專利名稱：使用橫向流動方法的核酸檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測樣品中靶核酸的方法和試劑盒。在一個(gè)具體 的應(yīng)用中，本發(fā)明允許檢測食品中或存在于食物制品表面上的不良微 生物(例如李斯特菌屬(Listeria)、沙門氏菌屬(Salmonella)或腸桿 菌屬 (Enterobacter))。
優(yōu)先權(quán)文獻(xiàn)
本申請要求來自以下臨時(shí)專利申請的優(yōu)先權(quán)
于2006年4月10日提交的篇名為"核酸檢測方法"的澳大利亞 臨時(shí)專利申請No.2006901847;于2006年4月IO日提交的篇名為"核 酸檢測方法"的美國臨時(shí)專利申請No.60/790，536。將這兩篇文獻(xiàn)的全 部內(nèi)容均以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
近年來，已報(bào)告的由微生物造成食物中毒的爆發(fā)的數(shù)量在世界范 圍內(nèi)增加。這些食源病原體可以作為污染物存在于在類型多樣的食品 中以及食品加工環(huán)境中(如食物制品表面)，其中所述的食品包括肉 制品(如紅肉、禽肉和海產(chǎn)品)、蛋產(chǎn)品、乳產(chǎn)品(如乳酪、乳和冰 淇凌)、糖果和水果及蔬菜。沙門氏菌屬(Salmonella)和李斯特菌屬 (Listeria)尤其被多數(shù)國家的食品安全機(jī)構(gòu)視為重大食品污染的原因， 并且許多這些食品安全機(jī)構(gòu)要求針對這些細(xì)菌進(jìn)行環(huán)境檢驗(yàn)和終末檢 驗(yàn)。因此，對食品和食品加工環(huán)境兩者進(jìn)行常規(guī)檢查由此類微生物所 致的污染是慣例。
也在其它工業(yè)例如醫(yī)藥和化妝品制造工業(yè)中進(jìn)行相似的檢驗(yàn)。對 微生物的檢驗(yàn)通常包括獲得樣品例如食物樣品、來自待檢測區(qū)域的拭子或取自地板掃除物、廢水及生產(chǎn)用水或?yàn)V過空氣的樣品，轉(zhuǎn)移該樣 品至預(yù)富集或富集培養(yǎng)基以增加受損微生物的恢復(fù)和修復(fù)，隨后進(jìn)行 一個(gè)或兩個(gè)額外的選擇性富集步驟以增加目的微生物數(shù)，并且此后使 用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法或諸如免疫測定法之類的快速方法測檢特定微生物在 培養(yǎng)基中的存在。
檢驗(yàn)李斯特菌屬和沙門氏菌屬的快速方法已經(jīng)并入本發(fā)明申請人
提供的系統(tǒng)內(nèi)。在如澳大利亞專利說明書No 610925中所述的稱作 UNIQUETM系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例中，該系統(tǒng)包括首先轉(zhuǎn)移樣品至預(yù)富集培養(yǎng) 基16小時(shí)，并隨后轉(zhuǎn)移預(yù)富集培養(yǎng)物的小等分試樣至第一試管內(nèi)，將 包被有對抗所關(guān)注微生物的抗體(例如抗沙門氏菌抗體)的檢測試紙 條(dipstick)插入其中檢測試紙條20分鐘，在此期間存在于該第一試 管中的任何任何微生物均被捕獲至檢測試紙條表面上。此后，該系統(tǒng) 包括在第二試管內(nèi)洗滌檢測試紙條，此后轉(zhuǎn)移該檢測試紙條至裝有生 長培養(yǎng)基的第三試管內(nèi)，并且培養(yǎng)與檢測試紙條結(jié)合的任何微生物以 便在檢測試紙條表面上繁殖直至存在足以允許檢測的數(shù)目。對于沙門 氏菌屬，該培養(yǎng)期通?；ㄙM(fèi)約4小時(shí)。在該培養(yǎng)期后，UNIQUEiM系統(tǒng) 則涉及在含有用酶(如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)標(biāo)記的抗所關(guān) 注微生物抗體的第四試管中孵育此檢測試紙條30分鐘，該抗體與檢測 試紙條上存在的任何微生物結(jié)合，隨后在第五試管中洗滌該檢測試紙 條(即用以除去過量的或未結(jié)合的標(biāo)記抗體)，并且最后，將該檢測 試紙條轉(zhuǎn)移至含有酶標(biāo)記的色原體前體的第六管內(nèi)。若所關(guān)注的微生 物存在，則從該前體中產(chǎn)生色素原(通常顏色上呈紫色)并且這表現(xiàn) 為在檢測試紙條上的有色區(qū)。
這種UNIQUETM系統(tǒng)已經(jīng)證明對眾多微生物如李斯特菌屬和沙門 氏菌屬是極為可靠的。然而，本申請人認(rèn)識到改進(jìn)以實(shí)現(xiàn)更為便利并 涉及更少用戶時(shí)耗的系統(tǒng)將通過改善(例如)與用于多種孵育/培養(yǎng)期 的最佳時(shí)間及條件(如溫度)的符合性而增加可靠性。為此目的， UNIQUETM系統(tǒng)已經(jīng)加以自動化，并且這種自動UNIQUE PLUSTM系統(tǒng)已
14在本申請人的共同未決的澳大利亞專利申請No.2002333050中描述。
因樣品中微生物的"陽性"檢驗(yàn)結(jié)果往往導(dǎo)致嚴(yán)重的后果或退貨， 常常希望在相同或相似的樣品上進(jìn)行確證檢驗(yàn)。目前，對于UNIQUE 和UNIQUE PLUS 系統(tǒng)而言，此類確證檢驗(yàn)通過簡單地將來自上述第 一試管或第三試管的樣品等分試樣在瓊脂上接種并檢驗(yàn)任何生長的微 生物的生物化學(xué)特征和形態(tài)學(xué)特征而進(jìn)行。該方法可能容易出錯(cuò)并且 還可能是費(fèi)力的并引起明顯的時(shí)間拖延(例如使用該方法，確證結(jié)果 可能花費(fèi)至多到48至72小時(shí))。此外，對于某些微生物檢測系統(tǒng)， 陽性檢驗(yàn)結(jié)果可以僅指示源自具體屬的微生物的存在，而可能優(yōu)選的 是或希望的是鑒定具體物種(例如對于受李斯特菌屬污染的食品，產(chǎn) 品召回可能僅在污染由人病原體即單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)所致的情況下才強(qiáng)制進(jìn)行)。本申請人在下文描述了 用于檢測諸如食源病原體之類的微生物的簡單、迅速(例如約1至4 小時(shí))且可靠的方法，該方法可以容易地用于從UNIQUETM或UNIQUE PLUSTM檢驗(yàn)系統(tǒng)獲得的樣品(例如來自上述第一試管或第三試管的樣 品等分試樣)或其它合適樣品以提供確證結(jié)果，并且還可以由此可揭 示特定微生物物種的方式進(jìn)行。所述方法還適用于篩選測定法。
本
發(fā)明內(nèi)容
因此，在第一方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的 方法，所述方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意微生物釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微 生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5'和3'端的 一對第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而所述 第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，以使得對靶序列的任意擴(kuò)增產(chǎn)生了第 一和第二標(biāo)簽雙標(biāo)記的擴(kuò)增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的組分朝
該橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近 該遠(yuǎn)端的位置處，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)
設(shè)有特異性結(jié)合至第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；
和
(v) 檢測緩沖產(chǎn)物的組分在所述檢測區(qū)以及在所述對照區(qū)的任意
妙A(yù)
5口 口 o
檢測檢測區(qū)處的結(jié)合提供了顯示樣品中存在旨在被檢測的微生物 的結(jié)果。
對照試劑可用特異性結(jié)合至第一試劑，在此情況下，檢測檢測區(qū) 處的結(jié)合提供了顯示微粒已經(jīng)成功流過基底并且微粒結(jié)合的第一試劑 能夠被對照試劑結(jié)合的結(jié)果。
在檢測區(qū)和對照區(qū)處的結(jié)合容易通過觀察(如可以由微粒提供的) 顏色出現(xiàn)而方便地檢測。優(yōu)選地，對照區(qū)位于橫向流動裝置的檢測區(qū)
和遠(yuǎn)端之間。
該方法可以輕易地進(jìn)行變化，以使得將第一引物序列的第一標(biāo)簽
省略并用經(jīng)標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)替換。
因此，在第二方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的
方法，所述方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意微生物釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微 生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5'和3'端的 一對第一和第二引物序列，其中靶序列的擴(kuò)增利用了用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)并且所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo) 記，以使得對靶序列的任意擴(kuò)增產(chǎn)生了第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò) 增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽之一的第一試劑標(biāo)
記，并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的組分朝 該橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近 該遠(yuǎn)端的位置內(nèi)，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū) 設(shè)有特異性結(jié)合至第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑； 以及
(V)檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任意結(jié)合。
附圖簡述
圖1提供適用于本發(fā)明方法的橫向流動裝置的示意圖。該示意圖 顯示裝置(1)包括樣品墊(2)、膜(3)、吸附墊(4)和支持卡(5)。 據(jù)顯示檢測區(qū)(6)和對照區(qū)(7)鄰近吸附墊(4)。檢測區(qū)(6)提 供檢驗(yàn)結(jié)果而對照區(qū)(7)提供陽性對照結(jié)果。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的方法。具體而言，所 述方法旨在檢測食品中存在的微生物如細(xì)菌(例如李斯特菌屬、沙門 氏菌屬、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希桿菌屬(Escherichia)、軍團(tuán) 菌屬(Legionella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 葡萄球菌屬(Staphylococcus)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)和螺桿 菌屬(Helicobacter))，然而，該方法也適合用于檢測可能在食物、 水或其它環(huán)境樣品中存在的其它類型微生物例如病毒、酵母、霉菌和 原蟲(如隱孢子蟲(Cryptosporidium))。
17在第一方面，本發(fā)明的方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意微生物釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微 生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5'和3'端的 一對第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而所述 第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和 第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記，
并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝
橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該 遠(yuǎn)端的位置內(nèi)，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè) 有特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試 劑；和
(v) 檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任意結(jié)合。
樣品可以是任意合適的樣品，包括(例如)食物樣品、從食物制 品表面的拭子制備的樣品、廢水或生產(chǎn)用水樣品和微生物培養(yǎng)物或富 集樣品(如來自UNIQUE系統(tǒng)檢驗(yàn)的第一試管或第三試管中的樣品等 分試樣)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含準(zhǔn)備用于檢測的微生物的樣品并不總是需要在步驟 (ii)的擴(kuò)增之前從該微生物中分離核酸的任意步驟。而是，該樣品可 能僅需要進(jìn)行處理，優(yōu)選通過加熱(如在85-10(TC范圍的溫度下)進(jìn) 行處理，以引起微生物核酸(例如通過裂解)釋放，并且，優(yōu)選的是， 使任意雙鏈核酸(如dsDNA)變性(即"解鏈")成單鏈核酸(例如
18ssDNA)。步驟(i)可能實(shí)際上不由實(shí)施剩余方法步驟的同一方實(shí)施
(如樣品收集者可以在將樣品送遞至實(shí)驗(yàn)室之前加熱樣品以使核酸從 存在的任何微生物中釋放)。
擴(kuò)增步驟(ii)可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意方法進(jìn)行。優(yōu)
選的是，使用標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增方法，利用限定耙核苷酸 序列5'和3'端的一對引物序列(即第一和第二引物序列)實(shí)施擴(kuò)增。 然而，在一些情況下，可能優(yōu)選的是使用"嵌套式"PCR擴(kuò)增方法， 利用另外的"外側(cè)"引物序列對(即第一外側(cè)引物序列和第二外側(cè)引 物序列)實(shí)施擴(kuò)增步驟。
通過選擇物種特異性引物序列，該方法可以由此揭示樣品中存在 的具體微生物物種的身份的方式進(jìn)行。
優(yōu)選對第一和第二引物序列加以選擇，以使得在擴(kuò)增步驟(ii)期 間產(chǎn)生的擴(kuò)增子具有40-3000個(gè)核苷酸長度、更優(yōu)選50-1500個(gè)核苷酸 長度。通常，擴(kuò)增子越短，則可以越迅速地完成擴(kuò)增步驟(ii)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將充分理解，如果合適，第一引物和第二引物可以是簡并 引物或者，以別的方式，可以據(jù)需要包括多種引物以確保靶核苷酸序 列的檢測。
在第一方面的方法中，第一和第二引物序列分別用第一和第二標(biāo) 簽標(biāo)記。優(yōu)選地，第一和第二標(biāo)簽選自半抗原，例如生物素、熒光素 衍生物(如FITC)、若丹明衍生物(如TAMRA)、級聯(lián)藍(lán)(Cascade Blue)、熒光黃、5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU) 、 二硝基苯酚(DNP)、 地高辛(DIG)和短肽標(biāo)簽序列(即可以針對其而產(chǎn)生特異性抗體的短 肽)。更優(yōu)選地，第一標(biāo)簽是生物素而第二標(biāo)簽是DNP，在這種情況 下，擴(kuò)增步驟(ii)期間產(chǎn)生的擴(kuò)增子由生物素和DNP兩者標(biāo)記。
在擴(kuò)增步驟(ii)后，將一定量的擴(kuò)增產(chǎn)物在合適的緩沖液中稀釋。該緩沖液包含用特異性結(jié)合至第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記的微粒。該步 驟(iii)可以簡單地涉及將擴(kuò)增產(chǎn)物直接稀釋進(jìn)已制備的包含所述微粒 的緩沖液，或另外它可以涉及逐步稀釋過程，其中擴(kuò)增產(chǎn)物最終稀釋 于所述包含微粒的合適緩沖液中。此種逐步稀釋過程的具體實(shí)施例涉 及，首先添加一定量的擴(kuò)增產(chǎn)物至缺少包含所述微粒的所述合適緩沖 液，并且此后添加所述微粒至擴(kuò)增產(chǎn)物-緩沖液組合物。方便的是，可 以通過這樣的方式實(shí)現(xiàn)將微粒加至擴(kuò)增產(chǎn)物緩溶液組合物，即讓擴(kuò)增 產(chǎn)物-緩沖液組合物與已經(jīng)在其上干燥了所述微粒的收集容器或表面接 觸，以使得微粒懸浮在擴(kuò)增產(chǎn)物-緩沖液組合物中，由此形成所需的包 含所述微粒的合適緩沖液。
步驟(iii)進(jìn)行足以允許第一試劑結(jié)合至擴(kuò)增產(chǎn)物中存在的所述 第一標(biāo)簽的時(shí)間。優(yōu)選地，步驟(m)進(jìn)行的持續(xù)時(shí)間范圍為0.1-5分 鐘、更優(yōu)選0.2-1分鐘。
微?？梢杂筛鞣N物質(zhì)組成，不過優(yōu)選由一種或多種基本上惰性的 物質(zhì)例如金、硅、硒、聚苯乙烯、三聚氰胺樹脂、聚甲基丙烯酸酯、 苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和聚乙烯基甲苯組成。微粒優(yōu)選是無孔的。 微?？梢园试S橫向流動裝置上的檢測區(qū)和對照區(qū)處的結(jié)果可視化 的物質(zhì)。便利的是，此種物質(zhì)將是允許以肉眼觀察的染料或其它有色 物質(zhì)，然而，這種物質(zhì)可以是(例如)允許因產(chǎn)生有色物質(zhì)(例如酶 或其它催化性標(biāo)簽)或因熒光、發(fā)光或磁力相互作用(如使用熒光計(jì)、
光度計(jì)或磁感應(yīng))而觀察到的標(biāo)簽物質(zhì)。微粒可以具有范圍為0.002至 5/ium的直徑大小。優(yōu)選的是，微粒是具有范圍為0.002至0.25/|Um (即 2至250nm)、更優(yōu)選0.01至0.06/mi (即10至60nm)的直徑大小的 金微粒，并且最優(yōu)選的是具有0.04Mm (即40nm)的平均直徑大小的 金微粒。合適的聚苯乙烯微粒包括具有范圍為0.1至5/Mm的直徑大小 的聚苯乙烯微粒。
第一試劑選自能夠與第一標(biāo)簽特異性結(jié)合或與之反應(yīng)的試劑。因而，第一試劑可以是抗體、抗體片段(如Fab、 F(ab')2和scfv片段)、 受體或其它結(jié)合伴侶。第一試劑本身可以綴合至允許因在添加合適底 物后產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物而可視的酶或催化性物質(zhì)。在第一標(biāo)簽是生物素 的情況下，第一試劑可以是鏈霉親和素或抗生物素蛋白，不過更優(yōu)選 地是抗生物素抗體。
步驟(iii)的緩沖產(chǎn)物在橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施 加。該橫向流動裝置包括允許緩沖產(chǎn)物的成分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端 橫向地芯吸或流動的基底。通常，橫向流動裝置是條狀基底形式(例 如尺度4-8 mm X 40-80mm)。優(yōu)選的是，基底由硝化纖維素膜、聚 偏氟乙烯(PVDF)、尼龍或單一多孔材料基底(如Fusion 5 (Whatman, Middlesex, UK)組成，并如美國專利說明書No2006/0040408中所述)。
該橫向流動裝置在遠(yuǎn)端處或鄰近該遠(yuǎn)端設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)。檢 測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試 劑。試劑可以綴合或吸附至蛋白質(zhì)、微?；蚱渌镔|(zhì)，以使得試劑固 定至檢驗(yàn)基底上。
檢測區(qū)提供檢驗(yàn)結(jié)果。也就是說，檢測區(qū)結(jié)合并固定擴(kuò)增子(其 中每種擴(kuò)增子應(yīng)當(dāng)與微粒結(jié)合)并由此提供顯示樣品中存在或不存在 旨在檢測的微生物的結(jié)果。A"陽性"檢驗(yàn)結(jié)果(即指示樣品中存在微 生物的檢驗(yàn)結(jié)果)優(yōu)選由檢測區(qū)處出現(xiàn)(如微粒所提供的)可視顏色 信號而指示。在微粒是金微粒的情況下，可視顏色信號將是粉紅色-紅 色。
對照區(qū)是橫向流動裝置上與檢測區(qū)隔開的區(qū)域。優(yōu)選地，對照區(qū) 位于橫向流動裝置的檢測區(qū)與遠(yuǎn)端之間。對照區(qū)提供陽性對照結(jié)果。 如下文所述，該陽性對照結(jié)果可以顯示微粒已經(jīng)成功地流過基底，或 以別的方式，指示步驟(ii)擴(kuò)增是成功的。任選地，對照區(qū)可以包含 第一亞區(qū)和第二亞區(qū)，第一亞區(qū)能夠提供顯示微粒已經(jīng)成功流過基底的陽性對照結(jié)果，而第二亞區(qū)能夠指示步驟(ii)擴(kuò)增是成功的。
因此，在最簡單的情況下，對照區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至第一試劑的 對照試劑，在這種情況下，對照區(qū)結(jié)合并固定微粒并且由此提供指示 微粒是否已經(jīng)成功流過基底的結(jié)果。步驟(ii)的緩沖液中存在的微粒 量可以因此足以提供用于結(jié)合至該對照區(qū)的未結(jié)合微粒(和/或與未摻 入的第一引物結(jié)合的微粒)的量。然而，緩沖液中存在的微粒量可能 也是足夠的，若除未結(jié)合的微粒量之外或作為其替代，該微粒量還提 供相對于可以為檢測區(qū)所結(jié)合的量為過量的(即與雙標(biāo)記擴(kuò)增子結(jié)合 的)結(jié)合微粒量(即因而提供可以流經(jīng)過檢測區(qū)進(jìn)入對照區(qū)的結(jié)合微 粒的量)。如果對照區(qū)包含與第一標(biāo)簽相同或功能等價(jià)的對照試劑時(shí)， 則陽性對照結(jié)果指示第一試劑與第一標(biāo)簽之間的結(jié)合應(yīng)當(dāng)已經(jīng)是成功 的。
如果擴(kuò)增可能是在潛在抑制性分子(如可能在樣品中找到的抑制 性分子)存在下進(jìn)行，則用于步驟(ii)擴(kuò)增的陽性對照可能是特別有 價(jià)值的?？梢酝ㄟ^這樣的方式在單獨(dú)的擴(kuò)增容器中開展用于步驟(ii) 擴(kuò)增的陽性對照，即與步驟(ii)擴(kuò)增平行地?cái)U(kuò)增在對照核酸上所提供 的對照核苷酸序列(如與靶核苷酸序列大約相等長度的序列)，并隨 后在步驟(iii)之前合并單獨(dú)擴(kuò)增的產(chǎn)物。然而，優(yōu)選的是，用于擴(kuò)增 的陽性對照涉及在步驟(ii)中包括提供對照核苷酸序列的對照核酸， 和限定該對照核苷酸序列5，和3'端的一對第三引物序列和第四引物序
列。因此，對照核酸可以在步驟(i)處理之前或之后添加至步驟(ii)
的擴(kuò)增混合物內(nèi)或?qū)胨龅臉悠分?。?yōu)選的是，第三引物和第四引
物將優(yōu)選具有與第一引物和第二引物相似的解鏈溫度(Tm)和引發(fā)特 征，以便允許能使用相同的退火溫度和擴(kuò)增時(shí)間。第三引物序列和第 四引物序列分別用第三標(biāo)簽和第四標(biāo)簽標(biāo)記(如生物素、DNP、 FITC 和DIG均可以使用)，其中第三標(biāo)簽和第四標(biāo)簽優(yōu)選均異于第一和第 二標(biāo)簽，盡管第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽有可能是相同的(或者說是功能等 價(jià)的)，在這種情況下，在步驟(iii)中第一試劑標(biāo)記的微粒應(yīng)當(dāng)結(jié)合至從第一和第二引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子以及從第三引物序列和第四引 物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子。然而，如果第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽不同，包含擴(kuò) 增的陽性對照必需向步驟(iii)中使用的緩沖液添加特異性結(jié)合至第三 標(biāo)簽的第三試劑標(biāo)記的微粒。在這種情況下，橫向流動裝置上的對照 區(qū)將包含特異性結(jié)合至第四標(biāo)簽的對照試劑。
因此，第一方面方法的步驟(ii)可以包括提供對照核酸，并共 擴(kuò)增所述微生物核酸上存在的耙核苷酸序列，所述靶序列是所述微生 物獨(dú)有的或者說是特征性的，并且其中對靶序列的所述擴(kuò)增包括使用 限定所述靶序列5'和3'端的一對第一和第二引物序列，所述第一引物 序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序 列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；以及7"
所述對照核酸上存在的對照核苷酸序列，其中對照序列的所述擴(kuò) 增包括使用限定所述對照序列的5，和3'端的一對第三引物序列和第四 引物序列，所述第三引物序列用第三標(biāo)簽標(biāo)記(該標(biāo)簽可以與第一標(biāo) 簽相同或與其功能等價(jià))而所述第四引物序列用第四標(biāo)簽標(biāo)記，以使 得對照序列的任意擴(kuò)增產(chǎn)生第三標(biāo)簽和第四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子。
陽性對照結(jié)果優(yōu)選由檢測區(qū)處出現(xiàn)(如微粒所提供的)可見顏色 信號指示。如果微粒是金微粒，則可件顏色信號是粉紅色-紅色。
橫向流動裝置還可以包括在近端處的樣品墊和/或位于遠(yuǎn)端處的 吸附墊，以輔助步驟(iii)的緩沖產(chǎn)物的成分流過基底。此外，橫向流 動裝置可以設(shè)有用于基底的支持手段，例如， 一張卡紙板或硬質(zhì)聚合 物，基底可以附連至其上。另外，橫向流動裝置可以設(shè)有用于容納多 重陣列或甚至巨型陣列用途中的裝置的任何合適容器(如托盤)中的 兩個(gè)或更多個(gè)相同或相似裝置。
檢測在檢測區(qū)和對照區(qū)處步驟(m)緩沖產(chǎn)物的成分的任意結(jié)合
的步驟最優(yōu)選是通過簡單地用肉眼觀察(如由微粒提供的)可見顏色
23信號的出現(xiàn)而進(jìn)行。然而，顏色的出現(xiàn)或顏色的強(qiáng)度可以使用光學(xué)或 反射檢測器(如電荷耦合器件(CCD)或明視傳感器)測量。在檢測 區(qū)內(nèi)的顏色強(qiáng)度可以用作樣品中存在的微生物量的半定量性度量。某 些微粒也可以用作吸收或發(fā)射可檢測輻射(例如特定波長的光)的標(biāo) 簽。
如上所述，擴(kuò)增步驟(ii)可以使用嵌套式PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行。 在這種實(shí)施例中，嵌套式PCR擴(kuò)增優(yōu)選在含有"內(nèi)側(cè)"和"外側(cè)"引 物序列對的單個(gè)擴(kuò)增容器(如試管)內(nèi)進(jìn)行。內(nèi)側(cè)引物序列對與第一 和第二引物序列相對應(yīng)，而外側(cè)引物序列對由第一外側(cè)引物序列和第 二外側(cè)引物序列提供。選擇第一外側(cè)引物序列和第二外側(cè)引物序列以 使得能夠擴(kuò)增靶核苷酸序列旁側(cè)的序列；它們通常將未經(jīng)標(biāo)記。嵌套 式PCR擴(kuò)增提供增加特異性和敏感度的可能性，因?yàn)楦锌赡鼙苊鈾z 測由錯(cuò)誤引發(fā)所致的擴(kuò)增子(即從不同于所準(zhǔn)備檢測的微生物的核酸 的核酸中產(chǎn)生的擴(kuò)增子)。此外，擴(kuò)增步驟(ii)可以采用多重PCR， 或另外，使用簡并引物以確保特異性檢測靶微生物。
第一方面的方法可以容易進(jìn)行變化，以使得能同時(shí)檢測屬于具體 科的微生物(如李斯特菌科(Listeriaceae )、腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)、葡萄球菌禾斗(Staphylococcaceae)、芽胞桿菌 科(Bacillaceae )、軍團(tuán)菌科(Legionellaceae )、假單胞菌科 (Pseudomonadaceae)、彎曲菌科(Campylobacteraceae)禾口螺桿菌科 (Helicobacteraceae))，以及更特別是，同時(shí)檢測所述科內(nèi)的具體屬 (如李斯特菌屬、沙門氏菌屬、腸桿菌屬、埃希桿菌屬、軍團(tuán)菌屬、 芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、葡萄球菌屬、彎曲桿菌屬和螺桿菌屬的微 生物；或類似地，同時(shí)檢測屬于特定屬的微生物，以及更具體地，同
時(shí)檢測所述屬的具體物種的微生物。例如，使用屬特異性引物對(如 李斯特菌屬物種特異性引物對)和物種特異性引物對(如單核細(xì)胞增
多性李斯特菌特異性引物對)。在該實(shí)施例中，第一和第二引物序列 (包含物種特異性引物)分別用第一和第二標(biāo)簽標(biāo)記，而第三引物序列和第四引物序列(包含屬特異性引物)分別用第三標(biāo)簽和第四標(biāo)簽
標(biāo)記(如生物素、DNP、 FITC和DIG均可以使用)，其中第三標(biāo)簽和
第四標(biāo)簽優(yōu)選均異于第一和第二標(biāo)簽，雖然第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽有可 能是相同的或功能等價(jià)的(即以使得第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽均能為第一 試劑結(jié)合)。擴(kuò)增將優(yōu)選在單個(gè)擴(kuò)增容器內(nèi)進(jìn)行(即多重反應(yīng))，并
因而，第三引物序列和第四引物序列將優(yōu)選具有相似的解鏈溫度(Tm) 和引發(fā)特征，以致允許使用相同的退火溫度和擴(kuò)增時(shí)間。然而，擴(kuò)增 也可以另外在獨(dú)立的擴(kuò)增容器中進(jìn)行，同時(shí)將獨(dú)立擴(kuò)增的產(chǎn)物在步驟 (iii)之前合并。第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽可以是相同的(或否則是功能等 價(jià)的)，在這種情況下，第一試劑標(biāo)記的微粒在步驟(iii)中應(yīng)當(dāng)結(jié)合 至從第一和第二引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子以及從第三引物序列和第四引 物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子。然而，在第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽不同的情況下， 該方法必需向步驟(iii)中使用的緩沖液添加用特異性結(jié)合至第三標(biāo)簽 的第三試劑標(biāo)記的微粒。該方法還必需在橫向流動裝置上提供附加的 檢測區(qū)，該附加檢測區(qū)具有特異性結(jié)合至第四標(biāo)簽的第四試劑。該附 加檢測區(qū)由此結(jié)合并固定從第三引物序列和第四引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增 子。
第一方面的方法也可以容易地進(jìn)行變化，以使得能同時(shí)檢測多于 一種類型的微生物(如李斯特菌屬和沙門氏菌屬)。在這種實(shí)施例中， 擴(kuò)增將優(yōu)選在含有一對第一和第二引物序列和另一對第三引物序列和 第四引物序列的單個(gè)擴(kuò)增容器內(nèi)進(jìn)行。選擇第一和第二引物序列以擴(kuò) 增第一微生物(如李斯特菌屬)的靶核苷酸序列，而選擇第三引物序 列和第四引物序列以擴(kuò)增第二微生物(例如沙門氏菌屬)的靶核苷酸 序列。第三引物序列和第四引物序列分別用第三標(biāo)簽和第四標(biāo)簽標(biāo)記 (如生物素、DNP、 FITC和DIG均可以使用)，其中第三標(biāo)簽和第四 標(biāo)簽優(yōu)選均不同于第一和第二標(biāo)簽，雖然第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽有可能 是相同的(或否則是功能等價(jià)的)，在這種情況下，第一試劑標(biāo)記的 微粒在步驟(iii)中應(yīng)當(dāng)結(jié)合至從第一和第二引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子以 及從第三引物序列和第四引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子。然而，如果第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽不同，則該方法必需向步驟(iii)中使用的緩沖液添加用 特異性結(jié)合至第三標(biāo)簽的第三試劑標(biāo)記的微粒。擴(kuò)增將優(yōu)選在單個(gè)擴(kuò) 增容器內(nèi)進(jìn)行(即多重反應(yīng))，并因而，第三引物序列和第四引物序
列將優(yōu)選具有相似的解鏈溫度(Tm)和引發(fā)特征，以致允許采用相同
的退火溫度和擴(kuò)增時(shí)間。然而，擴(kuò)增也可以另外在獨(dú)立的擴(kuò)增容器中 進(jìn)行，同時(shí)將獨(dú)立擴(kuò)增的產(chǎn)物在步驟(iii)之前合并。該方法還必需在 橫向流動裝置上提供附加檢測區(qū)，其中該附加檢測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合 至第四標(biāo)簽的第四試劑。檢測區(qū)結(jié)合并固定從第一和第二引物序列產(chǎn) 生的擴(kuò)增子(由此指示第一微生物的存在)，而附加檢測區(qū)結(jié)合并固 定從第三引物序列和第四引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子(由此指示第二微生 物的存在)。
在第一方面方法的備選方法中，本發(fā)明可以容輕易地進(jìn)行變化， 以使得第一引物序列的第一標(biāo)簽被省略并用經(jīng)標(biāo)記的脫氧核糖核苷三
磷酸(dNTP)(例如經(jīng)標(biāo)記的2'-脫氧腺苷5'-三磷酸(dATP)和/或經(jīng) 標(biāo)記的2'-脫氧胸苷三磷酸(dTTP))替換。
因而，在第二方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的 方法，所述方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意微生物釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微
生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5'和3'端的 一對第一和第二引物序列，其中靶序列的擴(kuò)增利用了第一標(biāo)簽標(biāo)記的 脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記， 使得靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽之一的第一
試劑標(biāo)記，并允許所述第一試劑與存在的所述第一和第二標(biāo)簽中的所 述一種標(biāo)簽結(jié)合；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟(iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，其中所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成 分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰 近該遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū) 設(shè)有特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中不為所述第一試劑結(jié)合的另 一種標(biāo)簽的第二試劑，而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；以及
(V)檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任意結(jié)
出于排除任何疑問的目的，應(yīng)該理解，在整篇說明書內(nèi)，對所述 第一引物序列的指代可以被稱為"正向"或"反向"引物序列。類似 地，對所述第二引物序列的指代可以被稱為"正向"或"反向"引物 序列的稱謂。然而，必要的是，所述第一和第二引物序列一起限定微 生物中靶核苷酸序列的5'和3'端。
第二方面的方法的對照區(qū)優(yōu)選提供關(guān)于步驟(ii)的擴(kuò)增的陽性對 照。因而，第三引物序列用與第一標(biāo)簽相同的(或否則是功能等價(jià)的) 第三標(biāo)簽標(biāo)記而第四引物用不同于第一 (和第三)以及第二標(biāo)簽的第 四標(biāo)簽標(biāo)記，在這種情況下，第一試劑標(biāo)記的微粒在步驟(iii)應(yīng)當(dāng)結(jié) 合至從第一和第二引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子以及從第三引物序列和第四 引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子。在這種情況下，橫向流動裝置上的對照區(qū)將 包含特異性結(jié)合至第四標(biāo)簽的對照試劑。該對照區(qū)結(jié)合并固定從第三 引物序列和第四引物序列產(chǎn)生的擴(kuò)增子，由此指示步驟(ii)的擴(kuò)增是 成功的。對照區(qū)也可以指示微粒已經(jīng)成功流過基底并且微粒結(jié)合的第 三試劑已經(jīng)能夠結(jié)合至第三標(biāo)簽。若第一標(biāo)簽和第三標(biāo)簽是相同的(或 否則是功能等價(jià)的)，則對照區(qū)也可以指示微粒結(jié)合的第一試劑是否 已經(jīng)能夠結(jié)合至第一標(biāo)簽。
因此，第二方面的方法的步驟(ii)可以包括
提供對照核酸，并共擴(kuò)增所述微生物核酸上存在的靶核苷酸序列， 所述靶序列是所述微生物獨(dú)有的或者說是特征性的，并且其中所述靶
27序列的擴(kuò)增包括利用限定所述耙序列的5'和3'端的一對第一和第二引 物序列，其中靶序列的擴(kuò)增利用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸
(dNTP)并且所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，以使得對靶序列的
任意擴(kuò)增產(chǎn)生了第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子，以及所述對照核 酸上存在的對照核苷酸序列，其中對照序列的所述擴(kuò)增包括使用限定
所述對照序列的5，和3'端的一對第三引物序列和第四引物序列，其中 對照序列的擴(kuò)增利用了用第一標(biāo)簽標(biāo)記的dNTP而所述第四引物序列 用第四標(biāo)簽標(biāo)記，以使得對照序列的任意擴(kuò)增產(chǎn)生了用第三標(biāo)簽和第 四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子。
在第三方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的試劑盒，
所述試劑盒包括
一對第一和第二引物序列，其限定所述微生物獨(dú)有的或者說是特
征性的靶核苷酸序列的5'和3'端，所述第一引物序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而 所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記；
緩沖液，其包含用特異性結(jié)合至第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記的微粒；
和
橫向流動裝置，其包括設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)的基底，所述檢測區(qū)設(shè)有 特異性結(jié)合至第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合 至第一試劑的對照試劑。
在第四方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中存在的微生物的試劑盒， 所述試劑盒包括
用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(如包括經(jīng)標(biāo)記
的dATP的dNTP混合物)；
一對第一和第二引物序列，其限定所述微生物獨(dú)有的或者說是特 征性的耙核苷酸序列的5'和3'端，所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記；
緩沖液，其包含用特異性結(jié)合至第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記的微粒;
以及
橫向流動裝置，其包括設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)的基底，所述檢測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合 至第一試劑的對照試劑。
第三方面或第四方面的試劑盒還可以包括其它組分，例如洗滌溶 液和阻斷試劑、對照核酸(如寡核苷酸)和限定對照核苷酸序列的5' 和3'端的一對引物序列以及合適的聚合酵(如T叫聚合酶)。
本發(fā)明的方法可以容易適用于檢測來自可能被懷疑存在于具體樣 品中的非微生物來源的核酸，例如血液樣品中的人核酸(如以使得能
(例如)對個(gè)體進(jìn)行基因分型)和來自植物或其它動物的核酸(如用 以檢測食物變應(yīng)原如花生、蛋和貝類食物變應(yīng)原)。
因此，在第五方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中的核酸的方法， 所述方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意細(xì)胞(如哺乳動物、 昆蟲或植物細(xì)胞)或其它含核酸的結(jié)構(gòu)(如病毒衣殼)釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述耙 序列5'和3'端的一對第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一 標(biāo)簽標(biāo)記而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序列的任意擴(kuò) 增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記， 并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝
橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該 遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有 特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑； 以及
(v) 檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任音^t A 思^口 口 。
因此，在第六方面，本發(fā)明提供用于檢測樣品中的核酸的方法，
所述方法包括如下步驟
(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意細(xì)胞或其它含核酸的 結(jié)構(gòu)釋放核酸；
(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述耙
序列5'和3'端的一對第一和第二引物序列，其中靶序列的擴(kuò)增利用了 第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)并且所述第二引物用第 二標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記 的擴(kuò)增子；
(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，其中所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中的一種標(biāo)
簽的第一試劑標(biāo)記，并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一和第 二標(biāo)簽中的所述一種標(biāo)簽；
(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝
橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該 遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有 特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中不為所述第一試劑結(jié)合的另一種 標(biāo)簽的第二試劑，而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；以及
(v) 檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任
音# A 思5口 口 o
就第一方面和第二方面的方法而言，第五和第六方面的方法利用 了一個(gè)對照區(qū)。對照區(qū)是橫向流動裝置上與檢測區(qū)隔開的區(qū)域。優(yōu)選 的是，對照區(qū)位于橫向流動裝置的檢測區(qū)和遠(yuǎn)端之間。對照區(qū)提供陽 性對照結(jié)果。以與上面第一方面和第二方面方法中所描述的方式等效 的方式，該陽性對照結(jié)果可以顯示微粒已經(jīng)成功地流過基底，或以別 的方式，指示步驟(ii)擴(kuò)增是成功的。任選地，對照區(qū)可以包括第一
30亞區(qū)和第二亞區(qū)，第一亞區(qū)能夠提供顯示微粒已經(jīng)成功流過基底的陽 性對照結(jié)果，而第二亞區(qū)能夠顯示步驟(ii)擴(kuò)增是成功的。
在第二和第六方面的方法中，步驟(ii)的擴(kuò)增可以利用2'-脫氧
尿苷三磷酸(dUTP)，其優(yōu)選未經(jīng)標(biāo)記，因?yàn)閐UTP摻入擴(kuò)增子提供 了通過使用特異性尿嘧啶降解酶例如尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)來降 解所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的機(jī)制。本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的這種酶的實(shí)例可 以不可逆地被熱滅活(如可從美國威斯康辛州麥迪遜的Epicentre Biotechnologies獲得的HKTMUNG)。因而，如果擔(dān)心步驟(ii)的擴(kuò)增 混合物可能會受外來核酸(即非樣品核酸)污染，其中所述外源核酸 可能包括靶核苷酸序列并由此導(dǎo)致"假陽性"結(jié)果(例如來自早先擴(kuò) 增的可能保留在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備或表面上的污染擴(kuò)增子)，則在擴(kuò)增步驟 (ii)之前向樣品中添加諸如HK UNG之類的酶應(yīng)當(dāng)引起選擇性降解 包含dUTP的任意外來核酸。在足以使得任意的這種外來核酸被降解的 孵育時(shí)間(例如37-5(TC下約15分鐘)后，可以加熱該樣品以不可逆 地滅活HK^UNG (如通過加熱樣品至約95°C)。
為了可以更清晰地理解本發(fā)明的性質(zhì)，現(xiàn)在將參考下列非限制性 實(shí)例描述本發(fā)明的優(yōu)選形式。
實(shí)例
實(shí)例1使用經(jīng)標(biāo)記的引物序列檢測李斯特菌屬
材料和方法
樣品
樣品從TECRA UNIQUE PLUS 李斯特菌屬檢測模塊的第三試 管(即澳大利亞專利申請NO.2002333050中所述的操作用于李斯特菌 屬檢測的自動化系統(tǒng)中的第三試管)獲得。
PCR引物
選擇聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物以使得能從16srRNA基因的區(qū)域擴(kuò)增李斯特菌屬中存在的核酸序列。引物的核苷酸序列是
正向引物5'-GCGTGCCTAATACATGCAAG-3'， (SEQIDNO:
1)
反向引物5'誦ACCTCGCGGCTTCGCGAC-3' (SEQIDNO: 2) 經(jīng)標(biāo)記且脫鹽的引物從Sigma Proligo (Boulder， CO， USA)獲得。 正向引物用熒光素在5'端加以標(biāo)記而反向引物用生物素在5'端加以標(biāo) 記。利用這些引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)生長度大約1234個(gè)核苷酸(例如單核 細(xì)胞增多性李斯特菌4b)的擴(kuò)增子。
橫向流動裝置
使用維度為5mmX60mm的一條硝化纖維素薄膜(Immun叩ore FP， Whatman)制備如圖1中所示的橫向流動裝置。將樣品墊(Arista Biologicals, Allentown， PA， USA)施加至該薄膜帶上以允許上樣緩 沖的分析樣品。在該裝置的遠(yuǎn)端，粘附包含棉纖維的吸附墊(Arista Biochemicals， Allentown， PA， USA)以汲取緩沖的分析樣品流過該薄 膜。在該薄膜上制備檢測線和陽性對照線。檢測線通過將2.3pg抗FITC 單克隆抗體(Sigma-Aldrich， St丄ouis， MO， USA)吸附至橫跨膜寬度 的細(xì)線中的薄膜上而制備。陽性對照線位于檢測線和該裝置的遠(yuǎn)端之 間，并且通過在橫跨膜寬度的細(xì)線內(nèi)吸附與生物素綴合的牛血清白蛋 白(Sigma-Aldrich)而制備。整個(gè)橫向流動裝置通過將該薄膜和樣品 墊及吸附墊施加至粘性背襯卡(Millenia Diagnostics, SanDiego， CA， USA)上而構(gòu)建。
擴(kuò)增
根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實(shí)施PCR擴(kuò)增。用上文所述的引 物(即SEQIDNO: l禾卩2) ， PCR擴(kuò)增如下實(shí)施
(i)使用無菌接種環(huán)將樣品接種至PCR混合物(25°C 下，包含1.5mM MgCl2、 10mM Tris-HCl 50mMKCl pH 8.3的緩沖液中 的終濃度為0.5pM的各引物、20單位/mL Taq DNA聚合酶、200/^1 dATP、 200岸dCTP、 200岸dGTP和200岸dTTP);(ii) 使用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)PCR機(jī)，讓接種的PCR混合物接受94。C的
初始加熱步驟5分鐘；以及
(iii) 35個(gè)如下循環(huán)
a. 解鏈步驟，9fC下15秒，
b. 退火步驟，大約58"C下20秒，和
c. 延伸步驟，72'C下2分鐘。
PCR產(chǎn)物的制備
在正要施加至橫向流動裝置之前，將PCR產(chǎn)物的5pL等分試樣與 100/iL流動緩沖液(磷酸鹽緩沖生理鹽水，pH7.5和0.05% Tween-20) 和20/^L預(yù)吸附至特異性結(jié)合生物素的山羊抗生物素(OD530=10.2) (Alchemy Laboratories, Dundee, UK)的金微粒混合。
橫向流動裝置上的測定
將緩沖的分析樣品(其包含緩沖的PCR產(chǎn)物/金微粒混合物的全部 132ML等分試樣)上樣至上述橫向流動裝置的樣品墊上。讓該混合物的 成分流過該膜5分鐘。包含抗FITC抗體的檢測線"捕集"在混合物中 存在的FITC標(biāo)記的雙標(biāo)記擴(kuò)增子。雙標(biāo)記的擴(kuò)增子與金微粒結(jié)合，并 因而在檢測線處由抗FITC抗體捕集時(shí)，產(chǎn)生粉紅色-紅色線。另一方 面，陽性對照線捕集了或者未結(jié)合至擴(kuò)增子或者未被檢測線的抗FITC 抗體捕集的金微粒。陽性對照線確證金微粒流過該薄膜并且抗生物素 金微粒能夠捕生物素。在陽性對照線處捕集金微粒也產(chǎn)生粉紅色-紅色 線。
結(jié)果與討論
讓樣品接受上述擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物在流動緩沖液中稀釋以在橫 向流動裝置測定。由于樣品源(即來自操作用于李斯特菌屬檢測的自 動化UNIQUE PLUSTM檢測系統(tǒng)中的第三試管)產(chǎn)生指示李斯特菌的存 在的陽性結(jié)果，因而預(yù)期該實(shí)例的測定法將提供確證性陽性結(jié)果。在 上樣至橫向流動裝置后，兩條粉紅色-紅色線在約2分鐘后出現(xiàn)在薄膜上，由此指示樣品中存在李斯特菌屬。從樣品的初始加熱至橫向流動 裝置上出現(xiàn)兩條粉紅色-紅色線，花費(fèi)約220分鐘(即少于4小時(shí))。 平行分析來自僅含有沙門氏菌屬的純培養(yǎng)物的比較樣品，在檢測線處 未產(chǎn)生顏色，指示李斯特菌屬的陰性結(jié)果。
實(shí)例2利用經(jīng)標(biāo)記的dNTP檢測李斯特菌屬
材料和方法
樣品
樣品從TECRA②UNIQUE PLUSTM李斯特菌屬檢測模塊的第三試管 (即澳大利亞專利申請No 2002333050中所述的操作用于李斯特菌檢 測的自動化系統(tǒng)中的第三試管)獲得。
PCR引物
使用的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物與實(shí)例1中所用的引物相同， 然而，在本例中，正向引物用熒光素在5'端進(jìn)行標(biāo)記而反向引物不作標(biāo) 記。再次，引物從Sigma Proligo獲得。
橫向流動裝置
制備如實(shí)例1中所述的橫向流動裝置。檢測線通過將抗FITC單克 隆抗體(Sigma-Aldrich)吸附至細(xì)線中的薄膜上而制備。陽性對照線 通過將與生物素綴合的BSA (Sigma-Aldrich)吸附至細(xì)線中的薄膜上 而制備。
擴(kuò)增
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，使用包含經(jīng)生物素標(biāo)記的dATP的dNTP混合物 (NEBiolabs， Ipswich， MA， USA)實(shí)施PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增如下實(shí) 施
(i)使用無菌接種環(huán)將2wL樣品接種至50uL PCR混合物(25 。C下，包含1.5mM MgCl2、 10mM Tris-HCl 50mMKCl pH8.3的緩沖液 中的終濃度為0.5"M的每種引物、20單位/mL的Taq DNA聚合酶、
3432/xM生物素化dATP、 168/iM dATP、 200pM dCTP、 200/xM dGTP和 200岸dTTP);
(ii) 使用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)PCR機(jī)，讓接種的PCR混合物接受94°〇的 初始加熱步驟5分鐘；以及
(iii) 35個(gè)如下循環(huán)
a. 解鏈步驟，94'C下15秒，
b. 退火步驟，大約58。C下20秒，和
c. 延伸步驟，72'C下2分鐘。
PCR產(chǎn)物的制備
按照如實(shí)例1中所述的相同方式制備用于上樣至橫向流動裝置上 的PCR產(chǎn)物。
橫向流動裝置上的測定
將緩沖的PCR產(chǎn)物/金微?；旌衔锏娜?32/xL等分試樣上樣至 上述橫向流動裝置上。讓該混合物的成分流過該膜5分鐘。
結(jié)果與討論
在含有李斯特菌屬的樣品中，在檢測線處檢測到雙標(biāo)記的擴(kuò)增子。 對照線指示金微粒完全流至膜的遠(yuǎn)端并指示抗生物素金微粒能夠被生 物素捕集。不含李斯特菌屬的比較樣品是陰性的。
生物素化dNTP與用于擴(kuò)增特定核酸序列的一種標(biāo)記引物和一種 非標(biāo)記引物的使用產(chǎn)生了容易檢測到的雙標(biāo)記擴(kuò)增子。這種方法可以 起到增加測定法敏感度的作用，因?yàn)榇嬖诟嗫杀唤鹞⒘５目股锼?抗體結(jié)合的生物素分子。然而，如果發(fā)生錯(cuò)誤引發(fā)，將經(jīng)標(biāo)記的引物 并入擴(kuò)增子中，則從該測定法中獲得假陽性結(jié)果的可能性可能增加。
實(shí)例3使用兩種經(jīng)標(biāo)記的引物和單層多孔基質(zhì)材料檢測李斯特菌
凰材料和方法 樣品
如實(shí)例1中所述獲得含有李斯特菌屬16s rRNA基因的經(jīng)雙標(biāo)記的 擴(kuò)增子的PCR產(chǎn)物樣品。
橫向流動裝置
將一條維度為5mmX60mm的Fusion 5薄膜(Whatman)粘附于 相同大小的粘性背襯卡(Millenia Diagnostics)。檢測線通過施加一列 2.3/mi聚苯乙烯珠(Bangs Laboratories, Fishers， IN， USA)而制備， 在所述聚苯乙烯珠上已經(jīng)根據(jù)由Bangs實(shí)驗(yàn)室提供的方案吸附了抗 FITC單克隆抗體(Sigma-Aldrich)。簡而言之，將lmg聚苯乙烯珠加 至100/tL吸附緩沖液(磷酸鹽緩沖生理鹽水，pH7.4)中。在獨(dú)立的試 管內(nèi)，將23/xg抗FITC抗體在IOOmI吸附緩沖液中稀釋。將聚苯乙烯 珠溶液轉(zhuǎn)移至含有抗體的試管內(nèi)并將合并的溶液在室溫下混合2小時(shí)， 隨后在4。C下混合過夜以使抗體吸附至聚苯乙烯珠上。在吸附后，將聚 苯乙烯珠溫和地離心(2000Xg)并移除含有未吸附抗體的上清液。隨 后，將聚苯乙烯珠在施加至Fusion 5薄膜條帶之前貯存于100/iL貯存 緩沖液(磷酸鹽緩沖生理鹽水，pH 7.4-0.05% Tween20)中。聚苯乙烯 珠防止抗FITC抗體遷移通過該薄膜。將薄膜條帶在使用前于37'C下干 燥30分鐘。
橫向流動裝置上的測定
通過取出10/^L等分試樣并將其與160pL緩沖液 (PBS-0.05%Tween20)和10/xL金微粒(OD530=10.1)混合而制備用 于測定的PCR產(chǎn)物樣品，其中山羊抗生物素抗體(Alchemy Laboratories)預(yù)吸附至金微粒表面。將該樣品立即直接上樣至橫向流 動條帶的Fusion 5薄膜條帶上。混合物橫向地芯吸通過該薄膜并在大 約IO分鐘后抵達(dá)檢測線。
結(jié)果與討論樣品在檢測線處產(chǎn)生粉紅色-紅色線，指示李斯特菌屬陽性結(jié)果。 該結(jié)果表明在橫向流動裝置中使用諸如Fusion 5之類的單層多孔基質(zhì)
材料是其它薄膜類型例如硝化纖維素的可行替代品。使用單層多孔基 質(zhì)材料可以提供制造方面的優(yōu)勢。
實(shí)例4使用提供PCR對照的多重PCR擴(kuò)增檢測單核細(xì)胞增多性 李斯特菌
材料和方法 樣品
樣品可以從TECRA UNIQUE PLUSTm李斯特菌屬檢測模塊的第三
試管獲得。
對照模版
可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法合成非相關(guān)核苷酸序列(即 在核細(xì)胞增生性李斯特菌中不存在的核苷酸序列)的對照模板(和互 補(bǔ)鏈)。從鴨嘴獸(platypus)甘露糖6-磷酸/類胰島素生長因子2受體 (M6P/IGF-2R)基因的對照核酸制備的合適對照模板具有如下序列
編碼鏈
5'-TTGAAAGACGATGAAGAAAGTAAGCCAGATTTCTGCAAT GGCCATA
GAGGTGG
AGTGGATCACTGAGTACACCTGCCATAGAGATTATTTGGAA
AGTAATT
CCTGCTATCTAAATAG-3' (SEQIDNO: 3)
非編碼互補(bǔ)鏈
5'-CTATTTAGATAGCAGGAATTACTTTCCAAATAATCTCTAT GGCAGG
37AGCCGTG
AGCTTGGGAGCTGTGCTTTCTATTCTCCCTGACGGGCATATA AATGTAA
TTTCTTCA
TCGTCTTTCAA-3' (SEQIDNO: 4)
PCR引物
選擇引物以使得能多重PCR擴(kuò)增單核細(xì)胞增多性李斯特菌的區(qū) 域，例如侵襲相關(guān)蛋白(IAP)基因的130bp區(qū)和對照核酸的206個(gè)堿 基對區(qū)(即鴨嘴獸M6P/IGF-2R基因的938-1143bp區(qū)域；Genbank登 錄號AF151172)。合適的引物的核苷酸序列是
第一引物對(IAP基因，單核細(xì)胞增多性李斯特菌) 正向引物5'-ACAAGCTGCACCTGCTGCAG-3' ( SEQ ID NO: 5) 反向引物5'-TAACAGCGTGTGTAGTAGCA-3' (SEQIDNO: 6) 在第一引物對的引物的5'端，對正向引物用生物素標(biāo)記，而對反 向引物用熒光素標(biāo)記。
第二引物對(M6P/IGF-2R基因)
正向引物5'-TTGAAAGACGATGAAGAAAGTAAG-3 (SEQ ID
NO: 7)
反向引物5'-CTATTTAGATAGCAGGAATTACTTTC-3' (SEQ ID
NO: 8)
在第二引物對的引物的5'端，對正向引物用生物素標(biāo)記，而對反 向引物用二硝基苯酚(DNP)標(biāo)記。
橫向流動裝置
制備如實(shí)例1中所述的橫向流動裝置。檢測線通過將抗FITC抗體 吸附至檢測區(qū)內(nèi)橫跨膜寬度的細(xì)線中的薄膜上而制備。PCR對照線優(yōu)
38選位于檢測線和該裝置的遠(yuǎn)端之間。PCR對照線通過將抗DNP抗體吸 附至橫跨膜寬度的細(xì)線中的薄膜上而制備。
擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法實(shí)施，然而，將全部四種引物和少量 (例如IO-IOO個(gè)拷貝)的對照模板加至混合物中。使用如上所述的引 物(即SEQIDNO: 5、 6、 7禾卩8) ， PCR擴(kuò)增可以如下實(shí)施
(i) 使用包含終濃度為250nM的每種引物(SEQIDNO: 5、 6、 7 和8)和10-100個(gè)拷貝的雙鏈陽性對照模板DNA(SEQ ID NO: 3和4) 的20/iL分子級別H20，使干燥的PCR混合物(Accupower， Bioneer， Korea)再水化；
(ii) 使用無菌接種環(huán)將1mL樣品接種至再水化的干燥pcr混合
物；
(iii) 使用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)PCR機(jī)，讓接種的PCR混合物接受9fC的 初始加熱步驟5分鐘；隨后
(iv) 進(jìn)行如下40個(gè)循環(huán)
a. 解鏈步驟，9fC下15秒，
b. 退火步驟，大約58'C下20秒，以及
c. 延伸步驟，72。C下30秒。
PCR產(chǎn)物的制備
將PCR產(chǎn)物的10/xL等分試樣與包含磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS， pH7.5)和Tween-20 (0.05%)和10/iL金微粒(OD530 =10.2)的120pL 流動緩沖液混合，其中山羊抗生物素抗體(Alchemy Laboratories)已 經(jīng)預(yù)吸附至所述金微粒上。
橫向流動裝置上的測定
將緩沖的PCR產(chǎn)物混合物的140ML等分試樣上樣至橫向流動裝置 上。讓該混合物的成分流過該薄膜1至IO分鐘。包含抗生物素抗體的 檢測線捕集混合物中存在的生物素和FITC雙標(biāo)記的任意單核細(xì)胞增多性李斯特菌擴(kuò)增子。抗DNP的PCR對照線捕集從對照模板產(chǎn)生的生物
素和DNP雙標(biāo)記的擴(kuò)增子。
實(shí)例5利用雙試管對照PCR擴(kuò)增檢測單核細(xì)胞增多性李斯特菌
材料和方法
樣品
樣品可以從TECRA UNIQUE PLUS 李斯特菌屬檢測模塊的第 三試管獲得。
PCR引物
選擇引物以使得能多重PCR擴(kuò)增單核細(xì)胞增多性李斯特菌的區(qū) 域，例如侵襲相關(guān)蛋白(IAP)基因的130bp區(qū)和對照核酸的206個(gè)堿 基對區(qū)(即鴨嘴獸M6P/IGF-2R基因的938-1143bp區(qū)域；Genbank登 錄號為AF151172)。合適的經(jīng)標(biāo)記的引物如實(shí)例4中所描述。
橫向流動裝置
制備如實(shí)例1中所述的橫向流動裝置。檢測線和PCR對照線如實(shí) 例4中所述制備。
擴(kuò)增
PCR擴(kuò)增在兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)試管中實(shí)施。檢測反應(yīng)(即使用樣品 的反應(yīng))如實(shí)例4中所述實(shí)施，除了反應(yīng)在兩個(gè)獨(dú)立的試管進(jìn)行外， 以使得
(i) 兩管干燥的PCR混合物(Accupower， Bioneer， Korea)被再 水化。 一個(gè)試管裝有包含終濃度為250nM的第一引物對(SEQIDNO: 5和6)的20ML分子級別H20，而第二試管裝有包含終濃度為250nM 的第二引物對(SEQIDNO: 7和8)和10-100個(gè)拷貝的雙鏈陽性對照 模板DNA (SEQIDNO: 3禾卩4)的20juL分子級別H20;
(ii) 使用無菌接種環(huán)將lML樣品接種至裝有再水化的干燥PCR混 合物的每一試管內(nèi)；(m)使用標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)PCR機(jī)，讓接種的PCR混合物接受94。C的
初始加熱步驟5分鐘；隨后 (iv)進(jìn)行如下40個(gè)循環(huán)
a. 解鏈步驟，94'C下15秒，
b. 退火步驟，大約58X:下20秒，以及
c. 延伸步驟，72"C下30秒。
PCR產(chǎn)物的制備
將每種PCR產(chǎn)物的5ML等分試樣與120/xL流動緩沖液(磷酸鹽緩 沖生理鹽水，pH7.5和0.05% Tween-20)和10pL金微粒(OD530=10,2) 混合在一起，其中山羊抗生物素抗體(Alchemy Laboratories)已經(jīng)預(yù) 吸附至所述金微粒上。
橫向流動裝置上的測定
將緩沖的PCR產(chǎn)物混合物的140/iL等分試樣上樣至橫向流動裝置 上。讓該混合物的成分流過該薄膜1至10分鐘。包含抗生物素抗體的 檢測線截獲混合物中存在的以生物素和FITC雙標(biāo)記的任意試驗(yàn)單核細(xì) 胞增多性李斯特菌擴(kuò)增子。另一方面，PCR對照線捕集對照擴(kuò)增子。
在整篇本說明書內(nèi)，單詞"包含"(comprise)或變型例如"包括" 或"包含著"將理解為表示包括所述的要素、整數(shù)或步驟，或要素、 整數(shù)或步驟的組，但是不排除任意其它的要素、整數(shù)或步驟，或要素、 整數(shù)或步驟的組。
在本說明書中提及的全部出版物通過參考而并入在本文中。對本 說明書中所包括的文獻(xiàn)、動作、材料、裝置、物品或其它等的任何討 論，其目的僅是為本發(fā)明提供上下文環(huán)境。將不視為承認(rèn)任何或全部 這些事物因?yàn)樵诒旧暾埖拿宽?xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日之前存在于澳大利 亞或其它地方而形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或是與本發(fā)明相關(guān)的領(lǐng)域中 的常見一般性知識。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可以對如具體實(shí)施例中所示的本發(fā)明進(jìn)行 眾多改變和/或修改而不脫離廣義描述的本發(fā)明的精神或范圍。因此， 本發(fā)明實(shí)施例將在所有方面均被視為是示例性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1. 一種用于檢測樣品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步驟(i)處理所述樣品以致使樣品中存在的任意所述微生物釋放核酸；(ii)擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5′和3′端的一對第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；(iii)將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中稀釋，所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記，并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；(iv)在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟(iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；以及(v)檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任意結(jié)合。
2. —種用于檢測樣品中存在的微生物的方法，所述方法包括如下步驟(i) 處理所述的樣品以致使樣品中存在的任意所述微生物釋放核酸；(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，所述靶序列是所述微 生物獨(dú)有的或者說是特征性的，包括使用限定所述靶序列5'和3'端的一 對第一和第二引物序列，其中靶序列的擴(kuò)增利用了用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記， 使得靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；(iii) 將一定量的步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液中 稀釋，所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中的一種標(biāo)簽的 第一試劑標(biāo)記，并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一和第二標(biāo) 簽中的所述一種標(biāo)簽；(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (m)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該 遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有 特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中不為所述第一試劑結(jié)合的另一種 標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；以及(v) 檢測緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任意結(jié)合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中樣品是食物樣品、從食 物制品表面的拭子制備的樣品、廢水或生產(chǎn)用水樣品、或微生物培養(yǎng) 或富集樣品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述處理步驟(i) 包括在85-10(TC的溫度下加熱樣品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增步驟(ii) 包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增步驟 (ii)包括嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一和第二引 物序列分別用第一和第二半抗原標(biāo)簽標(biāo)記。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽是生物素而第二標(biāo)簽是二硝基苯酚(DNP)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和第 二引物序列中至少一種是簡并引物序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中微粒是金微粒。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微粒具 有的直徑大小為0.002-0.25/im。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其中所述微粒具有的平均直徑 大小為0.04/mi。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對照區(qū) 位于所述橫向流動裝置的檢測區(qū)和遠(yuǎn)端之間。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測步 驟(v)包括觀察可見的顏色信號在所述檢測區(qū)和對照區(qū)之一或二者處 出現(xiàn)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和 第二引物序列的序列是科特異性的。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對于選自李斯特菌科(Listeriaceae )、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、葡萄球菌禾斗(Staphylococcaceae)、芽胞桿菌 科(Bacillaceae )、軍團(tuán)菌科(Legionellaceae )、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、 彎曲菌禾斗(Campylobacteraceae)禾口螺桿菌禾斗 (Helicobacteraceae )的科是特異性的。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和 第二引物序列的序列是屬特異性的。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對于選自李斯特菌屬(Listeria)、沙門氏菌屬(Salmonella)、 腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希桿菌屬(Escherichia)、軍團(tuán)菌屬(Legionella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、 葡萄球菌屬(Staphylococcus)、彎曲菌屬(Campylobacter)和螺桿菌 屬(Helicobacter)的屬是特異性的。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和 第二引物序列的序列是種特異性的。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是特異性 的。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對坂崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)是特異性的。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和 第二引物序列的序列對物種是特異性的，并且其中所述擴(kuò)增步驟(ii) 還包括通過使用限定其它靶核苷酸序列的5'和3'端的一對第三和第四 引物序列來擴(kuò)增所述其它靶序列，所述第三和第四引物序列對于所述 物種所屬的屬是特異性的并且以第三和第四標(biāo)簽分別標(biāo)記，使得所述 靶序列和其它靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的種 特異性擴(kuò)增子和/或第三和第四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的屬特異性擴(kuò)增子，其中所述第三和第四標(biāo)簽或者兩者均不同于第一和第二標(biāo)簽，或者備選地， 所述第三標(biāo)簽與第一標(biāo)簽相同或功能等價(jià)而所述第四標(biāo)簽不同于第一 和第二標(biāo)簽。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對單核細(xì)胞增多性李斯特菌是特異性的。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述第三和第四引 物序列的序列對李斯特菌屬是特異性的。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一和 第二引物序列的序列對第一屬是特異性的，并且其中所述擴(kuò)增步驟(ii) 還包括通過使用限定其它靶核苷酸序列的5'和3'端的一對第三和第四 引物序列來擴(kuò)增所述其它靶序列，所述第三和第四引物序列對第二屬 是特異性的并且分別用第三和第四標(biāo)簽標(biāo)記，使得所述靶序列和其它 耙序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子和/或第三 和第四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子，其中所述第三和第四標(biāo)簽或者兩者均 不同于第一和第二標(biāo)簽，或者備選地，所述第三標(biāo)簽與第一標(biāo)簽相同 或功能等價(jià)而所述第四標(biāo)簽不同于第一和第二標(biāo)簽。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述第一和第二引物序列 的序列對李斯特菌屬是特異性的。
27. 根據(jù)權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述第三和第四引 物序列的序列對沙門氏菌屬是特異性的。
28. 根據(jù)權(quán)利要求22至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第三 和第四引物序列中至少一種是簡并引物序列。
29. 根據(jù)權(quán)利要求22至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中對所述靶序列和其它靶序列的擴(kuò)增在單個(gè)擴(kuò)增容器內(nèi)進(jìn)行。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對照區(qū) 包含與所述第一標(biāo)簽相同或功能等價(jià)的對照試劑。
31. 根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中擴(kuò)增步驟(ii) 還包括通過使用限定對照核苷酸序列的5'和3'端的一對第三和第四引 物序列來擴(kuò)增所述對照序列，所述第三和第四引物序列分別用第三和 第四標(biāo)簽標(biāo)記，使得所述靶序列和對照序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和 第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子和/或第三和第四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子， 其中所述第三和第四標(biāo)簽或者兩者均不同于第一和第二標(biāo)簽，或者備 選地，所述第三標(biāo)簽與第一標(biāo)簽相同或功能等價(jià)而所述第四標(biāo)簽不同 于第一和第二標(biāo)簽，并且其中所述橫向流動裝置上的對照區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至所述第四標(biāo)簽的對照試劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述對照核苷酸序列存在 于所述處理步驟(i)之前或之后加至樣品的對照核酸上。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述對照核酸包含SEQ ID NO:3禾口/或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
34. 根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶序 列和對照序列的擴(kuò)增在單個(gè)擴(kuò)增容器內(nèi)進(jìn)行。
35. 根據(jù)權(quán)利要求22至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iii) 中使用的所述緩沖液還包含用特異性結(jié)合至所述第三標(biāo)簽的第三試劑 標(biāo)記的微粒。
36. —種用于檢測樣品中存在的微生物的試劑盒，所述試劑盒包括一對第一和第二引物序列，其限定所述微生物獨(dú)有的或者說是特 征性的靶核苷酸序列的5'和3'端，所述第一引物序列用第一標(biāo)簽標(biāo)記而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記；緩沖液，其包含用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記的 微粒；和橫向流動裝置，其包括具有檢測區(qū)和對照區(qū)的基底，所述檢測區(qū) 設(shè)有特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試 劑。
37. —種用于檢測樣品中存在的微生物的試劑盒，所述試劑盒包括用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP);一對第一和第二引物序列，其限定所述微生物獨(dú)有的或者說是特征性的耙核苷酸序列的5'和3'端，所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記；緩沖液，其包含用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記的微粒；和橫向流動裝置，其包括具有檢測區(qū)和對照區(qū)的基底，所述檢測區(qū) 設(shè)有特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試 劑。
38. 根據(jù)權(quán)利要求所述36或37的試劑盒，還包括對照核酸和限 定對照核苷酸序列的5'和3'端的一對引物序列。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中所述對照核酸包含SEQ ID NO:3禾口/或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
40. —種用于檢測樣品中的核酸的方法，所述方法包括如下步驟(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意細(xì)胞或其它含核酸的 結(jié)構(gòu)釋放核酸；(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶序列的5'和3'端的一對第一和第二引物序列，所述第一引物序列用第一 標(biāo)簽標(biāo)記而所述第二引物序列用第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得耙序列的任意擴(kuò) 增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子；(iii) 將一定量所述步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液 中稀釋，所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一標(biāo)簽的第一試劑標(biāo)記并允 許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一標(biāo)簽；(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物的至少一部分，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該 遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至所述第二標(biāo)簽的第二試劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑； 以及(V)檢測所述緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任音妙厶思^P 口 o
41. 一種用于檢測樣品中的核酸的方法，所述方法包括如下步驟(i) 處理所述樣品以致使樣品中存在的任意細(xì)胞或其它含核酸的 結(jié)構(gòu)釋放核酸；(ii) 擴(kuò)增所述核酸上存在的靶核苷酸序列，包括使用限定所述靶 序列5'和3'端的一對第一和第二引物序列，其中所述耙序列的擴(kuò)增利用 了用第一標(biāo)簽標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)而所述第二引物用 第二標(biāo)簽標(biāo)記，使得所述靶序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和第二標(biāo)簽兩 者標(biāo)記的擴(kuò)增子；(iii) 將一定量所述步驟(ii)的擴(kuò)增產(chǎn)物在包含微粒的合適緩沖液 中稀釋，所述微粒用特異性結(jié)合至所述第一和第二標(biāo)簽中的一種標(biāo)簽 的第一試劑標(biāo)記并允許所述第一試劑結(jié)合至存在的所述第一和第二標(biāo) 簽中的所述一種標(biāo)簽；(iv) 在包括基底的橫向流動裝置的近端處或鄰近該近端施加步驟 (iii)的緩沖產(chǎn)物，所述基底允許所述緩沖產(chǎn)物的成分朝橫向流動裝置的遠(yuǎn)端橫向地芯吸或流動，其中在所述遠(yuǎn)端處或鄰近該遠(yuǎn)端的位置，該橫向流動裝置設(shè)有檢測區(qū)和對照區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合至 所述第一和第二標(biāo)簽中不為所述第一試劑結(jié)合的另一種標(biāo)簽的第二試 劑而所述對照區(qū)設(shè)有對照試劑；以及(V)檢測所述緩沖產(chǎn)物的成分在所述檢測區(qū)和在所述對照區(qū)的任音^厶 思^口 口 。
42. 根據(jù)權(quán)利要求40或41所述的方法，其中所述樣品是血液樣a叫o
43. 根據(jù)權(quán)利要求40至42中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述處理 步驟(i)包括在溫度85-10(TC下加熱樣品。
44. 根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增 步驟(ii)包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。
45. 根據(jù)權(quán)利要求40至43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增 步驟(ii)包括嵌套式聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。
46. 根據(jù)權(quán)利要求40至45中任一項(xiàng)所述的方法，其中第一和第 二引物序列分別用第一和第二半抗原標(biāo)簽標(biāo)記。
47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述第一標(biāo)簽是生物素而 第二標(biāo)簽是二硝基苯酚(DNP)。
48. 根據(jù)權(quán)利要求40至47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 和第二引物序列中至少一種是簡并引物序列。
49. 根據(jù)權(quán)利要求40至48中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微粒 是金微粒。
50. 根據(jù)權(quán)利要求40至49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微粒 具有的直徑大小范圍為0.002至0.25/mi。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中所述微粒具有的平均直徑 大小為0.04/mi。
52. 根據(jù)權(quán)利要求40至51中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對照 區(qū)位于所述橫向流動裝置的檢測區(qū)和遠(yuǎn)端之間。
53. 根據(jù)權(quán)利要求40至52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述檢測 步驟(v)包括觀察可見的顏色信號在所述檢測區(qū)和對照區(qū)之一或二者 處出現(xiàn)。
54. 根據(jù)權(quán)利要求40至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 和第二引物序列的序列是科特異性的。
55. 根據(jù)權(quán)利要求40至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 和第二引物序列的序列是屬特異性的。
56. 根據(jù)權(quán)利要求40至53中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一 和第二引物序列的序列是種特異性的。
57. 根據(jù)權(quán)利要求40至56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述對照 區(qū)包含與所述第一標(biāo)簽相'同或功能等價(jià)的對照試劑。
58. 權(quán)利要求40至56中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述擴(kuò)增步驟 (ii)還包括通過使用限定對照核苷酸序列的5'和3'端的一對第三和第四引物序列來擴(kuò)增所述對照序列，所述第三和第四引物序列分別用第 三和第四標(biāo)簽標(biāo)記，使得靶序列和對照序列的任意擴(kuò)增都產(chǎn)生第一和 第二標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子和/或第三和第四標(biāo)簽兩者標(biāo)記的擴(kuò)增子，其中所述第三和第四標(biāo)簽或者均不同于第一和第二標(biāo)簽，或者備選地， 所述第三標(biāo)簽與第一標(biāo)簽相同或功能等價(jià)而所述第四標(biāo)簽不同于第一 和第二標(biāo)簽，并且其中所述橫向流動裝置上的對照區(qū)設(shè)有特異性結(jié)合 至第四標(biāo)簽的對照試劑。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述對照核苷酸序列存在于所述處理步驟(i)之前或之后加至樣品的對照核酸上。
60. 根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中所述對照核酸包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4的核苷酸序列。
61. 根據(jù)權(quán)利要求58至60中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述靶序 列和對照序列的擴(kuò)增在單個(gè)擴(kuò)增容器內(nèi)進(jìn)行。
62. 根據(jù)權(quán)利要求58至61中任一項(xiàng)所述的方法，其中在所述步 驟(iii)中使用的緩沖液還包含用特異性結(jié)合至所述第三標(biāo)簽的第三試 劑標(biāo)記的微粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測樣品中的靶核酸的方法和試劑盒。在一個(gè)具體的應(yīng)用中，所述方法和試劑盒允許檢測食品中或存在于食物制品表面上的不良微生物(如李斯特菌屬、沙門氏菌屬或腸桿菌科)。
文檔編號C12Q1/68GK101473043SQ200780020617
公開日2009年7月1日 申請日期2007年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月10日
發(fā)明者克里斯蒂娜·瑪麗·薩迪克, 安·加特維特, 菲利普·阿爾伯特·邁爾斯 申請人:3M創(chuàng)新有限公司