專利名稱：電化學(xué)檢測核酸寡聚體雜交事件的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾的核酸寡聚體以及電化學(xué)檢測序列特異性核酸寡聚體雜交事件的方法。
背景技術(shù)：
在疾病診斷、毒理學(xué)試驗方法、遺傳學(xué)研究和開發(fā)以及農(nóng)業(yè)和制藥領(lǐng)域，通常用采用放射自顯影或光學(xué)檢測的凝膠電泳方法來進行DNA和RNA序列分析。
在最重要地采用光學(xué)檢測的凝膠-電泳方法-Sanger法中，含有DNA的溶液被分成4份樣品。為了區(qū)分4份樣品，將各樣品的引物(復(fù)制的互補起始序列)用可以在不同波長下發(fā)光的熒光染料進行共價修飾。從引物開始，各樣品在DNA聚合酶I的催化下進行復(fù)制。除了必需堿基A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、C(胞嘧啶)和G(鳥嘌呤)的三磷酸脫氧核苷外，各反應(yīng)混合物還含有足夠的這些三磷酸核苷之一的2′，3′-二脫氧類似物作為阻斷堿基(每份樣品各含一種四種可能的阻斷堿基之一)以在所有可能的結(jié)合位點終止復(fù)制。在將四種樣品混合后，可以得到所有長度的具有阻斷堿基特異性熒光的復(fù)制DNA片段，并且可以根據(jù)長度進行凝膠電泳分類并通過熒光光譜進行鑒定。
另一種光學(xué)檢測方法是基于在寡核苷酸上連接熒光染料例如溴化乙錠。與染料的游離溶液相比，所述染料的熒光在與雙鏈DNA或RNA締合后會發(fā)生劇烈變化，因此可用于檢測雜交的DNA或RNA。
在放射標(biāo)記中，32P被構(gòu)建在寡核苷酸的磷酸骨架內(nèi)，32P通常被多核苷酸激酶加到5′-羥基末端。然后，優(yōu)選將標(biāo)記的DNA在確定的條件下在四種核苷酸類型其中之一處裂解，從而每條鏈平均裂解一次。因此，對于給定的堿基類型，在反應(yīng)混合物中存在從32P-標(biāo)記延伸至該堿基位置的鏈(如果該堿基出現(xiàn)了多次，會相應(yīng)的產(chǎn)生不同長度的鏈)。然后將四種片段混合物在四條泳道上進行凝膠電泳分離。然后，制備凝膠的放射自顯影圖，從該圖可以直接讀出序列。
幾年前，開發(fā)了另一種基于光學(xué)(放射自顯影)檢測的DNA測序方法，即，通過寡聚體雜交進行測序(參見，例如Drmanac等，《基因組學(xué)》(Genomics)4，(1989)，114-128頁，或Bains等，理論生物學(xué)(Theor.Biol.)135，(1988)，303-307頁)。在該方法中，將完整的一套短寡核苷酸或核酸寡聚體(探針寡核苷酸)，例如寡核苷酸八聚體的所有65536種可能的堿基A、T、C和G的組合結(jié)合在載體材料上。結(jié)合發(fā)生在含有65536個試驗位點的有序網(wǎng)格內(nèi)，每個相當(dāng)大量的定義一個試驗位點的寡核苷酸組合，并且各試驗位點(寡核苷酸組合)的位置是已知的。在這種雜交基質(zhì)中，將寡聚體芯片、即需要測定其序列的DNA片段(靶點)用熒光染料(或32P)標(biāo)記然后在僅允許一種特定的雙鏈形成的條件下雜交。通過該方法，靶DNA片段僅與那些其互補序列與自身序列的一部分(八聚體)精確對應(yīng)的核酸寡聚體(在該例子中為八聚體)相結(jié)合。因此，通過光學(xué)(或放射自顯影)檢測雜交DNA片段的結(jié)合位置測定出片段中所存在的所有核酸寡聚體序列(八聚體序列)。由于相鄰核酸寡聚體序列的重疊，DNA片段的連續(xù)序列可以用適宜的數(shù)學(xué)算法進行測定。該方法的優(yōu)點之一是測序的微型化，從而可以在一次操作中同時獲得龐大的數(shù)據(jù)量。此外，可以免除引物和DNA片段的凝膠電泳分離。在


圖1中用長度為13個堿基的DNA片段對該原理進行了舉例說明。
在DNA/RNA測序中使用放射性標(biāo)記有許多缺點，例如在處理放射性物質(zhì)和接觸輻射時需要復(fù)雜的、合法的安全防護、有限的空間分辨能力(最大為1mm2)，以及只有當(dāng)放射性片段的輻射作用于X-線膠片足夠長的時間(數(shù)小時至數(shù)天)時才能有高的靈敏度。雖然可以通過另外的硬件和軟件來增加空間分辨力，并通過使用β掃描來縮短檢測時間，但這兩項均需要相當(dāng)高的附加成本。
常用于標(biāo)記DNA的某些熒光染料(例如溴化乙錠)是致突變的，與放射自顯影一樣，需要適當(dāng)?shù)陌踩雷o。在幾乎所有的情況下，使用光學(xué)檢測均需要使用一種或多種激光系統(tǒng)，因此就需要有經(jīng)驗的人員以及適當(dāng)?shù)陌踩雷o。實際的熒光檢測需要另外的硬件，例如用于放大的光學(xué)元件，并且在改變激發(fā)波長和檢測波長的情況下(例如在Sanger方法中)，還需要對照系統(tǒng)。因此，根據(jù)所需的激發(fā)波長和所需的檢測性能，可能會需要相當(dāng)高的投資成本。當(dāng)通過在寡聚體芯片上雜交進行測序時，檢測將更為昂貴，因此除了激發(fā)系統(tǒng)外，還需要高分辨率的CCD照相機(電耦合器件照相機)來進行熒光斑的二維檢測。
因此，雖然存在定量的和極為敏感的DNA/RNA測序方法，但這些方法耗時、需要進行辛苦的樣品制備和昂貴的設(shè)備，并且通常不能作為便攜式系統(tǒng)。
本發(fā)明的描述
因此，本發(fā)明的目的是提供不存在現(xiàn)有技術(shù)的缺點的用于檢測核酸寡聚體雜交體的儀器和方法。
根據(jù)本發(fā)明，通過獨立權(quán)利要求1的修飾的核酸寡聚體、獨立權(quán)利要求21的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法、獨立權(quán)利要求29的修飾的導(dǎo)電表面、獨立權(quán)利要求44的生產(chǎn)修飾的導(dǎo)電表面的方法和獨立權(quán)利要求48的電化學(xué)檢測核酸寡聚體雜交事件的方法實現(xiàn)了該目的。
在本發(fā)明中將使用如下縮寫和術(shù)語遺傳學(xué)
本發(fā)明涉及通過化學(xué)結(jié)合氧化還原活性部分進行修飾的核酸寡聚體。氧化還原活性部分可以是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分，也可以是化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分。在光誘導(dǎo)的向外部氧化劑(例如電極)釋放電子或從外部還原劑(例如電極)獲取電子后，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分可以被游離的氧化還原活性物質(zhì)再還原或再氧化，也就是說，它可以恢復(fù)到其原始狀態(tài)。在向外部氧化劑給出電子后，化學(xué)誘導(dǎo)的氧化還原活性部分可以被外部還原劑(例如電極)還原，或在從外部還原劑獲取電子后，被外部氧化劑(例如電極)氧化。
在本發(fā)明中，使用含有至少兩個共價連接的核苷酸或至少兩個共價連接的嘧啶(例如胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)或嘌呤堿基(例如腺嘌呤或鳥嘌呤)的化合物、優(yōu)選DNA、RNA或PNA片段作為核酸寡聚體。在本發(fā)明中，術(shù)語“核酸”是指任何共價連接的嘧啶或嘌呤堿基的骨架，例如DNA、cDNA或RNA的糖-磷酸酯骨架、PNA的肽骨架或類似的骨架結(jié)構(gòu)，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或磷酰胺骨架。本發(fā)明含義范圍內(nèi)的核酸的基本特點是它可以序列特異性地與天然的cDNA或RNA結(jié)合。術(shù)語“(探針)寡核苷酸”、“核酸”和“寡聚體”可以與術(shù)語“核酸寡聚體”互換使用。
本文中，術(shù)語“電子受體”或“電子受體分子”以及術(shù)語“電子供體”或“電子供體分子”是指氧化還原活性部分的成分。
本文中，“氧化還原活性部分”應(yīng)理解為是指含有一個或多個電子供體分子和一個或多個電子受體分子的任何部分。該氧化還原活性部分的電子供體分子或分子部分以及電子受體分子或分子部分可以通過一種或多種共價鍵或離子鍵、通過氫鍵、范德華力鍵、π-π相互作用、或通過電子對供給和接受的配位作用彼此結(jié)合在一起，共價鍵可以是直接或間接的鍵(例如通過間隔基，但不通過核酸寡聚體)。此外，電子供體分子和/或電子受體分子可以整合到一種或多種大分子內(nèi)，該整合作用可以通過包封在大分子的適宜的分子腔(結(jié)合袋)內(nèi)、通過氫鍵、范德華力鍵、π-π相互作用、或通過大分子和電子供體分子和/或電子受體分子之間的電子對供給和接受的配位作用來完成。因此，在該情況下，大分子和電子供體分子以及電子受體分子形成氧化還原活性部分。如果氧化還原活性部分由多個大分子組成，大分子之間也可以通過共價鍵、離子鍵、氫鍵、范德華力鍵、π-π相互作用、或通過電子對供給和接受的配位作用進行結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明，上述的供體和受體分子形成氧化還原活性部分，即，它們直接或通過其它分子部分相互連接。根據(jù)本發(fā)明，對于連接氧化還原活性部分各成分的分子或分子部分的唯一限制是其不包括核酸寡聚體。根據(jù)本發(fā)明，氧化還原活性部分作為完整的部分與探針寡核苷酸結(jié)合，當(dāng)然，在寡核苷酸和氧化還原活性部分之間可以形成多種化學(xué)鍵。排除核酸寡聚體作為連接氧化還原活性部分各成分的分子或分子部分是想要清楚地證實并不是氧化還原活性部分的各個部分連接在探針寡核苷酸的各個位點。因此，探針寡核苷酸明確不表示氧化還原活性部分的電子供體分子或分子部分和電子受體分子或分子部分之間的連接。
氧化還原活性部分可以是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分，也可以是化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分。
本文中，“光誘導(dǎo)型”是指光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在用特定或任何給定波長的光線照射時才顯示氧化還原活性，也就是說在某些外部條件下向適宜的氧化劑給出電子或從適宜的還原劑獲取電子的特性。在用特定或任何給定波長的光線照射時，電子供體“D”給出一個電子到電子受體“A”并至少是暫時性地形成包含氧化的供體和還原的受體的電荷分離狀態(tài)D+A-。這種在光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分內(nèi)的過程稱為光誘導(dǎo)的電荷分離。給出適當(dāng)選擇的外部條件，例如在可以氧化A-而不是A的氧化劑的存在下(或在可以將D+而不是D還原的還原劑的存在下)，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在電荷分離狀態(tài)顯示其氧化還原活性，因為還原劑僅向光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化了的供體轉(zhuǎn)移電子或者氧化劑僅從還原了的受體獲取電子。
具體地講，上述的氧化劑或還原劑可以是電極，例如，如果將電極設(shè)置在可以氧化A-而不是A(或者可以還原D+而不是D)的電位下，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在光誘導(dǎo)的電荷分離之后可以向電極給出電子(或從電極獲取電子)。此外，氧化劑或還原劑還可以是游離的氧化還原活性物質(zhì)，例如，如果游離的氧化還原活性物質(zhì)可以氧化A-而不是A(或者可以還原D+而不是D)，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在光誘導(dǎo)的電荷分離之后可以向游離的氧化還原活性物質(zhì)給出電子(或從其獲取電子)。
本文中，“化學(xué)誘導(dǎo)型”是指化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在被外部的還原劑(或氧化劑)還原(或氧化)之后才顯示氧化還原活性，也就是說在某些外部條件下向適宜的氧化劑給出電子(或從適宜的還原劑獲取電子)的特性?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分在組成和作用方式上與光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分相當(dāng)，但與光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的作用方式不同的是，排除了光激活作為引發(fā)氧化還原活性部分的氧化還原活性的外部條件。給出適當(dāng)選擇的外部條件，只有當(dāng)電子從還原劑轉(zhuǎn)移到電子供體“D”之后，化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分才顯示其氧化還原活性，例如向適宜的氧化劑給出電子的特性。只有在還原狀態(tài)“D-”時電子供體才可以向受體“A”轉(zhuǎn)移電子，而氧化劑僅從該氧化還原活性部分的還原的受體“A-”獲取電子，例如在可以氧化A-而不是A(連續(xù)的電荷轉(zhuǎn)移)的氧化劑的存在下。具體地講，所述氧化劑還可以是電極，例如，如果電極設(shè)置在可以氧化A-而不是A的電位下。相反，給出不同的外部條件，只有當(dāng)電子從電子受體“A”轉(zhuǎn)移到氧化劑之后，化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分才顯示其氧化還原活性，例如從適宜的還原劑獲取電子的特性。僅有在氧化狀態(tài)“A+”時電子受體才可以從供體D獲取電子并且還原劑僅向氧化還原活性部分的氧化了的供體“D+”轉(zhuǎn)移電子，例如在可以還原D+而不是D(連續(xù)的電荷轉(zhuǎn)移)的還原劑的存在下。具體地講，所述還原劑還可以是電極，例如，如果電極設(shè)置在可以還原D+而不是D的電位下。
除了含有電子供體和電子受體或電子供體、電子受體和大分子外，光誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的基本特點是(i)在適于本發(fā)明的形式(原始狀態(tài)或氧化或還原狀態(tài)的電子供體和電子受體)中，該部分是穩(wěn)定的并且不會解離成其組成成分，(ii)該部分不包含核酸，(iii)該部分的組成包含本領(lǐng)域技術(shù)人員可以識別的電子供體和電子受體或電子供體、電子受體和大分子而不考慮各成分之間的鍵，因為在理論上電子供體和受體還可以是單個的分子，(iv)在與適于本發(fā)明的形式相同或類似的外部條件下，作為氧化還原活性部分的組成成分的電子供體和電子受體還可以以單個分子的形式在溶液中起電子供體和電子受體的作用，也就是說，即使在游離的溶解電子供體和電子受體的情況下，電子也可以直接或在某些外部條件的影響下從溶解的電子供體轉(zhuǎn)移到溶解的電子受體，這取決于導(dǎo)致電子在氧化還原活性部分內(nèi)轉(zhuǎn)移的條件。在光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的電子供體和電子受體的情況下，對于游離、溶解的電子供體和電子受體的外部條件可以是由游離、溶解的電子供體和電子受體吸收光線，電子供體“D”給出一個電子到電子受體“A”并至少是暫時性地形成包含游離、溶解的氧化的供體和游離、溶解的還原的受體的電荷分離狀態(tài)D+A-。另一種外部條件可以是，與化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的電子供體和電子受體一樣，由還原劑向游離、溶解的電子供體轉(zhuǎn)移電子或由游離、溶解的電子受體向氧化劑釋放電子。
光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分可以是例如任何光誘導(dǎo)型氧化還原活性的蛋白/酶或任何光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物。在“光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物”的表達方式中，術(shù)語“至少是雙分子的”是指該復(fù)合物是由至少一個電子供體和至少一個電子受體組成，即使該供體是直接(或通過間隔基間接地)與該受體共價連接的。在用特定或任何給定波長的光線照射時，電子供體給出一個電子到電子受體之一，并至少是暫時性地形成包含氧化的供體和還原的受體的電荷分離狀態(tài)D+A-。這種在光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分內(nèi)的過程稱為光誘導(dǎo)的電荷分離。給出適當(dāng)選擇的外部條件，例如在可以將D+而不是D還原的還原劑的存在下(或在可以氧化A-而不是A的氧化劑的存在下)，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在電荷分離的狀態(tài)顯示其氧化還原活性，也就是它向適宜的氧化劑給出電子或從適宜的還原劑獲取電子的特性，因為還原劑僅向光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化了的供體轉(zhuǎn)移電子或者氧化劑僅從還原了的受體獲取電子。具體地講，該氧化劑或還原劑還可以是電極，例如，如果電極設(shè)置在可以氧化A-而不是A(或者可以還原D+而不是D)的電位下，光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分僅在光誘導(dǎo)的電荷分離之后可以向電極給出電子(或從電極獲取電子)。
化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分可以是例如任何化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性的蛋白/酶或任何化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物。在“化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物”的表達方式中，術(shù)語“至少是雙分子的”是指該復(fù)合物是由至少一個電子供體和至少一個電子受體組成，即使該供體是直接(或通過間隔基間接地)與該受體共價連接的。給出適當(dāng)選擇的外部條件，只有當(dāng)被外部還原劑還原或被外部氧化劑氧化之后，化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分才顯示其氧化還原活性，也就是說向適宜的氧化劑給出電子或從適宜的還原劑獲取電子的特性。只有當(dāng)電子從還原劑轉(zhuǎn)移到電子供體“D”之后，還原了的供體“D-”才能向受體“A”轉(zhuǎn)移電子，而氧化劑僅從該氧化還原活性部分的還原的受體“A-”獲取電子。具體地講，上述氧化劑還可以是電極，例如，如果電極設(shè)置在可以氧化A-而不是A的電位下。相反，給出不同的外部條件，只有當(dāng)電子從電子受體“A”轉(zhuǎn)移到外部氧化劑之后，處于氧化狀態(tài)“A+”的化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的電子受體才能夠從電子供體D獲取電子，而還原劑僅向氧化還原活性部分的氧化了的供體“D+”轉(zhuǎn)移電子。具體地講，上述還原劑還可以是電極，例如，如果電極設(shè)置在可以還原D+而不是D的電位下。
本文中，術(shù)語“氧化劑”是指可以通過從另一種化合物(化學(xué)物質(zhì)、電子供體、電子受體)獲取電子將所述的另一種化合物(化學(xué)物質(zhì)、電子供體、電子受體)氧化的化合物(化學(xué)物質(zhì))。氧化劑的行為與電子受體類似，但在本發(fā)明中是指不直接屬于氧化還原活性部分的外部電子受體。其中的“不直接”是指該氧化劑或者是不與核酸寡聚體結(jié)合但與其相接觸的游離的氧化還原活性物質(zhì)，或者該氧化劑與核酸寡聚體共價連接在核酸寡聚體上，但所述位點與氧化還原活性部分共價連接位點相隔至少兩個共價連接的核苷酸或至少兩個共價連接的嘧啶或嘌呤堿基的位點。具體地講，電極可以代表氧化劑。
本文中，術(shù)語“還原劑”是指可以通過向另一種化合物(化學(xué)物質(zhì)、電子供體、電子受體)提供電子將所述的另一種化合物(化學(xué)物質(zhì)、電子供體、電子受體)還原的化合物(化學(xué)物質(zhì))。還原劑的行為與電子供體類似，但在本發(fā)明中是指不直接屬于氧化還原活性部分的外部電子供體。其中的“不直接”是指該還原劑或者是不與核酸寡聚體結(jié)合但與其相接觸的游離的氧化還原活性物質(zhì)，或者該還原劑與核酸寡聚體共價連接在核酸寡聚體上，但所述位點與氧化還原活性部分共價連接位點相隔至少兩個共價連接的核苷酸或至少兩個共價連接的嘧啶或嘌呤堿基的位點。具體地講，電極可以代表還原劑。
本文中，術(shù)語“游離的氧化還原活性物質(zhì)”是指不與氧化還原活性部分、核酸寡聚體或?qū)щ姳砻婀矁r連接，但通過例如加入到修飾的導(dǎo)電表面的溶液與其相接觸的游離的氧化劑或還原劑，游離的氧化還原活性物質(zhì)可以是例如不帶電荷的分子、各種鹽或氧化還原活性蛋白或酶(氧化還原酶)。游離的氧化還原活性物質(zhì)的特征在于它可以再還原光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化的供體(或再氧化還原的受體)，或者游離的氧化還原活性物質(zhì)可以還原化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的供體(或氧化受體)。此外，氧化還原活性物質(zhì)的特征還在于它在電位下是可以氧化和可以還原的，其中的滿足2.0V≥≥-2.0V的條件。此處的電位是指用標(biāo)準(zhǔn)氫電極在適宜的溶劑中對游離的氧化還原活性分子測得的。對于本發(fā)明，優(yōu)選1.7V≥≥-1.7V的電位范圍，特別優(yōu)選1.4V≥≥-1.2V的電位范圍，首選0.9V≥≥-0.7V的電位范圍，在該電位下可以氧化(或還原)本申請實施例的氧化還原活性物質(zhì)。
修飾的核酸寡聚體直接或間接地(通過間隔基)與導(dǎo)電表面連接。術(shù)語“導(dǎo)電表面”應(yīng)理解為是指任意厚度的各種導(dǎo)電表面，特別是金屬表面、含有金屬合金的表面或摻雜或非摻雜的半導(dǎo)體表面，所有半導(dǎo)體均可以以純凈物或混合物的形式使用。對于本發(fā)明，導(dǎo)電表面可以單獨存在或涂覆在任何載體材料例如玻璃上。對于本發(fā)明，術(shù)語“電極”可以和“導(dǎo)電表面”互換使用。
術(shù)語“修飾的導(dǎo)電表面”是指通過連接用氧化還原活性部分修飾的核酸寡聚體進行修飾的導(dǎo)電表面。
另一方面，本發(fā)明涉及電化學(xué)測定分子結(jié)構(gòu)的方法，具體地講，本發(fā)明涉及通過序列特異性的核酸寡聚體雜交在探針溶液中電化學(xué)檢測DNA/RNA/PNA片段的方法。通過電信號檢測雜交事件是一種簡單而且經(jīng)濟的方法，在使用電池的變化方法中，可以進行在位(on site)應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了測定分子結(jié)構(gòu)的光尋址讀出方法(photoaddressable read-out method)，該方法可以通過例如電信號在寡聚體芯片上檢測雜交事件。根據(jù)本發(fā)明，“光尋址(寡聚體芯片)讀出方法”是一種分子結(jié)構(gòu)的檢測局限在(完整寡聚體芯片的)完整系統(tǒng)內(nèi)特定試驗位點或試驗位點組的方法，其中，將特定或任何給定波長的光線在空間上聚焦在(局限在)該試驗位點(基團)以誘導(dǎo)光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化還原活性。氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合
本發(fā)明方法的必備條件是將光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分或化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分與核酸寡聚體結(jié)合。
以下是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的一些例子(i)光合細菌反應(yīng)中心(RC)，例如具有圖示結(jié)構(gòu)1的類球紅細菌的RC；其它光合細菌的RC，例如綠色紅假單孢菌(Rhodopseudomonasviridis)或莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)的反應(yīng)中心；或光合植物的反應(yīng)中心，例如光系1或光系，例如光誘導(dǎo)型氧化還原活性蛋白/酶。(ii)具有結(jié)構(gòu)通式2的cyclophanes或橋接的卟啉醌體系，光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物的一個實例。電子受體(結(jié)構(gòu)式2中的1，4-苯醌)和電子供體(結(jié)構(gòu)式2中的金屬卟啉)之間的兩個間隔基-橋接的共價連接(結(jié)構(gòu)式2中的“--間隔基--”)可以固定在電子供體和/或電子受體上的任何位點。除了結(jié)構(gòu)式2中所示的電子受體外，也可以使用通式1的黃素類、通式2的煙酰胺類或其它的醌類，例如通式3-8所示的醌類或其它有機或無機電子受體，此外，除了通式9的(金屬)卟啉外，也可以使用其它電子供體例如通式10的(金屬)葉綠素或通式11的(金屬)菌綠素或其它有機或無機電子供體。此外，簡單的共價的(間隔基)橋接的電子供體/電子受體復(fù)合物例如式9的物質(zhì)和式1-8的物質(zhì)之一的共價化合物、式10的物質(zhì)和式1-8的物質(zhì)之一的共價化合物或式11的物質(zhì)和式1-8的物質(zhì)之一的共價化合物也可以用作光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物。(iii)其中的電子供體(之一)和/或電子受體(之一)是電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物或過渡金屬復(fù)合物的光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物。
過渡金屬復(fù)合物的例子是[Ru(bipy)2(py)(im)]2+、任何其它的[Ru(II)(L1)(L2)(L3)(L4)(L5)(L6)]復(fù)合物、Cr(III)、Fe(II)、Os(II)或Co(II)復(fù)合物，其中“bipy”表示雙吡啶基配體，“py”表示吡啶基配體，“im”表示咪唑配體，L1至L3表示任意配體，并且可以有多于或少于6個的配體配位在一個過渡金屬上。
化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的例子是，作為化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性蛋白/酶的例子，光合細菌的細胞色素-bc復(fù)合物或細胞色素-c2復(fù)合物(一種含有蛋白基質(zhì)和四個內(nèi)含的鐵卟啉輔因子作為電子供體和/或電子受體的復(fù)合物)，或者，作為化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物的例子，如(ii)和(iii)項下所列的適當(dāng)組成的cyclophanes或類似的化合物。
結(jié)構(gòu)式1由輔因子P(初級供體、菌綠素二聚體)、BA和BB(菌綠素單體)、HA和HB(菌脫鎂葉綠素)、QA和QB(泛醌-50)以及包封輔因子的蛋白亞單位L、M和H(未示出)組成的反應(yīng)中心。
結(jié)構(gòu)式2cyclophane；M＝例如2H、Mg、Zn、Cu、Ni、Pd、Co、Cd、Mn、Fe、Sn、Pt等；R1至R8或間隔基彼此獨立地是任何烷基、鏈烯基、鏈炔基、雜烷基、雜鏈烯基或雜鏈炔基取代基。
式1 式2
式3 式4
式5 式6
式7 式8R1至R8彼此獨立地是H或任何烷基、鏈烯基、雜烷基、雜鏈烯基或雜鏈炔基取代基。
式9 式10
式11M＝2H、Mg、Zn、Cu、Ni、Pd、Co、Cd、Mn、Fe、Sn、Pt等；R1至R12彼此獨立地是H或任何烷基、鏈烯基、鏈炔基、雜烷基、雜鏈烯基或雜鏈炔基取代基。
此外，根據(jù)本發(fā)明，氧化還原活性部分的一個顯著特點是所述部分可以向同樣共價連接在核酸寡聚體上的氧化劑給出電子，或者從同樣共價連接在寡核苷酸上的另一種還原劑獲取電子，該氧化劑或還原劑可以是導(dǎo)電表面(電極)并且該氧化還原活性部分還可以通過向該電極施加電化學(xué)可使用的電位范圍內(nèi)的外部電壓進行電氧化/電還原。
根據(jù)本發(fā)明，氧化還原活性物質(zhì)的一個顯著特點是，該物質(zhì)可以在光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分向共價連接在寡核苷酸上的與氧化還原活性物質(zhì)不同的另一種氧化劑給出電子后，將所述光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分再還原，或者在光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分從共價連接在寡核苷酸上的與氧化還原活性物質(zhì)不同的另一種還原劑獲取電子后將其再氧化，或者游離的氧化還原活性物質(zhì)可以還原(或者氧化)化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的供體(或受體)。根據(jù)本發(fā)明，任何氧化還原活性物質(zhì)均可以使用，只要它可以在2.0V≥≥-2.0V的電位下被氧化和還原，并且該電位適于在所述光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分向同樣共價連接在核酸寡聚體上的另一種氧化劑給出電子后(或者從同樣共價連接在核酸寡聚體上的另一種還原劑獲取電子后)將其再還原(或再氧化)或者適于還原或氧化所述的化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分即可。此處的電位是指用標(biāo)準(zhǔn)氫電極在適宜的溶劑中對游離的、未修飾的氧化還原活性物質(zhì)測得的。對于本發(fā)明，優(yōu)選1.7V≥≥-1.7V的電位范圍，特別優(yōu)選1.4V≥≥-1.2V的電位范圍，首選0.9V≥≥-0.7V的電位范圍，在該電位下可以氧化(或再還原)本申請實施例的氧化還原活性物質(zhì)。除了常用的有機和無機氧化還原活性分子例如六氰基高鐵酸鹽、二茂鐵、二茂鈷和醌外，還可以使用抗壞血酸(或其Na+鹽)、[Ru(NH3)6]2+或細胞色素c2(cyt c2)2+，細胞色素c2是一種可以自由移動的含鐵蛋白，它可以將類球紅細菌的RC中氧化了的初級供體P+還原成P，在此過程中，它本身被氧化成(cyt c2)3+。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，光誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物以這樣的方式被包含在一種或多種大分子內(nèi)，即，大分子通過防止氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物在電極的直接電氧化/電還原而起到氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物的電絕緣的包封末端的作用，例如在電極和氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物之間直接接觸的情況下，但允許由雙鏈核酸寡聚體介導(dǎo)的電子供體/電子受體復(fù)合物的間接電氧化/電還原。所述大分子可以是例如特制的環(huán)糊精，由于它可以成型成內(nèi)部中空的修剪的圓錐的形狀，從而可以包裹cyclophane或類似的電子供體/電子受體復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明，通過將核酸寡聚體與氧化還原活性部分或它的一部分反應(yīng)將氧化還原活性部分與核酸寡聚體共價連接(參見“實施本發(fā)明的方式”)。該鍵可以通過四種不同的方式形成a)使用寡核苷酸骨架的游離磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基、特別是寡核苷酸骨架兩個末端的基團作為在核酸寡聚體上成鍵的活潑基團。游離的末端磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基顯示增加的反應(yīng)性，因此很容易發(fā)生常規(guī)的反應(yīng)，例如用(伯或仲)氨基或酸基團酰胺化；用(伯、仲或叔)醇或酸基團酯化；與(伯、仲或叔)硫醇或酸基團形成硫酯，或者將胺與醛縮合然后將形成的CH＝N鍵還原成CH2-NH鍵。與氧化還原活性部分共價連接所需的偶聯(lián)基團(酸、醇、硫醇或醛功能基)可以是氧化還原活性部分上天然存在的，也可以通過化學(xué)修飾氧化還原活性部分得到。氧化還原活性部分的連接可以是完全的，或是氧化還原活性的部分連接然后完成全部氧化還原活性部分連接(見下)。b)通過任意組成和鏈長(彼此連接的最長的連續(xù)原子鏈)的、特別是鏈長為1至14的共價連接的分子部分(間隔基)在寡核苷酸骨架或在堿基上用活潑基團對核酸寡聚體進行修飾。修飾優(yōu)選在寡核苷酸骨架的一端或在末端堿基上進行?？梢允褂猛榛?、鏈烯基、鏈炔基、雜烷基、雜鏈烯基或雜鏈炔基取代基作為間隔基。用于在氧化還原活性部分和修飾的核酸寡聚體之間形成共價鍵的可能的簡單反應(yīng)是，如a)項下所述，由酸和氨基酰胺化、由酸和醇基團酯化、由酸和硫醇基團形成硫酯或者將醛與胺縮合然后將形成的CH＝N鍵還原成CH2-NH鍵。氧化還原活性部分的連接可以是完全的，或氧化還原活性的部分連接，然后完成全部氧化還原活性部分的連接(見下)。c)如果合成核酸寡聚體，末端堿基將被氧化還原活性部分代替。氧化還原活性部分的連接可以是完全的，或氧化還原活性的部分連接，進行然后完成全部氧化還原活性部分的連接(見下)。d)如果使用連接的(至少是雙分子的)電子供體/電子受體復(fù)合物作為氧化還原活性部分，在第一步共價修飾中，如本章節(jié)的b)或c)項下所述，電子受體(或供體)將與末端堿基結(jié)合或代替末端堿基與核酸寡聚體結(jié)合，然后，在電子供體(或受體)的第二步共價修飾中，如本章節(jié)的a)項下所述，在核酸寡聚體骨架的同一端與骨架的活潑基團結(jié)合或與受體(或供體)的活潑基團結(jié)合。如果使用共價連接的、三分子或更多分子的電子供體/電子受體復(fù)合物，則可以在第一步共價修飾中用電子供體/電子受體復(fù)合物的任何部分代替電子受體(或供體)，然后在第二步或其它的共價修飾中完成。
根據(jù)本發(fā)明，氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合可以在核酸寡聚體與導(dǎo)電表面結(jié)合之前或結(jié)合之后，完全發(fā)生或部分發(fā)生。因此，在用含有脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子的氧化還原活性蛋白/酶代替完整的氧化還原活性部分的情況下，也可以僅連接脫輔基蛋白質(zhì)、脫輔基蛋白質(zhì)和一部分輔因子或一種或多種輔因子，然后通過用剩余的部分重建來完成氧化還原活性部分的連接。如果使用連接的(至少是雙分子的)電子供體/電子受體復(fù)合物作為氧化還原活性部分，在第一步共價修飾中，如本章節(jié)的b)或c)項下所述，電子受體(或供體)將與末端堿基結(jié)合或代替末端堿基與核酸寡聚體結(jié)合，然后，在電子供體(或受體)的第二步共價修飾中，如本章節(jié)的a)項下所述，在核酸寡聚體骨架的同一端與骨架的活潑基團結(jié)合。如果使用共價連接的、三分子或更多分子的電子供體/電子受體復(fù)合物，則可以在第一步共價修飾中用電子供體/電子受體復(fù)合物的任何部分代替電子受體(或供體)，然后在第二步共價修飾中完成。這些修飾可以在核酸寡聚體與導(dǎo)電表面結(jié)合之前和結(jié)合之后進行。
如果在一個共享表面上有多個不同的核酸寡聚體組合(試驗位點)，并且氧化還原活性部分是在核酸寡聚體被固定后連接到表面上的，則最好通過適當(dāng)?shù)剡x擇各試驗位點的游離核酸寡聚體末端的活潑基團將整個表面上氧化還原活性部分與核酸寡聚體的(共價)連接標(biāo)準(zhǔn)化。
如果使用氧化還原活性蛋白/酶作為氧化還原活性部分，核酸寡聚體的共價連接可以發(fā)生在蛋白上天然存在的或通過修飾固定在蛋白上的任何活潑基團上，或者，當(dāng)氧化還原活性蛋白/酶由脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子組成時，共價連接可以發(fā)生在輔因子上天然存在的或通過修飾固定在輔因子上的任何活潑基團上。對于本發(fā)明，優(yōu)選在蛋白的輔因子上天然存在或通過修飾固定在輔因子上的任何活潑基團的共價連接。不想受到機械細節(jié)的束縛，如果多個輔因子，特別優(yōu)選可以向同樣共價連接在核酸寡聚體上的外部氧化劑給出電子或者可以從同樣共價連接在核酸寡聚體上的外部還原劑劑獲取電子的輔因子(參見“電流滴定檢測核酸寡聚體雜合物的方法”一節(jié))。導(dǎo)電表面
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“導(dǎo)電表面”應(yīng)理解為是指具有任意厚度的導(dǎo)電表面的任何載體，特別是含有鉑、鈀、金、鎘、汞、鎳、鋅、碳、銀、銅、鐵、鉛、鋁和錳的表面。
此外，也可以使用任意厚度的任何摻雜或非摻雜的半導(dǎo)體表面。所有半導(dǎo)體均可以以純凈物或混合物的形式使用。其例子包括但不僅限于，碳、硅、鍺、α錫以及任何晶體結(jié)構(gòu)的鹵化亞銅(I)和鹵化銀(I)。同樣適宜的是含有14和16族元素、13和15族元素、15和16族元素的任何組成和任何結(jié)構(gòu)的各種二元化合物。此外，也可以使用含有11、13和16族元素或12、13和16族元素的任何組成和任何結(jié)構(gòu)的三元化合物。對周期表各族的指定參照了IUPAC在1985年所推薦的。核酸寡聚體與導(dǎo)電表面的結(jié)合
根據(jù)本發(fā)明，將核酸寡聚體直接或通過接頭/間隔基與上述類型的導(dǎo)電表面的表面原子或分子連接。結(jié)合可以以三種不同的方式進行
a)將表面以活潑分子基團易于接近的方式進行修飾。這可以通過將表面分子直接衍生化來進行，例如，通過濕法化學(xué)或電化學(xué)氧化/還原。因此，例如，可以通過濕法化學(xué)氧化在石墨電極的表面提供醛或羧酸基團。電化學(xué)可以通過例如在芳基-重氮鹽的存在下還原在石墨電極表面偶聯(lián)適宜的(功能基化的，即，帶有活潑基團)芳基基團，或者通過在R′CO2H的存在下氧化在石墨電極表面偶聯(lián)(功能基化的)R′-基團。直接修飾半導(dǎo)體表面的一個例子是將硅表面衍生化成活潑的甲硅烷醇，即，在表面上帶有Si-OR″基團的硅載體，R″和R′均表示任何功能基化的有機殘基(例如烷基、鏈烯基、鏈炔基、雜烷基、雜鏈烯基或雜鏈炔基取代基)。或者，完整的表面可以通過共價連接雙功能基接頭的活潑基團進行修飾，從而在表面上形成含有各種分子并且含有活潑基團(優(yōu)選在末端)的單分子層。術(shù)語“雙功能基接頭”是指任何鏈長的、特別是鏈長為2-14的、帶有兩個相同(同雙功能基)或兩個不同(雜雙功能基)活潑分子基團的分子。
如果通過使用光刻法在表面上形成多個不同的試驗位點，則同-或雜雙功能基接頭的活潑基團中至少有一個是光誘導(dǎo)型活潑基團，即，僅在受到特定或任何給定波長的光線照射時才變活潑的基團。接頭以這樣的方式應(yīng)用，即，當(dāng)接頭與表面共價連接后光激活的活潑基團是可以利用的。核酸寡聚體共價連接在修飾的表面，并且被活潑基團通過任意組成和鏈長、特別是鏈長1-14的間隔基修飾，優(yōu)選靠近核酸寡聚體的一端。寡核苷酸的活潑基團是可以直接(或間接)與修飾的表面反應(yīng)形成共價鍵的基團。此外，可以在核酸寡聚體的靠近其第二個末端處結(jié)合另一個活潑基團，該活潑基團直接或通過任意組成和鏈長、特別是鏈長1-14的間隔基連接。此外，作為所述另一個活潑基團的替代物，可以將氧化還原活性部分(完整的或其一部分)連接在核酸寡聚體的第二個末端。
b)將準(zhǔn)備涂覆于導(dǎo)電表面的核酸寡聚體用一種或多種活潑基團通過任意組成和鏈長、特別是鏈長為1-14的共價連接的間隔基修飾，活潑基團的位置優(yōu)選靠近核酸寡聚體的一端。活潑基團是可以直接與未修飾的表面反應(yīng)的基團。例如(i)通式為(n x HS-間隔基)-oligo、(n x R-S-S-間隔基)-oligo或oligo-間隔基-S-S-間隔基-oligo的巰基-(HS-)或二硫化物-(S-S-)衍生的核酸寡聚體，它與金表面反應(yīng)形成金-硫鍵或(ii)通過化學(xué)吸附或物理吸附連接在鉑或硅表面的胺。此外，可以在核酸寡聚體的靠近其第二個末端處結(jié)合另一個活潑基團，該活潑基團直接或通過任意組成和鏈長、特別是鏈長為1-14的間隔基連接。此外，作為所述另一個活潑基團的替代物，可以將光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分(完整的或其一部分)連接在寡核苷酸的第二個末端。用多個間隔基橋接的巰基或二硫化物橋((n x HS-間隔基)-oligo或(n x R-S-S-間隔基)-oligo)修飾的核酸寡聚體的優(yōu)點是，從核酸一端來看，如果將巰基或二硫化物功能基與核酸寡聚體連接的間隔基具有增加或減少的鏈長，該核酸寡聚體可以以特定的安裝角(曲面法線和雙鏈螺旋狀核酸寡聚體的螺旋軸之間的角度或曲面法線和與雙鏈非螺旋狀核酸寡聚體的堿基對垂直的軸之間的角度)涂覆于導(dǎo)電表面。
c)在探針核酸寡聚體上用作活潑基團的基團是寡核苷酸骨架的磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基，特別是末端基團。磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基顯示增加的反應(yīng)性，因此很容易發(fā)生常規(guī)的反應(yīng)，例如用(伯或仲)氨基或酸基團酰胺化；用(伯、仲或叔)醇或酸基團酯化；與(伯、仲或叔)硫醇或酸基團形成硫酯，或者將胺與醛縮合然后將形成的CH＝N鍵還原成CH2-NH鍵。在該情況下，與磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基共價連接所需的偶聯(lián)基團是用具有任意分子長度的(單分子)層衍生化的表面的一部分(如本節(jié)a)項下所述)，或者磷酸、糖-C-3-羥基、羧酸或氨基直接與未修飾的表面反應(yīng)(如本節(jié)b)項下所述)。此外，可以在寡核苷酸的靠近其第二個末端處結(jié)合另一個活潑基團，如上所述，該活潑基團直接或通過任意組成和鏈長、特別是鏈長為1-14的間隔基連接。此外，作為所述另一個活潑基團的替代物，可以將氧化還原活性部分(完整的或其一部分)連接在核酸寡聚體的第二個末端。
核酸寡聚體與導(dǎo)電表面的結(jié)合可以在氧化還原活性部分與核酸寡聚體連接之前或連接之后進行。在用含有脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子的氧化還原活性蛋白/酶代替完整的氧化還原活性部分的情況下，也可以僅連接脫輔基蛋白質(zhì)、脫輔基蛋白質(zhì)和一部分輔因子或一種或多種輔因子，然后通過用剩余的部分重建來完成氧化還原活性部分。如果使用連接的(至少是雙分子的)電子供體/電子受體復(fù)合物作為氧化還原活性部分，如“氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”一節(jié)的b)或c)項下所述，電子受體(或供體)可以與末端堿基結(jié)合或代替末端堿基與核酸寡聚體結(jié)合，然后，電子供體(或受體)可與電子受體(或供體)的活潑基團共價連接，或者如“氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”一節(jié)的a)項下所述，與核酸寡聚體骨架同一端的末端活潑基團結(jié)合(參見“實施本發(fā)明的方式”一節(jié))?；蛘?，核酸寡聚體與導(dǎo)電表面的結(jié)合可以在帶有用于結(jié)合氧化還原活性部分的活潑基團的間隔基連接之前或連接之后進行。將已經(jīng)修飾過的核酸寡聚體與導(dǎo)電表面結(jié)合，即，在氧化還原活性部分與核酸寡聚體連接之后或者在連接了氧化還原活性部分的片段之后，或者在連接了帶有用于結(jié)合氧化還原活性部分的活潑基團的間隔基之后與表面結(jié)合，也按照本節(jié)a)至c)項下所述進行。
在產(chǎn)生試驗位點時，當(dāng)將單鏈核酸寡聚體與表面連接時，必需注意在各核酸寡聚體之間保留足夠的距離，以提供首先是與靶核酸寡聚體雜交所需的空間，其次是連接氧化還原活性部分所需的空間。就此而言，有三種不同的進行方法(及其組合形式)
1.)通過連接雜交的核酸寡聚體產(chǎn)生修飾的表面，也就是說，用雜交的探針核酸寡聚體代替單鏈探針寡核苷酸衍生表面。用于雜交的核酸寡聚體鏈?zhǔn)俏葱揎椀?表面連接按照本節(jié)a)-c)項下所述)。然后，將雜交的核酸寡聚體雙鏈?zhǔn)沁M行熱去雜交(dehybridized)，由此產(chǎn)生在探針核酸寡聚體之間有較大距離的單鏈核酸寡聚體修飾的表面。
2.)通過連接單鏈或雙鏈核酸寡聚體產(chǎn)生修飾的表面，在表面衍生化的過程中加入適宜的單功能基接頭，除了單鏈或雙鏈核酸寡聚體外，所述單功能基接頭也與表面結(jié)合(表面連接按照本節(jié)a)-c)項下所述進行)。根據(jù)本發(fā)明，單功能基接頭的鏈長與表面和核酸寡聚體之間的間隔基的鏈長相同，或者相差最多4個鏈原子。如果用雙鏈核酸寡聚體進行表面衍生化，在雙鏈核酸寡聚體和接頭共同連接在表面上之后將核酸寡聚體雙鏈熱去雜交。通過同時將接頭與表面連接，同樣結(jié)合在表面上的單鏈或雙鏈核酸寡聚體之間的距離得到增加。如果使用雙鏈核酸寡聚體，該效果可以通過隨后進行熱去雜交進一步放大。
3.)通過連接已經(jīng)連接了氧化還原活性部分的單鏈或雙鏈寡核苷酸產(chǎn)生修飾的表面，氧化還原活性部分的直徑大于30埃。如果使用雙鏈寡核苷酸，在雙鏈寡核苷酸與表面連接之后將寡核苷酸雙鏈?zhǔn)菬崛ルs交。
關(guān)于“氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”以及“寡核苷酸與導(dǎo)電表面的結(jié)合”中的各個步驟，應(yīng)當(dāng)注意，在“實施本發(fā)明的方式”一節(jié)中，在一個例子中證實了可以產(chǎn)生相同的最終結(jié)果的各步驟的各種組合可能性(圖2)。電化學(xué)檢測核酸寡聚體雜合物的方法
根據(jù)電化學(xué)檢測核酸寡聚體雜合物的方法，優(yōu)選將多個不同序列的核酸寡聚體、最好是所有所需的核酸寡聚體的組合涂覆于寡聚體(DNA)芯片上以檢測任意靶核酸寡聚體或(片段化的)靶DNA的序列，或者尋找和序列特異性地檢測靶中的突變。為此，將導(dǎo)電表面上特定區(qū)域(試驗位點)的表面原子或分子按照以上描述與具有已知但任意序列的DNA/RNA/PNA核酸寡聚體連接。但是，在最常見的實施方案中，DNA芯片還可以用單個探針寡核苷酸衍生化。優(yōu)選的探針核酸寡聚體是堿基長度為3至50、優(yōu)選長度為5至30、特別優(yōu)選長度為8至25的核酸寡聚體(例如DNA、RNA或PNA片段)。根據(jù)本發(fā)明，氧化還原活性部分按照以下描述與探針核酸寡聚體結(jié)合。
探針核酸寡聚體用氧化還原活性部分的修飾可以是完全的或者是在氧化還原活性部分的組成成分上、在寡核苷酸探針與導(dǎo)電表面結(jié)合之前或結(jié)合之后進行。在“實施本發(fā)明的方式”一節(jié)中借助圖2以氧化還原活性部分與電極通過探針寡核苷酸結(jié)合為例對各步驟的各種組合可能性(反應(yīng)順序)進行了說明。
不論各自的反應(yīng)順序如何，均會產(chǎn)生具有通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分的表面雜合物，其中“部分”表示光誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分。當(dāng)然，也可以產(chǎn)生沒有間隔基或僅有一個間隔基(elec-ss-oligo-間隔基-部分或elec-間隔基-ss-oligo-部分)的橋。在圖2的例子中，所述的部分是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分，即類球紅細菌菌株的光合細菌的反應(yīng)中心(RC)，一種由脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子組成的光誘導(dǎo)型氧化還原活性蛋白。在圖2、3和4的例子中，RC通過其位于稱為RC的QA蛋白結(jié)合袋內(nèi)的輔因子泛醌-50(UQ)與核酸寡聚體共價連接。RC與QA結(jié)合袋內(nèi)的輔因子泛醌-50形成1∶1復(fù)合物，泛醌-50與核酸寡聚體以所述的方式共價結(jié)合。在圖5和6的例子中，所述部分是光誘導(dǎo)型氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物，即共價連接的鋅-菌綠素醌復(fù)合物，其與核酸寡聚體通過醌(復(fù)合物的電子受體分子)共價連接(通過間隔基)。
在通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分中，(導(dǎo)電)表面與通過的單鏈寡核苷酸橋接的氧化還原活性部分(“部分”)之間的電化學(xué)通訊很弱或者不存在。
在下一步中，將試驗位點與待測試的核酸寡聚體溶液(靶)相接觸。只有當(dāng)溶液中含有與結(jié)合在導(dǎo)電表面的探針核酸寡聚體互補、或者在至少廣域內(nèi)互補的核酸寡聚體鏈時，才會導(dǎo)致雜交。探針和靶核酸寡聚體之間的雜交導(dǎo)致表面和氧化還原活性部分之間導(dǎo)電性的增加，因為后者現(xiàn)在是通過由雙鏈組成的核酸寡聚體橋接。圖3以elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-UQ(RC)為例對其進行了圖示說明。在圖4中詳細示出了elec-間隔基-ds-oligo-間隔基-UQ(RC)內(nèi)電子轉(zhuǎn)移步驟的順序，而圖5以elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl為例進行了圖示說明，圖6詳細描述了elec-間隔基-ds-oligo-間隔基-Q-ZnBChl內(nèi)電子轉(zhuǎn)移步驟的順序。
由于探針核酸寡聚體和與其互補的核酸寡聚體鏈(靶)雜交的結(jié)果，(導(dǎo)電)表面和光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分之間的電傳導(dǎo)發(fā)生了改變。因此，可以通過電化學(xué)方法例如循環(huán)伏安法、電流分析法或?qū)щ娦缘臏y量來檢測序列特異性的雜交事件。
在循環(huán)伏安法中，靜止工作電極的電位隨時間線性改變。從不發(fā)生電氧化或電還原的電位開始，改變電位直至氧化還原活性的物質(zhì)被氧化或被還原(即，有電流流過)。在經(jīng)過了氧化或還原操作(其在電流-電壓曲線中產(chǎn)生開始增加的電流，然后達到最大電流(峰值)，最后電流逐漸減弱)后，將施加電位的方向逆轉(zhuǎn)。然后在逆轉(zhuǎn)操作中記錄電氧化或電還原產(chǎn)物的行為。
另一種電學(xué)檢測方法是電流分析法，該方法采用適宜的恒定電極電位，從而使氧化還原活性部分可以被電氧化(電還原)，但氧化還原活性部分向其原始狀態(tài)的再還原(再氧化)不是向循環(huán)伏安法那樣通過改變電極電位來實現(xiàn)的，而是通過向靶溶液中加入適宜的還原劑(氧化劑)-“氧化還原活性物質(zhì)”來實現(xiàn)的，從而閉合了整個體系的電流回路。只要有還原劑(氧化劑)存在，或者只要消耗了的還原劑(氧化劑)在反電極上被再還原(再氧化)，就會有可以通過電流分析進行測定的并且與雜交事件的數(shù)量成比例的電流流過。
將以葡萄糖氧化酶作為光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分或氧化還原活性部分的例子對電流分析檢測的原理進行更詳細的解釋。葡萄糖氧化酶是一種由脫輔基蛋白質(zhì)和一個輔因子(黃素腺嘌呤二核苷酸)組成的氧化還原活性酶。一端與電極共價連接的探針寡核苷酸可以在另一個游離的末端用完整的葡萄糖氧化酶的酶催化部分功能基化，例如將酶的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔因子與探針寡核苷酸共價連接，然后將其用葡萄糖氧化酶脫輔基蛋白質(zhì)(GOx)重建。所形成的通式為elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-FAD(GOx)的表面雜合物在電極和FAD之間顯示很小的導(dǎo)電性或者沒有導(dǎo)電性。在與“ss-oligo”-互補靶寡核苷酸雜交的情況下，導(dǎo)電性顯著增加。在向靶寡核苷酸溶液中加入葡萄糖底物后，葡萄糖氧化酶(FAD(GOx))的FAD被還原成葡萄糖氧化酶(FADH2(GOx))的FADH2，葡萄糖被氧化成葡萄糖酸。如果向電極施加適宜的外加電位從而使FADH2(GOx)通過雜交的寡核苷酸向電極給出電子，由此使FADH2(GOx)被再氧化成FAD(GOx)(但在該電位下，葡萄糖或葡萄糖酸均不能被電氧化或被電還原)，只要FAD(GOx)被游離的葡萄糖還原、即直至所有的葡萄糖均被消耗掉，或者，在向反電極施加可以將葡萄糖酸還原成葡萄糖的電位的情況下，只要葡萄糖酸在反電極上被還原，就會有電流在elec-間隔基-ds-oligo-間隔基-FAD(GOx)體系內(nèi)流動。該電流可以通過電流分析進行測定并且與雜交事件的數(shù)量成比例。
但是，適用于本發(fā)明的光誘導(dǎo)型或化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分具有至少一個電子供體和至少一個電子受體，而不是一個電子供體或電子受體。
對于本發(fā)明，在化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的情況下，在電子供體和電子受體之間插入了至少一個電荷轉(zhuǎn)移步驟?？梢赃€原D(或氧化A)的游離的氧化還原活性物質(zhì)可以引發(fā)從D-至A的電子轉(zhuǎn)移形成A-(或從D向A+轉(zhuǎn)移電子形成D+)，從而可以將電極設(shè)置在可以氧化(或還原)A-(或D+)而不是A(或D)的電位。其優(yōu)點是該電極具有可以顯著抑制游離的氧化還原活性物質(zhì)與電極直接反應(yīng)的電位，并且可以檢測氧化還原活性部分和電極之間的初始電子轉(zhuǎn)移。
如果氧化還原活性部分是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分，則該部分的氧化還原活性僅由特定的或任何給定波長的光線所引發(fā)。根據(jù)本發(fā)明，可以利用該特性使電化學(xué)檢測僅在光線照射到具有通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ds-oligo-間隔基-部分的表面雜合物(帶有雜交的靶的表面雜合物)上時才被引發(fā)，并且持續(xù)最多是光線照射所持續(xù)的時間。因此，特別是在電流分析檢測的情況下，如果使用光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分，在某些外部條件下，只有當(dāng)光線照射在表面雜合物上時才會流過(相當(dāng)長時間)的電流。所述外部條件是，例如存在適于還原(或氧化)光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的光誘導(dǎo)形成的氧化的供體D+(或還原的受體A-)的還原劑(或氧化劑)的存在下，以及向電極施加可以氧化(或還原)光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的光誘導(dǎo)形成的還原的受體A-(或氧化的供體D+)但不會氧化(或還原)未還原的受體A(或未氧化的供體D)的電位。在“實施本發(fā)明的方式”一節(jié)中，用帶有光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的各種elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分的例子對其進行了更詳細的解釋。通過該方式，可以通過將光線限制在寡聚體芯片上的某些試驗位點或試驗位點組將利用光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的檢測在空間上局限在這些試驗位點或試驗位點組。根據(jù)本發(fā)明，可將寡聚體芯片的各種試驗位點(核酸寡聚體組合)涂覆于一個共享的、連續(xù)的、導(dǎo)電表面。如果精確地將特定的試驗位點或試驗位點組用光照射，可以通過向(完整的)表面施加適宜的外部電位來方便地定位并電流分析檢測該試驗位點或試驗位點組。因此，無需將各試驗位點涂覆在彼此電絕緣的并且可以在施加電位和讀出電流上進行單獨控制的單個(微)電極上。此外，如果將具有通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分的表面雜合物與光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分和電流分析檢測一起使用，在寡聚體芯片上檢測單個的序列特異性雜交事件的讀出過程可以通過如下方法優(yōu)化首先通過用適當(dāng)聚焦的光線粗略地掃描試驗位點讀出試驗位點，然后逐漸增加有雜交事件的網(wǎng)格內(nèi)的分辨能力，例如，對于有65536個試驗位點的八聚體芯片，例如讀出64個分別有1024個試驗位點的組，然后通過電流分析測定證實顯示雜交事件的試驗位點組可以在例如各有32個試驗位點的32個試驗組檢測，然后，在再次顯示雜交事件的試驗位點組中，對試驗位點單個進行分析。通過該方式，可以用很少的實驗將單個的雜交事件迅速指定在特定的探針寡聚體上。附圖概述
以下將參照例舉的實施方案結(jié)合附圖對本發(fā)明進行更詳細的解釋，其中
圖1 顯示了通過在芯片上雜交對寡核苷酸測序的簡圖；圖2 顯示了用于生產(chǎn)表面雜合物elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-
UQ(RC)的各種反應(yīng)順序。該表面雜合物中的光誘導(dǎo)型氧化還
原活性部分是光合細菌類球紅細菌的反應(yīng)中心(RC)。該光誘
導(dǎo)型氧化還原活性蛋白由脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子組成。RC通
過其位于稱為QA蛋白結(jié)合袋內(nèi)的輔因子泛醌-50(UQ)與寡核苷
酸通過間隔基共價連接；圖3 以圖2中的表面雜合物elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-UQ(RC)為
例顯示了光誘導(dǎo)的電流分析測定方法的簡圖(hv用光線照射；
PRC的初級供體；UQRC的QA蛋白結(jié)合袋內(nèi)的泛醌-50電子
受體；Red/Ox加入到靶溶液中的游離的氧化還原活性物質(zhì)的
還原或氧化的形式，例如cyt c22+、抗壞血酸鈉或Fe(CN)62+，其
可以將氧化形式的P+再還原成其原始中性狀態(tài)P；Eox可以通
過向電極轉(zhuǎn)移電子將UQ-氧化成UQ的電極電位；“hv on”
光照射的開始；“hv off”光照射結(jié)束)；圖4 顯示了含有金作為固體載體材料、含有巰基乙醇作為電極和
寡核苷酸之間的間隔基(-S-CH2CH2-間隔基)、含有
-CH2-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH-作為電子受體PQQ和寡核苷酸
之間的間隔基的圖3的表面雜合物Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔
基-Q-ZnBChl的詳圖，以及光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移步驟的順序的
圖。RC的脫輔基蛋白質(zhì)僅以殼體(實心線)的形式示出(參見結(jié)
構(gòu)1)。詳細給出了雜交狀態(tài)的示范性序列5′-
TAGTCGGAAGCA-3′的12-bp探針寡核苷酸；圖5以表面雜合物elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl為例顯示
了光誘導(dǎo)的電流分析測定方法的簡圖(hv用光線照射；
ZnBChl電子供體分子鋅-菌綠素；Q電子受體分子醌，例如
修飾的蒽醌或PQQ；Red/Ox加入到靶溶液中的游離的氧化還
原活性物質(zhì)的還原或氧化的形式，例如Fe(CN)62+，其可以將氧
化形式的電子供體ZnBChl+還原成其原始狀態(tài)ZnBChl；Eox
可以通過向電極轉(zhuǎn)移電子將Q-氧化成Q的電極電位；“hv
on”光照射的開始；“hv off”光照射結(jié)束)；圖6 顯示了含有金作為固體載體材料、含有巰基乙醇作為電極和
寡核苷酸之間的間隔基(-S-CH2CH2-間隔基)、含有
-CH2-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH-作為電子受體PQQ和寡核苷酸
之間的間隔基的圖5的表面雜合物Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔
基-Q-ZnBChl的詳圖，以及光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移步驟的順序的
圖。詳細給出了雜交狀態(tài)的示范性序列5′-
TAGTCGGAAGCA-3′的12-bp探針寡核苷酸。
實施本發(fā)明的方式
在圖4中舉例說明了示范性的試驗位點和具有通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ds-oligo-間隔基-部分的雜交的靶Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-UQ(RC)的形成單元。對于本發(fā)明，“形成單元”是指最小的試驗位點重復(fù)單元。在圖4的例子中，表面是金電極。金電極與探針寡核苷酸之間的連接是由接頭(HO-(CH2)2-S)2形成的，它被3′-端的末端磷酸基團酯化形成P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH，在將金表面上的S-S鍵均裂后各產(chǎn)生一個Au-S鍵，通過該鍵將2-羥基-巰基乙醇和巰基乙醇-橋接的寡核苷酸共同吸附在表面上。圖4的例子中的光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分是光合細菌類球紅細菌的反應(yīng)中心(RC)，一種由脫輔基蛋白質(zhì)和輔因子組成的光誘導(dǎo)型氧化還原活性蛋白。在本申請的實施例中，RC通過其位于稱為QA蛋白結(jié)合袋內(nèi)的輔因子泛醌-50(UQ)與寡核苷酸共價連接，其中，游離的UQ首先提供活潑的羧酸基團(參見實施例1)，然后通過該羧酸基團與探針寡核苷酸共價連接(將連接在5′胸腺嘧啶C-5位的-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2接頭的末端氨基功能基酰胺化然后脫水)，最后，將其余的RC(脫輔基蛋白質(zhì)和除UQ之外的所有輔因子)重建到UQ上。
如上所述，探針寡核苷酸的修飾可以用完整的氧化還原活性部分或其成分進行，可以在探針寡核苷酸與導(dǎo)電表面結(jié)合之前或結(jié)合之后進行。以下將借助圖2以表面雜合物Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-UQ(RC)或其更概括的形式elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-UQ(RC)為例對可以產(chǎn)生相同的試驗位點形成單元的各步驟的各種組合可能性進行說明。
可以通過簡單的操作(Gunner，M.R.，Robertson，D.E.，Dutton，P.L.，1986，《物理化學(xué)雜志》(Journal of Physical Chemistry)，Vol.90，3783-3795頁)使反應(yīng)中心在QA或QB結(jié)合袋游離兩個泛醌輔因子，從而產(chǎn)生與其余的RC(脫輔基蛋白質(zhì)，包括除QA或QB結(jié)合袋中的泛醌之外的所有輔因子)分離的泛醌。探針寡核苷酸在其末端通過間隔基與(相同或不同的)活潑基團連接。在反應(yīng)順序“1”中，在單功能基接頭的存在下(參見“寡核苷酸與導(dǎo)電表面的結(jié)合”一節(jié)中的a)-c)點2.)點)，將修飾的探針寡核苷酸和單功能基接頭一起與電極共價連接，確保加入足夠的適宜鏈長的單功能基基團以在各探針寡核苷酸之間提供足夠的空間，以允許與靶寡核苷酸的雜交并允許與氧化還原活性部分的連接。然后，將事先形成了適宜的活潑偶聯(lián)基團的UQ與探針寡核苷酸的間隔基橋接的活潑基團連接。連接按照“氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”一節(jié)中a)或b)項下的描述進行。在該反應(yīng)順序“1”的最后的步驟中，將剩余的RC(脫輔基蛋白質(zhì)以及除UQ之外的所有輔因子)重建到UQ上。在另一種形式中(反應(yīng)順序“2”)，將(用間隔基和活潑基團)修飾的探針寡核苷酸首先共價連接到?jīng)]有游離單功能基接頭(間隔基)的電極上，形成寡核苷酸的平面連接。然后，將游離的單功能基接頭(間隔基)與電極共價連接。另一種可能性(反應(yīng)順序“3”)將(用間隔基和活潑基團)修飾的探針寡核苷酸首先用UQ修飾，然后將其在游離單功能基接頭(間隔基)的存在下與電極共價連接，然后將其用剩余的RC重建。最后，在反應(yīng)順序“4”中，可以將(用間隔基和活潑基團)修飾的探針寡核苷酸首先用UQ修飾，然后將其用剩余的RC重建，然后將其與電極共價連接。與RC的情況一樣，當(dāng)氧化還原活性部分的直徑明顯比雜交的ds-寡核苷酸(大于30埃)時，可以無需在電極上共價連接適宜的游離單功能基接頭(間隔基)；否則，可以在適宜的游離單功能基接頭的存在下在電極上連接結(jié)構(gòu)-間隔基-ss-間隔基-UQ(RC)。
在圖2的例子中，RC通過其位于稱為RC的QA蛋白結(jié)合袋內(nèi)的輔因子泛醌-50(UQ)與寡核苷酸共價連接?；蛘?，除了QA結(jié)合袋內(nèi)的UQ輔因子外，RC的其它輔因子或脫輔基蛋白質(zhì)也可以與探針寡核苷酸共價連接，圖2中的反應(yīng)順序“1”、“2”、“3”或“4”的任何組合均可采用，只要它們可以產(chǎn)生相同的最終產(chǎn)物即可(參見圖2)，并且在任何反應(yīng)步驟中，均可以用與互補的、未修飾的(靶)寡核苷酸雜交的探針寡核苷酸代替單鏈的探針寡核苷酸。探針寡核苷酸還可以直接(也就是說不通過間隔基橋接)與電極和氧化還原活性部分連接，如“核酸寡聚體與導(dǎo)電表面的結(jié)合”一節(jié)中c)項下或者“氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”一節(jié)中a)項下所述。
在通式結(jié)構(gòu)elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分中，導(dǎo)電表面與通過單鏈寡核苷酸橋接的氧化還原部分之間的電傳導(dǎo)很弱或者不存在。如果在探針和靶之間發(fā)生了雜交，將試驗位點用待測試的寡核苷酸溶液處理將會導(dǎo)致表面和通過雙鏈寡核苷酸橋接的氧化還原活性部分之間導(dǎo)電性的增加。對于作為例子的試驗位點Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-UQ(RC)(帶有12個堿基對的探針寡核苷酸)的形成單元，在圖3中用電流分析測定進行了圖示說明。
通過用適宜波長的光線照射RC可以將輔因子P(也稱為初級供體)電子激發(fā)，造成光誘導(dǎo)的RC的輔因子內(nèi)的電荷分離，電子從受激的初級供體P*轉(zhuǎn)移到QA結(jié)合袋內(nèi)的UQ。如果在電極上施加適宜的電位使電子從還原的泛醌(UQ-)向電極轉(zhuǎn)移，在探針寡核苷酸未與靶寡核苷酸增加的情況下，仍然不會有電流流動，因為Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-UQ(RC)內(nèi)的ss-寡核苷酸的導(dǎo)電性非常弱或者不存在。但是，在雜交狀態(tài)(Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-UQ(RC))，導(dǎo)電性非常高，電子可以從UQ-向電極轉(zhuǎn)移(形成UQ)，并且，在可以將P+還原成P的適宜氧化還原活性物質(zhì)的存在下，電路閉合，當(dāng)RC再吸收光線時可以開始新的循環(huán)。這可以在電流分析中表現(xiàn)為電極和光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分之間的明顯的電流(圖3)。因此，可以通過電流分析用光誘導(dǎo)檢測靶與探針寡核苷酸之間的序列特異性的雜交。在圖4中舉例說明了通過光照射以及在可以將P+還原成P的氧化還原活性物質(zhì)的存在下在表面雜合物Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-UQ(RC)激發(fā)的各電子轉(zhuǎn)移步驟。給定適宜的外部條件和適宜的連接(例如RC與靠近初級供體的探針寡核苷酸的連接)，表面雜合物Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-UQ(RC)也可以逆轉(zhuǎn)，從而在光線照射后，P+被電極還原，Q-被適宜的氧化劑氧化。
圖5舉例說明了通式結(jié)構(gòu)為elec-間隔基-ss-oligo-間隔基-部分的另一個試驗位點，Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl。通過將ZnBChl用適宜波長的光線照射，ZnBChl被電子激發(fā)并且發(fā)生光誘導(dǎo)的電荷分離，電子從受激的ZnBChl*轉(zhuǎn)移到醌Q。如果在電極上施加適宜的電位使電子從還原的醌(Q-)向電極轉(zhuǎn)移，在探針寡核苷酸未與靶寡核苷酸增加的情況下，仍然不會有電流流動，因為Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl內(nèi)的ss-寡核苷酸的導(dǎo)電性非常弱或者不存在。但是，在雜交狀態(tài)(Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-Q-ZnBChl)，導(dǎo)電性非常高，電子可以從Q-向電極轉(zhuǎn)移(形成Q)，并且，在可以將ZnBChl+還原成ZnBChl的適宜氧化還原活性物質(zhì)的存在下，電路閉合，當(dāng)ZnBChl再吸收光線時可以開始新的循環(huán)。這可以在電流分析中表現(xiàn)為電極和光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分之間的明顯的電流(圖5)。因此，可以通過電流分析用光誘導(dǎo)檢測靶與探針寡核苷酸之間的序列特異性的雜交。給定適宜的外部條件和適宜的連接(例如Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-ZnBChl-Q)，表面雜合物Au-S(CH2)2-ds-oligo-間隔基-Q-ZnBChl也可以逆轉(zhuǎn)，從而在光線照射后，ZnBChl+被電極還原，Q-被適宜的氧化劑氧化。
由于光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化還原活性-即使在適宜的電極電位下-僅在用適宜波長的光線照射時才被激發(fā)，并且最多僅維持光線照射所持續(xù)的時間，根據(jù)本發(fā)明，可以利用該條件通過將光線局限在寡聚體芯片上的特定試驗位點或試驗位點組在空間上分辨該試驗位點或試驗位點組。根據(jù)本發(fā)明，這樣做的優(yōu)點是，可以將寡聚體芯片的各試驗位點(核酸寡聚體的組合)涂覆在共享的、連續(xù)的導(dǎo)電表面上，并且，如果精確地僅對特定的試驗位點或試驗位點組用光照射，將可以簡單地通過向(完整的)表面施加適宜的外部電位對特定的試驗位點或特定的試驗位點組進行定位和電流測定。因此，無需將各試驗位點涂覆在彼此電絕緣的并且可以在施加電位和電流選擇上進行單獨控制的單個(微)電極上。
此外，可以通過循環(huán)伏安法特征的改變來識別有缺陷的堿基配對(堿基對錯配)。錯配表現(xiàn)為在循環(huán)伏安法的導(dǎo)電表面和光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分之間可逆的電子轉(zhuǎn)移中，電還原和電再氧化(當(dāng)電位的施加方向相反時電還原的逆轉(zhuǎn))或電氧化和電再還原的電流最大值之間有較大的電位差。這一事實對電流檢測有非常重要的影響，因為在電流檢測中，可以在良好雜合寡核苷酸靶提供明顯電流的電位下檢測到電流，但有缺陷的配對的寡核苷酸靶則不能。實施例1用間隔基橋接的活潑羧酸基團修飾泛醌-50。將泛醌-50(UQ-50)的2-甲氧基通過用HBr進行醚裂解(一種常規(guī)方法)修飾成2-羥基(或者，可以按照Moore，H.W.和Folkers，K.，美國化學(xué)會雜志(Journal of the American Chemical Society)，1966，88，564-570頁或Daves，G.等，美國化學(xué)會雜志，1968，90，5587-5593頁的方法產(chǎn)生2-OH-UQ-50)。然后，在采用等摩爾量Cl-CH2-CH2-CO2H的常規(guī)方法中，將2-OH-UQ-50轉(zhuǎn)變成2-(CH-CH2-CO2H)-UQ-50并將其進行色譜純化。
或者，在一種常規(guī)方法中，可將UQ50的5-OH-6-烷基-1，4-苯醌類似物(按照Catlin等，美國化學(xué)會雜志，1968，90，3572-3574的方法生產(chǎn))用等摩爾量的Cl-CH2-CH2-CO2H修飾成5-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50-類似物。
實施例2生產(chǎn)寡核苷酸電極Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基UQ(RC)。Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基UQ(RC)分4個步驟進行生產(chǎn)，即，產(chǎn)生導(dǎo)電表面，將表面用寡核苷酸探針在適宜的單功能基接頭的存在下衍生化(保溫步驟)，共價連接修飾的泛醌-50(氧化還原步驟)和重建剩余的RC(重建步驟)。
云母(白云母薄片)上約100nm厚的金薄膜形成了共價連接雙鏈寡核苷酸的載體材料。為此，將新劈開的云母用氬離子等離子體在放電室內(nèi)純化并通過放電涂覆一層厚度約為100nm的金(99.99％)。然后，用30％H2O2/70％H2SO4除去金薄膜表面的雜質(zhì)(有機積聚物的氧化)并在乙醇中浸泡約20分鐘以驅(qū)散表面上吸附的所有的氧。將表面用雙蒸水洗滌后，將預(yù)先制備的1×10-4M的(修飾的)雙鏈寡核苷酸溶液涂覆在水平固定的表面上，從而使整個金表面被濕潤(保溫步驟，見下)。
為了進行保溫，使用序列為5′-TAGTCGGAAGCA-3′的雙重修飾的12個堿基對的單鏈寡核苷酸，將其用(HO-(CH2)2-S)2在3′-末端的磷酸酯基團進行酯化形成P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH。在5′-末端，將寡核苷酸的末端胸腺嘧啶堿基在C-5碳上用-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2修飾。將約10-4至10-1M的2-羥基-巰基乙醇(或具有適宜鏈長的另一種巰基或二硫化物接頭)加入到2×10-4M上述寡核苷酸的HEPES緩沖液(0.1M的水溶液，pH 7.5，加入0.7MTEATFB，參見縮寫)溶液中，將試驗位點的金表面完全濕潤并保溫2-24小時。在該反應(yīng)時間內(nèi)，寡核苷酸的二硫化物間隔基P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH被均裂。在該過程中，間隔基與表面的金原子形成Au-S共價鍵，從而引起ss-寡核苷酸和裂解的2-羥基-巰基乙醇的1∶1共吸附。在保溫溶液中存在的游離2-羥基-巰基乙醇也通過形成Au-S鍵被共吸附(保溫步驟)。
將用含有ss-寡核苷酸和2-羥基-巰基乙醇的單層修飾的金電極用雙蒸水洗滌然后用3×10-3M醌2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50、10-2MEDC和10-2M磺基-NHS的HEPES緩沖液(0.1M水溶液，pH＝7.5)溶液潤濕。反應(yīng)約1-4小時后，-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2間隔基和2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50形成共價鍵(間隔基的氨基和2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50的C-2-酸功能基之間的酰胺化，氧化還原步驟)。
然后，將修飾的金電極用雙蒸水洗滌并與大約5×10-5M泛醌-50-游離RC在10mM Tris(pH＝8，加有0.7M TEATFB)中的溶液一起在約4℃下保溫約12小時將剩余的RC重建到與寡核苷酸連接的UQ-50上(重建步驟)。
或者，為了在相同的條件下將2-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50與探針寡核苷酸，也可以使用5-(CH2-CH2-CO2H)-UQ-50-類似物(實施例1)或帶有活潑羧酸基團的式1-8的另一種醌，因為泛醌-50-游離RC也可以重建到這些物質(zhì)上。實施例3生產(chǎn)寡核苷酸電極Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl。Au-S(CH2)2-ss-oligo-間隔基-Q-ZnBChl分5個步驟進行生產(chǎn)，即，產(chǎn)生導(dǎo)電表面，在適宜單功能基接頭的存在下將表面用探針寡核苷酸衍生化(與互補的鏈雜交)(保溫步驟)，共價連接電子受體(受體步驟)，共價連接電子供體(供體步驟)和將雙鏈寡核苷酸熱去雜交(去雜交步驟)。
按照實施例1的描述生產(chǎn)用于共價連接雙鏈寡核苷酸的載體材料，約100nm厚的在云母(白云母薄片)上的金薄膜。
為了進行保溫，使用序列為5′-TAGTCGGAAGCA-3′的雙重修飾的12個堿基對的單鏈寡核苷酸，將其用(HO-(CH2)2-S)2在3′-末端的磷酸酯基團進行酯化形成P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)-OH。在5′-末端，將寡核苷酸的末端胸腺嘧啶堿基在C-5碳上用-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2修飾。將2×10-4M上述寡核苷酸在雜交緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，pH 7.5，加有0.7M TEATFB，參見縮寫)中的溶液與2×10-4M(未修飾的)互補鏈在雜交緩沖液中的溶液在室溫下雜交約2小時(雜交步驟)。雜交后，向1×10-4M雙鏈寡核苷酸溶液中加入約10-4至10-1M的2-羥基-巰基乙醇(或具有適宜鏈長的另一種巰基或二硫化物接頭)并將試驗位點的金表面完全濕潤并保溫2-24小時。在該反應(yīng)時間內(nèi)，寡核苷酸的二硫化物間隔基P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH被均裂。在該過程中，間隔基與表面的金原子形成Au-S共價鍵，從而引起ss-寡核苷酸和裂解的2-羥基-巰基乙醇的1∶1共吸附。在保溫溶液中存在的游離2-羥基-巰基乙醇也通過形成Au-S鍵被共吸附(保溫步驟)。
將用含有ds-寡核苷酸和2-羥基-巰基乙醇的單層修飾的金電極用雙蒸水洗滌然后用3×10-3M醌PQQ、10-2M EDC和10-2M磺基-NHS的HEPES緩沖液溶液潤濕。反應(yīng)約1-4小時后，-CH＝CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2間隔基和PQQ形成共價鍵(間隔基的氨基和PQQ的C-7-羧酸功能基之間的酰胺化，氧化還原步驟)。
然后，將修飾的金電極用雙蒸水洗滌并用約3×10-3M供體ZnBChl(游離酸)、1.5×10-1M EDC、2.5×10-3M一水合肼(NH2-NH2xH2O)和1×10-1M咪唑的水溶液濕潤。于23℃反應(yīng)約16小時后，與寡核苷酸結(jié)合的PQQ的C-1-羧酸功能基通過肼與ZnBChl的游離羧酸基團結(jié)合(肼的氨基與PQQ的C-1-羧酸基團或ZnBChl的游離羧酸基團之間的酰胺化，供體步驟)。然后，將雙鏈在大于40℃的溫度下熱去雜交然后再次用雙蒸水沖洗(去雜交步驟)。通過與三氟乙酸一起保溫從Zn-BChl(按照Hartwich等，美國化學(xué)會雜志，1998，120，3684-3693頁生產(chǎn))制得ZnBChl(游離酸)。
或者，例如，還可以通過按照常規(guī)方法進行酯化將ZnBChl(游離酸)與探針寡核苷酸的5′-末端糖的3-OH結(jié)合，或者將預(yù)先共價連接的電子供體/電子受體復(fù)合物與探針寡核苷酸按照供體步驟中的描述通過游離的羧酸基團例如供體進行連接。在相同的反應(yīng)條件下，還可在受體步驟中用蒽醌-2，6-二磺酸二鈉鹽代替PQQ。如果將PNA寡核苷酸和例如-NH-(CH2)2-N(COCH2-堿基)-CH2CO-用作寡核苷酸結(jié)構(gòu)單元，根據(jù)“光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分與核酸寡聚體的結(jié)合”一節(jié)中的d)，有另一種將ZnBChl-PQQ部分與核酸寡聚體(PNA寡核苷酸)連接的方法。在該情況下，在PNA寡核苷酸合成的過程中，代替常規(guī)PNA合成反應(yīng)中的N-末端堿基，將PQQ通過其吡咯的氮進行連接。然后，通過與供體步驟中所述類似的方式，通過將用PQQ修飾的PNA寡核苷酸與3×103M ZnBChl(游離酸)、1.5×10-1M EDC 10-2和2×10-1M磺基-NHS一起在HEPES緩沖液中保溫將Zn-BChl與肽骨架的氨基末端連接(骨架的氨基和Zn-BChl(游離酸)的羧酸基團之間的酰胺化)。
權(quán)利要求
1.一種通過共價連接氧化還原活性部分進行修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述氧化還原活性部分含有一個或多個電子供體分子和一個或多個電子受體分子。
2.權(quán)利要求1所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述氧化還原活性部分含有至少一種氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物，氧化還原活性部分的電子供體分子和/或電子受體分子中至少有兩個通過一個或多個鍵相互連接。
3.權(quán)利要求2所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于氧化還原活性部分的電子供體分子和/或電子受體分子中至少有兩個通過一個或多個共價鍵相互連接。
4.權(quán)利要求1所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述氧化還原活性部分含有至少一種氧化還原活性的、連接的、至少是雙分子的電子供體/電子受體復(fù)合物，至少有兩個電子供體分子和/或電子受體分子通過一個或多個任意組成和鏈長的直鏈或支鏈分子部分共價連接。
5.權(quán)利要求4所述的修飾的核酸寡聚體，其中的直鏈或支鏈的分子部分的鏈長為1-20個原子，特別是1-14個原子。
6.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于，含有一個或多個電子供體分子和一個或多個電子受體分子的氧化還原活性部分還含有一種或多種大分子。
7.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其中的氧化還原活性部分是光合微生物的天然或修飾的反應(yīng)中心，特別是光合細菌的天然或修飾的反應(yīng)中心。
8.權(quán)利要求1至6中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述的一種或多種電子供體和/或電子受體分子是顏料、特別是黃素類、(金屬)卟啉類、(金屬)葉綠素類或(金屬)菌綠素類或其衍生物。
9.權(quán)利要求1至6中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于一種或多種電子供體和/或電子受體分子是煙酰胺類或醌類，特別是吡咯并-喹啉醌類(PQQ)、1，2-苯醌類、1，4-苯醌類、1，2-萘醌類、1，4-萘醌類或9，10-蒽醌類或其衍生物。
10.權(quán)利要求1至6中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于一種或多種電子供體和/或電子受體分子是電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物。
11.權(quán)利要求10所述的修飾的核酸寡聚體，其中的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物是過渡金屬復(fù)合物，特別是Ru(II)、Cr(III)、Fe(II)、Os(II)或Co(II)復(fù)合物。
12.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其中，修飾的核酸寡聚體可以序列特異性地結(jié)合單鏈DNA、RNA和/或PNA。
13.權(quán)利要求12所述的修飾的核酸寡聚體，其中，修飾的核酸寡聚體是脫氧核糖核酸寡聚體、核糖核酸寡聚體、肽核酸寡聚體或具有結(jié)構(gòu)類似的骨架的核酸寡聚體。
14.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其中，氧化還原活性部分與核酸寡聚體骨架的磷酸、羧酸或氨基之一共價結(jié)合，或者與糖共價結(jié)合，特別是與糖的羥基共價結(jié)合。
15.權(quán)利要求1至13中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其中，氧化還原活性部分與核酸寡聚體的修飾的堿基之巰基、羥基、羧酸或氨基共價連接。
16.權(quán)利要求15所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于，堿基的活潑的巰基、羥基、羧酸或氨基通過具有任意組成和鏈長的直鏈或支鏈分子部分與堿基共價連接，巰基、羥基、羧酸或氨基與堿基之間最短的連續(xù)連接是鏈長為1-20個原子、特別是1-14個原子的直鏈或支鏈的分子部分。
17.權(quán)利要求14至16中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其中的氧化還原活性部分與核酸寡聚體骨架的一端相連接或與末端修飾的堿基相連接。
18.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述的氧化還原活性部分是光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分。
19.權(quán)利要求1至17中任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于所述的氧化還原活性部分是化學(xué)誘導(dǎo)型氧化還原活性部分。
20.前述權(quán)利要求任意一項所述的修飾的核酸寡聚體，其特征在于有多個氧化還原活性部分與核酸寡聚體相連接。
21.一種生產(chǎn)前述權(quán)利要求任意一項所定義的修飾的核酸寡聚體的方法，其中，將氧化還原活性部分與核酸寡聚體共價連接。
22.權(quán)利要求21所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，通過共價連接一種或多種電子供體分子將氧化還原活性部分與核酸寡聚體連接。
23.權(quán)利要求21所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，通過共價連接一種或多種電子受體分子將氧化還原活性部分與核酸寡聚體連接。
24.權(quán)利要求21所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，通過共價連接一種或多種大分子或者通過共價連接一種或多種蛋白質(zhì)將氧化還原活性部分與核酸寡聚體連接。
25.權(quán)利要求22至24所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，通過加入一種或多種電子受體分子、一種或多種電子供體分子、一種或多種大分子和/或一種或多種蛋白質(zhì)完成氧化還原活性部分。
26.權(quán)利要求21至25所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，通過一種或多種與氧化還原活性部分的胺或酸基團的酰胺化、通過一種或多種與氧化還原活性部分的醇或酸基團的酯化、通過與氧化還原活性部分的硫醇或酸基團形成硫酯，或者，通過將核酸寡聚體的一個或多個氨基與氧化還原活性部分的醛基縮合然后將形成的碳-氮雙鍵還原，將核酸寡聚體與氧化還原活性部分結(jié)合。
27.權(quán)利要求21至26所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，將一種或多種任意組成和鏈長的直鏈或支鏈分子部分與氧化還原活性部分共價連接，并且所述直鏈或支鏈的分子部分帶有用于和核酸寡聚體共價連接的活潑的胺、羥基、巰基、酸或醛基。
28.權(quán)利要求27所述的生產(chǎn)修飾的核酸寡聚體的方法，其中，核酸寡聚體和氧化還原活性部分之間最短的連續(xù)連接是鏈長為1-20個原子、特別是1-14個原子的直鏈或支鏈的分子部分。
29.一種修飾的導(dǎo)電表面，其特征在于有一種或多種 1至20任意一項所述的修飾的核酸寡聚體連接在導(dǎo)電表面上。
30.權(quán)利要求29所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中的表面由金屬或金屬合金組成，特別是選自鉑、鈀、金、鎘、汞、鎳、鋅、碳、銀、銅、鐵、鉛、鋁、錳的金屬及其混合物。
31.權(quán)利要求29所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中的表面由半導(dǎo)體組成，特別是選自碳、硅、鍺和α-錫的半導(dǎo)體。
32.權(quán)利要求29所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中的表面由14和16族元素的二元化合物、13和15族元素的二元化合物、15和16族元素的二元化合物或11和17族元素的二元化合物組成，特別是鹵化亞銅(I)或鹵化銀(I)。
33.權(quán)利要求29所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中的表面由11、13和16族元素的三元化合物或12、13和16族元素的三元化合物組成。
34.權(quán)利要求29至33中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中修飾的核酸寡聚體與導(dǎo)電表面的連接是共價連接或通過化學(xué)吸附或物理吸附進行的。
35.權(quán)利要求29至34中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中核酸寡聚體骨架的磷酸、羧酸或氨基之一或糖基團、特別是糖的羥基與導(dǎo)電表面共價連接或通過化學(xué)吸附或物理吸附進行連接。
36.權(quán)利要求29至34中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其特征在于，核酸寡聚體的修飾的堿基的巰基、羥基、羧酸或氨基與導(dǎo)電表面共價連接或通過化學(xué)吸附或物理吸附進行連接。
37.權(quán)利要求35或36所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中修飾的核酸寡聚體通過在核酸寡聚體骨架末端的基團或通過末端修飾的堿基的基團與導(dǎo)電表面結(jié)合。
38.權(quán)利要求29至37中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中任意組成和鏈長的直鏈或支鏈的分子部分與導(dǎo)電表面共價連接或通過化學(xué)吸附或物理吸附進行連接，并且修飾的核酸寡聚體與這些分子部分共價連接。
39.權(quán)利要求38所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中導(dǎo)電表面和核酸寡聚體之間最短的連續(xù)連接是鏈長為1-20個原子、特別是1-12個原子的直鏈或支鏈的分子部分。
40.權(quán)利要求38或39所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中，直鏈或支鏈的分子部分與核酸寡聚體骨架的磷酸、羧酸或氨基之一或糖基團、特別是糖的羥基相連接，或者與核酸寡聚體的修飾的堿基的巰基、羥基、羧酸或氨基相連接。
41.權(quán)利要求40所述的修飾的導(dǎo)電表面，其中，直鏈或支鏈的分子部分與核酸寡聚體骨架末端的磷酸、糖-羥基、羧酸或氨基結(jié)合，或者與末端修飾的堿基的巰基、羥基、羧酸或氨基結(jié)合。
42.權(quán)利要求29至41中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其特征在于，主要有一種類型的修飾的核酸寡聚體連接在導(dǎo)電表面上空間限定的區(qū)域。
43.權(quán)利要求29至41中任意一項所述的修飾的導(dǎo)電表面，其特征在于，僅有一種類型的修飾的核酸寡聚體各自連接在導(dǎo)電表面上空間限定的區(qū)域。
44.權(quán)利要求29至43所定義的修飾的導(dǎo)電表面，其特征在于，有一種或多種修飾的核酸寡聚體涂覆在導(dǎo)電表面。
45.生產(chǎn)權(quán)利要求29至43所定義的修飾的導(dǎo)電表面的方法，其特征在于將一種或多種核酸寡聚體涂覆在導(dǎo)電表面，然后，用權(quán)利要求21至28的方法進行核酸寡聚體的修飾。
46.權(quán)利要求44或45所述的生產(chǎn)修飾的導(dǎo)電表面的方法，其中將核酸寡聚體或修飾的核酸寡聚體與各自的互補核酸寡聚體鏈雜交，然后以雙鏈雜合物的形式涂覆在導(dǎo)電表面。
47.權(quán)利要求44或45所述的生產(chǎn)修飾的導(dǎo)電表面的方法，其中，將核酸寡聚體或修飾的核酸寡聚體在同樣可以連接到導(dǎo)電表面的其它化合物的存在下涂覆在導(dǎo)電表面。
48.一種電化學(xué)檢測寡聚體雜交事件的方法，其特征在于，將權(quán)利要求29至43所定義的一種或多種修飾的導(dǎo)電表面與核酸寡聚體接觸，然后檢測氧化還原活性部分和各導(dǎo)電表面之間所發(fā)生的電傳導(dǎo)。
49.權(quán)利要求48的方法，其中的檢測通過循環(huán)伏安法、電流分析法或?qū)щ娦詼y量來進行。
50.權(quán)利要求48或49的方法，其特征在于，電化學(xué)檢測是由光誘導(dǎo)的電荷分離引發(fā)的，所述電荷分離是在通過核酸寡聚體與導(dǎo)電表面連接的光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分內(nèi)。
51.權(quán)利要求50的方法，其中，用于光誘導(dǎo)的電荷分離的光線照射局限在帶有一種或多種修飾的核酸寡聚體類型的導(dǎo)電表面的一個區(qū)域內(nèi)，所述電荷分離是在通過核酸寡聚體與導(dǎo)電表面連接的光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分內(nèi)。
52.權(quán)利要求50或51的方法，其中，通過用特定或任何給定波長的光線照射所形成的光誘導(dǎo)型氧化還原活性部分的氧化的電子供體分子或還原的電子受體分子被不與核酸寡聚體結(jié)合但與其相接觸的適宜的游離氧化還原活性物質(zhì)再還原或再氧化，即，氧化的電子供體分子或還原的電子受體分子被恢復(fù)至其在進行光線照射以前的最初狀態(tài)。
53.權(quán)利要求48或49所述的電化學(xué)檢測方法，其特征在于，通過可以完成化學(xué)誘導(dǎo)的向氧化還原活性部分轉(zhuǎn)移電荷的游離氧化還原活性物質(zhì)促進電化學(xué)檢測。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其中，不與核酸寡聚體結(jié)合但與其相接觸的游離氧化還原活性物質(zhì)可以在電位下被選擇性地氧化和還原，其中，在用標(biāo)準(zhǔn)氫電極測量時，滿足2.0V≥≥-2.0V的條件。
55.權(quán)利要求52至54中任意一項所述的方法，其中，不與核酸寡聚體結(jié)合但與其相接觸的游離氧化還原活性物質(zhì)是游離的醌、游離的六氰基高鐵酸鹽(II)復(fù)合物、游離的抗壞血酸鈉、游離的Ru(II)六胺復(fù)合物或游離的氧化還原活性的蛋白質(zhì)、特別是游離的細胞色素。
全文摘要
本發(fā)明涉及了一種用于電化學(xué)檢測序列特異性核酸寡聚體雜交事件的方法。一端結(jié)合于導(dǎo)電表面且于另一游離端連接氧化還原活性單元的DNA/RNA/PNA寡聚體單鏈用作雜交基質(zhì)(探針)。通過用待測寡核苷酸溶液(靶)處理使部分單鏈寡核苷酸雜交,得到導(dǎo)電表面和氧化還原活性單元之間電交流增加的結(jié)果,所述電交流最初不存在或幾乎不存在。這樣使得利用如伏安法、電流分析法或?qū)щ娦詼y量的電化學(xué)方法可檢測雜交事件。
文檔編號C12N15/09GK1352697SQ00803149
公開日2002年6月5日 申請日期2000年1月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月18日
發(fā)明者G·哈特維奇 申請人:弗里茲生物化學(xué)有限公司