏈氨基酸序列。提供了與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié) 合的分離的單克隆抗體，在其重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 7中顯示 的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 7具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié) 合的分離的單克隆抗體，在其輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 8中顯示 的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié) 合的分離的單克隆抗體，在其重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中分別含有 SEQ ID NO: 7和8中顯示的氨基酸序列或分別與它們具有至少90%同 源性的氨基酸序列。提供了含有一種或多種本發(fā)明的抗體和可藥用載 體的藥物組合物。在另一方面，抗體提供了至少一個CDR序列，包括但不限于，VL: QSISS (SEQIDNO: 9) ， VL: A AS (SEQIDNO: 10) ， VL: QQ SYSTPSTF( SEQ ID NO: 11) ， VH: G G T F S S Y A (SEQ ID NO: 12) ， VH: GIIPILGI A (SEQIDNO: 13)，或VH: ARGPRG Y S YNFDY (SEQIDNO: 14)。在另一方面，抗體包括但不限于IgG,、16IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA!、 IgA2、分泌性IgA、 IgD或IgE抗體。 抗體可以是IgG^或IgGi入同種型?？贵w是IgG4K或IgGA同種型?？?體可以是IgG" IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA,、 IgA2、分泌性IgA、 IgD 或IgE抗體?？贵w可以是IgG,zc或IgGiX同種型?？贵w可以是IgG4K或 IgG4人同種型。在具體方面，抗體是人類、非人類靈長動物、兔、嚙齒 動物、大鼠或小鼠的抗體或其組合。在另一方面，本發(fā)明的分離的單克隆抗體具有下列一種或多種特 征(i)在抗體濃度為大約4nM以上時，在體外MCF-7乳腺癌細胞分 析中抑制IGF-I受體的磷酸化；(ii)抑制與IGF-I受體的IGF-I結(jié)合或 IGF-II結(jié)合；或(iii)在細胞遷移分析中抑制細胞的遷移。在另一方面，使用重組人類胰島素樣生長因子I或人類胰島素樣 生長因子II作為分析物和抗體作為配體，通過表面等離子體共振(SPR) 進行測定時，本發(fā)明的分離的單克隆抗體的解離平衡常數(shù)(KD)為大 約10—8 M以下。在另一方面，提供了能夠以大約1()SM"以上的結(jié)合親和力與人類 胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的單克隆抗體。 在另一方面，提供了能夠以大約1(^M"以上的結(jié)合親和力與人類胰島 素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的單克隆抗體。在 具體的方面，分離的單克隆抗體是完整的抗體，完整的IgG,抗體，完 整的IgG2抗體，完整的IgG3抗體，完整的IgG4抗體，完整的IgM抗 體，完整的IgAi抗體，完整的IgA2抗體，完整的分泌性IgA抗體，完 整的IgD抗體或完整的IgE抗體，其中該抗體在真核細胞中被糖基化。 在另一方面，分離的單克隆抗體是抗體片段或單鏈抗體。抗體可以是 單克隆抗體?？贵w可以是F(ab')2、 Fab，F(xiàn)v或Fd片段?？贵w可以是抗原 特異性的。在另一方面，本發(fā)明的分離的單克隆抗體是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i) SEQ ID NO: 7中顯示的可變重鏈氨基酸序列或 與SEQIDNO: 7具有至少90%同源性的可變重鏈序列，通過接頭肽與 SEQ ID NO: 8中顯示的可變的輕鏈氨基酸序列或與SEQ ID NO: 8具有 至少90%同源性的可變的輕鏈序列融合，所述可變重鏈氨基酸序列與 免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合(ii)與鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2 恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。 抗體可以以平衡結(jié)合常數(shù)(Ka)與預定的抗原結(jié)合，例如至少10s M"、 至少109 M"或至少1010M-'。提供了與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié) 合的分離的人類單克隆抗體。在一個方面，抗體含有至少一個下列的 CDR序列VL: Q SI S S (SEQIDNO: 9) ， VL: A AS (SEQIDNO: 10) ， VL: QQSYSTPSTF (SEQIDNO: 11) ， VH: GGTFSS Y A (SEQIDNO: 12) ， VH: GIIPILGIA (SEQIDNO: 13)，或VH: ARGPRGYSYNFDY (SEQIDNO: 14)。提供了與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體， 在其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 1中顯示的氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 1具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島 素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在其人類輕鏈可變區(qū)中 含有SEQ ID NO: 2中顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 2具有至少 90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分 離的人類單克隆抗體，在其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQIDNO:3中顯 示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 3具有至少90%同源性的氨基酸序 列。提供了與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體， 在其人類輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 4中顯示的氨基酸序列或與 SEQ ID NO: 4具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島 素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的人類單克隆 抗體，在其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQIDNO: 5中顯示的氨基酸序列 或與SEQ ID NO: 5具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在其人類輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 6中顯示的氨基酸 序列或與SEQ ID NO: 6具有至少90%同源性的氨基酸序列。提供了含 有一種或多種本發(fā)明的抗體和可藥用載體的藥物組合物。提供了編碼本發(fā)明的蛋白/抗體的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序 列或輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的分離的核酸。提供了含有核酸 和可藥用載體的藥物組合物。提供了含有本發(fā)明的抗體的免疫球蛋白 可變結(jié)構(gòu)域序列的一種或多種編碼核酸的重組細胞。提供了宿主細胞， 其包含編碼含有抗體的HC可變結(jié)構(gòu)域的多肽的第一種核酸序列和編 碼含有抗體的LC可變結(jié)構(gòu)域的多肽的第二種核酸序列，其中所述抗體是本發(fā)明的蛋白。提供了能夠與胰島素生長因子i和胰島素生長因子n結(jié)合的抗體的制備方法，該方法包括在提供核酸表達的條件下在宿主 細胞中表達本發(fā)明的核酸，然后回收抗體。提供了分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段， 該抗體含有人類恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)競爭性抑制m708.2抗體(ATCC登錄號No._)與人類IGF-I和人類IGF-II的結(jié)合，以及(ii)在體內(nèi)以至少1乂108升/摩爾的親和力或至少1X109 升/摩爾的親和力與人類IGF-I和人類IGF-II的中和性表位結(jié)合，親和 力是作為結(jié)合常數(shù)(Ka)通過表面等離子體共振測定的。抗體或抗原 結(jié)合片段可以包含人類恒定區(qū)和人類可變區(qū)?？贵w或抗原結(jié)合片段可 以包含至少一條人類輕鏈和至少一條人類重鏈。在另一方面，輕鏈含有m708.2 (ATCC登錄號No._)的輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。重鏈可以含有m708.2 (ATCC登錄號No._)的重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。輕鏈可以含有m708.2 (ATCC登錄號No._)的輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)，和其中重鏈含有m708.2 (ATCC登錄號No._)的重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。提供了分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體含有人類恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)含有m708.2抗體(ATCC登錄號No._)的抗原結(jié)合區(qū)，并且(ii)在體內(nèi)以至少1 X 108升/摩爾的親和力或至少1 X 109升/摩爾的親和力與人類 IGF-I和人類IGF-II的中和性表位結(jié)合，親和力是作為結(jié)合常數(shù)(Ka) 通過表面等離子體共振測定的。提供了分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II 抗體或其抗原結(jié)合片段，該抗體含有人類IgGl恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)競爭性抑制m708.2抗體(ATCC登錄號No._)與人類IGF-I和人類IGF-II的結(jié)合，并且(ii)在體內(nèi)以至少1X1()S升 /摩爾的親和力或至少1 X 109升/摩爾的親和力與人類IGF-I和人類 IGF-II的中和性表位結(jié)合，親和力是作為結(jié)合常數(shù)(Ka)通過表面等 離子體共振測定的。提供了分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗 原結(jié)合片段，該抗體含有人類IgGl恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)含有m708.2抗體(ATCC登錄號No._)的抗原結(jié)合區(qū)，并且(ii)在體內(nèi)以至少1乂108升/摩爾的親和力或至少1乂109升/摩爾 的親和力與人類IGF-I和人類IGF-II的中和性表位結(jié)合，親和力是作為 結(jié)合常數(shù)(Ka)通過表面等離子體共振測定的。提供了在樣品中檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II 的方法，包括(a)提供樣品；(b)在允許多肽配體與人類胰島素生長 因子I和胰島素生長因子II結(jié)合的條件下，將(a)的樣品與特異性結(jié)合 含有人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的多肽的人類單克隆 抗體m708或m708.2進行接觸；以及(c)檢測抗體m708或m708.2與樣 品中人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的結(jié)合，其中檢測到 結(jié)合表明在樣品中存在人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II;從 而檢測出樣品中的人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II。提供了在樣品中檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II 的方法，包括(a)提供樣品；(b)在允許多肽配體與人類胰島素生長 因子I和胰島素生長因子II結(jié)合的條件下，將(a)的樣品與特異性結(jié)合 含有人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的多肽的人類單克隆抗體m708或m708.2進行接觸；以及(c)檢測抗體m708或m708.2與樣品中人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的結(jié)合，其中檢測到結(jié)合表明在樣品中存在人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II;從而檢測出樣品中的人類胰島素生長因子i和胰島素生長因子n。提供了在樣品中檢測人類胰島素生長因子I的方法，包括(a)提 供樣品；(b)在允許多肽配體與人類胰島素生長因子I結(jié)合的條件下， 將(a)的樣品與特異性結(jié)合含有人類胰島素生長因子I的多肽的人類單 克隆抗體m705或m706進行接觸；以及(c)檢測抗體m705或m706與 樣品中人類胰島素生長因子I的結(jié)合，其中檢測到結(jié)合表明在樣品中存 在人類胰島素生長因子I;從而檢測出樣品中的人類胰島素生長因子I。提供了能夠結(jié)合胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的抗體的 制備方法，該方法包括在提供核酸表達的條件下，在宿主細胞中表達 本發(fā)明的核酸，然后回收抗體。提供了鑒定特異性針對人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子 II的多肽配體的方法，包括(a)提供包含表達候選的人類胰島素生長 因子I和胰島素生長因子I結(jié)合多肽的噬菌體的噬菌體文庫；(b)將噬 菌體文庫與人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II蛋白進行接觸， 以及(c)檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II蛋白與噬菌 體的結(jié)合；從而鑒定了特異性針對人類胰島素生長因子I和胰島素生長 因子II的多肽配體。提供了在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的方法，包括給哺乳動物 對象施用含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體的藥物組合物，該抗體以有效減輕或消除哺乳動物對 象中的腫瘤疾病的量與胰島素樣生長因子I特異性結(jié)合。在一個方面， 抗體與胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II特異性結(jié)合。在另21一個方面，抗體含有SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或 SEQIDNO: 8的氨基酸序列?？贵w可以與細胞毒性劑連接。細胞毒性 劑可以是細胞毒性藥物或放射性同位素。在具體的方面，腫瘤疾病是 實體腫瘤、血液惡性腫瘤、白血病、結(jié)腸直腸癌、良性或惡性乳腺癌、 子宮癌、子宮平滑肌瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合癥、 子宮內(nèi)膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂體癌、子宮腺肌病、腺癌、 腦膜瘤、黑素瘤、骨癌、多發(fā)性骨髓瘤、CNS癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形 母細胞瘤。在其他的具體方面，腫瘤疾病是哺乳動物對象中腫瘤細胞 的轉(zhuǎn)移。腫瘤疾病可以是哺乳動物對象中的乳腺癌轉(zhuǎn)移。提供了在懷疑患有腫瘤疾病或懷疑處于腫瘤疾病的風險下的哺乳 動物對象中診斷癌癥的方法，包括從對象的血液或組織獲得測試樣品， 測試樣品含有細胞群體，提供含有SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體檢測在細胞群體內(nèi)的細胞上是 否存在IGF-I標志，對通過IGF-I標志檢測到的細胞群體進行分析以鑒 定細胞和表征細胞，在細胞中或細胞上存在IGF-I標志指示了在哺乳動 物對象中的腫瘤疾病或腫瘤疾病的風險。診斷癌癥的方法還包括提供包含SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體，以檢測在細胞群 體內(nèi)的細胞上或細胞中是否存在IGF-II標志和IGF-I標志，并對通過 IGF-I標志和IGF-II標志檢測到的細胞群體進行分析以鑒定和表征細 胞，在細胞中或細胞上存在IGF-I標志和IGF-II標志指示了在哺乳動物 對象中的腫瘤疾病或腫瘤疾病的風險。在該診斷方法中，在樣本中的細胞上或細胞中存在IGF-I標志或 IGF-II標志指示了哺乳動物對象中存在轉(zhuǎn)移性癌癥。在該診斷方法中， 在樣本中的細胞上或細胞中存在IGF-I標志或IGF-II標志指示了哺乳動 物對象中存在早期癌癥。在該診斷方法中，在樣本中的細胞上或細胞中不存在IGF-I標志和IGF-II標志指示了哺乳動物對象中存在無疾病狀 態(tài)或不能檢測到的疾病狀態(tài)。在該診斷方法的另一個方面，在樣本中 的細胞上或細胞中IGF-I標志或IGF-II標志的存在或不存在，在癌癥治 療或癌癥恢復過程中對治療處理進行了監(jiān)測。在另一方面，該方法包 含與抗體結(jié)合的成像部分。成像部分可以通過磁共振波譜、X-射線波 譜或正電子發(fā)射斷層成像(PET)。結(jié)合可以是共價鍵或非共價鍵。腫 瘤疾病包括但不限于實體腫瘤、血液惡性腫瘤、白血病、結(jié)腸直腸癌、 乳腺癌、子宮癌、子宮平滑肌瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢 綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、前列腺癌、前列腺肥大、垂體癌、子宮腺肌 病、腺癌、腦膜瘤、黑素瘤、骨癌、多發(fā)性骨髓瘤、CNS癌、神經(jīng)膠 質(zhì)瘤或星形母細胞瘤。在哺乳動物對象中治療癌癥的藥物候選化合物的篩選方法，包括 給懷疑患有癌癥的對象施用治療有效量的藥物候選化合物，在用藥物 候選化合物治療之前和之后從對象的血液或組織獲得測試樣品，測試 樣品含有懷疑含有腫瘤細胞的細胞群體，提供含有SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體檢測在測試樣 品中的細胞上是否存在IGF-I標志，對通過IGF-I標志檢測到的細胞群 體進行分析，以鑒定藥物候選化合物治療之前測試樣品中的腫瘤細胞， 與藥物候選化合物治療之后相比較，其中在治療后樣本中存在的腫瘤 細胞數(shù)量與治療前樣本中腫瘤細胞數(shù)量相比降低，表明了藥物候選化 合物在治療哺乳動物對象的癌癥中的有效性。在另一方面，在哺乳動物對象中治療癌癥的藥物候選化合物的篩 選方法包括提供含有SEQIDNO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或 SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體，以檢測在測試樣品中的細胞上是 否存在IGF-II標志和IGF-I標志，并對通過IGF-I標志和IGF-II標志檢測到的細胞群體進行分析，以鑒定藥物候選化合物治療之前測試樣品 中的腫瘤細胞，與藥物候選化合物治療之后相比較，其中在治療后樣本中存在的腫瘤細胞數(shù)量與治療前樣本中腫瘤細胞數(shù)量相比降低，表 明了藥物候選化合物在治療哺乳動物對象的癌癥中的有效性。癌癥可 以是轉(zhuǎn)移性癌癥或早期癌癥。附圖簡述

圖1顯示了針對IGF-I篩選的人類單克隆抗體，其結(jié)合IGF-I或 IGF-I和IGF-II。圖2顯示了 IgG 708.2與IGF-I和IGF-II結(jié)合的ELISA結(jié)合分析。 圖3顯示了 IgG 708.2抑制了 MCF-7細胞中IGF-IR的磷酸化。 圖4顯示了針對IGF-I篩選的人類單克隆抗體抑制IGF-I與可溶性 IGF-IR的結(jié)合。圖5顯示了抗IGF-II人類IgG! m708.2劑量依賴性抑制MCF7細 胞中IGF-II和IGF-I誘導的IGF-IR磷酸化。圖6顯示了 IgGl 708.2抑制細胞的運動性。圖7顯示了通過ELISA分析檢測的單克隆抗體m705、 m706和 m708與IGF-I和IGF-II的結(jié)合特異性。圖8顯示了單克隆抗體m705、 m706和m708在IGF-I和IGF-I受 體之間結(jié)合的結(jié)合競爭性。圖9顯示了單克隆抗體m708.2 IgG與IGF-II的結(jié)合。具體說明總的來說，本發(fā)明涉及在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的抗體組 合物和方法。本發(fā)明還涉及在哺乳動物對象中診斷腫瘤疾病的方法。 抗體組合物是結(jié)合胰島素樣生長因子I的分離的單克隆抗體。另一組抗 體組合物是結(jié)合胰島素樣生長因子I并與胰島素樣生長因子II交叉反 應并結(jié)合的單克隆抗體。分離的單克隆抗體是例如人類、非人類靈長 動物、兔、大鼠或小鼠的抗體。與胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人 類單克隆抗體組合物是例如m705和m706。與胰島素樣生長因子I和 胰島素樣生長因子II都結(jié)合的分離的人類單克隆抗體組合物是m708 和m708.2。單克隆抗體m705、 m706、 m708和m708.2不結(jié)合人類胰島素。胰島素樣生長因子(IGF)是有絲分裂原，在調(diào)控細胞增殖、分化 和凋亡中發(fā)揮作用。IGF的效應通過胰島素樣生長因子受體IGF-IR介 導。胰島素樣生長因子I (IGF-I)和胰島素樣生長因子II (IGF-II)通 過與I型胰島素樣生長因子受體(IGF-IR)結(jié)合介導了效應。IGF-IR 被許多腫瘤過量表達，并介導增殖、運動性以及對免于凋亡的保護。 它的由腫瘤過量表達的主要配體是IGF-I。對IGF-IR介導的信號發(fā)送 的抑制可以在細胞外和細胞內(nèi)靶上進行。在細胞外IGF與IGF-IR結(jié)合， 激活的酪氨酸激酶導致了包括PI3激酶/ Akt和MAPK途徑在內(nèi)的信號 途徑所介導的增殖和細胞存活增強。對IGF-IR的抑制可以在細胞外和 細胞內(nèi)的多種水平上進行。LeRoithD, Helman L， Cancer Cell 5: 201-202， 2004。阻止IGF-I與其受體的結(jié)合可以導致抑制細胞增殖所需的信號轉(zhuǎn) 導。通過篩選人類天然噬菌體抗體文庫，鑒定到了兩種抗體m705和 m706，它們特異性針對IGF-I，并且不與IGF-II和胰島素發(fā)生交叉反應。 兩種抗體m708禾卩m708.2與IGF-I禾卩IGF-II交叉反應。M708顯示出 與IGF-I的結(jié)合親和力最高，并被轉(zhuǎn)變成IgGl。所有的抗體都顯示出 與受體(IGF-IR)競爭與IGF-I和IGF-II的結(jié)合。IgGl m708在MCF-7 乳腺癌細胞系中有力地抑制了 IGF-IR介導的信號轉(zhuǎn)導，ICso等于1 nM。 抑制的機理是通過與IGF-IR競爭與IGF-II的結(jié)合產(chǎn)生的。這與它與 IGF-I的高nM范圍的親和力相一致。這些抗體可用于癌癥的治療和與 癌癥治療有關(guān)的診斷分析。應該理解，本發(fā)明不限于具體的方法、試劑、化合物、組合物或 生物系統(tǒng)，這些當然是可以改變的。還應該理解，在本文中使用的術(shù) 語僅僅是出于描述具體的實施方案的目的，而不是為了限制。用在本 說明書和所附的權(quán)利要求中，除非內(nèi)容明確地另有指明，單數(shù)形式的 "a"、 "an"和"the"包括了復數(shù)的指代物。因此，例如，稱為"acell"包括兩個或多個細胞的組合，等等。
本文使用的術(shù)語"大約"在指稱可測量的值例如量、時間長度等
時，是指包含了與特定的值有±20%或±10%的差異，更優(yōu)選為±5%、更 加優(yōu)選±1%、尤為優(yōu)選±0.1%，因為這樣的差異對于執(zhí)行本發(fā)明的方法 是合適的。
除非另有定義，在本文中使用的技術(shù)和科學術(shù)語具有的意義與本 發(fā)明所屬的技術(shù)領(lǐng)域中普通專業(yè)人員所通常理解的相同。盡管與本文 描述的方法和材料類似或等價的任何方法和材料也可以用于實施本發(fā) 明的檢測，但是優(yōu)選的材料和方法是本文所述的。在本發(fā)明的描述和 權(quán)利要求中，使用了下面的術(shù)語。
"患者"、"對象"或"哺乳動物"可以互換使用，是指哺乳動 物例如人類患者和非人類靈長動物，以及實驗動物例如兔、大鼠和小 鼠，以及其它的動物。動物包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺 乳動物，諸如綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。
"治療"或包括施用本發(fā)明的抗體組合物、化合物或藥劑阻止或 延遲疾病的癥狀、并發(fā)癥、或生化指標的發(fā)作、緩解癥狀或者遏制或 抑制疾病、病狀或病障(例如癌癥、轉(zhuǎn)移癌、或轉(zhuǎn)移的乳腺癌)的進 一步發(fā)展。治療可以是預防性的(例如阻止或延遲疾病的發(fā)作，或阻 止其臨床或亞臨床癥狀的顯現(xiàn))，或是疾病顯現(xiàn)之后對癥狀的治療性 抑制或緩解。
"癌癥"或"惡性腫瘤"被用作同義術(shù)語，是指多種疾病中的任 何一種，這些疾病的特征為細胞不受控制的異常增殖、受影響的細胞 局部擴散或通過血流和淋巴系統(tǒng)擴散到身體的其它部位(即轉(zhuǎn)移)的 能力以及多種特征性的結(jié)構(gòu)和/或分子特點的任何。"癌性的"或"惡 性細胞"被理解為具有特定的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、缺少分化并能夠侵染和轉(zhuǎn)移
26的細胞。癌癥的例子是乳腺、肺、腦、骨、肝、腎、結(jié)腸和前列腺癌
(參見DeVita等主編的《癌癥原理和腫瘤學實踐》(Cancer Principles and Practice of Oncology)第六版，Lippincott Williams & Wilkins， Philadelphia, PA, 2001;該文獻在此出于所有目的以其全文引為參考)。
"癌癥相關(guān)的"是指核酸及其表達或其缺失、或蛋白及其水平或 活性或其缺失與對象細胞中惡性腫瘤發(fā)生的關(guān)系。例如癌癥可以與特 定基因的表達相關(guān)，該基因在正常的健康細胞中不表達，或以較低的 水平表達。反過來，癌癥相關(guān)的基因可以是在惡性細胞(或經(jīng)歷轉(zhuǎn)化 的細胞)中不表達，或在惡性細胞中比在正常的健康細胞中的表達水 平低的基因。
在癌癥的內(nèi)容時，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指正常細胞在變?yōu)閻盒詴r所經(jīng) 歷的變化。在真核生物中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"可以用于描述在細胞培養(yǎng)中 正常細胞向惡性細胞的轉(zhuǎn)變。
"增殖細胞"是正在活躍地經(jīng)歷細胞分裂和指數(shù)生長的細胞。"失 去細胞增殖控制"是指細胞己經(jīng)失去了在正常情況下確保適當限制細 胞分裂的細胞周期控制的性質(zhì)。失去了這樣的控制的細胞增殖速度比 正?？?，不需要刺激信號，并且對抑制信號沒有響應。 "晚期癌癥"意味著癌癥不再局限于初發(fā)的腫瘤位點，或者是根 據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer, AJCC) 為III期或IV期的癌癥。
"良好耐受"是指健康狀況中沒有作為治療的結(jié)果而產(chǎn)生并將影 響治療決定的不利變化。
"轉(zhuǎn)移性的"是指腫瘤細胞，例如人類乳腺癌細胞，在注射到免 疫缺陷小鼠的乳房脂肪墊和/或循環(huán)中后，能夠在免疫缺陷小鼠的肺、肝、骨或腦中建立起繼發(fā)腫瘤病變。
"非轉(zhuǎn)移性的"是指是指腫瘤細胞，例如人類乳腺癌細胞，在注 射到乳房脂肪墊和/或循環(huán)中后，不能在免疫缺陷小鼠的肺、肝、骨或 腦或其它乳腺癌轉(zhuǎn)移的靶器官中建立起繼發(fā)腫瘤病變。在本文中使用 并在本文中闡述為非轉(zhuǎn)移性的人類腫瘤細胞，在注射到免疫缺陷小鼠 的乳房脂肪墊中之后，能夠建立起原發(fā)腫瘤，但是它們不能從那些原 發(fā)腫瘤播散。
本文中使用的"淋巴細胞"具有本技術(shù)領(lǐng)域中的通常意義，是指 在血液、淋巴和淋巴樣組織中發(fā)現(xiàn)的任何單核細胞、非吞噬性白細胞， 例如B和T淋巴細胞。
本文中使用的"多肽片段"是指氨基和/或羧基末端缺失的多肽，
但是剩余的氨基酸序列與例如從全長的cDNA序列推導的天然存在的 序列中的對應位置一致。片段典型為至少5、 6、 8或10個氨基酸長， 優(yōu)選至少14個氨基酸長，更優(yōu)選至少20個氨基酸長，通常至少50個 氨基酸長，更優(yōu)選至少70個氨基酸長。本文中使用的術(shù)語"類似物" 是指含有與推導的氨基酸序列的一部分基本上一致的至少25個氨基酸 片段的多肽，并且它具有至少一種下面的性質(zhì)(1)在適當?shù)慕Y(jié)合條件 下與IGF-I或IGF-II特異性結(jié)合，(2)阻斷IGF-I或IGF-II與IGF-I 受體結(jié)合的能力，或(3)在體外或體內(nèi)抑制表達IGF-I或表達IGF-II 的細胞生長的能力。典型情況下，多肽類似物相對于天然存在的序列 來說含有保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。類似物典型為至少20 個氨基酸長，優(yōu)選為至少50個氨基酸長或更長，并且通?？梢耘c全長 的天然存在的多肽一樣長。
肽類似物通常在制藥工業(yè)中用作具有與模板肽性質(zhì)相似的非肽藥 物。這些類型的非肽類化合物被稱為"肽模擬物(peptide mimetics)" 或"肽擬似物(peptidomimetics) ，， 。 Fauchere， J. Adv. Drug Res. 15: 29，1986; Veber和Freidinger TINS p. 392 (1985);以及Evans等，J. Med. Chem. 30: 1229, 1987，在此引為參考。這些化合物通常是在計算機分 子模擬的幫助下開發(fā)的。與治療有用的肽結(jié)構(gòu)類似的肽模擬物可以用 于產(chǎn)生同等的治療或預防效果。 一般來說，肽模擬物與范本多肽(即 具有生化性質(zhì)或藥理活性的多肽)例如人類抗體的結(jié)構(gòu)相似，但是有 一個或多個肽鍵任選通過本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的方法用選自下面的鍵代 替-CH2NH-、 -CH2S-、 -CH2-CH2-、 -CHNCH-(順式和反式)、-COCH2-、 -(^(011)012-和-01280-。用同樣類型的0-氨基酸有系統(tǒng)取代保守序列 的一個或多個氨基酸(例如D-賴氨酸代替L-賴氨酸)，可以用于產(chǎn)生 更穩(wěn)定的肽。此外，可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法(Rizo和Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61: 387， 1992，在此引為參考)產(chǎn)生含有保守序列
或基本上一致的保守序列變異體的受約束肽；例如，通過加入能夠形 成分子內(nèi)二硫橋的內(nèi)部半胱氨酸殘基使肽環(huán)化。
在用于多肽時，術(shù)語"基本上一致"意味著兩個肽序列，當例如
使用缺省的間隙權(quán)重通過程序GAP或BESTFIT進行最適比對時，共有 至少80%的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性，更優(yōu)選至少95% 的序列同一性，最優(yōu)選至少99%的序列同一性。優(yōu)選不一致的殘基位 置的差別是保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代是指具有類似側(cè)鏈 的殘基的可互換性。例如， 一類具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸， 一類具有脂肪羥基側(cè)鏈的氨基 酸是絲氨酸和蘇氨酸， 一類具有含有酰胺的側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺 和谷氨酰胺， 一類具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色 氨酸， 一類具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸， 一類 具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取 代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸， 丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
正如在本文中討論的那樣，抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列 中的少量變化被認為包涵在本發(fā)明中，只要氨基酸序列的變化維持了至少75%、更優(yōu)選至少80%、 90%、 95%、和最優(yōu)選99%的同源性就行。 具體來說，考慮到了保守的氨基酸取代。保守的氨基酸取代不對抗總 體同源性，總體同源性可以維持在至少75%、更優(yōu)選至少80%、 90%、 95%、最優(yōu)選99%的同源性。保守取代是側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生 的取代。遺傳編碼的氨基酸一般被分成下列家族(1)酸性=天冬氨酸， 谷氨酸；(2)堿性=賴氨酸，精氨酸，組氨酸；(3)非極性=丙氨酸， 纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸； 以及(4)不帶電荷的極性=甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸， 絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸是脂肪 族羥基氨基酸；天冬酰胺和谷氨酰胺是含有酰胺的家族；丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂肪族家族；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸 是芳香族家族。例如，期望用異亮氨酸或纈氨酸孤立取代亮氨酸、用 谷氨酸孤立取代天冬氨酸、用絲氨酸孤立取代蘇氨酸、或?qū)被嵊?結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸類似取代不會對得到的分子的結(jié)合或性質(zhì)有顯著的 影響，這是合理的，特別是如果取代不涉及框架位點內(nèi)的氨基酸的話。 氨基酸的改變是否會產(chǎn)生有功能的肽，這可以通過分析多肽衍生物的 比活來容易地確定。分析方法在本文中詳細描述。本技術(shù)領(lǐng)域的普通 專業(yè)人員可以容易地制備抗體或免疫球蛋白分子的片段或類似物。片 段或類似物的優(yōu)選的氨基-和羧基-末端出現(xiàn)在靠近功能性結(jié)構(gòu)域的邊 界。結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域可以通過將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共 的或?qū)Ｓ械男蛄袛?shù)據(jù)庫進行比較來鑒定。優(yōu)選使用計算機化的比較方 法來鑒定在其它具有已知結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白中存在的序列基序或預 測的蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)域。鑒定折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白序列的方法是 已知的。Bowie等，Science 253: 164, 1991。因此，上述的例子證實本 技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員可以認識到可用于確定本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu) 域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。
優(yōu)選的氨基酸取代是這樣的取代(1)降低了對蛋白水解的易感 性，(2)降低了對氧化的易感性，(3)改變了形成蛋白復合物的結(jié)合親 和力，(4)改變了結(jié)合親和力，以及(4)賦予或修飾了這樣的類似物的其它物理化學或功能性質(zhì)。類似物可以包含天然存在的肽序列之外的 各種不同的突變蛋白序列。例如，可以在天然存在的序列中(優(yōu)選在 多肽形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的部分中)進行單個或多個氨基酸 取代(優(yōu)選為保守氨基酸取代)。保守的氨基酸取代將基本上不改變 親本序列的結(jié)構(gòu)特征(例如取代的氨基酸不應該傾向于破壞親本序列 中存在的螺旋、或破壞表征親本序列特征性的其它類型的二級結(jié)構(gòu))。 本技術(shù)領(lǐng)域公認的多肽的二級和三級結(jié)構(gòu)的例子描述在《蛋白，結(jié)構(gòu)
禾口分子原理》(Proteins, Structures and Molecular Principles ) (Creighton 主編，W.H. Freeman and Company, New York (1984))，《蛋白結(jié)構(gòu)簡 介》(Introduction to Protein Structure) (C. Branden禾口 J. Tooze主編， Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))和Thornton等，Nature 354: 105， 1991中，每個在此引為參考。
"抗體"或"抗體肽"是指完整的抗體或其與完整的抗體競爭特 異性結(jié)合的結(jié)合片段。結(jié)合片段通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或通過完整 抗體的酶法或化學水解來產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、 Fab'、 F(ab')2、 Fv 和單鏈抗體。完整的"抗體"含有至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L) 鏈，通過二硫鍵相連。每條重鏈包含重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為HCVR 或Vh)和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)含有3個結(jié)構(gòu)域CH" CH2和CH3。 每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為LCVR或Vl)和輕鏈恒定
區(qū)。輕鏈恒定區(qū)含有一個結(jié)構(gòu)域CL。 Vh和VL區(qū)還可以細分成超變區(qū)、
稱為互補性決定區(qū)(CDR)，間有更加保守的區(qū)域，被稱為框架區(qū)(FR)。 每個Vh和Vl由三個CDR和四個FR構(gòu)成，從氨基末端到羧基末端按 下面的次序排列FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4。重 鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū) 可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合，包括免疫系統(tǒng)的各種 不同細胞(例如效應細胞)和經(jīng)典的補體系統(tǒng)的第一種成分(Clq)。 術(shù)語抗體包含了完整的抗體的保留了與IGF-I或IGF-II結(jié)合的能力的抗 原結(jié)合部分。結(jié)合的例子包括(i) Fab片段，由VL、 Vh、 Cl和CH1 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，含有由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接
31的兩個Fab片段的雙價片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成； (iv) Fv片段，由抗體的單個臂的Vl和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；(v) dAb片段 (Ward等，Nature 341: 544-546, 1989)，它由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；以及(vi) 分離的互補性決定區(qū)(CDR)。
"雙特異性"或"雙功能"抗體之外的抗體被理解為它的每個結(jié) 合位點都是相同的。當過量的抗體使與反受體結(jié)合的受體量減少了至 少大約20%、 40%、 60%或80%、更通常大于大約85%時(在體外競爭 性結(jié)合分析中測定)，則抗體顯著抑制了受體與反受體的結(jié)合。
"Fab抗體"或"Fab片段"是指缺少了全部或一部分免疫球蛋白 恒定區(qū)、并含有抗體的Fab區(qū)的抗體片段。Fab抗體按照本文的描述制備。
"單鏈抗體"或"單鏈Fv (scFv)"是指Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域 Vl和Vh的抗體融合分子。盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域Vl和Vh由分離 的基因編碼，但可以使用重組方法通過合成的接頭將它們連接起來， 使它們能夠被制成單一的蛋白鏈，其中Vl和Vh區(qū)配対形成了単價分 子(被稱為單鏈Fv (scFv);參見例如Bird等，Science 242: 423-426， 1988;和Huston等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 85: 5879-5883, 1988)。 在使用術(shù)語"抗體"片段時包含了的這種單鏈抗體可以通過重組技術(shù) 或完整抗體的酶法或化學水解來制備。
"人類序列抗體"包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列的可變 區(qū)和恒定區(qū)(如果存在的話)的抗體。本發(fā)明的人類序列抗體可以包 含不是人類種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如通過體外隨 機或位點專一的誘變或通過體內(nèi)體細胞突變導入的突變)。這樣的抗 體可以在非人類的轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生，例如描述在PCT公布No. WO 01/14424和WO 00/37504中。但是，本文中使用的術(shù)語"人類序列抗 體"不打算包含其中來自另一種哺乳動物種類例如小鼠的種系的CDR序列嫁接到人類框架序列上的抗體(例如人源化抗體)。
此外，可以生產(chǎn)重組的免疫球蛋白。參見Cabilly的美國專利No. 4,816,567，在此出于所有目的以其全文引為參考；以及Queen等，Proc. Nat，l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033， 1989。
"單克隆抗體"是指單一分子組成的抗體分子的制劑。單克隆抗 體組成顯示出對特定表位的單一的結(jié)合特異性和親和力。因此，術(shù)語 "人類單克隆抗體"是指顯示出單一的結(jié)合特異性的抗體，其具有源 自人類種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在的話)。在 一個實施方案中，人類單克隆抗體通過雜交瘤產(chǎn)生，雜交瘤含有與永 生化的細胞融合的B細胞，該B細胞從轉(zhuǎn)基因的非人類動物例如轉(zhuǎn)基 因小鼠獲得，其基因組中含有人類重鏈轉(zhuǎn)基因和輕鏈轉(zhuǎn)基因。
"多克隆抗體"是指針對細胞表面受體或配體的大于一種(兩種 或以上)不同抗體的制劑，例如與IGF-I受體結(jié)合的IGF-I或IGFII。 這樣的制劑包括與多種不同的表位結(jié)合的抗體。針對IGF-I或IGF-II 的抗體可以結(jié)合IGF-I或IGF-II上的表位，因此抑制了 IGF-I或IGF-II 與IGF-I受體的結(jié)合。類似地，針對IGF-I或IGF-II的抗體，可以充當 與IGF-I受體結(jié)合從而抑制IGF-I或IGF-II與IGF-I受體結(jié)合的肽模擬 物。這些以及適合用于本發(fā)明的其它抗體可以按照本技術(shù)領(lǐng)域熟知的 方法和/或在本文引用的參考文獻中描述的方法來制備。在優(yōu)選的實施 方案中，在本發(fā)明中使用的抗IGF-I或抗IGF-II抗體是"人類抗體"一 例如從人類分離的抗體一或者它們是"人類序列抗體"(定義如上)。
"免疫細胞應答"是指免疫系統(tǒng)的細胞對外部或內(nèi)部刺激(例如 抗原、細胞表面受體、IGF-I、 IGF-II、 IGF-I受體、細胞因子、化學因 子和其它細胞)的應答，在免疫細胞中產(chǎn)生了生化改變，導致免疫細 胞的遷移、靶細胞的殺死、細胞吞噬、抗體和免疫應答的其它可溶性 效應物的產(chǎn)生，等等。
33"免疫應答"是指淋巴細胞、抗原呈遞細胞、巨噬細胞、粒細胞 以及上述細胞或肝臟產(chǎn)生的可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補 體)的協(xié)同行動，導致從人體中選擇性損傷、破壞或消除癌性細胞、 轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞、轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞、侵入的病原體、被病原體感染 的細胞或組織、或者在自體免疫或病理性炎癥情況下的正常人類細胞 或組織。
"T淋巴細胞應答"和"T淋巴細胞活性"這里可以互換使用，是 指依賴于T淋巴細胞的免疫應答的成分(例如T淋巴細胞增殖和/或分
化成輔助性、細胞毒性殺傷性或抑制性T淋巴細胞，輔助性T淋巴細 胞提供信號給B淋巴細胞引起或阻止抗體的生產(chǎn)，由細胞毒性T淋巴 細胞殺死特定的靶細胞，以及釋放可溶性因子例如細胞因子來調(diào)節(jié)其 它免疫細胞的功能)。
癌癥的治療
通過抗體組合物阻斷IGF-I或IGF-II與IGF-I受體的結(jié)合，可以增 強針對患者中的癌性細胞的記憶和二次免疫應答。針對IGF-I或IGF-II 的抗體可以與免疫原性劑例如癌性細胞、純化的腫瘤抗原(包括重組 蛋白、肽和碳水化合物分子)、細胞、以及用編碼免疫刺激性細胞因 子和細胞表面抗原的基因轉(zhuǎn)染的細胞相組合，或單獨使用，來刺激免 疫。
在接種方案后，針對IGF-I或IGF-II的抗體是有效的。已經(jīng)設(shè)計 了許多針對腫瘤的實驗性預防接種方略(參見Rosenberg, ASCO Educational Book Spring: 60-62， 2000( ASCO教學書，2000春季60-62); Logothetis, ASCO Educational Book Spring: 300-302, 2000 (ASCO教學 書，2000春季300-302) ; Khayat, ASCO Educational Book Spring: 414-428， 2000 (ASCO教學書，2000春季414-428) ; Foon, ASCO Educational Book Spring: 730-738, 2000 (ASCO教學書，2000春季730-738);也參見Restifo等，《癌癥腫瘤學原理和實踐》(Cancer: Principles and Practice of Oncology) ， 61: 3023-3043, 1997。在一禾中這樣 的方略中，使用了自體或異源的腫瘤細胞制備疫苗。已經(jīng)顯示出，當 轉(zhuǎn)導腫瘤細胞表達GM-CSF時，這些細胞疫苗最為有效。GM-CSF已 經(jīng)顯示出對于腫瘤預防接種來說是抗原呈遞的有力的激活劑。Dranoff 等，Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 90: 3539-43, 1993。
針對IGF-I或IGF-II的抗體可以加強GMCSF修飾的腫瘤細胞疫 苗，在許多實驗性腫瘤模型中增加疫苗的功效，例如乳腺癌(Hurwitz 等，1998，同上)、原發(fā)性前列腺癌(Hurwitz等，Cancer Research, 60: 2444-8, 2000)和黑素瘤(van Elsas等，J. Exp. Med.， l卯355-66， 1999)。 在這些情況下，非免疫原性的腫瘤例如B 16黑素瘤，已經(jīng)被賦予了易 于被免疫系統(tǒng)破壞。也可以修飾腫瘤細胞疫苗，使其特別表達其它的 免疫激活劑例如IL-2，和共刺激分子。
本文中使用的"抗腫瘤劑"是指具有在人類中抑制腫瘤、特別是 惡性(癌性)病變例如癌、肉瘤、淋巴瘤或白血病的發(fā)生或發(fā)展的功 能性性質(zhì)的藥劑。抑制轉(zhuǎn)移通常也是抗腫瘤劑的性質(zhì)。
"實體腫瘤"包括但不限于肉瘤、黑素瘤、癌或其它實體腫瘤癌癥。
"肉瘤"是指由類似胚胎結(jié)締組織的物質(zhì)組成的腫瘤， 一般由包 埋在纖維狀或均質(zhì)的物質(zhì)中的緊密堆積的細胞構(gòu)成。肉瘤包括但不限 于軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑肉瘤、粘液肉瘤、骨肉瘤、Abemethy 氏肉瘤、脂肉瘤、脂肪肉瘤、腺泡狀軟組織肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡 萄樣肉瘤、綠色肉瘤、胚胎性肉瘤、Wilms氏腫瘤肉瘤、子宮內(nèi)膜肉 瘤、間質(zhì)肉瘤、尤文氏(Ewing's)肉瘤、筋膜肉瘤、成纖維細胞肉瘤、 巨細胞肉瘤、粒細胞肉瘤、霍奇金氏(Hodgkin's)肉瘤、特發(fā)性多發(fā) 性色素沉著出血性肉瘤、B細胞的免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞的
35免疫母細胞肉瘤、Jensen氏肉瘤、卡波斯(Kaposi's)肉瘤、庫普弗
(Kupffer)細胞肉瘤、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤肉瘤、 骨膜外肉瘤、骨網(wǎng)狀細胞肉瘤、勞氏(Rous)肉瘤、漿液囊性肉瘤、 滑膜肉瘤和血管擴張性肉瘤。
"黑素瘤"是指從皮膚和其它器官的黑色素細胞系統(tǒng)產(chǎn)生的腫瘤。 黑素瘤包括例如肢端著色斑性黑素瘤、非黑色素性黑素瘤、良性青少 年黑素瘤、克勞德曼(Cloudman's)黑素瘤、S91黑素瘤、哈-帕二氏 (Harding-Passey)黑素瘤、青少年黑素瘤、惡性小痣黑素瘤、惡性黑 素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、甲下黑素瘤和淺表播散性黑素瘤。
"癌"是指由表皮細胞細胞形成的惡性的新生長，傾向于浸潤周 圍的組織并產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。示例性的癌包括例如腺泡癌、腺泡狀癌、腺樣 囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、 腺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、肺泡癌、肺泡細胞癌、基細胞癌、基底細胞癌、 基底細胞上皮癌、基底細胞樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、 支氣管癌、肺癌、腦樣癌、膽管細胞型癌、絨毛膜癌、膠樣癌、粉刺 狀癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、癌瘡、柱狀癌、柱狀細胞癌、 導管癌、硬癌、胚胎性癌、髓質(zhì)癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌、外植體 癌、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌、膠狀癌、巨細胞癌(giant cell carcinoma)、 巨細胞癌(carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒層細胞癌、毛母質(zhì)癌、 多血癌、肝細胞癌、Hurthle細胞癌、玻璃體癌、腎透明細胞樣
(hypemephroid)癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮內(nèi)癌、上皮內(nèi)癌、 克氏(Krompecher's)癌、庫爾奇茨基(Kulchitzky)細胞癌、大細胞 癌、豆狀癌(lenticular carcinoma)、 豆狀癌(carcinoma lenticular)、 脂肪瘤狀癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare)、髓樣癌
(medullare carcinoma)、黑色素癌、軟癌、粘液癌(mucinous carcinoma)、 粘液癌(carcinoma muciparum)、粘液細胞癌、粘液表皮樣癌、粘液癌
(carcinoma mucosum)、禾占液癌(mucous carcinoma)、 粘液瘤樣癌、 鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌、骨化性癌、乳頭狀癌、門脈周癌、浸潤前癌、棘細胞癌、軟糊狀癌、腎臟的腎細胞癌、貯備細胞癌、肉
瘤樣癌、schneiderian癌、硬癌、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細 胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭形細胞癌、海綿體癌、鱗狀癌、 鱗狀細胞癌、繩捆癌、血管擴張性癌(carcinoma telangiectaticum)、 血管擴張性癌(carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、結(jié)節(jié)性皮癌 (carcinoma tuberosm)、 結(jié)節(jié)性皮癌(tuberous carcinoma)、 疣狀癌禾口 viflosum癌o
"白血病"是指造血器官的進行性的惡性疾病，其特點通常為血 液和骨髓中的白細胞及它們的前體的畸變增殖和發(fā)育。白血病通常在 臨床上根據(jù)下述基準分類(l)疾病的時程和特點一一急性或慢性；(2) 涉及的細胞類型；骨髓樣的(骨髓性的)、淋巴樣的(淋巴性的)或 單核細胞的；(3)血液中異常細胞的數(shù)量增加或不增加_—白血性或非 白血性(亞白血性)的。白血病包括，例如，急性非淋巴細胞性白血 病、慢性淋巴細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、慢性粒細胞性白 血病、急性前髓細胞性白血病、成人T細胞白血病、非白血性白血病、 白細胞性白血病、嗜堿性細胞性白血病、母細胞白血病、牛白血病、 慢性髓細胞性白血病、皮膚白血病、胚胎性白血病、嗜酸性細胞性白 血病、Gross氏白血病、毛細胞白血病、成血細胞性白血病(hemoblastic leukemia)、成血細胞性白血病(h畫cytoblastic leukemia)、組織細 胞性白血病、干細胞白血病、急性單核細胞性白血病、白細胞減少性 白血病、淋巴性白血病、淋巴母細胞性白血病、淋巴細胞性白血病、 淋巴球性白血病、淋巴樣白血病、淋巴肉瘤細胞性白血病、肥大細胞 白血病、巨核細胞性白血病、小成髓細胞性白血病、單核細胞性白血 病、成髓細胞性白血病、髓細胞性白血病、骨髓粒細胞性白血病、骨 髓單核細胞性白血病、內(nèi)格利氏(Naegeli)白血病、漿細胞白血病、 漿細胞性白血病、早幼粒細胞性白血病、Rieder細胞白血病、Schilling 氏白血病、干細胞白血病、亞白血性白血病以及未分化細胞白血病。
其它的癌癥包括例如霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板 增多、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細胞肺部腫瘤、原發(fā)性腦部腫瘤、胃 癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤、惡性類癌瘤、膀胱癌、癌前皮膚病 變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細胞瘤、食管癌、泌尿生殖 道癌、惡性高鈣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺 癌°
抗體的結(jié)構(gòu)
已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單元包含了四聚體。每個四聚體由兩對同樣
的多肽鏈構(gòu)成，每對有一條"輕鏈"(大約25KDa)和一條"重鏈" (大約50-70KDa)。每條鏈的氨基末端部分包括大約100到110個或 更多的氨基酸的可變區(qū)，主要負責抗原的識別。每條鏈的羧基末端部 分限定了恒定區(qū)，主要負責效應子功能。人類的輕鏈被分類為k和X 輕鏈。重鏈被分類為n、 5、 Y、 a或s，并分別將抗體的同種型確定為 IgM、 IgD、 IgG、 IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過 大約12個以上氨基酸的"J"區(qū)連接，在重鏈中也包括了大約10個以 上氨基酸的"D"區(qū)?？偟膩碚f可以參見《基礎(chǔ)免疫學》第七章 (Fundamental Immunology Ch. 7) ， Paul, W.主編，第二版，Raven Press, N.Y. (1989))(出于所有目的以其全文引為參考)。每對輕鏈/重鏈的 可變區(qū)形成了抗原結(jié)合位點。
因此，完整的IgG抗體具有兩個結(jié)合位點。除了在雙功能抗體或 雙特異性抗體中之外，這兩個結(jié)合位點是相同的。
所有的鏈都顯示出同樣的總體結(jié)構(gòu)，相對保守的框架區(qū)(FR)被 三個超可變區(qū)、也稱為互補性決定區(qū)或CDR連接起來。來自每對的兩 條鏈的CDR通過框架區(qū)對齊，確保與特異性表位的結(jié)合。從N-末端到 C-末端，輕鏈和重鏈都包含結(jié)構(gòu)域FR1、 CDR1、 FR2、 CDR2、 FR3、 CDR3和FR4。每個結(jié)構(gòu)域的氨基酸指派按照《免疫重要的蛋白的Kaba 序歹ll》的定義來進行(Kabat Sequences of Proteins of Immunological
38Interest)(國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health), Bethesda， Md. (1987和1991))，或Chothia & Lesk， J. Mol. Biol. 196: 901-917， 1987; Chothia等，Nature 342: 878-883， 1989。
雙特異性或雙功能抗體是具有兩種不同的重鏈/輕鏈對和兩種不 同結(jié)合位點的人造雜合抗體。雙特異性抗體可以通過各種不同的方法 來生產(chǎn)，包括雜交瘤的融合或Fab'片段的連接。參見例如Songsivilai 禾口 Lachmann， Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321, 1990; Kostelny等，J. Immunol. 148: 1547-1553， 1992。此外，雙特異性抗體可以形成為"雙 抗體"(Holliger等，PNAS USA 90: 6444-6448， 1993)或"Ja腿ins"
(Traunecker等，EMBO J. 10: 3655-3659, 1991和Traunecker等，Int J Cancer 7:51-52， 1992)。雙特異性抗體的生產(chǎn)與常規(guī)抗體的生產(chǎn)相比可 能是勞動強度相對高的過程，并且雙特異性抗體的產(chǎn)率和純度通常較 低。雙特異性抗體不存在具有單一結(jié)合位點的片段形式(例如Fab、Fab' 禾口 Fv)。
Fab或scFv噬菌體文庫
噬菌體展示文庫鑒定與配體或轉(zhuǎn)移細胞上的細胞表面受體、例如 IGF-I、 IGF-II或IGF-I受體特異性結(jié)合的抗體組合物的方法，使用了 Fab或單鏈Fv(scFv)噬菌體文庫。參見例如Huston等，Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883， 1988; Chaudhary等，Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.， 87: 1066-1070， 1990; Zhang等，J. Virol. 78: 9233-9242, 2004。 已經(jīng)描述了在噬菌體外殼蛋白上展示Fab或scFv文庫的各種實施方案。 噬菌體展示方法的改良也是已知的，例如在WO96/06213和 WO92/01047 (醫(yī)學研究委員會(Medical Research Council) 等)和 WO97/08320 (Morphosys)中描述，在此引為參考。Fab文庫的展示是 已知的，例如在WO92/01047 (CAT/MRC)禾B W091/17271 (Affymax) 中描述。
克隆到展示載體中的雜合抗體或雜合抗體片段，可以針對與轉(zhuǎn)移細胞有關(guān)的適合的抗原、例如轉(zhuǎn)移腫瘤細胞上的細胞表面受體或針對 細胞表面受體的配體進行篩選，以便鑒定因為抗體或抗體片段將呈遞 于噬菌體或噬粒顆粒的表面上而維持良好的結(jié)合活性的變異體。參見
例如Barbas III等的《噬菌體展示，實驗室手冊》(Phage Display, A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001，其內(nèi)容在此引為參考。例如，在Fab片段的情況下， 輕鏈和重鏈Fd產(chǎn)物是在lac啟動子的控制之下，每條鏈具有與其融合 的前導信號，以便引導到細菌宿主的周質(zhì)空間中。抗體片段將能夠在 這個空間中適當?shù)匮b配。重鏈片段被表達成與噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)域 的融合體，這使得裝配的抗體片段整合到新制造的噬菌體或噬粒顆粒 的外殼中。新的噬粒顆粒的產(chǎn)生需要加入含有所有必需的噬菌體基因 的輔助噬菌體。 一旦抗體片段的文庫呈遞在噬菌體或噬粒表面上，就 進行被稱為淘選的過程。借助于該方法，i)展示在噬菌體或噬粒顆粒 表面上的抗體與目的抗原相結(jié)合，ii)沒有結(jié)合的被洗掉，iii)將結(jié)合 的顆粒從抗原上洗脫，以及iv)將洗脫下的顆粒暴露于新鮮的細菌宿主 以便擴增富集的集合體，用于下一輪的選擇。典型情況下，在對抗體 克隆的特異性結(jié)合進行篩選之前，進行三或四輪的淘選。以這種方式， 噬菌體/噬粒顆粒使得表現(xiàn)型(抗體)與基因型(DNA)結(jié)合的連鎖使 得抗體展示技術(shù)的使用非常成功。但是，其它的載體形式也可以用于 這種人源化過程，例如將抗體片段文庫克隆到裂解性噬菌體載體(修 飾的T7或X噬菌體Zap系統(tǒng))中用于選擇和/或篩選。
在選擇了所需雜合抗體和/或雜合抗體片段后，可以考慮使用本技 術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員已知的任何技術(shù)大量地生產(chǎn)它們，例如原核或真核 細胞表達等。例如，雜合抗體或片段可以使用常規(guī)的技術(shù)構(gòu)建編碼抗 體重鏈的表達載體來生產(chǎn)，在該抗體重鏈中，CDR以及，如果需要的 話，保持原始物種的抗體結(jié)合特異性所需的可變區(qū)框架的最少部分(按 照本文描述的技術(shù)進行工程化)，源自原始物種的抗體，而抗體的剩 余部分源自靶物種的免疫球蛋白，這可以按照本文的描述進行操作， 由此產(chǎn)生了用于表達雜合抗體重鏈的載體。在一個詳細的實施方案中，F(xiàn)ab或單鏈Fv (scFv)抗體文庫可以 從患有各種癌癥疾病的5、 10、 15或20個或更多的患者的外周血淋巴 細胞來制備。然后可以使用合成的唾液酸化的LewiSx和LewiSx BSA結(jié) 合物來篩選完全人類的高親和力Fab或scFv抗體。在一項研究中，通 過ELISA、 BIAcore和與胰腺腺癌細胞的細胞表面結(jié)合的流式細胞分 析，證實了這些人類scFv抗體對唾液酸化的Lewisx和Lewisx的特異性。 核苷酸測序揭示，獲得了至少四種獨特的scFv基因。Kd值范圍從1.1 到6.2 x 10—7 M，與二次免疫應答產(chǎn)生的mAbs的親和力相當。這些抗 體對于探測糖類抗原的結(jié)構(gòu)和功能、以及在人類腫瘤疾病的治療中， 可能是有價值的試劑。Mao等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 6953-6958， 1999。
在另一個詳細的實施方案中，噬菌體展示的組合抗體文庫可用于 產(chǎn)生和篩選針對與轉(zhuǎn)移性細胞有關(guān)的適當抗原例如轉(zhuǎn)移腫瘤細胞上的 細胞表面受體或針對細胞表面受體的配體的各種各樣的抗體。噬菌體 外殼蛋白pVII和pIX可用于展示抗體Fv區(qū)域的異源二聚體結(jié)構(gòu)。這 種技術(shù)的方面已經(jīng)擴展到構(gòu)建大的人類Fab或單鏈Fv (scFv)文庫， 該文庫在絲狀噬菌體的pIX上展示4.5 x 109個成員。此外，文庫的多 樣性、質(zhì)量和應用通過針對6種不同的蛋白抗原篩選Fab或scFv克隆 進行證實。值得注意的是，在經(jīng)過少至三輪的淘選后，90%以上篩選出 的克隆顯示出了與它們各自的抗原的陽性結(jié)合。被分析的Fab或scFv 也被發(fā)現(xiàn)是高親和力的。例如，動力學分析(BIAcore)揭示，針對葡 萄球菌腸毒素B和霍亂毒素B亞基的Fab或scFv分別具有納摩爾和低 于納摩爾的解離常數(shù)，具有與通過免疫接種獲得的mAB相當或更高的 親和力。也獲得了高特異性，不僅在非常不同的蛋白之間，而且在更 緊密相關(guān)的蛋白的情況下，例如蓖麻(Ricinus communis)("篦麻毒 素")凝集素(RCAeo禾n RCA，)，盡管在兩者之間有大于80%的序 列同源性。結(jié)果表明，pIX展示文庫的性能可能超過了 pIII展示形式， 使得它理想地適合淘選各種各樣的靶抗原。Gao等，Proc. Natl. Acad. Sci.
41U.S.A. 99: 12612-12616, 2001。
抗體或其它結(jié)合劑與抗原之間的特異性結(jié)合是指結(jié)合親和力至少 為10—6M。優(yōu)選的結(jié)合劑以至少大約10—7M、并優(yōu)選IO-SM到10—9M、 1(T1QM、 10—"M或10^M的親和力結(jié)合。術(shù)語表位是指能夠與抗體特 異性結(jié)合的抗原性決定簇。表位通常由分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的化 學活性表面基團構(gòu)成，并通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電 荷特征。構(gòu)象與非構(gòu)象表位的區(qū)別在于，在存在變性溶劑的情況下， 前者的結(jié)合性會失去，而后者不會。
"表位"是指任何分子中能夠被抗體或T細胞受體在一個或多個 抗體或T細胞受體的抗原結(jié)合區(qū)上識別并被結(jié)合的部分。表位通常由 分子例如氨基酸或糖側(cè)鏈的化學活性表面基團構(gòu)成，并具有特定的三 維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。"抑制性和/或中和性表位"是指表 位當被抗體結(jié)合時，導致含有表位的分子或生物體的生物活性喪失， 可以在體內(nèi)、體外或原位發(fā)生，更優(yōu)選在體內(nèi)發(fā)生，包括IGF-I或IGF-II 與IGF-I受體的結(jié)合。當解離常數(shù)小于1 ]UM、優(yōu)選小于100 nM和最優(yōu) 選小于10 nM時，抗體被說成是特異性結(jié)合抗原。構(gòu)象與非構(gòu)象表位 的區(qū)別在于，在存在變性溶劑的情況下，前者的結(jié)合性會失去，而后 者不會。
被本發(fā)明的抗體、其片段和區(qū)域識別的表位可以包含5個以上的 氨基酸，包括下面的IGF-I或IGF-II的氨基酸序列的每種或這兩種的至 少一個氨基酸，這提供了 IGF-I或IGF-II的拓撲或三維表位，可以被本 發(fā)明的抗IGF-I或IGF-II活性的抗體、其片段和可變區(qū)識別和/或結(jié)合。 本發(fā)明也提供了測定IGF-I或IGF-II的中和和/或抑制活性的篩選方法。 在本發(fā)明中，抗IGF-I或抗IGF-II中和活性或IGF-I或IGF-II抑制活性 是指IGF-I或IGF-II中和性化合物阻斷IGF-I或IGF-II的至少一種生物 學活性的能力，例如阻止IGF-I或IGF-II與IGF-I受體結(jié)合，通過細胞 內(nèi)加工例如轉(zhuǎn)錄、翻譯或翻譯后修飾阻斷IGF-I或IGF-II的生產(chǎn)、在細胞表面上表達、生物活性IGF-I或IGF-II的分泌或裝配。此外，IGF-I 或IGF-II中和性化合物可以通過誘導調(diào)控代謝途徑例如參與IGF-I或 IGF-II生產(chǎn)的上調(diào)或下調(diào)來發(fā)揮作用?；蛘?，IGF-I或IGF-II中和性化 合物可以通過降低細胞對IGF-I或IGF-II的靈敏度來調(diào)節(jié)該靈敏度。 IGF-I或IGF-II中和性化合物可以選自抗體或其片段或部分，肽、肽模 擬化合物或有機模擬化合物，如果按照本發(fā)明進行使用，能夠在體外、 原位或體內(nèi)中和IGF-I或IGF-II活性，也可被視為IGF-I或IGF-II中和 性化合物。可以用于確定IGF-I或IGF-II中和性化合物的IGF-I或IGF-II 中和活性的篩選方法可以包含在體外或體內(nèi)分析中。這樣的體外分析 可以包括針對下述的分析(i)在體外MCF-7乳腺癌細胞分析中，抗體 濃度為大約4 nM以上對IGF-I受體磷酸化的抑制；(ii)抑制IGF-I或 IGF-II與IGF-I受體的結(jié)合；或(iii)在細胞遷移分析中抑制細胞遷移。 可選的或另外的，IGF-I或IGF-II中和性化合物的IGF-I或IGF-II中和 活性的體內(nèi)測試，可以使用本文描述的在體外MCF-7乳腺癌細胞分析 中，大約4 nM以上的抗體濃度對IGF-I受體磷酸化的抑制的體外分析 來進行。
"中和性"是指抗體通過阻止人類IGF-I或IGF-II與其特異性受 體IGF-IR結(jié)合，或通過抑制IGF-I或IGF-II通過其將發(fā)生結(jié)合的受體 發(fā)送信號來抑制IGF-I或IGF-II活性。mAb，如果它在例如MCF-7乳 腺癌細胞的磷酸化分析中測定為90%有效、優(yōu)選95%有效、最優(yōu)選100% 有效抑制IGF-I或IGF-II的活性，則是中和性的。
本文使用的"藥劑"是指化學化合物、化學化合物的混合物、生 物大分子或從生物學材料制成的提取物。
"改變的抗體"是指由改變的免疫球蛋白編碼區(qū)編碼的蛋白，可 以通過在選定的宿主細胞中表達來獲得。這樣的改變的抗體是工程化 的抗體(例如嵌合抗體或人源化抗體)或缺少了全部或部分免疫球蛋 白恒定區(qū)的抗體片段，例如Fv、 Fab或F(ab)2等。"改變的免疫球蛋白編碼區(qū)"是指編碼本發(fā)明的改變的抗體的核 酸序列。當改變的抗體是CDR-嫁接的或人源化抗體時，編碼來自非人
類免疫球蛋白的互補性決定區(qū)(CDR)的序列被插入到含有人類可變
區(qū)框架序列的第一個免疫球蛋白配偶體中。任選第一個免疫球蛋白配 偶體與第二個免疫球蛋白配偶體可操作地連接。
"高親和力"是指抗體的結(jié)合親和力的特征通過表面等離子體共
振測定時，對人類IGF-I或IGF-II的Ka等于或小于3.5 X 10—11 M。
"對于人類IGF-I或IGF-II的結(jié)合特異性"是指對于人類IGF-I 或人類IGF-II的高親和力。單克隆抗體m705和m706對于人類IGF-I 具有高結(jié)合特異性，并且不結(jié)合人類胰島素。單克隆抗體m708和 m708.2對于人類IGF-I和人類IGF-II具有高結(jié)合特異性，并且不結(jié)合 人類胰島素。
術(shù)語Fv、 Fc、 Fd、 Fab或F(ab)2按照它們的標準意義使用(參見 例如Harlow等，《抗體實驗室手冊》(Antibodies A Laboratory Manual) ， Cold Spring Harbor Laboratory, (1988))。
"工程化抗體"描述了一類改變的抗體，即全長的合成抗體(例 如嵌合的或人源化的抗體而不是抗體片段)，其中選定的受體抗體的 輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域的一部分，被來自一個或多個對于選定的表 位具有特異性的供體抗體的類似部分所代替。例如，這樣的分子可以 包括其特征為人源化的重鏈與未修飾的輕鏈(或嵌合的輕鏈)相結(jié)合 的抗體，反之亦然。工程化抗體的特征也可以是改變編碼接受體的抗 體輕鏈和/或重鏈可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的核酸序列，以便保留供體抗體的 結(jié)合特異性。這些抗體可以包括本文描述的用來自供體抗體的CDR替 換來自接受體抗體的一個或多個CDR (優(yōu)選為所有的)。"嵌合抗體"是指一類工程化抗體，其含有與來自接受體抗體的 輕鏈和重鏈恒定區(qū)結(jié)合的來自供體抗體的天然存在的可變區(qū)(輕鏈和 重鏈)。
"人源化抗體"是指一類工程化抗體，其CDR源自非人類的供體 免疫球蛋白，分子的其它的來自免疫球蛋白的部分源自一個(或多個) 人類免疫球蛋白。此外，可以改變框架支持殘基以保留結(jié)合親和力。
參見例如Queen等，Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032, 1989; Hodgson等，Bio/Technology, 2: 421， 1991。
"供體抗體"是指給第一個免疫球蛋白配偶體貢獻了其可變區(qū)、 CDR或其它其功能性片段或其類似物的核酸序列的抗體(單克隆或重 組)，從而提供了改變的免疫球蛋白編碼區(qū)，并產(chǎn)生表達的改變抗體， 該抗體具有供體抗體的抗原性特異性和中和性活性特征。
"接受體抗體"是指與供體抗體異源的抗體(單克隆或重組)，
它為第一個免疫球蛋白配偶體貢獻了所有的(或任何部分，但優(yōu)選所 有的)編碼其重鏈和/或輕鏈框架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的核酸
序列。優(yōu)選人類抗體是接受體抗體。
"CDR"被定義為抗體的互補性決定區(qū)氨基酸序列，它是免疫球 蛋白重鏈和輕鏈的超變區(qū)。參見例如Kabat等，《免疫重要的蛋白序列》 第四版，美國衛(wèi)生與人類服務(wù)部，國立衛(wèi)生研究院(S叫uences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987))。在免疫球蛋白的可變區(qū) 部分中有三個重鏈和三個輕鏈CDR (或CDR區(qū))。因此，本文中使用 的"CDR"是指所有三個重鏈CDR或所有三個輕鏈CDR (或者如果合 適，兼指所有重鏈和所有輕鏈CDR)。
CDR為抗體與抗原或表位的結(jié)合提供了大部分接觸殘基。本發(fā)明中的目的CDR源自供體抗體的可變重鏈和輕鏈序列，并包括了天然存
在的CDR的類似物，其類似物也享有或保留了與它們所源自的供體抗
體同樣的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
"享有抗原結(jié)合特異性或中和能力"是指例如，盡管mAbm705、 m706、 m708或m708.2可以以某種水平的抗原親和力為特征，但由 m705、 m706、 m708或m708.2的核酸序列編碼的CDR，在適合的結(jié)構(gòu) 環(huán)境中可能具有更低或更高的親和力。然而，預計m705、 m706、 m708 或m708.2的CDR在這樣的環(huán)境中也將識別與原初的單克隆抗體同樣 的表位。示例性的重鏈CDR包括SEQ IDNO: 1、 SEQIDN0:3、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7，示例性的輕鏈CDR包括SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 8。參見例如表1和表2。
"功能性片段"是部分重鏈或輕鏈可變序列(例如在免疫球蛋白 可變區(qū)的氨基或羧基末端有少量缺失)，它保留了與片段所源自的抗 體同樣的抗原結(jié)合特異性和/或中和能力。
"類似物"是修飾了至少一個氨基酸的氨基酸序列，其中所述修 飾可以是化學的或幾個氨基酸(即不超過10個)的取代或重排，其中 修飾允許氨基酸序列保留未修飾的序列的生物學特性，例如抗原特異 性和高親和力。例如，當在CDR編碼區(qū)內(nèi)或附近產(chǎn)生某些內(nèi)切核酸酶 限制性位點時，可以通過取代來構(gòu)建(沉默)突變。
類似物也可以形成為等位基因變異。"等位基因變異或修飾"是 編碼本發(fā)明的氨基酸或肽序列的核酸序列中的變化。這樣的變異或修 飾可以是由于遺傳密碼的簡并性，或者可以是特意工程化以提供所需 的特征。這些變異或修飾可以產(chǎn)生或不產(chǎn)生任何編碼的氨基酸序列的 改變。
"載體劑"或"效應劑"是指非蛋白的載體分子，改變的抗體、
46和/或供體抗體的天然的或合成的輕鏈或重鏈、或供體抗體的其它片段 可以通過常規(guī)方法與其相結(jié)合。這樣的非蛋白載體可以包括在診斷領(lǐng) 域中使用的常規(guī)載體，例如聚苯乙烯或其它塑料珠，多糖，例如在
BIAcore [Pharmacia]系統(tǒng)中使用的多糖，或其它可用于醫(yī)學領(lǐng)域并可 以安全用于人類和動物的非蛋白物質(zhì)。其它效應劑可以包括用于螯合 重金屬原子的大環(huán)或放射性同位素。這樣的效應劑也可以用于增加改 變的抗體的半衰期，例如聚乙二醇。
免疫應答的成分可以在體外通過本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員所熟 知的各種不同的方法來檢測。例如(1)細胞毒性T淋巴細胞可以與放 射活性標記的靶細胞溫育，并通過放射活性的釋放來檢測這些靶細胞 的裂解；(2)輔助性T淋巴細胞可以與抗原和抗原呈遞細胞溫育，通 過標準方法測量細胞因子的合成和分泌(Windhagen等，Immunity, 2: 373-80， 1995) ; (3)抗原呈遞細胞可以與全蛋白抗原溫育，通過T 淋巴細胞活化分析或生物物理方法檢測該抗原在MHC上的呈遞 (Harding等，Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4， 1989) ; (4)月巴大細 胞可以與交聯(lián)它們的Fc-e受體的試劑溫育，通過酶免疫分析測量釋放 的組胺(Siraganian等，TIPS, 4: 432-437， 1983)。
類似地，在模型生物體(例如小鼠)或人類患者中免疫應答的產(chǎn) 物也可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的普通專業(yè)人員所熟知的各種方法來檢測。 例如(1)對預防接種作出應答產(chǎn)生的抗體可以通過在臨床實驗室中目 前使用的標準方法來容易地檢測，例如ELISA; (2)免疫細胞向炎性 位點的遷移可以通過刮取皮膚表面并放置在無菌容器來捕獲通過刮取 位點的遷移細胞來檢測(Peters等，Blood, 72: 1310-5， 1988) ; (3) 外周血單核細胞對有絲分裂原作出應答進行的增殖或混合的淋巴細胞
反應，可以使用3H-胸腺嘧啶來測量；(4) PBMC中的粒細胞、巨噬 細胞和其它吞噬細胞的細胞吞噬能力可以通過將PBMC與標記的顆粒 一起放置在孔中來測量(Peters等，Blood， 72: 1310-5， 1988);以及(5) 免疫系統(tǒng)細胞的分化可以通過用針對CD分子例如CD4和CD8的抗體來標記PBMC，并測量表達這些標記物的PMBC的分數(shù)來測量。
為方便起見，在本發(fā)明中，通常將免疫應答描述為"初次"或"二 次"免疫應答。初次免疫應答，也被稱為"保護性"免疫應答，是指 在個體中作為某些初次暴露(例如初次"免疫")于特定抗原例如細
胞表面受體、配體、IGF-IIGF-II或IGF-E受體的結(jié)果而產(chǎn)生的免疫應 答。這樣的免疫可以例如作為某些自然暴露于抗原(例如被某些展示 或呈遞抗原的病原體初次感染)的結(jié)果而發(fā)生，或由于個體中被某些 腫瘤的癌癥細胞(例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞)呈遞的抗原而發(fā)生?；蛘撸?免疫也可以作為用含有抗原的疫苗接種個體的結(jié)果而發(fā)生。例如，疫 苗可以是含有來自癌癥細胞、例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞的一種或多種抗 原的癌癥疫苗。
初次免疫應答可能隨著時間變?nèi)趸蛩p，甚至可能消失或至少變 得減弱到不能檢測到。因此，本發(fā)明還涉及"二次"免疫應答，在本 文中也被描述為"記憶免疫應答"。術(shù)語二次免疫應答是指在已經(jīng)產(chǎn) 生過初次免疫應答后，在個體中引發(fā)的免疫應答。因此，可以引發(fā)二 次免疫應答，例如，以加強現(xiàn)有的已經(jīng)變?nèi)趸蛩p的免疫應答，或重 新產(chǎn)生以前的已經(jīng)消失或不再能夠檢測到的免疫應答?？梢允┯靡l(fā) 二次免疫應答的藥劑在后文中稱為"加強劑"，因為該藥劑可以被說 成是"加強"了初次免疫應答。
舉例而不是限制，二次免疫應答可以通過在個體中重新引入引發(fā) 初次免疫應答的抗原來引發(fā)(例如通過重新接種疫苗)。但是，對抗 原的二次免疫應答也可以通過施用不含有實際抗原的其它藥劑來引 發(fā)。例如，本發(fā)明提供了通過給個體施用針對IGF-I和IGF-II的抗體而 加強二次免疫應答的方法。在這種方法中，不是必需將實際的抗原與 針對IGF-I或IGF-II的抗體一起使用，并且含有抗體的組合物也不是必 需含有抗原。二次或記憶免疫應答可以是體液(抗體)應答或細胞應 答。二次或記憶體液應答是在刺激了第一次呈遞抗原時產(chǎn)生的記憶B
48細胞后發(fā)生的。延遲型超敏(DTH)反應是一類由CD4+細胞介導的細
胞性二次或記憶免疫應答。第一次暴露于抗原致敏了免疫系統(tǒng)，再次
暴露導致了 DTH。
"免疫交叉反應性"或"免疫反應性"是指一種抗原，其與抗體 特異性反應，所述抗體是使用同樣的("免疫反應性")或不同的("免 疫交叉反應性")抗原產(chǎn)生的。 一般來說，抗原是IGF-I、 IGF-II或IGF-I 受體，或其子序列。
"免疫反應性條件"是指該條件使得針對抗原的特定表位所產(chǎn)生 的抗體與該表位結(jié)合的可檢測程度比該抗體與基本上所有其它表位的 結(jié)合更高， 一般來說比背景結(jié)合高至少兩倍，優(yōu)選比背景高至少5倍。 免疫反應性條件依賴于抗體結(jié)合反應的模式，并且通常是在免疫分析 方法中使用的條件。參見Harlow和Lane，《抗體，實驗室指手冊》
(Antibodies, A Laboratory Manual) ， Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988中對于免疫分析模式和條件的描述。
"細胞表面受體"是指能夠接受信號并將這樣的信號傳送過細胞 質(zhì)膜的分子和分子復合物。本發(fā)明的"細胞表面受體"的例子是轉(zhuǎn)移 細胞上的IGF-I受體。
"非特異性T細胞活化"是指T細胞不依賴于其抗原性特異性的刺激。
"效應細胞"是指參與免疫應答的效應階段而不是免疫應答的識 別和活化階段的免疫細胞。示例性的免疫細胞包括骨髓或淋巴來源的 細胞，例如淋巴細胞(例如B細胞和T細胞，包括細胞毒性T細胞 (CTL))、殺傷細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性 細胞、嗜中性細胞、多形核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性細胞。 效應細胞表達特異性Fe受體并執(zhí)行特定的免疫功能。效應細胞可以誘導抗體依賴性的細胞介導的細胞毒性(ADCC)，例如嗜中性細胞能夠
誘導ADCC。例如，表達FcaR的單核細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、 嗜酸性細胞和淋巴細胞參與了靶細胞的特異性殺死和將抗原呈遞給免 疫系統(tǒng)的其它成分，或與呈遞抗原的細胞結(jié)合。效應細胞也可以吞噬 耙抗原、耙細胞、轉(zhuǎn)移的癌癥細胞或微生物。
"靶細胞"是指可以被本發(fā)明的抗體或抗體組合物的耙定的對象 (例如人和動物)中任何不需要的細胞。靶細胞可以是表達或過量表 達人類IGF-I受體的細胞。表達人類IGF-I受體的細胞可以包括腫瘤細 胞，例如乳腺癌細胞或轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞。
轉(zhuǎn)移的癌癥細胞例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞的抗體組合物的目的靶， 包括但不限于在癌癥例如轉(zhuǎn)移的癌癥和轉(zhuǎn)移的乳腺癌中呈遞的細胞表 面受體、生長因子受體、IGF-I、 IGF-II、 IGF-I受體(參見例如Burtmm D.等，Cancer Res" 63: 8912-8921, 2003; Lu等，J. Biol. Chem. 279: 2856-2865， 2004; Miyamoto等，Clin. Cancer Res. 11: 3494-3502, 2005; Goya等，Cancer Research 64: 6252-6258， 2004.)、抗體、包括抗獨特 型抗體和自身抗體。其它的靶是粘附蛋白例如整聯(lián)蛋白、選擇蛋白和 免疫球蛋白超家族成員。Springer, Nature, 346: 425-433， 1990; Osborn, Cell, 62: 3， 1990; Hynes， Cell, 69: 11， 1992。其它的目的耙是生長因子 受體(例如FGFR、 PDGFR、 EGF、 her/neu、 NGFR和VEGF)以及它 們的配體。其它的靶是G-蛋白受體，包括物質(zhì)K受體、血管緊張素受 體、a-和/3-腎上腺素能受體、5-羥色胺受體和PAF受體。參見例如Gilman, Ann. Rev. Biochem. 56: 625-649, 1987。其它的靶包括離子通道(例如鈣、 鈉、鉀通道，介導多種藥物抗性的通道蛋白)、毒蕈堿受體、乙酰膽 堿受體、GABA受體、谷氨酸受體和多巴胺受體(參見Harpold，美國 專利No. 5,401,629和美國專利No. 5,436,128)。其它的靶是細胞因子， 例如白介素IL-1到IL-13、 a-和jQ-腫瘤壞死因子、a-、 /3-和7_干擾素、 /3-腫瘤生長因子(TGF-/3)、集落刺激因子(CSF)和粒細胞單核細胞 集落刺激因子(GM-CSF)。參見Aggrawal等主編的《人類細胞因子
50基礎(chǔ)和臨床研究手冊》 (Human Cytokines: Handbook for Basic & Clinical Research) , Blackwell Scientific, Boston, Mass" 1991 。其它的革巴 是激素、酶和細胞內(nèi)和細胞間信使，例如腺苷環(huán)化酶、鳥苷環(huán)化酶和 磷脂酶C。藥物也是目的靶。靶分子可以是人類、哺乳動物或細菌的。 其它的靶是抗原，例如來自病毒和細菌性微生物病原體和腫瘤的蛋白、 糖蛋白和糖類。還有其它的靶描述在美國專利No. 4，366，241中，在此 出于所有目的以其全文引為參考。某些通過靶篩選的藥劑僅僅與靶結(jié) 合。其它的藥劑激動或拮抗靶。
抗IGF-I或抗IGF-II抗體的重組表達
根據(jù)本發(fā)明，使用基于本文提供教導的已知技術(shù)，提供了抑制 IGF-I或IGF-II與IGF-IR結(jié)合的重組人類抗體。這參見例如Ausubel 等主編的《分子生物學現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) ， Wiley Interscience, N. Y. (1987， 1992， 1993);以及Sambrook 等，《分子克隆實驗室手冊》，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)，其全部內(nèi)容在此引為參考。
編碼本發(fā)明的抗IGF-I或抗IGF-II抗體的DNA可以是編碼重鏈恒 定區(qū)(CH)、重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL) 中的至少一種的基因組DNA或cDNA。使用染色體基因片段作為編碼 鼠V區(qū)抗原結(jié)合片段的DNA來源的方便替代方法，是使用cDNA來構(gòu) 建嵌合的免疫球蛋白基因，例如，正如在Liu等，Proc. Natl. Acad. Sci.， USA 84:3439 (1987)和J. Immunology 139: 3521 (1987)中報道的那樣， 在此以其全文引為參考。使用cDNA需要將適合宿主細胞的基因表達 元件與基因相結(jié)合，以便實現(xiàn)所需蛋白的合成。使用cDNA序列優(yōu)于 基因組序列(含有內(nèi)含子)，在于cDNA序列可以在缺少適合的RNA 間接系統(tǒng)的細菌或其它宿主中表達。
這類用于合成這樣的寡核苷酸的技術(shù)是眾所周知的，被描述在例 如Wu等，Prog. Nucl. Acid. Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978)和Ausubel等主編的《分子生物學現(xiàn)代方法》(Current Protocols in Molecular Biology) , Wiley Interscience (1987， 1993)中，其全部內(nèi)容在 此引為參考。
因為遺傳密碼是簡并的， 一個以上的密碼子可用于編碼特定的氨 基酸(Watson等，同上)。使用遺傳密碼，可以鑒定一個或多個不同 的寡核苷酸，每個都能夠編碼氨基酸。特定的寡核苷酸將實際上構(gòu)成 有效的抗IGF-I或抗IGF-II抗體編碼序列的概率，可以通過考慮在表達 抗IGF-I或抗IGF-II抗體或片段的真核或原核細胞中異常的堿基配對關(guān) 系和特定的密碼子實際使用頻率(編碼特定的氨基酸)來估算。這樣 的"密碼子使用規(guī)則"由Lathe等，J. Molec. Biol. 183:1-12(1985)公開。 使用Lathe的"密碼子使用規(guī)則"，可以鑒定出單一寡核苷酸或一組寡 核苷酸，其含有能夠編碼抗IGF-I或抗IGF-II可變區(qū)或恒定區(qū)序列的理 論上"最可能的"核苷酸序列。
盡管有時氨基酸序列可以僅由單個寡核苷酸編碼，但通常氨基酸 序列可以由一組類似的寡核苷酸中的任何一個編碼。重要的是，雖然 在該組中的所有成員都含有能夠編碼肽片段的寡核苷酸并因此可能含 有與編碼肽片段的基因相同的寡核苷酸序列，但該組中只有一個成員 含有與該基因的核苷酸序列一致的核苷酸序列。因為該成員存在于在 組內(nèi)，并且它即使是存在該組的其它成員的情況下也能夠與DNA雜交， 因此，以與使用單一寡核苷酸克隆編碼蛋白的基因相同的方式，使用 未分級的一組寡核苷酸，也是可能的。
寡核苷酸或寡核苷酸組，含有能夠編碼包括可變區(qū)或恒定區(qū)的抗 IGF-I或抗IGF-II抗體或片段的理論上"最可能的"序列，其被用于鑒 定能夠與"最可能的"序列或序列組雜交的互補寡核苷酸或寡核苷酸 組的序列。含有這樣的互補序列的寡核苷酸可用作探針，鑒定和分離 可變區(qū)或恒定區(qū)抗IGF-I或抗IGF-II基因(Sambrook等，同上)。能夠編碼抗IGF-I或抗IGF-II可變區(qū)或恒定區(qū)的片段的適合的寡
核苷酸或寡核苷酸組(或與這樣的寡核苷酸或寡核苷酸組互補)通過
本技術(shù)領(lǐng)域已知的方法，依靠來自能夠表達抗IGF-I或抗IGF-II抗體或 其可變區(qū)或恒定區(qū)的細胞的DNA、優(yōu)選為cDNA制劑進行鑒定(使用 上述程序)、合成和雜交。與"最可能的"抗IGF-I或抗IGF-II肽可 變區(qū)或恒定區(qū)編碼序列互補的單鏈寡核苷酸分子，可以使用本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專業(yè)人員所熟知的方法來合成(Belagaje等，J. Biol. Chem. 254: 5765-5780 (1979); Maniatis等，《基因表達控制中的分子機理》 (Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression) , Nierlich等 主編，Acad. Press, NY (1976); Wu等，Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 21:101-141 (1978); Khorana， Science 203: 614-625 (1979))。此夕卜， 可以通過使用自動化合成儀來進行DNA合成。核酸雜交的技術(shù)在 Sambrook等(同上)和Hayrnes等(《核酸雜交實用方法》(Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach) ， IRL Press, Washington, DC (1985))中公開，其內(nèi)容在此引為參考。諸如上述的技術(shù)或與其相似的 技術(shù)已經(jīng)成功地能夠克隆人類醛脫氫酶基因(Hsu等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3771-3775 (1985))、纖連蛋白基因(Suzuki等，Bur. Mol. Biol. Organ. J. 4: 2519-2524 (1985))、人類雌激素受體基因(Walter等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7889-7893 (1985))、組織型纖溶酶原激 活劑基因(Pennica等，Nature 301: 214- 221 (1983))和人類足月胎盤 堿性磷酸酶互補DNA的基因(Keun等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8715-8719 (1985))。
在編碼抗IGF-I或抗IGF-II可變區(qū)或恒定區(qū)的多核苷酸的另一種 克隆方法中，通過將DNA、更優(yōu)選為cDNA (來自能夠表達抗IGF-I 或抗IGF-II抗體或其可變區(qū)或恒定區(qū)的細胞)克隆到表達載體中，制 備表達載體的文庫。然后從文庫中篩選成員，該成員能夠表達競爭性 抑制抗IGF-I或抗IGF-II抗體例如m705、 m706、 m708或m708.2與 IGF-IR結(jié)合的蛋白，并且所具有的核苷酸序列能夠編碼與抗IGF-I或 抗IGF-II抗體或其片段具有同樣的氨基酸序列的多肽。在該實施方案
53中，DNA、或更優(yōu)選為cDNA，從能夠表達抗IGF-I或抗IGF-II抗體或 片段的細胞中提取和純化。純化的cDNA裂成片段(通過剪切、內(nèi)切 核酸酶消化等)，產(chǎn)生DNA或cDNA片段的集合體。然后將來自該集 合體的DNA或cDNA片段克隆到表達載體中，以產(chǎn)生表達載體的基因 組文庫，其成員每個都含有例如X噬菌體文庫中獨特的克隆DNA或 cDNA片段，在原核細胞(例如細菌)或真核細胞(例如哺乳動物、酵 母、昆蟲或真菌)中表達。參見例如Ausubel，同上；Harlow，同上； Colligan，同上；Nyyssonen等，Bio/Technology 11: 591-595 (Can 1993); Marks等，Bio/Technology 11: 1145-1149, 1993。 一旦分離了編碼這些 抗IGF-I或抗IGF-的可變區(qū)或恒定區(qū)的核酸，核酸就可以與其它的恒 定區(qū)或重鏈或輕鏈編碼核酸一起在宿主細胞中適當?shù)乇磉_，以提供以 抑制性活性與IGF-I或IGF-II結(jié)合的重組Mab。這樣的抗體優(yōu)選包含 鼠或人類的抗IGF-I或抗IGF-II可變區(qū)，該可變區(qū)含有具有負責抗原結(jié) 合的互補性決定殘基的框架殘基。在優(yōu)選實施方案中，上述核酸編碼 的抗IGF-I或抗IGF-II的可變輕鏈或重鏈，與SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的至少5個氨基酸的表位結(jié)合。
編碼本發(fā)明的鼠和嵌合抗體、片段和區(qū)域的恒定(C)區(qū)的人類基 因，可以通過已知的方法從人類胎兒肝臟文庫衍生。人類C區(qū)基因可 以源自任何人類細胞，包括表達和生產(chǎn)人類免疫球蛋白的細胞。人類 CH區(qū)可以源自任何已知類型或同種型的人類H鏈，包括7、 m、 a、 S 或€及其亞型，例如G1、 G2、 G3禾PG4。因為H鏈同種型負責抗體的 各種不同的效應功能，CH區(qū)的選擇將以所需的效應功能為指導，例如 補體固定、或抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)中的活性。優(yōu)選 Ch區(qū)源自？1 (IgGl) 、 73 (IgG3)、下4 (IgG4)或(IgM)。
人類抗體和抗體的人源化
人類抗體避免了與具有鼠或大鼠可變區(qū)和/或恒定區(qū)的抗體有關(guān) 的某些問題。存在這種鼠或大鼠來源的蛋白可能導致抗體的快速清除或?qū)е禄颊弋a(chǎn)生針對抗體的免疫應答。為了避免使用鼠或大鼠來源的 抗體，已經(jīng)假定人們可以通過將人類抗體功能導入嚙齒動物使得嚙齒 動物產(chǎn)生具有完全人類序列的抗體，從而開發(fā)出人源化抗體或產(chǎn)生完 全人類的抗體。
在YAC中克隆和重建兆堿基級的人類基因座并將它們導入小鼠 種系中的能力，提供了一種有力的方法來闡明非常大的或粗略作圖的 基因座的功能組分，并為人類疾病產(chǎn)生有用的模型。此外，使用這樣 的技術(shù)將小鼠的基因座用它們的人類等價物代替，為發(fā)育過程中人類 基因產(chǎn)物的表達和調(diào)控、它們與其它系統(tǒng)的聯(lián)絡(luò)、以及它們在疾病誘 導和發(fā)展中的參與，提供了獨特的視角。
這種方略的重要實踐應用是小鼠體液免疫系統(tǒng)的"人源化"。將 人類免疫球蛋白(Ig)基因座導入內(nèi)源性Ig基因已經(jīng)被失活的小鼠中，
為研究抗體的程序化表達和裝配的潛伏機制以及它們在B細胞發(fā)育中
的作用提供了機會。此外，這樣的方略可以為完全人類的單克隆抗體
(Mab)的生產(chǎn)提供理想的來源，這是在邁向人類疾病實現(xiàn)抗體療法的 重要里程碑。完全人類的抗體預期能夠最小化小鼠或小鼠來源的Mab 天生固有的免疫原性和過敏性反應，從而增加了施用抗體的功效和安 全性。完全人類抗體的使用，預期可以在慢性和復發(fā)性人類疾病例如 炎癥、自身免疫和癌癥等需要重復施用抗體的治療中提供顯著的優(yōu)勢。
實現(xiàn)這種目標的一種方法是用人類Ig基因座的大片段對小鼠抗體 生產(chǎn)缺陷的小鼠種系進行改造，以期望這樣的小鼠可以產(chǎn)生人類抗體 的龐大的所有組成成分，同時不含有小鼠抗體。大的人類Ig片段將保 留龐大的可變基因多樣性以及對抗體生產(chǎn)和表達的適當調(diào)控。通過開 發(fā)用于抗體多樣化和篩選以及缺失對人類蛋白的免疫耐受性的小鼠工 具，在這些的小鼠種系中重新產(chǎn)生的人類抗體全部組成成分將產(chǎn)生針 對任何目的抗原、包括人類抗原的高親和力抗體。使用雜交瘤技術(shù)， 可以容易地產(chǎn)生和篩選具有所需特異性的抗原特異性人類Mab。這種通用方略被證實與我們在1994年發(fā)表的第一個XenoMouseTM 種系的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)。參見Green等，Nature Genetics 7: 13-21, 1994。 XenoMouseTM種系用分別含有人類重鏈基因座和k輕鏈基因座的245 kb和190 kb大小的種系表型片段的酵母人工染色體(YAC)進行改造， 這些基因座含有核心可變區(qū)和恒定區(qū)序列ID。含有YAC的人類Ig被 證明在抗體的重排和表達方面與小鼠系統(tǒng)是相容的，并且能夠替代失 活的小鼠Ig基因。這被它們誘導B細胞發(fā)育、產(chǎn)生完全人類抗體的成 人樣人類全部組成成分、以及產(chǎn)生抗原特異性人類Mab的能力所證明。 這些結(jié)果也表明，導入含有較大數(shù)量V基因、其它的調(diào)控元件和人類 Ig恒定區(qū)的人類Ig基因座的較大部分，能夠基本上重現(xiàn)人類針對感染 和預防接種的特征性體液應答的完整的全部組成成分。Green等的工作 最近擴展到了通過分別導入兆堿基對規(guī)模的人類重鏈基因座和k輕鏈 基因座的種系表型YAC片段，導入了超過大約80%的人類抗體全部組 成成分，以產(chǎn)生XenoMouseTM小鼠。參見Mendez等，Nature Genetics 15: 146-156, 1997; Green和Jakobovits， J. Exp. Med. 188: 483-495, 1998;以 及1996年12月3日提交的美國專利申請系列號No. 08/759,620，其公 開內(nèi)容在此引為參考。
這些方法進一步討論和描述于下面的美國專利申請1990年1月 12日提交的系列號No. 07/466,008、 1990年11月8日提交No. 07/610,515、 1992年7月24日提交的No. 07/919,297、 1992年7月30 日提交的No. 07/922，649、1993年3月15日提交的No. 08/031,801 、 1993 年8月27日提交的No. 08/112,848、 1994年4月28日提交的No. 08/234,145、 1995年1月20日提交的No. 08/376,279、 1995年4月27 日提交的No. 08/430， 938、 1995年6月5日提交的No. 08/464,584、 1995 年6月5日提交的No. 08/464,582、 1995年6月5日提交的No. 08/463,191、 1995年6月5日提交的No. 08/462,837、 1995年6月5日 提交的No. 08/486,853、 1995年6月5日提交的No. 08/486,857、 1995 年6月5日提交的No. 08/486,859、 1995年6月5日提交的No.
5608/462,513、 1996年10月2日提交的No. 08/724,752、和1996年12 月3日提交的No. 08/759,620。也參見Mendez等，Nature Genetics 15: 146-156， 1997以及Green和Jakobovits, J. Exp. Med. 188: 483-495， 1998。也參見1996年6月12日授權(quán)公告的歐洲專利No. EP 0 463 151 Bl， 1994年2月3日公布的國際專利申請No. WO 94/02602， 1996年 10月31日公布的國際專利申請No. WO 96/34096，以及1998年6月 11日公布的WO 98/24893。上面引用的每個專利、申請和參考文獻的 公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。
在另一種方法中，其他人，包括GenPharm International, Inc.,使 用了一種"微小基因座"方法。在微小基因座方法中，通過包含來自 Ig基因座的片(個體基因)，模擬了外源Ig基因座。因此， 一個或多 個Vh基因、 一個或多個Dh基因、 一個或多個Jh基因、m恒定區(qū)和第 二個恒定區(qū)(優(yōu)選為7恒定區(qū))被構(gòu)入構(gòu)建體中，用于插入到動物中。 這種方法被描述在Surani的美國專利No. 5,545,807，以及Lonberg和 Kay的各個美國專利No. 5,545,806、 5,625,825、 5,625,126、 5,633,425、 5,661,016、 5,770,429、 5,789,650禾口 5,814,318， Krimpenfort禾口 Berns的 美國專利No. 5,591,669， Berns等的美國專利No. 5，612，205、 5,721,367、 5，789，215，以及Choi和Dunn的美國專利No. 5,643,763，以及GenPharm International于1990年8月29日提交的美國專利申請系列號No. 07/574,748、 1990年8月31日提交的No. 07/575,962、 1991年12月17 日提交的No. 07/810，279、1992年3月18日提交的No. 07/853,408、 1992 年6月23日提交的No. 07/904,068、 1992年12月16日提交的No. 07/990,860、 1993年4月26日提交的No. 08/053,131、 1993年7月22 日提交的No. 08/096,762、 1993年11月18日提交的No. 08/155,301、 1993年12月3日提交的No. 08/161,739、 1993年12月10日提交的 No. 08/165,699、 1994年3月9日提交的No. 08/209,741，其公開的內(nèi) 容在此引為參考。也參見歐洲專利No. 0 546 073 Bl、國際專利申請No. WO 92/03918、 WO 92/22645、 WO 92/22647、 WO 92/22670、 WO 93/12227、 WO 94/00569、 WO 94/25585、 WO 96/14436、 WO 97/13852
57和WO 98/24884，其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。還參見Taylor 等，1992; Chen等，1993; Tuaillon等，1993; Choi等，1993; Lonberg 等，1994; Taylor等，1994禾B Tuaillon等，1995; Fishwild等，1996;
其公開內(nèi)容在此以其全文引為參考。
通過使用微小基因座方法已經(jīng)產(chǎn)生了具有Ig基因座的轉(zhuǎn)基因小 鼠。微小基因座方法的優(yōu)點是包含Ig基因座的部分的構(gòu)建體可以很快 地產(chǎn)生并導入到動物中。但是，相應地，微小基因座方法的一個顯著 缺點是，從理論上說，通過包含小數(shù)量的V、 D和J基因所導入的多樣 性不充分。事實上，發(fā)表的工作顯然支持了這種擔心。通過使用微小 基因座方法產(chǎn)生的動物的B細胞發(fā)育和抗體生產(chǎn)顯得遲緩。因此，圍 繞本發(fā)明進行的研究始終針對導入Ig基因座的大的部分，以便實現(xiàn)更 大的多樣性，并力圖重建動物免疫的全部組成成分。
人類抗小鼠抗體(HAMA)應答已經(jīng)引導制備嵌合或者說是人源 化抗體的工業(yè)。盡管嵌合抗體具有人類恒定區(qū)和鼠類可變區(qū)，但預期 可以觀察到某些人類抗嵌合抗體(HACA)應答，特別是在抗體的長期 或多劑使用中。因此，希望能夠提供針對IGF-I或IGF-II的完全人類抗 體，以便消除對HAMA或HACA應答的擔心和/或影響。
人源化和展示技術(shù)
正如在前面就人類抗體產(chǎn)生所討論的那樣，產(chǎn)生免疫原性降低的 抗體是有利的。在某種程度上，這可以結(jié)合使用人源化技術(shù)和使用適 當文庫的展示技術(shù)來實現(xiàn)。應該認識到，鼠類抗體或其它物種的抗體 可以使用本技術(shù)領(lǐng)域已知的技術(shù)進行人源化或靈長動物化。參見例如 Winter和Harris, Immunol Today 14: 43-46， 1993;以及Wright等，Crit. Reviews in Immunol 12:125- 168, 1992。目的抗體可以通過重組DNA技 術(shù)進行改造，用相應的人類序列代替CHl、 CH2、 CH3、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/ 或框架結(jié)構(gòu)域(參見WO 92/02190和美國專利No. 5，530，101、5,585,089、 5,693,761、 5,693,792、 5,714,350和5，777，085)。此外，使用Ig cDNA來構(gòu)建嵌合的免疫球蛋白基因在本技術(shù)領(lǐng)域中也是己知的(Liu等，
PNAS USA 84: 3439， 1987和J. Immunol. 139: 3521, 1987)。從雜交瘤 或其它產(chǎn)生抗體的細胞分離mRNA，并用其生產(chǎn)cDNA。目的cDNA 可以通過聚合酶鏈反應使用特異性引物來擴增(美國專利No. 4,683,195 和4,683,202)?；蛘?，制備并篩選文庫，以分離目的序列。然后將編 碼抗體可變區(qū)的DNA序列與人類恒定區(qū)序列融合。人類恒定區(qū)基因的 序列可以在Kabat等(1991)《免疫重要的蛋白序列》 (S叫uences of Proteins of Immunological Interest), NIH publication no. 91-3242中找至廿。 人類C區(qū)基因可以從已知的克隆容易地獲得。同種型的選擇可以根據(jù) 所需的效應功能例如補體固定、或在抗體依賴性細胞性細胞毒性中的 活性作為指導。優(yōu)選的同種型是IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。對本發(fā) 明的抗體來說，特別優(yōu)選的同種型是IgG2和IgG4?？梢允褂萌祟愝p鏈 恒定區(qū)k或入的任一種。然后通過常規(guī)的方法表達嵌合的、人源化的 抗體。
抗體片段，例如Fv、 F(ab')2和Fab，可以通過完整蛋白的裂解來 制備，例如蛋白酶或化學裂解?；蛘撸梢栽O(shè)計截短的基因。例如， 編碼F(ab') 2片段的一部分的嵌合基因，將包含編碼CH1結(jié)構(gòu)域和H 鏈的鉸鏈區(qū)的DNA序列，后面跟有翻譯終止密碼子以產(chǎn)生截短的分子。
在另一種方法中，可以使用編碼重鏈和輕鏈J區(qū)的保守序列來設(shè) 計寡核苷酸，用作引物在J區(qū)中導入適用的限制性位點，用于隨后V 區(qū)片段與人類C區(qū)片段的連接。C區(qū)cDNA可以通過位點定向誘變進 行修飾，以便在人類序列的類似位置上放置限制性位點。
表達載體包括質(zhì)粒、反轉(zhuǎn)錄病毒、粘粒、YAC、 EBV衍生的附加 體等。方便的載體是編碼功能完整的人類Ch或Cl免疫球蛋白序列的 載體，帶有改造過的適當?shù)南拗菩晕稽c，以便任何Vh或Vl序列可以 容易地插入和表達。在這樣的載體中，通常在插入的J區(qū)中的剪接供體 位點和人類C區(qū)前的剪接接受體位點之間發(fā)生剪接，剪接也在人類CH外顯子內(nèi)存在的剪接區(qū)域中發(fā)生。多聚腺苷化和轉(zhuǎn)錄終止發(fā)生在編碼 區(qū)下游的天然染色體位點上。產(chǎn)生的嵌合抗體可以與任何強啟動子連
接，包括反轉(zhuǎn)錄病毒的LTR，例如SV-40早期啟動子(Okayama等， Mol. Cell. Bio. 3: 280, 1983)、 Rous肉瘤病毒LTR(Gorman等，P.N.A.S. 79:6777,1982)、以及莫洛尼鼠白血病病毒LTR (Grosschedl等，Cell 41:885,1985)、天然lg啟動子等。
此外，人類抗體或來自其它物種的抗體可以通過展示類型的技術(shù) 來產(chǎn)生，包括但不限于噬菌體展示、反轉(zhuǎn)錄病毒展示、核糖體展示和 其它技術(shù)，使用的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域中熟知，產(chǎn)生的分子可以進行進 一步的成熟，例如親和力成熟，這樣的技術(shù)是本技術(shù)領(lǐng)域中熟知的。 Wright和Harris,同上；Hanes和Plucthau， PNAS USA 94: 4937-4942, 1997 (核糖體展示);Parmley和Smith, Gene 73: 305-318, 1988 (噬菌 體展示);Scott, TIBS 17: 241-245, 1992; Cwirla等，PNAS USA 87: 6378-6382, 1990; Russel等，Nucl. Acids Research 21: 1081-1085, 1993; Hoganboom等，Immunol. Reviews 130: 43-68, 1992; Chiswell和 McCafferty， TIBTECH 10: 80-84， 1992;以及美國專利No. 5,733,743。 如果使用展示技術(shù)生產(chǎn)非人類的抗體，這樣的抗體可以按照上面的描 述進行人源化。
使用這些技術(shù)，可以產(chǎn)生針對IGF-I表達細胞或IGF- II表達細胞、 IGF-I或IGF-II或IGF-I或IGF-II形式、其表位或肽的抗體，以及其表 達文庫(參見例如美國專利No. 5，703，057)，該文庫在隨后可以按照 上面的描述篩選上面描述的活性。
其它治療方法的設(shè)計和產(chǎn)生
按照本發(fā)明并基于在本文中產(chǎn)生和表征的針對IGF-I或IGF-II的 抗體活性，便于設(shè)計其它的治療方法，包括其它的抗體、或抗體之外 的其它拮抗劑或化學部分。這樣的方法包括但不限于具有類似的結(jié)合 活性或功能性的抗體，改進的抗體療法例如雙特異性抗體、免疫毒素和放射性標記治療物、產(chǎn)生肽的治療物、基因治療劑特別是胞內(nèi)抗體、 反義治療物以及小分子。此外，正如上面討論的那樣，本發(fā)明的抗體
的效應功能可以通過同種型轉(zhuǎn)換成IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgD、 IgA、 IgE或IgM而變化，用于各種不同的治療應用。
對于產(chǎn)生補體固定是所需屬性的改進抗體療法來說，可能可以通 過使用例如雙特異性物質(zhì)、免疫毒素或放射性標記物來回避依賴補體 殺死細胞。
對于雙特異性抗體來說，可以產(chǎn)生這樣的雙特異性抗體，它們包 含(i)兩個抗體， 一個對IGF-I或IGF-II具有特異性，另一個針對結(jié)合 在一起的第二種分子具有特異性；(ii)單個抗體，其一條鏈對IGF-I 或IGF-II具有特異性，第二條鏈特異性針對第二種分子；或(m)單鏈
抗體，對IGF-I或IGF-II和其它分子具有特異性。這樣的雙特異性抗體 可以使用眾所周知的技術(shù)來產(chǎn)生，例如對于(i)和(ii)來說，參見例如 Fanger等，Immunol Methods 4: 72-81 ， 1994禾口 Wright禾口 Harris ，同上； 對于(iii)來說，參見例如Traunecker等，Int. J. Cancer 7: 51-52， 1992。
此外，也可以制備"k體(Kappabodies) " (111等，Protein Eng 10: 949-57,1997)、"微小抗體(Minibodies) " (Martin等，EMBO J. 13: 5303-9,1994)、"雙抗體(Diabodies) " (Holliger等，PNAS USA卯: 6444-6448, 1993)或"Janusins" (Traunecker等，EMBO J 10: 3655-3659, 1991禾口 Traunecker等，Int J Cancer 7:51-52， 1992)。
對于免疫毒素來說，可以使用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)對抗體進行 修飾以擔當免疫毒素。參見例如Vitetta, Immunol Today 14: 252, 1993。 也參見美國專利No. 5,194,594。對于制備放射性標記的抗體來說，這 樣的修飾抗體也可以利用本技術(shù)領(lǐng)域熟知的技術(shù)來容易地制備。參見 例如Junghans等，《癌癥的化療和生物療法》(Cancer Chemotherapy and Biotherapy) 655-686 (第二版，Chafier禾口 Longo主編，Lippincott
61Raven, 1996)。也參見美國專利No. 4，681，581 、 4,735,210、 5，101,827、 5,102,990 (RE 35,500) 、 5,648,471和5,697,902。每種免疫毒素和放射 性標記分子都可能殺死表達IGF-I或IGF-II的細胞，特別是本發(fā)明的抗 體在其中是有效的細胞。
對于產(chǎn)生治療肽來說，通過利用與IGF-I或IGF-II有關(guān)的結(jié)構(gòu)信 息和針對它們的抗體例如本發(fā)明的抗體(在下面就小分子迸行討論) 或篩選肽文庫的抗體，可以產(chǎn)生針對IGF-I或IGF-II的治療性肽。肽治 療物的設(shè)計和篩選在Houghten等，Biotechniques 13: 412-421， 1992; Houghten PNAS USA 82: 5131-5135, 1985; Pinalla等，Biotechniques 13: 901-905, 1992; Blake禾卩Litzi-Davis， BioConjugate Chem. 3: 510-513, 1992中討論。免疫毒素和放射性標記的分子也可以用類似的方式，結(jié) 合上面關(guān)于抗體所討論的肽部分來制備。
與抗體與抗原的結(jié)合相關(guān)的重要信息可以通過噬菌體展示實驗來 收集。這樣的實驗通常是通過淘選結(jié)合本發(fā)明抗體的表達隨機肽的噬 菌體文庫完成的，以確定是否可以分離到結(jié)合的肽。如果成功，可以 從結(jié)合的肽收集特定表位的信息。
一般來說，基于噬菌體M13系統(tǒng)，表達隨機肽的噬菌體文庫可以 從New England Biolabs購買(7聚體和12聚體文庫，分別為Ph.D.-7 肽7聚體文庫試劑盒和Ph.D,12肽12聚體文庫試劑盒)。7聚體文庫 代表了大約2.0乂109個獨立克隆的多樣性，代表了 207=1.28 乂10-9個可 能的7聚體序列中的大部分，如果不是全部的話。12聚體文庫含有大 約1.9 X 109個獨立的克隆，代表了 2012=4.1 X 1015個12聚體序列中 的潛在序列空間的僅僅非常少的樣本。每個7聚體和12聚體文庫按照 制造商的推薦方法進行淘選或篩選，其中用抗體包被板來捕獲適當?shù)?抗體(例如用山羊抗人IgGFc來捕獲IgG抗體)，之后清洗。結(jié)合的 噬菌體用0.2 M pH 2.2的甘氨酸-HCl洗脫。經(jīng)過三輪嚴緊性恒定(0.5% Tween)的篩選/擴增后，通過使用DNA測序，可以對來自文庫的與一
62種或多種抗體反應的克隆進行表征。肽的反應性可以通過ELISA測定。 關(guān)于肽的表位分析的進一步討論也可以參見Scott和Smith, Science 249: 386-390， 1990; Cwirla等，PNAS USA 87: 6378-6382, 1990; Felici等， J. Mol. Biol. 222: 301-310, 1991 ; 以及Kuwabara等，Nature Biotechnology 15: 74-78, 1997。
通過本發(fā)明，也便利了通過常規(guī)技術(shù)進行基因和/或反義治療物的 設(shè)計。這樣的方式可以用于調(diào)節(jié)IGF-I或IGF-II的功能。與此相關(guān)，本 發(fā)明的抗體便利了設(shè)計和使用與其相關(guān)的功能性分析方法。反義治療 物的設(shè)計和方略在國際專利申請No. WO 94/29444中進行了詳細的討 論?；蛑委煹脑O(shè)計和方略是眾所周知的。但是，具體來說，使用涉 及胞內(nèi)抗體的基因治療技術(shù)可能證明是特別有利的。參見例如Cheii等， Human Gene Therapy 5: 595-601， 1994禾口 Marasco, Gene Therapy 4: 11-15, 1997。與基因治療物相關(guān)的總體設(shè)計和考慮也在國際專利申請No. WO 97/38137中討論。編碼本發(fā)明的抗體(例如mAb、 m705、 m706、 m708和m708.2或其它)的遺傳物質(zhì)可以包含在適當?shù)谋磉_系統(tǒng)中(無 論是病毒、減毒的病毒、非病毒、裸露的等)并施用于宿主，以在宿 主中體內(nèi)產(chǎn)生抗體。
本發(fā)明中也設(shè)想了小分子治療物?？梢栽诒景l(fā)明的基礎(chǔ)上設(shè)計藥 物以調(diào)節(jié)IGF-I或IGF-II的活性。從IGF-I或IGF-II分子的結(jié)構(gòu)以及它 與本發(fā)明中的其它分子例如本發(fā)明的抗體IGF-IR等的相互作用獲得的 知識，可用于合理地設(shè)計其它的治療方式。就此而言，合理的藥物設(shè) 計技術(shù)例如X-射線晶體學、計算機輔助(或協(xié)助)分子模擬(CAMM)、 定量或定性結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)以及類似的技術(shù)，可用于將藥物 發(fā)現(xiàn)的成就集中起來。合理的設(shè)計允許預測蛋白或合成結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu) 可以與用于修飾或調(diào)節(jié)IGF-I或IGF-II活性的分子或其特定形式發(fā)生相 互作用。這樣的結(jié)構(gòu)可以化學合成或在生物系統(tǒng)中表達。這種方法綜 述在Capsey等的《遺傳工程人類治療藥物》中(Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs, Stockton Press, NY, 1988)。事實上，基于與其它分子(例如本發(fā)明中的抗體)的已知的或勾畫的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系 合理地設(shè)計分子(肽、肽模擬物、小分子等)，已經(jīng)普遍變成了常規(guī)。
參見例如Fry等，Proc Natl Acad Sci USA 95: 12022-7, 1998; Hoffman 等，J Mol Biol 282: 195-208， 1998; Ginalski等，Acta Biochim Pol 44: 557-64,1997; Jouko等，Biochem J 322: 927-35， 1997; Singh等，J Med Chem 40: 1130-5， 1997; Mandel等，Nat Biotechnol 14: 323-8, 1996; Monfardini等，Proc Assoc Am Physicians 108: 420-31, 1996; Furet等， J Comput Aided Mol Des 9: 465-72, 1995。
此外，可以設(shè)計和合成組合文庫并用于篩選程序，例如高通量篩 選工作。
在轉(zhuǎn)基因小鼠中制備抗體
本發(fā)明的抗體優(yōu)選通過利用轉(zhuǎn)基因小鼠來制備，該小鼠中插入了 產(chǎn)生人類抗體的基因組的主要部分，但使其缺乏內(nèi)源性鼠類抗體的產(chǎn) 生。然后，這樣的小鼠能夠生產(chǎn)人類免疫球蛋白分子和抗體，但缺乏 生產(chǎn)鼠類免疫球蛋白分子和抗體。但是，具體來說，小鼠轉(zhuǎn)基因生產(chǎn) 以及從其產(chǎn)生的抗體的優(yōu)選實施方案在1996年12月3日提交的美國
專利申請系列號No. 08/759,620中公開，其公開內(nèi)容在此引為參考。也 參見Mendez等，Nature Genetics 15: 146-156, 1997，其公開內(nèi)容在此引 為參考。
通過使用這樣的技術(shù)，我們生產(chǎn)了針對各種不同抗原的完全人類 的單克隆抗體。擇要而言，我們用目的抗原免疫了 XenoMouseTM系的 小鼠，從表達抗體的小鼠回收了淋巴細胞(例如B細胞)，將這些回 收的細胞與骨髓類型的細胞系融合，制備永生的雜交瘤細胞系，并對 這樣的雜交瘤細胞系進行篩選和選擇，以鑒定生產(chǎn)特異性針對目的抗 原的抗體的雜交瘤細胞系。我們在本發(fā)明中利用這些技術(shù)制備特異性 針對IGF-I和IGF-II的抗體。在本文中，我們描述了產(chǎn)生特異性針對 IGF-I或IGF-II的抗體的多個雜交瘤細胞系的生產(chǎn)。此外，我們提供了這樣的細胞系生產(chǎn)的抗體的性質(zhì)，包括這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷 酸和氨基酸序列分析。
從293浮游式(freestyle)細胞系衍生的抗體mAb m705、 m706、 m708和m708.2按照本文的描述表達。每種通過上述細胞系生產(chǎn)的抗 體是完全的人類IgGl重鏈和人類IgGl輕鏈。 一般來說，本發(fā)明的抗 體具有非常高的親和力，當通過固相或溶液相進行測量時，通常具有 從大約10—9到大約10—"M的Kd。
應該認識到，本發(fā)明的抗體可以在雜交瘤細胞系以外的細胞系中 表達。編碼特定抗體的cDNA或基因組克隆的序列可用于轉(zhuǎn)化適當?shù)?哺乳動物或非哺乳動物宿主細胞。轉(zhuǎn)化可以通過將多核苷酸導入宿主 細胞的任何已知方法來進行，包括，例如，將多核苷酸包裝在病毒(或 病毒載體)中并用病毒(或載體)轉(zhuǎn)導宿主細胞，或通過本技術(shù)領(lǐng)域 已知的轉(zhuǎn)染方法，例如在美國專利No. 4,399,216、 4，912，040、 4,740,461 和4,959,455 (這些專利在此引為參考)中的示例。使用的轉(zhuǎn)化方法依 賴于待轉(zhuǎn)化的宿主。將異源的多核苷酸導入哺乳動物細胞的方法在本 技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的，包括但不限于葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣 沉淀、聚凝胺介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、粒子轟擊、在脂 質(zhì)體、肽結(jié)合物、樹狀聚體中包裹多核苷酸，以及將DNA直接微注射 到核中。
可以用作表達宿主的哺乳動物細胞系在本技術(shù)領(lǐng)域中是熟知的， 包括可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的許多永生化細胞 系，包括但不限于中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSOo、 HeLa細胞、幼 倉鼠腎臟(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例 如HepG2)，以及許多其它的細胞系。非哺乳動物細胞包括但不限于 可用于表達重組抗體的細菌、酵母、昆蟲和植物。對抗體CH2結(jié)構(gòu)域 進行位點定向誘變以消除糖基化可能是優(yōu)選的，以防止由于非人類的 糖基化導致的免疫原性、藥代動力學和/或效應功能的改變。表達方法通過確定何種系統(tǒng)產(chǎn)生最高的表達水平和產(chǎn)生具有組成性IGF-I或
iGF-n結(jié)合性質(zhì)的抗體來選擇。
此外，生產(chǎn)細胞系表達本發(fā)明的抗體(或其它從其產(chǎn)生的部分)
可以使用許多已知的技術(shù)來增強。例如，谷氨酰胺合成酶和DEFR基 因表達系統(tǒng)是在特定條件下增強表達的常用方法。高表達的細胞克隆 可以使用常規(guī)的技術(shù)來鑒定，例如有限稀釋克隆和微滴(Microdrop) 技術(shù)。GS系統(tǒng)在歐洲專利No. 0 216 846、 0 256 055和0 323 997以及 歐洲專利申請No. 89303964.4中進行了全面或部分的討論。
本發(fā)明的抗體也可以轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)，通過產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈和輕 鏈序列目的序列的轉(zhuǎn)基因哺乳動物或植物，并產(chǎn)生可從中回收的抗體 形式來進行。對于在哺乳動物中轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)來說，抗體可以在山羊、 奶?；蚱渌溉閯游锏娜橹猩a(chǎn)和回收。參見例如美國專利No. 5,827,690、 5，756，687、 5,750,172和5,741,957。
對于本發(fā)明抗體的功能性分析來說，這些抗體被證明是IGF-I或 IGF-II及其與IGF-IR結(jié)合的強效抑制劑。例如，本發(fā)明的抗體如mAb m705、 m706、 m708和m708.2被證實與IGF陽I或IGF-I和IGF- II結(jié)合。 參見圖2。例如，本發(fā)明的抗體如mAbm708.2顯示出在MCF-7乳腺癌 細胞中抑制了 IGF-IR的磷酸化。
本發(fā)明所證實的結(jié)果表明，本發(fā)明的抗體具有某些性質(zhì)，其可以 使本發(fā)明的抗體比目前的治療抗體在腫瘤疾病的治療中更有效地對抗 IGF-I或IGF-II。
具體來說，本發(fā)明的抗體mAb m705、 m706、 m708和m708.2具 有高度期望的性質(zhì)。它們的結(jié)構(gòu)特征、功能或活性提供促進了上面討 論的其它抗體或其它分子的設(shè)計或選擇的標準。
66治療方案本發(fā)明提供了藥物組合物，其含有與可藥用載體配制在一起的一種或多種抗體組合、例如針對IGF-I或IGF-II的抗體(單克隆、多克隆或單鏈FV;完整的或其結(jié)合片段)。某些組合物包括多種(例如，兩種以上)本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的組合。在某些組合 物中，組合物的每種抗體或其抗原結(jié)合部分是與抗原獨特的預先選定 的表位結(jié)合的單克隆抗體或人類序列抗體。在預防性應用中，給懷疑患有疾病或病癥(即腫瘤疾病)或處于 該疾病或病癥風險中的患者施用藥物組合物或藥物，其用量足以消除 或降低疾病的風險、降低嚴重性、或延遲發(fā)作，包括疾病的生物化學、 組織學和/或行為學癥狀、疾病發(fā)展過程中其并發(fā)癥以及中間病理表現(xiàn) 型。在治療性應用中，給懷疑患有或已經(jīng)患有這樣的疾病的患者施用 藥物組合物或藥物，其用量足以治愈、或至少部分遏制疾病的癥狀(生 物化學、組織學和/或行為學癥狀)，包括疾病發(fā)展過程中其并發(fā)癥以 及中間病理表現(xiàn)型。足夠?qū)崿F(xiàn)治療性或預防性治療的量被定義為治療 有效或預防有效的劑量。在預防性和治療性方案中，藥劑通常施用數(shù) 劑，直到產(chǎn)生了充分的免疫應答。通常，監(jiān)測免疫應答，如果免疫應 答開始減弱，則重復使用劑量。有效劑量本發(fā)明的抗體組合物，例如針對IGF-I或IGF-II的抗體，在治療 本文描述與癌癥相關(guān)的病癥或疾病例如轉(zhuǎn)移癌時的有效劑量，根據(jù)許 多不同的因素而變化，包括給藥的方式、靶位點、患者的生理狀態(tài)、 患者是人類還是動物、其它用藥、以及治療是預防性的還是治療性的。 通常，患者是人類，但是也可以治療非人類的哺乳動物包括轉(zhuǎn)基因哺 乳動物。治療劑量需要滴定，以使安全性和功效最佳。對于抗體給藥來說，劑量范圍從0.0001到100 mg/kg、更通常0.01 到5 mg/kg宿主體重。例如，劑量可以為1 mg/kg體重或10 mg/kg體重或在1-10 mg/kg的范圍內(nèi)。示例性的治療方案需要每兩周用藥一次， 或每月一次或每3-6個月一次。在某些方法中，兩種以上具有不同結(jié)合 特異性的單克隆抗體同時施用，在這種情況下每種施用的抗體劑量在 所指的范圍內(nèi)?？贵w通常多次施用。單劑之間的間隔可以是周、月或 年。間隔也可以是不規(guī)則的，按照所測量的患者血液抗體水平來指示。 在某些方法中，將劑量調(diào)整到使血漿抗體濃度達到l-1000Mg/ml，在某 些方法中調(diào)整到25-300叫/ml?；蛘?，抗體也可以作為持續(xù)釋放的制劑 給藥，在這種情況下需要降低給藥頻率。劑量和頻率根據(jù)患者中抗體 的半衰期而變化。 一般來說，人類抗體顯示出最長的半衰期，然后是 人源化抗體、嵌合抗體和非人類抗體。給藥的劑量和頻率可以根據(jù)治 療是預防性的還是治療性的而變化。在預防性應用中，可以在較長時 期中以相對低的頻率施用相對低的劑量。 一些患者在其余生持續(xù)接受 治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的時間間隔使用相對高的 劑量，直到疾病的進程降低或終止，并優(yōu)選直到患者顯示出疾病癥狀 的部分或完全緩解。然后，患者可以施用預防性方案。編碼免疫原的核酸的劑量范圍從每個患者大約10ng到l g、100 ng 到100mg、 1 pg至lj 10 mg、或30-300pgDNA。感染性病毒載體的劑量 在每劑10-100或更多病毒粒子的范圍內(nèi)變化。給藥途徑誘導免疫應答的抗體組合物，例如針對IGF-I或IGF-II抗體，用 于治療與癌癥相關(guān)的病癥和疾病，例如轉(zhuǎn)移癌，其可以通過腸胃外、 局部、靜脈、口服、皮下、動脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或肌內(nèi)方式 給藥，作為吸入物用于抗體制劑靶向腦部病變的預防性治療，和/或治療性治療。免疫原性劑的最典型的給藥途徑是皮下，盡管其它途徑也 同樣有效。其次最常見的途徑是肌內(nèi)注射。這種類型的注射最典型是 在臂部或腿部肌肉內(nèi)進行。在某些方法中，藥劑被直接注射到沉積物 要積累的具體組織中，例如顱內(nèi)注射。肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)輸注對于抗體的給藥是優(yōu)選的。在某些方法中，具體的治療性抗體被直接注射到68顱內(nèi)。在某些方法中，抗體作為緩釋組合物或裝置例如MedipadTM裝置 施用。
本發(fā)明的藥劑能夠任選與至少部分有效地治療各種不同的疾病包 括各種不同的癌癥相關(guān)疾病的其它藥劑組合給藥。在腫瘤轉(zhuǎn)移到腦的 情況下，本發(fā)明的藥劑也可以與增加本發(fā)明的藥劑通過血腦屏障 (BBB)的其它藥劑結(jié)合給藥。
制劑
用于誘導免疫應答的抗體組合物，例如針對IGF-I或IGF-II抗體， 用于治療與癌癥相關(guān)的病癥和疾病例如轉(zhuǎn)移癌，通常是作為含有活性 治療劑，即，與各種不同的其它可藥用成分的藥物組合物施用。(參 見《雷氏藥物學》(Remington's Pharmaceutical Science)第15版，Mack Publishing Company, Easton， Pa.， 1980)。優(yōu)選的形式依賴于目的給藥 方式和治療應用。根據(jù)所需的制劑，組合物也可以包含可藥用的、無 毒性的載體或稀釋劑，它們被定義為通常用于配制動物或人類給藥的 藥物組合物的介質(zhì)。選擇稀釋劑，使其不影響組合的生物學活性。這 樣的稀釋劑的例子是蒸餾水、生理磷酸鹽緩沖的鹽水、林格(Ringer's) 溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。此外，藥物組合物或制劑也可以含 有其它的載體、佐劑或無毒性的、非治療性的、無免疫原性的穩(wěn)定劑 等。
藥物組合物也可以含有大型的代謝緩慢的大分子例如蛋白、多糖 如殼聚糖、聚乙酸、聚羥基乙酸和共聚物(例如膠乳功能化的 SepharoseTM、瓊脂糖、纖維素等)、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物和
脂類聚集體(例如油滴或脂質(zhì)體)。此外，這些載體可以作為免疫刺 激劑(即佐劑)發(fā)揮作用。
對于腸胃外給藥來說，本發(fā)明的組合物可以作為物質(zhì)在生理可接 受的稀釋劑與可藥用載體的溶液或懸浮液的可注射劑給藥，可藥用載體可以是無菌液體例如水油類、鹽水、甘油或乙醇。此外，輔助物質(zhì)例如潤濕劑或乳化劑、表面活性劑、pH緩沖物質(zhì)等也可以存在于組合物中。藥物組合物的其它成分是石油、動物、植物或合成來源的成分，例如花生油、大豆油和礦物油。 一般來說，多元醇例如丙二醇或聚乙二醇是優(yōu)選的液體載體，特別是對于可注射溶液來說。抗體可以以積存(depot)注射劑或植入制劑的形式給藥，它們可以被配制成可以使得活性成分的持續(xù)釋放。示例性的組合物含有5 mg/mL單克隆抗體，配制在由50 mM L-組氨酸和150 mM NaCl組成的水性緩沖液中，用HCl調(diào)整到pH6.0。
通常，組合物被制備成可注射物，例如液體溶液或懸浮液；也可以制備成適合在注射前溶解或懸浮在液體介質(zhì)中的固體形式。制劑也可以乳化或包裹在脂質(zhì)體或微粒例如聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中，以增強上面討論過的佐劑的效果。Langer, Science 249: 1527， 19卯和Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997。本發(fā)明的藥劑可以以積存注射劑或植入制劑的形式給藥，它們可以被配制成允許活性成分的持續(xù)或脈沖式的釋放。
適于其它給藥方式的其它制劑包括口服、鼻內(nèi)和肺部制劑、栓劑和透皮敷劑。
對于栓劑來說，粘合劑和載體包括例如聚亞垸基二醇或甘油三酯；這樣的栓劑可以從含有0.5%至1」10%、優(yōu)選1%到2%范圍的活性成分的混合物形成?？诜苿┌x形劑、例如藥品級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素和碳酸鎂。這些組合物采取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末的形式，并含有10%-95%的活性成分，優(yōu)選25%-70%。
局部敷劑可以產(chǎn)生透皮或皮內(nèi)投送。局部給藥可以通過將藥劑與霍亂毒素或其脫毒衍生物或亞基或其它類似的細菌毒素共同給藥來促進。Glenn等，Nature 391: 851, 1998。共同給藥可以通過將成分作為混合物或作為通過化學交聯(lián)或表達為融合蛋白而獲得的連接分子進行使用來實現(xiàn)。
或者，透皮投送可以使用皮膚貼劑或使用轉(zhuǎn)移體(transferosome)來實現(xiàn)。Paul等，Eur. J. Immunol. 25: 3521-24， 1995; Cevc等，Biochem.Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998。
藥物組合物一般被配置成無菌的、基本上等滲的，并完全符合美國藥品與食品管理局的所有良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)法規(guī)。
診斷應用
本發(fā)明的抗體和抗體組合物用作診斷試劑的特征。用于診斷方法以鑒定轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞例如轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞的人類抗體，優(yōu)選使用上面描述的方法來生產(chǎn)。這些方法事實上產(chǎn)生了無限數(shù)量的本發(fā)明的抗體和抗體組合物，具有對任何所需抗原的任何表位結(jié)合特異性和非
常高的結(jié)合親和力。 一般來說，抗體對其靶的結(jié)合親和力越高，在免疫分析中為除去非特異性結(jié)合的物質(zhì)而不除去靶抗原可以執(zhí)行的清洗條件越嚴緊。因此，在上述分析中使用的本發(fā)明的抗體和抗體組合物通常具有至少108、 109、 101Q、 10"或1012 M"的結(jié)合親和力。此外，期望用作診斷試劑的抗體具有足夠的速度(on-mte)，以在標準條件下在至少12小時、優(yōu)選至少5小時和更優(yōu)選至少1小時內(nèi)達到平衡。
在要求了權(quán)利的方法中使用的本發(fā)明的抗體和抗體組合物優(yōu)選具有高的免疫反應性，即抗體分子正確折疊以便它們能夠與它們的靶抗原特異性結(jié)合的百分率。這可以通過將編碼抗體的序列如上所述在大
腸桿菌中表達來實現(xiàn)。這樣的表達通常產(chǎn)生至少80%、90%、95%或99%的免疫反應性。
本發(fā)明的某些方法利用了本發(fā)明的抗體和抗體組合物的多克隆制
71劑作為診斷試劑，其它方法使用了單克隆分離物。使用多克隆混合物 相對于由一種單克隆抗體制成的組合物來說有許多優(yōu)點。通過與靶上 的多個位點結(jié)合，多克隆抗體或其它多肽可以產(chǎn)生比結(jié)合單一位點的 單克隆抗體更強的信號(用于診斷)。此外，單克隆制劑可以與原型 耙序列的大量變異體(例如等位基因變異體、種變異體、株變異體、 藥物誘導的脫逸變異體)結(jié)合，而單克隆抗體可能只與原型序列或其 較窄范圍的變異體結(jié)合。但是，單克隆抗體在存在或可能存在緊密相 關(guān)的抗原下檢測單一抗原是有利的。
在使用按照前述的方法制備的多克隆人類抗體的方法中，制劑通 常含有對于目的耙抗原具有不同表位特異性的多種不同的抗體。在使 用單克隆抗體的某些方法中，希望含有具有不同表位結(jié)合特異性的兩 種抗體。表位結(jié)合特異性的不同可以通過競爭分析來確定。
樣品和靶。盡管人類抗體可以用作任何種類樣品的診斷試劑，但 作為人類樣品的診斷試劑最為有用。樣品可以從患者的任何組織或體 液獲得。樣品的優(yōu)選來源包括全血、血槳、精液、唾液、淚液、尿液、 糞便物質(zhì)、汗液、口頰、皮膚和毛發(fā)。樣品也可以從內(nèi)部器官的活體 組織檢查或從癌癥獲得。樣品可以從進行診斷或研究的臨床患者獲得， 或者可以從無病的個體獲得，作為對照或用于基礎(chǔ)研究。
方法可用于檢測任何類型的靶抗原。示例性的靶抗原包括引起人 類疾病的細菌、真菌和病毒病原體，例如HIV、肝炎(甲型、乙型和 丙型)、流感、皰疹、賈第鞭毛蟲、瘧疾、利什曼原蟲、金黃色葡萄
球菌(Staphylococcus aureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 其它的靶抗原是其表達水平或組成與人類疾病或其它表現(xiàn)型有關(guān)的人 類蛋白。這樣的抗原的例子包括粘附蛋白、激素、生長因子、細胞受 體、自身抗原、自身抗體和淀粉樣沉積。其它的目的靶包括腫瘤細胞 抗原，例如癌胚抗原。其它目的抗原是I類和II類MHC抗原。用于診斷分析的形式。人類抗體可以以多種不同的標準分析形式
用于檢測給定的靶。這樣的形式包括免疫沉淀、Western印跡、ELISA、 放射免疫分析和免疫測量分析。參見Harlow & Lane，同上；美國專利 No. 3,791,932、 3,839,153、 3,850,752、 3，879，262、 4，034，074、 3,791,932、 3，817，837、 3,839,153、 3,850,752、 3，850，578、 3,853,987、 3,867,517、 3,879,262、 3,901,654、 3,935,074、 3,984,533、 3，996，345、 4，034，074禾口 4,098,876，每個在此以其全文并且出于所有目的引為參考。
免疫測量或三明治分析法是優(yōu)選的形式。參見美國專利No. 4,376,110、 4,486,530、 5，914，241禾P 5,965,375，每個在此以其全文并且 出于所有目的引為參考。這樣的分析方法使用了固定在固相上的一種 抗體或一群抗體，以及溶液中的另一種抗體或一群抗體。典型情況下， 溶液中的抗體或抗體群是標記的。如果使用抗體群，它們通常含有與 靶抗原內(nèi)的不同表位特異性結(jié)合的抗體。因此，同一群抗體可用于固 相和溶液抗體。如果使用單克隆抗體，具有不同結(jié)合特異性的第一種 和第二種單克隆抗體被用于固相和溶液相。固相和溶液抗體可以以任 何次序或同時與靶抗原接觸。如果固定相抗體先接觸，分析被稱為正 向分析。相反，如果溶液抗體先接觸，分析被稱為反向分析。如果靶 與兩種抗體同時接觸，分析被稱為同時分析。在將靶與抗體接觸后， 將樣品溫育一段時間，通常在大約10分鐘到大約24小時之間變化， 通常為大約1小時。然后進行清洗步驟，以除去樣品中沒有與用作診 斷試劑的抗體特異性結(jié)合的成分。當固相和溶液抗體在分別的步驟中 進行結(jié)合時，清洗可以在任何一個或這兩個結(jié)合步驟之后進行。清洗 后，對結(jié)合進行定量，通常是檢測通過標記的溶液抗體結(jié)合而連接到 固相上的標記物來進行的。通常，對于給定的一對抗體或一群抗體和 給定的反應條件來說，從含有己知濃度的靶抗原的樣品制備標準曲線。 然后通過內(nèi)推法從校正曲線讀出被測試的樣品中抗原的濃度。被分析 物可以從平衡時被結(jié)合的標記的溶液抗體的量測量，或通過在平衡達 到之前的一系列時間點處動力學測量結(jié)合的標記溶液抗體進行測量。 這樣的曲線的斜率是樣品中所測量的靶濃度。用于上述方法的適當支持物包括例如硝酸纖維素膜、尼龍膜以及 衍生化的尼龍膜，還有粒子，例如瓊脂糖、基于葡聚糖的凝膠、浸試
條(dipsticks)、微粒、微球、磁性粒子、試管、微量滴定板、SEPHADEXtm (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway N丄)。固定化可以通過吸 附或通過共價結(jié)合。任選抗體可以與接頭分子例如生物素連接，用于 結(jié)合表面結(jié)合接頭例如親和素。
標記物
在分析中使用的具體標記物或可檢測基團不是本發(fā)明的關(guān)鍵方 面，只要它不顯著干擾分析中使用的抗體的特異性結(jié)合就行?？蓹z測 基團可以是任何具有可檢測的物理或化學性質(zhì)的物質(zhì)。這樣的可檢測 標記物在免疫分析領(lǐng)域中已經(jīng)得到了很好的發(fā)展， 一般來說，大部分 任何可用于這樣的方法中的標記物都可應用于本發(fā)明。因此，標記物 是可以通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化 學方法檢測的任何組成。在本發(fā)明中有用的標記物包括磁珠(例如 DynabeadsTM)、熒光染料(例如熒光素異硫氰酸酯、德克薩斯紅、羅 丹明等)、放射性標記物(例如3h、 14C、 35S、 125I、 121I、 112In、 "mTc) 其它成像劑例如微泡(用于超聲成像、18F、 UC、 150 (用于正電子發(fā)射 斷層成像)、"mTC、 mIn (用于單光子發(fā)射斷層成像)、酶(例如辣 根過氧化物酶、堿性磷酸酶和其它在ELISA中常用的酶)，以及量熱 標記物例如膠體金或彩色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠 等)珠子。描述了這樣的標記物的應用的專利包括美國專利No. 3,817,837、 3,850,752、 3，939，350、 3,996,345、 4，277，437、 4,275,149和 4,366,241，每個在此以其全文并出于所有目的引為參考。也參見《熒 光探針和研究化學物質(zhì)手冊》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(第6版)，Molecular Probes, Inc., Eugene OR.。
標記物可以按照本技術(shù)領(lǐng)域熟知的方法直接或間接地與所需的分 析成分結(jié)合。正如上面指出的那樣，可以使用多種多樣的標記物，標
74記物的選擇依賴于所需的靈敏度、與化合物結(jié)合的容易程度、穩(wěn)定性 要求、可用的儀器以及處置規(guī)定。
非放射性標記物通常通過間接方法連接。 一般來說，將配體分子 (例如生物素)共價連接到分子上。然后將配體與抗配體(例如鏈親 和素)分子結(jié)合，后者或者本身可檢測，或者與信號系統(tǒng)例如可檢測 的酶、熒光化合物或化學發(fā)光化合物共價連接?？梢允褂枚喾N配體和 抗配體。當配體具有天然的抗配體時，例如生物素、甲狀腺素和皮質(zhì) 醇，它可以聯(lián)合標記的、天然存在的抗配體使用?；蛘?，任何半抗原 或抗原性化合物可以與抗體組合使用。
分子也可以與信號產(chǎn)生化合物直接結(jié)合，例如通過與酶或熒光團 結(jié)合。用作標記物的目的酶主要是水解酶，特別是磷酸酶、酯酶和糖 苷酶，或氧化還原酶、特別是過氧化物酶。熒光化合物包括熒光素及 其衍生物、羅丹明及其衍生物、丹磺酰、7-羥基香豆素等?；瘜W發(fā)光化 合物包括熒光素和2,3-二氫酞嗪二酮，例如魯米諾。對于可以使用的各
種不同標記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述，參見美國專利No. 4,391,904，在 此以其全文并出于所有目的引為參考。
檢測標記物的方法對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員來說是熟知的。因 此，例如，當標記物是放射性標記物時，檢測工具包括放射自顯影中 的閃爍計數(shù)器或照相底片。當標記物是熒光標記物時，可以通過用適 當波長的光激發(fā)熒光色素并檢測產(chǎn)生的熒光來進行檢測。熒光可以通 過照相底片、通過使用電子檢測器例如電荷耦合器件(CCD)或光電 倍增器等進行目測檢測。同樣地，酶標記物可以通過提供酶的適合底 物并檢測得到的反應產(chǎn)物來檢測。最后，簡單的量熱標記物可以簡單 地通過觀察與標記物相關(guān)的顏色來檢測。因此，在各種浸試條分析中， 結(jié)合的金通常顯示粉紅色，而各種結(jié)合的珠子顯示出珠子的顏色。
某些分析形式不需要使用標記的成分。例如，凝集分析可用于檢測靶抗體的存在。在這種情況中，抗原包被的顆粒被含有靶抗體的樣 品凝集。在這種形式中，成分不需要標記，靶抗體的存在通過簡單的 目測檢查來檢測。
通常，IGF-I或IGF-II蛋白和針對IGF-I或IGF-II的抗體，通過與 提供可檢測信號的物質(zhì)共價或非共價地連接進行標記。
毒性
優(yōu)選治療有效劑量的本文描述的抗體組合物將提供治療益處而不 產(chǎn)生顯著的毒性。
本文描述的蛋白的毒性可以通過在細胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀯游镏械臉?準藥物學方法來測定，例如通過測定LDs。(群體的50%致死劑量)或 LD1Qo (群體的100%致死劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率是治 療指數(shù)。從這些細胞培養(yǎng)物分析和動物研究獲得的數(shù)據(jù)可用于調(diào)配對 人類使用無毒性的劑量范圍。本文描述的蛋白的劑量優(yōu)選位于循環(huán)濃 度的范圍內(nèi)，包括毒性很低或沒有毒性的有效劑量。劑量可以在該范 圍內(nèi)根據(jù)使用的劑型和采用的給藥途徑而變化。準確的制劑、給藥途 徑和劑量可以由具體醫(yī)生根據(jù)患者的情況選擇(參見例如Fingl等， 1975，《治療的藥物學基礎(chǔ)》第一章(The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 )。
試劑盒
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括了含有本發(fā)明的組合物(例如單克隆抗 體、人類序列抗體、人類抗體、多特異性和雙特異性分子)以及使用 說明書的試劑盒。試劑盒還可以含有至少一種其它試劑，或本發(fā)明的 一種或多種其它人類抗體(例如與第一種人類抗體不同的抗原中的表 位結(jié)合的、具有互補活性的人類抗體)。試劑盒通常包含了標簽，指 示試劑盒中的包含物的目的用途。術(shù)語標簽包括試劑盒上或與試劑盒 一起提供、或者說隨著試劑盒提供的任何書寫的或記錄的材料。下列在本說明書中描述和下面的實施例中進一步描述的CDNA克 隆，將根據(jù)布達佩斯公約的要求于_保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏
中心(American Type Culture Collection) ， 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209。 m705 VH的cDNA克隆的ATCC登錄號
為_，保藏于_。 m705 VL的cDNA克隆的ATCC登錄
號為_，保藏于_。 m706 Vh的cDNA克隆的ATCC
登錄號為._，保藏于_。 m706 VL的cDNA克隆的
ATCC登錄號為_，保藏于_。 m708 VH的cDNA克隆
的ATCC登錄號為_，保藏于_。 m708 VL的cDNA克
隆的ATCC登錄號為_，保藏于_。m708.2 VH的cDNA
克隆的ATCC登錄號為_，保藏于_。 m708.2 VL的
cDNA克隆的ATCC登錄號為_，保藏于_。
根據(jù)本公開，其它的實施方案和應用對于本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員 來說是顯而易見的。
示例的實施方案 實施例1
針對人類IGF-I的噬菌體展示的人類Fab的篩選 大多數(shù)，如果不是所有，現(xiàn)有的針對IGF-II的抗體不是人類的， 而通常是小鼠來源的。為了發(fā)展針對IGF-II的人類mAb，我們使用了 最近開發(fā)的、含有10"個不同的噬菌體展示的Fab的天然人類Fab大 文庫。將重組人類IGF-I與dynal珠結(jié)合，用作靶抗原進行抗體文庫的 淘選。經(jīng)過三輪淘選之后，使用IGF-I作為靶，通過噬菌體ELISA篩 選了 200個隨機的個體噬菌體克隆。在表現(xiàn)出與IGF-I明顯結(jié)合并進行 了測序的克隆中，3個Fab具有獨特的序列s;將它們在細菌中作為可 溶性Fab進行表達，純化，并測試結(jié)合活性。兩個被命名為m705和 m706的Fab只顯示出對IGF-I的結(jié)合特異性，而一個Fab， m708，在 ELISA中顯示出了顯著水平的與IGF I和IGF II 二者的結(jié)合，并被選擇
77用于親和力成熟和表征。
在按照材料和方法中的描述進行輕鏈改組的m708突變體文庫構(gòu) 建后，獲得了 2xl()S個獨立的克隆。針對結(jié)合了 IGFI的珠子進行了兩 輪淘選，通過噬菌體ELISA從第二輪的淘選中篩選出200個克隆，經(jīng) 過DNA測序和ELISA結(jié)合測試后鑒定到5個獨特的克隆，克隆m708.2 顯示出對IGF I和IGF II 二者的結(jié)合活性最高，被選出進行下一步的表 征。
表i、具有被鑒定的CDR1、 CDR2和CDR3的m705和m706抗體
蛋白序列。
m705 (IGF-I特異性mAb)
VH
CDR3
(SEQ ID NO: 1)
PRLLV
CDR2
COORRRWPPGATFGGGTKVEIKR
CDR3 (SEQ ID NO: 2)
m706 (IGF-I特異性mAb)VH
CDR]
OGLEWMGGIIPIFGTANYAOKFOGRVTITADESASTAYMELSS CDR2
VT VSS
CDR3
(SEQ ID NO: 3)
VL
OASOSVLTOPPSVSAAPGORVSISCSGSSSNIGNYHVSWYOH
CDRl
CDR2
GDYYCATWDTSLRWVFGTGTKVTVL CDR3
(SEQ ID NO: 4)
表2、m708和m708.2是針對IGF-I和IGF-II的交叉反應性單克隆 抗體。具有被鑒定的CDR1、 CDR2和CDR3的Vh和Vl抗體蛋白序列。
AP G
TSTAYMELSSL
CDR3
(SEQ ID NO: 5)
VL DIi
CDR2
COOSYSTPSTFGGGTKVEIKR
CDR3 (SEQ ID NO: 6)
CDRl
SSLQPEDFATYY
79CDR3
(SEQ ID NO: 7)
VL
CDR2
DFATYFCOOTYSPPITFGOGTRLEIKR CDR3
(SEQ ID NO: 8)
表1顯示了 IGF-I特異性單克隆抗體m705和m706的Vh和VL區(qū)。 每個抗體的CDR區(qū)被下劃線。表1顯示了 IGF-I特異性和IGF-II特異 性單克隆抗體m708和m708.2的Vh和Vl區(qū)。每個抗體的CDR區(qū)被 下劃線。m708和m708.2的CDR區(qū)序列是VL: Q S I S S (SEQ ID NO: 9)， VL: A A S (SEQ ID NO: 10), VL:Q QSYSTPSTF (SEQ ID NO: 11)， VH: G G T F S S Y A (SEQ ID NO: 12), VH: G I I P I L G I A (SEQ ID NO: 13)，和VH: A R G P RGY S Y N F D Y (SEQ ID NO: 14)。
圖1顯示了針對IGF-I篩選的與IGF-I或IGF-I和IGF-II結(jié)合的人 類單克隆抗體。m705 (No. 5)和m706 (No. 6)與IGF-I反應但不與IGF- II 反應。m708 (No. 8)與IGF-I和IGF-II交叉反應。
圖2顯示了與IGF-I和IGF-II結(jié)合的IgG 708.2的ELISA結(jié)合分 析。使用m708 Fab和m606 Fab結(jié)合作為對照，顯示了 m708.2 Fab與 人類IGF-I和IGF-II的ELISA結(jié)合分析。IgG 708.2 Fab證實了對IGF-I 和IGF-II 二者的結(jié)合親和力。IgG 606 Fab證實了對IGF-II的結(jié)合親和 力。IgG 708 Fab證實了對IGF-I的結(jié)合親和力高于它對IGF-II的結(jié)合 親和力。實施例2
抑制IGF-IR和胰島素受體的磷酸化
圖3顯示了 IgG 708.2在MCF-7細胞中抑制了 IGF-IR的磷酸化。 MCF-7細胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓6小時，然后加入含有1.5 nM IGF-I 或lOnMIGF-II以及標明濃度的IgG708.2的處理培養(yǎng)基。20分鐘后將 細胞冷卻并裂解。將IGF-IR免疫沉淀，使用磷酸酪氨酸特異性單克隆 抗體檢測磷酸化的受體。IGF-IR的總量通過使用與免疫沉淀中同樣的 多克隆抗體來檢測。
圖4顯示了通過針對IGF-I篩選到的人類單克隆抗體抑制IGF-I 與可溶性IGF-IR的結(jié)合。m705和m708的濃度是400 nM。 m706的濃 度是100nM。 IGF-I的濃度是50 nM， IGF-II是500 nM。
圖5顯示了在MCF7細胞中，通過抗IGF-II人類抗體IgGl m708 對IGF-II和IGF-I誘導的IGF-IR磷酸化的劑量依賴性抑帝lj。m708的濃 度是從0到125 nM。 IGF-I的濃度是1.5 nM， IGF-II是10 nM。
圖6顯示了IgGl m708.2對癌癥細胞運動性的抑制。癌癥細胞的 運動性對于腫瘤的轉(zhuǎn)移是根本的。進行了細胞遷移分析以測試IgG m708.2是否能夠抑制MCF-7細胞遷移通過8 pm的膜孔。40 nmol/L濃 度的IgG m708.2在含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基中抑制了 40%的細胞遷 移。
圖7顯示了通過ELISA分析檢測的單克隆抗體m705、 m706和 m708對IGF-I和IGF-II的結(jié)合特異性。數(shù)據(jù)顯示出m705和m706與 IGF-I特異性結(jié)合，而m708與IGF-I和IGF-II 二者結(jié)合。
圖8顯示了單克隆抗體m705、 m706和m708在IGF-I和IGF-I受 體之間結(jié)合的結(jié)合競爭。m705、 m706和m708每個都顯示出在IGF-I 和IGF-I受體之間結(jié)合的競爭性抑制。圖9顯示了單克隆抗體m708.2 IgG與IGF-II的結(jié)合。m708.2 IgG與IGF II的結(jié)合親和力Kd為大約0.8 x 10—1Q M。
單克隆抗體m705和m706對于人類IGF-I具有高結(jié)合特異性，但不與人類胰島素結(jié)合。單克隆抗體m708和m708.2對人類IGF-I和人類IGF-II具有高的結(jié)合特異性，并且不與人類胰島素結(jié)合。
實施例3材料與方法
噬菌體展示Fab文庫的淘選。重組人類IGF I被用于篩選含有101()個獨特克隆的人類天然Fab噬菌體文庫。Zhang等，J. Virol. 78:9233-9242, 2004。重組人類IGF I被結(jié)合到磁珠上用作文庫淘選的靶。10Mg抗原被用于第一輪淘選。1012個擴增的噬菌體用于淘選，清洗后，將結(jié)合在珠子上的噬菌體直接用于感染指數(shù)生長的TG1細胞，并用M13K07輔助噬菌體拯救。淘選用2pg抗原重復兩次，每輪后清洗IO次。在第三輪后挑取200個個體菌落，接種到96孔板中的2YT培養(yǎng)基中，用于噬菌體ELISA篩選。
輕鏈改組的噬菌體展示文庫的產(chǎn)生和篩選。原始的人類Fab噬菌體展示文庫被用作改組文庫中的VL全部組成成分的來源。從原始文庫制備的噬粒首先用Nco I和Spe I消化，然后在瓊脂糖凝膠上進行電泳以缺失所有的VH全部組成成分?？寺708的VH結(jié)構(gòu)域的編碼基因通過Stmtagene的易錯PCR試劑盒進行擴增以導入隨機突變，然后通過交疊延伸拼接(SOE) PCR與CH1基因片段融合。將融合的片段用NcoI和SpeI消化，從凝膠中純化，然后連接到純化的骨架載體中，產(chǎn)生VL改組的Fab全部組成成分。用連接混合物通過電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1細胞。將轉(zhuǎn)化的TG1細胞平鋪在含有100 Mg/ml氨芐青霉素和2。/。葡萄糖的2YT瓊脂板上。在37。C溫育過夜后，將所有在平板上生長的菌落刮到5ml 2YTAG培養(yǎng)基中，與1.2 ml 50%甘油混合(終
82濃度為10%)，分成等份，儲存在-70。C作為突變文庫儲液。
針對IGF-I篩選VL改組的文庫。文庫儲液(100 pl)在20 ml 2YT 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)期，用M13K07輔助噬菌體拯救，在2YT培養(yǎng)基 中(含有100 /zg/ml氨芐青霉素和50 Aig/ml卡那霉素的2YT)在30°C 擴增過夜。將噬菌體制備物在4。/。PEG、 0.5MNaCl中沉淀，重新懸浮 在lmlPBS中，作為噬菌體文庫儲液。按照原始文庫淘選中的描述， 在結(jié)合了人類IGF-I的磁珠上進行兩輪生物淘選。
從Fab到IgGl的轉(zhuǎn)變。將pComb3H中的Fab克隆到pDR12中， 以允許同時表達重鏈和輕鏈。參見，例如，BarbasIII等《噬菌體展示 實驗室手冊》(Phage Display, A Laboratory Manual) ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001 。簡單來說，首 先通過Xba I和Sac I位點將重鏈可變區(qū)克隆到pDR12中。然后通過 HindIII和EcoRI位點將輕鏈序列(VL + CL)克隆到pDR12中。
Fab禾P IgGl的表達。用含有Fab序列的pCombni質(zhì)粒轉(zhuǎn)化HB2151 細胞。將單個新鮮的菌落接種到2YT培養(yǎng)基+100Ag/mL氨芐青霉素 + 0.2%葡萄糖中。將培養(yǎng)物在37°C以250 rpm搖動，直到A600=0.5。 加入異丙基-L-硫代-h-D-半乳糖吡喃糖苷(lmmol/L)以誘導表達。在 30。C過夜生長后收獲培養(yǎng)物。將細菌以5,000 Xg離心15分鐘。將沉 淀重新懸浮在含有多粘菌素B (10,000單位/mL)的PBS中。通過在 室溫溫育45分鐘將可溶性Fab從外周胞質(zhì)釋放出來。提取物以15,000g 離心30分鐘進行澄清?；厥粘吻宓纳锨逡河糜谠诘鞍譍柱子上純化。
IgGl在293浮游式細胞中表達。按照制造商(Invitrogen)的說明 書，使用293Fectin來轉(zhuǎn)染293浮游式細胞。轉(zhuǎn)染4天后，收獲培養(yǎng)上 清液。在蛋白A柱子上純化IgG。
ELISA結(jié)合分析?？乖?0 ng/孔的量在窄孔96孔板上于4°C包被過夜。對于噬菌體ELISA來說，將來自每輪淘選的101()個噬菌體與 抗原溫育。結(jié)合的噬菌體用抗M13-HRP多克隆抗體(Pharmacia, Piscataway， NJ)檢測。對于可溶性Fab結(jié)合分析來說，使用抗Flag HRP 結(jié)合物來檢測結(jié)合。
通過表面等離子體共振測定動力學速度常數(shù)和親和力。通過表面 等離子體共振技術(shù)，使用Biacore 1000儀器(Pharmacia),分析了各 種不同的Fab與人類IGF I和IGF-II之間的相互作用。使用碳二亞胺偶 聯(lián)化學將IGFI和IGF-II共價固定在傳感芯片(CM5)上。制備了對照 參比表面用于非特異性結(jié)合和折射率變化。對于相互作用的動力學分 析來說，以30/iL/分鐘的流速注射不同濃度的Fab，使用的運行緩沖液 含有150 mmol/L NaCl、 3 mmol/L EDTA和0.005% P-20 (pH 7.4)。通過 使用非線性數(shù)據(jù)分析程序BIAevaluation 3.2，將結(jié)合和解離相數(shù)據(jù)與 l:lLangumir整體模型同時擬合。所有的實驗在25。C進行。
磷酸化分析。將MCF-7細胞以每個孔1.0X 106個細胞的量接種到 6孔板中的完全生長培養(yǎng)基中。過夜培養(yǎng)后，用無血清DMEM漂洗細 胞，然后在無血清DMEM中培養(yǎng)6小時。將細胞與各種不同濃度的重 組Fab或IgG溫育30分鐘，然后加入IGF-II至終濃度為10 nmol/L。 在某些情況下，抗體與IGF-II被同時加入到培養(yǎng)物中，但是不預先混 合。加入IGFII后20分鐘，將細胞在冰上激冷，在冷的PBS中漂洗， 并在1 mL裂解緩沖液[50 mmol/L HEPES (pH 7.4)， 150 mmol/L NaCl， 10%甘油，1% Triton X-100， 1.5 mmol/L MgCl2， 2mmol/L釩酸鈉，以 及蛋白酶抑制劑]中裂解。將裂解物在冰上保持30分鐘，然后以.17,000 Xg離心30分鐘。將上清液用于免疫沉淀20AL的蛋白GSepharose 4B和2 Ag的兔抗IGF-IR h (C-20, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cmz, CA)。在深度清洗后，將免疫沉淀物在4%到12% NUPAGE上 電泳，轉(zhuǎn)移到聚聚偏氟乙烯膜上，用抗磷酸酪氨酸mAb4G10成印跡。 將膜分成條帶，用C-20多克隆抗體重新探測以檢測免疫沉淀物中的總 IGF-IR，或用C-19檢測總胰島素受體。對于Akt和MAPK使用相似的步驟，只是使用識別磷酸-Akt和磷酸-MAPK的抗體進行Western印跡。
細胞遷移分析。按照制造商(Corning Life Sciences Q5)的說明書， 使用帶有8Mm孔徑的聚碳酸酯膜的Transwdl培養(yǎng)板。簡單來說，底部 孔含有2.6 mL DMEM,其中含有5%胎牛血清和不同濃度的抗體。含 有5%胎牛血清的DMEM和無血清的DMEM被用作陽性和陰性對照。 上部插入物中含有1.5 mL在無血清DMEM中的0.5 X 106個MCF-7單 細胞懸浮液。將細胞在37°C培養(yǎng)箱中溫育。4小時后，將結(jié)合到膜的 上側(cè)面的細胞用棉球簽清除。在膜的下側(cè)面上的細胞用Hema3試劑盒 (Fischer)染色。從transwell上取下膜，安放在顯微鏡載玻片上，在 顯微鏡下對細胞計數(shù)。
當在本文中對物理性質(zhì)例如分子量或化學性質(zhì)例如化學公式使用 范圍時，這些范圍的所有組合和子組合及其中的具體實施方案都旨在 包括在內(nèi)。
在本文件中引用或描述的每個專利、專利申請和出版物的公開內(nèi) 容，在此以其全文引為參考。
本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認識到，可以對本發(fā)明的實施方案進 行大量的改變和修飾，這樣的改變和修飾可以在不背離本發(fā)明的精神 的情況下做出。因此，所附的權(quán)利要求旨在覆蓋處于本發(fā)明的真實精 神和范圍之內(nèi)的所有這樣的等價變化。
8權(quán)利要求
1.與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的單克隆抗體，在其重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO7顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO7至少90％同源的氨基酸序列。
2. 與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的 分離的單克隆抗體，在其輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 8顯示的氨基 酸序列或與SEQ ID NO: 8至少90%同源的氨基酸序列。
3. 與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的 分離的單克隆抗體，在其重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)中分別含有SEQ ID NO: 7和8顯示的氨基酸序列，或分別至少90%同源的氨基酸序列。
4. 權(quán)利要求3的抗體，其含有下列的至少一種CDR序列Q S ISS (SEQ ID NO: 9) ， VL: A A S (SEQIDNO: 10) ， VL: Q Q S Y S T P S T F (SEQ ID NO: 11) ， VH: G G T F S S Y A (SEQ ID NO: 12)， VH: GIIPILGI A (SEQIDNO: 13)，或VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (SEQIDNO: 14)。
5. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體是IgG,、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgA!、 IgA2、分泌性IgA、 IgD或IgE抗體。
6. 權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是IgG,/c或IgG,X同種型。
7. 權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是IgG4K或IgGA同種型。
8. 權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體是IgG,、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAp IgA2、分泌性IgA、 IgD或IgE抗體。
9. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體是IgG,K或IgG,X同種型。
10. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體是IgG4K或IgG4入同種型。
11. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是IgG^ IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgM、 IgAi、 IgA2、分泌性IgA、 IgD或IgE抗體。
12. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是IgG,K或IgGA同種型。
13. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是IgG4K或IgG4入同種型。
14. 權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗體是人類、非人類靈長動物、 兔、大鼠或小鼠的抗體，或其組合。
15. 權(quán)利要求2的抗體，其中所述抗體是人類、非人類靈長動物、 兔、大鼠或小鼠的抗體，或其組合。
16. 權(quán)利要求3的抗體，其中的抗體是人類、非人類靈長動物、 兔、大鼠或小鼠的抗體，或其組合。
17. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體具有下列特征中的一個或 多個(i)在體外MCF-7乳腺癌細胞分析中，在大約4 nM以上的抗 體濃度下抑制IGF-1受體的磷酸化；(ii)抑制與IGF-1受體的IGF-I 結(jié)合或IGF-II結(jié)合；或(iii)在細胞遷移分析中抑制細胞的遷移。
18. 權(quán)利要求3的抗體，當使用重組的人類胰島素樣生長因子I 或人類胰島素樣生長因子II作為被分析物和抗體作為配體通過表面等 離子體共振(SPR)進行測定時，其解離平衡常數(shù)(KD)為大約10—8 M 以下。
19. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體能夠以大約108 m-1以上的結(jié)合親和力與人類胰島素樣生長因子I和胰島素樣生長因子II結(jié)合。
20. 權(quán)利要求3的抗體，其是完整的抗體，完整的IgG,抗體，完 整的IgG2抗體，完整的IgG3抗體，完整的IgG4抗體，完整的IgM抗 體，完整的IgA,抗體，完整的IgA2抗體，完整的分泌性IgA抗體，完 整的IgD抗體或完整的IgE抗體，其中所述抗體在真核細胞中被糖基 化。
21. 權(quán)利要求3的抗體，其是抗體片段或單鏈抗體。
22. 權(quán)利要求4的抗體，其是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白， 包含(i) SEQ ID NO: 7顯示的可變重鏈氨基酸序列或與SEQ ID NO: 7 至少90%同源的可變重鏈序列，通過接頭肽與SEQ ID NO: 8顯示的可 變輕鏈氨基酸序列或與SEQ ID NO: 8至少90%同源的可變輕鏈酸序列 融合，所述可變重鏈氨基酸序列與免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽融合，(ii)與 鉸鏈區(qū)融合的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，以及(iii)與CH2恒定區(qū)融 合的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。
23. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體以至少10"M"的平衡結(jié)合 常數(shù)(Ka)與預定的抗原結(jié)合。
24. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體以至少1(^M"的平衡結(jié)合 常數(shù)(Ka)與預定的抗原結(jié)合。
25. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體以至少1(^M"的平衡結(jié)合 常數(shù)(Ka)與預定的抗原結(jié)合。
26. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是單克隆的。
27. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是F(ab')2、 Fab、 Fv或Fd 片段。
28. 權(quán)利要求3的抗體，其中所述抗體是抗原特異性的。
29. 分離的人類單克隆抗體，其與人類胰島素樣生長因子I和人類 胰島素樣生長因子II結(jié)合。
30. 權(quán)利要求29的抗體，其含有下列的至少一種CDR序列V^: Q SISS (SEQIDNO:9) ， VL: A A S (SEQ ID NO: 10) ， VL: Q Q S Y S TPSTF (SEQ ID NO: 11) ， VH:GGTFSSYA (SEQ ID NO: 12)， VH: G 11 P I L G I A (SEQ ID NO: 13)，或VH: A R G P R G Y S Y N F D Y (SEQ ID NO: 14)。
31. 與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在 其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 1顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 1至少90%同源的氨基酸序列。
32. 與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在 其人類輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO:2顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:2至少90%同源的氨基酸序列。
33. 與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在 其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 3顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 3至少卯％同源的氨基酸序列。
34. 與人類胰島素樣生長因子I結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在 其人類輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO:4顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO:4至少90%同源的氨基酸序列。
35. 與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合的分離的人類單克隆抗體，在其人類重鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 5 顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 5至少卯％同源的氨基酸序列。
36. 與人類胰島素樣生長因子I和人類胰島素樣生長因子II結(jié)合 的分離的人類單克隆抗體，在其人類輕鏈可變區(qū)中含有SEQ ID NO: 6 顯示的氨基酸序列或與SEQ ID NO: 6至少90%同源的氨基酸序列。
37. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的抗體和可藥用的載體。
38. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求2的抗體和可藥用的載體。
39. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求31的抗體和可藥用的載體。
40. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求32的抗體和可藥用的載體。
41. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求33的抗體和可藥用的載體。
42. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求34的抗體和可藥用的載體。
43. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求35的抗體和可藥用的載體。
44. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求36的抗體和可藥用的載體。
45. 分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段，所述 抗體含有人類恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)競爭性抑制m708.2抗體(ATCC登錄號為_)與人類IGF-I和人類IGF-II的結(jié)合，以及(ii)在體內(nèi)以至少1 X 1()S升/摩爾的親和力與人類IGF-I和 人類IGF-II的中和性表位結(jié)合，以通過表面等離子體共振所測出的結(jié) 合常數(shù)(Ka)表示。
46. 權(quán)利要求45的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段含有人類恒定區(qū)和人類可變區(qū)。
47. 權(quán)利要求45的抗體或抗原結(jié)合片段，其含有至少一條人類輕 鏈和至少一條人類重鏈。
48. 權(quán)利要求47的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈含有 m708.2 (ATCC登錄號為_)的輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。
49. 權(quán)利要求47的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈含有 m708.2 (ATCC登錄號為_)的重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。
50. 權(quán)利要求47的抗體或抗原結(jié)合片段，其中所述輕鏈含有m708.2 (ATCC登錄號為_)的輕鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)，并且其中所述重鏈含有m708.2 (ATCC登錄號為_)的重鏈的所有抗原結(jié)合區(qū)。
51. 分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段，所述 抗體含有人類恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)含有m708.2抗體(ATCC登錄號為_)的抗原結(jié)合區(qū)，以及(ii)在體內(nèi)以至少1 X 108升/摩爾的親和力與人類IGF-I和人類IGF-II的中和性表位結(jié) 合，以通過表面等離子體共振所測出的結(jié)合常數(shù)(Ka)表示。
52. 分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段，所述 抗體含有人類IgGl恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)競爭性抑制m708.2抗體(ATCC登錄號為_)與人類IGF-I和人類IGF-II的結(jié)合，以及(ii)在體內(nèi)以至少1 X 108升/摩爾的親和力與人類IGF-I 和人類IGF-II的中和性表位結(jié)合，以通過表面等離子體共振所測出的 結(jié)合常數(shù)(Ka)表示。
53. 分離的重組抗IGF-I和抗IGF-II抗體或其抗原結(jié)合片段，所述 抗體含有人類IgGl恒定區(qū)，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段(i)含有m 08.2抗體(ATCC登錄號為_)的抗原結(jié)合區(qū)，以及(ii)在體內(nèi)以至少1 X 108升/摩爾的親和力與人類IGF-I和人類IGF-II的中和性 表位結(jié)合，以通過表面等離子體共振所測出的結(jié)合常數(shù)(Ka)表示。
54. 在樣品中檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的 方法，該方法包括(a)提供樣品；(b)將(a)的樣品與特異性結(jié)合含 有人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的多肽的人類單克隆抗 體m708或m708.2，在允許多肽配體與人類胰島素生長因子I和胰島素 生長因子II結(jié)合的條件下進行接觸；以及(c)檢測抗體m708或m708.2 與樣品中人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的結(jié)合，其中檢 測到結(jié)合表明在樣品中存在人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子 II;從而探明樣品中的人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II。
55. 在樣品中檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的 方法，該方法包括(a)提供樣品；(b)將(a)的樣品與特異性結(jié)合含 有人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的多肽的人類單克隆抗 體m708或m708.2，在允許多肽配體與人類胰島素生長因子I和胰島素 生長因子II結(jié)合的條件下進行接觸；以及(c)檢測抗體m708或m708.2 與樣品中人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II的結(jié)合，其中檢 測到結(jié)合表明在樣品中存在人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子 II;從而探明樣品中的人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II 。
56. 在樣品中檢測人類胰島素生長因子I的方法，該方法包括(a) 提供樣品；(b)將(a)的樣品與特異性結(jié)合含有人類胰島素生長因子I 的多肽的人類單克隆抗體m705或m706，在允許多肽配體與人類胰島 素生長因子I結(jié)合的條件下進行接觸；以及(c)檢測抗體m705或m706 與樣品中人類胰島素生長因子I的結(jié)合，其中檢測到結(jié)合表明在樣品中存在人類胰島素生長因子I;從而探明樣品中的人類胰島素生長因子I。
57. 分離的核酸，其編碼權(quán)利要求l、 2、 31、 32、 33、 34、 35或36的蛋白/抗體的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列或輕鏈免疫球蛋白可 變結(jié)構(gòu)域序列。
58. 藥物組合物，其含有權(quán)利要求57的核酸和可藥用載體。
59. 重組細胞，其含有一種或多種編碼權(quán)利要求1、 2、 31、 32、 33、 34、 35或的抗體的免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列的核酸。
60. 宿主細胞，其含有的第一個核酸序列編碼含有抗體的HC可變 結(jié)構(gòu)域的多肽以及第二個核酸序列編碼含有抗體的LC可變結(jié)構(gòu)域的 多肽，其中所述抗體是權(quán)利要求1、 2、 31、 32、 33、 34、 35或36的蛋白。
61. 制備能夠與胰島素生長因子I和胰島素生長因子II結(jié)合的抗 體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求57的核酸在提供用于所述核酸表 達的條件下在宿主細胞中表達，然后回收該抗體。
62. 鑒定特異性針對人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II 的多肽配體的方法，包括(a)提供噬菌體文庫，該文庫包含表達候選 物人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子I結(jié)合多肽的噬菌體；(b) 將所述噬菌體文庫與人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II蛋白 進行接觸，以及(c)檢測人類胰島素生長因子I和胰島素生長因子II 蛋白與噬菌體的結(jié)合；從而鑒定特異性針對人類胰島素生長因子I和胰 島素生長因子II的多肽配體。
63. 在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的方法，其包括給哺乳動物 對象施用含有抗體的藥物組合物，所述抗體具有SEQ ID NO: 1、 SEQID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的氨基酸序列，并以有效減輕或消 除哺乳動物對象中的腫瘤疾病的量與胰島素樣生長因子I特異性結(jié)
64. 權(quán)利要求63的方法，其中所述抗體與胰島素樣生長因子I和 胰島素樣生長因子II特異性結(jié)合。
65. 權(quán)利要求64的方法，其中所述抗體還含有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。
66. 權(quán)利要求63的方法，其中所述抗體與細胞毒性劑相連。
67. 權(quán)利要求66的方法，其中所述細胞毒性劑是細胞毒性藥物。
68. 權(quán)利要求66的方法，其中所述細胞毒性劑是放射性同位素。
69. 權(quán)利要求63的方法，其中所述腫瘤疾病是實體腫瘤、血液惡 性腫瘤、白血病、結(jié)腸直腸癌、良性或惡性乳腺癌、子宮癌、子宮平 滑肌瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、 前列腺癌、前列腺肥大、垂體癌、子宮腺肌病、腺癌、腦膜瘤、黑素 瘤、骨癌、多發(fā)性骨髓瘤、CNS癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形母細胞瘤。
70. 權(quán)利要求69的方法，其中所述腫瘤疾病是所述哺乳動物對象 中的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。
71. 權(quán)利要求70的方法，其中所述腫瘤疾病是所述哺乳動物對象 中的乳腺癌轉(zhuǎn)移。
72. 在懷疑患有腫瘤疾病或懷疑處于腫瘤疾病風險下的哺乳動物對象中診斷癌癥的方法，其包括從對象的血液或組織獲得測試樣品，測試樣品含有細胞群體，提供含有SEQ IDNO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的抗體來檢測在細胞群體內(nèi)的細胞上是否存在IGF-I標志，對IGF-I標志檢測到的細胞群體進行分析以鑒定并表征細胞，在 細胞上或細胞中存在IGF-I標志表明在哺乳動物對象中的腫瘤疾病或 腫瘤疾病風險。
73. 權(quán)利要求72的方法，還包括提供含有SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8中的氨基酸序列的抗體，以檢 測在細胞群體內(nèi)的細胞上或細胞中是否存在IGF-II標志和IGF-I標志， 并對通過IGF-I標志和IGF-II標志檢測到的細胞群體進行分析以鑒定細 胞和表征，在細胞中或細胞上存在IGF-I標志和IGF-II標志表明哺乳動 物對象中的腫瘤疾病或腫瘤疾病的風險。
74. 權(quán)利要求73的方法，其中在樣本中的細胞上或細胞中存在 IGF-I標志或IGF-II標志表明哺乳動物對象中存在轉(zhuǎn)移癌。
75. 權(quán)利要求73的方法，其中在樣本中的細胞上或細胞中存在 IGF-I標志或IGF-II標志表明哺乳動物對象中存在早期癌癥。
76. 權(quán)利要求73的方法，其中在樣本中的細胞上或細胞中不存在 IGF-I標志和IGF-II標志表明哺乳動物對象中存在無疾病狀態(tài)或沒有可 檢測的疾病狀態(tài)。
77. 權(quán)利要求72的方法，其中在樣本中的細胞上或細胞中存在或 不存在IGF-I標志或IGF-II標志對癌癥治療或癌癥恢復過程中的治療處 理進行監(jiān)測。
78. 權(quán)利要求72的方法，其還包含了與抗體相連的成像部分。
79. 權(quán)利要求78的方法，其中所述成像部分可以通過磁共振光譜、 X-射線光譜或正電子發(fā)射斷層成像(PET)進行成像。
80. 權(quán)利要求78的方法，其中所述連接是共價鍵。
81. 權(quán)利要求78的方法，其中所述連接是非共價鍵。
82. 權(quán)利要求72的方法，其中所述腫瘤疾病是實體腫瘤、血液惡 性腫瘤、白血病、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、子宮癌、子宮平滑肌瘤、卵 巢癌、子宮內(nèi)膜癌、多囊性卵巢綜合癥、子宮內(nèi)膜息肉、前列腺癌、 前列腺肥大、垂體癌、子宮腺肌病、腺癌、腦膜瘤、黑素瘤、骨癌、 多發(fā)性骨髓瘤、CNS癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或星形母細胞瘤。
83. 在哺乳動物對象中治療癌癥的藥物候選化合物的篩選方法，包括，給懷疑患有癌癥的對象施用治療有效量的藥物候選化合物， 在用藥物候選化合物治療之前和之后，從對象的血液或組織獲得 測試樣品，測試樣品含有懷疑含有腫瘤細胞的細胞群體，提供含有SEQIDNO: 1、 SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8 的氨基酸序列的抗體用于檢測在測試樣品中的細胞上是否存在IGF-I標志，對IGF-I標志檢測到的細胞群體進行分析，以鑒定藥物候選化合 物治療之前測試樣品中的腫瘤細胞，與藥物候選化合物治療之后相比 較，其中在治療后樣本中存在的腫瘤細胞數(shù)量與治療前樣本中腫瘤細 胞數(shù)量相比降低，表明藥物候選化合物在治療哺乳動物對象的癌癥中 的有效性。
84. 權(quán)利要求83的方法，還包括提供含有SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6、 SEQIDNO: 7或SEQIDNO: 8的氨基酸序列的抗體，以檢測 在測試樣品中的細胞上是否存在IGF-II標志和IGF-I標志，并對IGF-I 標志和IGF-II標記物檢測到的細胞群體進行分析，以鑒定藥物候選化 合物治療之前測試樣品中的腫瘤細胞，與藥物候選化合物治療之后相 比較，其中在治療后樣本中存在的腫瘤細胞數(shù)量與治療前樣本中腫瘤 細胞是數(shù)量相比降低，表明藥物候選化合物在治療哺乳動物對象的癌 癥中的有效性。
85. 權(quán)利要求83的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移癌或早期癌。
全文摘要
提供了用于在哺乳動物對象中治療腫瘤疾病的抗體組合物和方法。還提供了在哺乳動物對象中診斷癌癥的方法。
文檔編號C12N15/13GK101578297SQ200780021016
公開日2009年11月11日 申請日期2007年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月7日
發(fā)明者朱忠玉, 迪米特爾·S·迪米特羅夫 申請人:美國政府健康及人類服務(wù)部