專(zhuān)利名稱(chēng)：編碼交替蔗糖酶的核酸分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及編碼交替蔗糖酶(alternansucrase)的核酸分子。此外本發(fā)明也涉及載體、宿主細(xì)胞和由此處所述核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，和含有這些細(xì)胞的植物。此外，也描述了制備由于插入編碼交替蔗糖酶的DNA分子而合成碳水化合物交替糖(alternan)的轉(zhuǎn)基因植物的方法。此外還描述了制備交替糖的方法。
公開(kāi)內(nèi)容包含于本申請(qǐng)書(shū)之內(nèi)的現(xiàn)有技術(shù)文件在下文中引用。
交替糖是一種由葡萄糖單元組成的多糖。葡萄糖單元通過(guò)α-1，3-和α-1，6-糖苷鍵彼此連接，這兩種鍵主要交替出現(xiàn)。然而，交替糖不是一種線性多糖，而可含有分支(Seymour等人，碳水化合物研究(CarbohydrateResearch)74，(1979)，41-62)。由于其物理化學(xué)性質(zhì)，曾經(jīng)討論了交替糖用于制藥工業(yè)如作為藥物活性成分的載體和作為添加劑用于紡織品、化妝品和食品工業(yè)的可能性(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)(Enzyme Microb.Technol.)15，(1993)，77-85；Leathers等人，工業(yè)微生物與生物技術(shù)雜志(Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology)18，(1997)，278-283)。此外，它還能用作阿拉伯膠的替代品(Coté，碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)19，(1992)，249-252)。
工業(yè)上對(duì)制造寡糖和多糖特別是交替糖的生物技術(shù)方法特別感興趣，交替糖幾乎不能或根本不能通過(guò)經(jīng)典有機(jī)合成獲得。與有機(jī)合成化學(xué)的經(jīng)典方法相比，生物技術(shù)方法具有優(yōu)點(diǎn)。例如，酶促催化反應(yīng)通常顯示更高的特異性(區(qū)域特異性、立體特異性)和更高的反應(yīng)速度，在較溫和反應(yīng)條件下進(jìn)行，并導(dǎo)致較高產(chǎn)量。這些因素在制造新的寡糖和多糖中是非常重要的。
交替糖是利用具有交替蔗糖酶生物活性的酶酶促制備的。交替蔗糖酶屬于葡糖基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)，其由蔗糖開(kāi)始，能催化交替糖和果糖的形成。迄今為止，交替蔗糖酶只在細(xì)菌變異鏈球菌(Streptococcus mutans)(Mukasa等人，(普通微生物學(xué)雜志(J.Gen.Microbiol.)135(1989)，2055-2063)；Tsumori等人，(普通微生物學(xué)雜志131(1985)，3347-3353))和革蘭氏陽(yáng)性菌腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的特殊菌株中發(fā)現(xiàn)，它們通常與其他多糖形成酶(如形成葡聚糖的葡聚糖蔗糖酶)或與多糖降解酶(如交替糖酶)一起存在。因此，天然存在的菌株除交替糖之外也產(chǎn)生葡聚糖。
迄今為止，已用部分純化的蛋白質(zhì)有無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中或用產(chǎn)交替蔗糖酶腸膜明串珠菌菌株通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)出了交替糖。
已描述了用于純化交替蔗糖酶的多種純化方法(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85；Lopez-Munguia等人，紐約科學(xué)院年報(bào)(Annals New York Academy of Sciences)613(1990)，717-722；Coté和Robyt，碳水化合物研究101(1982)，57-74)。這些方法復(fù)雜且成本相對(duì)較高，并且通常導(dǎo)致低蛋白質(zhì)產(chǎn)量(Leathers等人，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology)18(1997)，278-283)。這些方法都不能生產(chǎn)高純度的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)，因此該蛋白質(zhì)的測(cè)序和相應(yīng)DNA序列的分離迄今尚未成功。如果按照這些方法純化的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)用于體外生產(chǎn)交替糖，則交替蔗糖酶制品中所含的葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)殘余物在生產(chǎn)的交替糖中產(chǎn)生葡聚糖雜質(zhì)。交替糖與葡聚糖的分離相對(duì)耗時(shí)且昂貴(Leathers等人，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志18(1997)，278-283)。交替蔗糖酶蛋白質(zhì)酶制劑中所含的葡聚糖蔗糖酶蛋白質(zhì)雜質(zhì)的另一個(gè)缺點(diǎn)是一部分蔗糖底物被轉(zhuǎn)化為葡聚糖而不是交替糖的事實(shí)，這導(dǎo)致交替糖產(chǎn)量的降低。
利用明串珠菌的發(fā)酵生產(chǎn)也導(dǎo)致交替糖和葡聚糖產(chǎn)品混合物的形成。為了提高來(lái)源于明串珠菌菌株的交替蔗糖酶的量，已分離了突變體如突變體NRRL B-21138，其分泌交替蔗糖酶并產(chǎn)生相對(duì)于葡聚糖蔗糖酶較高比例的交替蔗糖酶量。然而，如果這些突變體與蔗糖發(fā)酵，則獲得的交替糖持續(xù)顯示有葡聚糖雜質(zhì)(Leathers等人，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志18(1997)，278-283)。
從上述現(xiàn)有技術(shù)能看出，迄今尚且不能生產(chǎn)高度純化的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)。
因此，本發(fā)明研究關(guān)于提供可以以省時(shí)、便宜的方式制備交替糖的工具和方法的問(wèn)題。
專(zhuān)利權(quán)利要求書(shū)中表征的實(shí)施方案解決了這一問(wèn)題。
因此，本發(fā)明涉及編碼具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，其選自(a)編碼至少成熟形式的蛋白質(zhì)的核酸分子，其包含Seq.ID No.2所示的氨基酸序列或質(zhì)粒DSM 12666中所含cDNA編碼的氨基酸序列；(b)包含Seq.ID No.1所示核苷酸序列或質(zhì)粒DSM 12666中所含cDNA的核苷酸序列或相應(yīng)核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與Seq.IDNo 2所示的氨基酸序列有至少40％的同源性；(d)核酸分子，其一條鏈可與如(a)或(b)所述的任一核酸分子雜交；(e)包含一種核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列編碼由(a)、(b)、(c)或(d)所述的任一種核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的生物活性片段；和(f)核酸分子，其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于如(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子的序列。
因此，本發(fā)明涉及編碼具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，該分子優(yōu)選地編碼包含Seq.ID No.2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
具有交替蔗糖酶(E.C.2.4.1.140)的酶學(xué)或生物學(xué)活性的酶被認(rèn)為是指能催化蔗糖轉(zhuǎn)化為交替糖和果糖的酶。這種轉(zhuǎn)化可在外部接納體(例如麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖等)存在或不存在時(shí)發(fā)生。無(wú)外部接納體時(shí)，交替蔗糖酶由蔗糖始催化果糖和高分子交替糖的釋放，交替糖是一種由葡萄糖單元組成的多糖，其主鏈由彼此主要以α-1，3-和α-1，6-糖苷鍵交替連接的葡萄糖單元組成。關(guān)于α-1，3-和α-1，6-連接的葡萄糖單元，文獻(xiàn)顯示不同的數(shù)值。根據(jù)Mukasa等人，(普通微生物學(xué)雜志135(1989)，2055-2063)，交替糖由76mol％α-1，3-連接的葡萄糖和24mol％α-1，6-連接的葡萄糖組成。Tsumori等人(普通微生物學(xué)雜志131(1985)，3347-3353)描述交替糖是一種含有49.1mol％α-1，6-連接的葡萄糖和33.9mol％α-1，3-連接的葡萄糖及13.6mol％末端葡萄糖和3.3mol％α-1，3，6-支鏈葡萄糖的葡聚糖。在外部接納體如麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖存在時(shí)，交替蔗糖酶能催化α-D-葡聚糖鏈的合成，其中葡萄糖殘基主要通過(guò)α-1，6-和α-1，3-糖苷鍵交替連接，在這些多糖接納體處合成果糖。根據(jù)所使用的接納體，形成的產(chǎn)物具有不同的結(jié)構(gòu)。例如能如Lopez-Munguia(紐約科學(xué)院年報(bào)613(1990)，717-722)所述或如本申請(qǐng)書(shū)實(shí)施例所述檢測(cè)交替蔗糖酶的酶活性。
本發(fā)明尤其涉及含有Seq.ID No.1所示核苷酸序列的核酸分子或其部分，優(yōu)選地涉及包含Seq.ID No.1所示編碼區(qū)或相應(yīng)核糖核苷酸序列的分子。
此外，本發(fā)明也涉及編碼一種交替蔗糖酶的核酸分子，其一條鏈可與上述分子之一雜交。
本發(fā)明也涉及編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，它與Seq.ID No.2所示的完整氨基酸序列有同源性，也就是說(shuō)有至少40％、優(yōu)選地至少60％、優(yōu)選地至少70％、特別優(yōu)選地至少80％、特別是至少90％的同一性，該蛋白質(zhì)具有交替蔗糖酶的生物活性。
本發(fā)明也涉及編碼一種交替蔗糖酶的核酸分子，其序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于上述核酸分子的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及具有與整個(gè)或部分上述序列互補(bǔ)的序列的核酸分子。
Seq.ID No.1所示的核酸序列例如編碼一種胞外交替蔗糖酶。包含Seq.ID No.2的大約前39個(gè)N端氨基酸基團(tuán)的信號(hào)序列確保其分泌。在某些情況下，這只是對(duì)于將在無(wú)天然存在的信號(hào)序列時(shí)和/或與其他信號(hào)序列一起時(shí)表達(dá)的成熟蛋白質(zhì)才是希望的。因此，上述核酸分子至少編碼具有交替蔗糖酶生物活性的成熟形式的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“雜交”意思是在常規(guī)雜交條件下、優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下的雜交，如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版(1989)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY所述。在特別優(yōu)選的含義中，術(shù)語(yǔ)“雜交”是指在下列條件下發(fā)生雜交雜交緩沖液 2xSSC；10xDenhardt溶液(Fikoll 400＋PEG＋BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鯡精DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸鈉緩沖液，pH7.2；1mM EDTA7％SDS雜交溫度T ＝60℃洗滌緩沖液 2xSSC；0.1％SDS洗滌溫度T ＝60℃。
可與本發(fā)明的核酸分子雜交的核酸分子原則上能編碼來(lái)源于表達(dá)這些蛋白質(zhì)的生物的交替蔗糖酶。
例如，可與本發(fā)明的分子雜交的核酸分子能從微生物的基因組文庫(kù)中分離。此外，它們也能通過(guò)遺傳工程或化學(xué)合成制備。
這些核酸分子可用本發(fā)明的分子或這些分子的部分或這些分子的反向互補(bǔ)體鑒定和分離，例如通過(guò)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法的雜交(參見(jiàn)，例如Sambrook等人，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
具有與Seq.ID No.1所示核苷酸序列相同或基本相同的核酸分子或其部分例如能用作雜交探針。用作雜交探針的片段也可以是用普通合成技術(shù)制備的合成片段，其序列與本發(fā)明的核酸分子基本一致。
可與本發(fā)明的核酸分子雜交的分子也包括上述編碼本發(fā)明的交替蔗糖酶的核酸分子的片段、衍生物和等位變體。在此，片段可理解為長(zhǎng)度足以編碼所述蛋白質(zhì)之一，優(yōu)選地顯示交替蔗糖酶生物活性的核酸分子的部分。與此相關(guān)，術(shù)語(yǔ)衍生物是指這些分子的序列在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上也不同于上述核酸分子的序列，并顯示與這些序列有高度同源性。在本說(shuō)明書(shū)中，同源性是指至少40％的序列同一性，特別是至少60％、優(yōu)選地80％以上、特別優(yōu)選地90％以上的同一性。與上述核酸分子的不同可通過(guò)缺失、置換、插入和/或重組實(shí)現(xiàn)。
優(yōu)選地，通過(guò)將各自序列與SEQ ID No.1編碼區(qū)的核苷酸序列比較確定同源性程度。當(dāng)比較的序列沒(méi)有相同長(zhǎng)度時(shí)，同源性程度優(yōu)選地是指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分?jǐn)?shù)。同源性程度可用已知的計(jì)算機(jī)程度如ClustalW程序常規(guī)確定(Thompson等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)22(1994)，4673-4680)，該程序的由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)發(fā)布，歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德國(guó)。ClustalW也能從幾個(gè)網(wǎng)站下載，包括IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire etCellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，法國(guó)；ftp//ftp-igbmc.u-strasbg，fr/pub/)和EBI(ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI(歐洲生物信息學(xué)研究所(European Bioinformatics Institute)，Wellcome TrustGenome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)的所有鏡象站點(diǎn)。
當(dāng)使用ClustalW程序1.8版本確定特定序列是否與根據(jù)本發(fā)明的參照序列例如90％相同時(shí)，對(duì)于DNA序列對(duì)比，設(shè)定值如下設(shè)置KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIXIUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未加權(quán)。
對(duì)于使用ClustalW程序1.8版本的蛋白質(zhì)序列對(duì)比，設(shè)置如下KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
此外，同源性?xún)?yōu)選地是指編碼蛋白質(zhì)顯示與SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少40％、更優(yōu)選地至少60％、再更優(yōu)選地至少80％、特別是至少90％、特別優(yōu)選地至少95％的序列同一性。
同源性還指在相應(yīng)的核酸分子或其編碼的蛋白質(zhì)之間有功能和/或結(jié)構(gòu)相當(dāng)。與上述分子同源并且代表這些分子的衍生物的核酸分子通常是這些分子的變異，它們代表具有相同生物學(xué)功能的修飾。它們可以是天然發(fā)生的變異，例如來(lái)源于其他微生物的序列，也可以是突變，該突變可以天然形成或可以通過(guò)人工誘變產(chǎn)生。此外，變異也可以是合成產(chǎn)生的序列。等位變體可以是天然發(fā)生的變體或是合成產(chǎn)生的變體或是通過(guò)重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的變體。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“衍生物”包括編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)包含至少1個(gè)、更優(yōu)選地至少3個(gè)、再更優(yōu)選地至少5個(gè)、特別是至少10個(gè)、特別優(yōu)選地至少20個(gè)選自下列的肽基序a)MKQQE(SEQ ID NO22)，b)KKVPV(SEQ ID NO23)，c)KDDEN(SEQ ID NO24)，d)IDGNL(SEQ ID NO25)，e)YVADS(SEQ ID NO26)，f)HLRKN(SEQ ID NO27)，g)NENTP(SEQ ID NO28)，h)NVDGY(SEQ ID NO29)，i)NPDLK(SEQ ID NO30)，j)SNDSG(SEQ ID NO31)，k)NTFVK(SEQ ID NO32)，l)ISGYL(SEQ ID NO33)，m)SNAAL(SEQ ID NO34)，n)RQYTD(SEQ ID NO35)，o)QLYRA(SEQ ID NO36)，p)DDKAP(SEQ ID NO37)，q)TRQYT(SEQ ID NO38)，r)ITFAG(SEQ ID NO39)，s)NQYKG(SEQ ID NO40)，t)LFLNA(SEQ ID NO41)，
u)QVSDT(SEQ ID NO42)，v)LITLN(SEQ ID NO43)，w)GRYVH(SEQ ID NO44)，x)TAPYG(SEQ ID NO45)，y)VVDYQ(SEQ ID NO46)，z)LSGQE(SEQ ID NO47)。
本發(fā)明核酸分子的不同變體所編碼的蛋白質(zhì)具有其通常具有的某些特征。例如包括酶活性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等，和物理性質(zhì)，如在凝膠電泳中的遷移行為、色譜行為、沉降系數(shù)、溶解度、光譜性質(zhì)、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度等。
交替蔗糖酶(E.C.2.4.1.140)是一種屬于葡糖基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)的酶。迄今為止，交替蔗糖酶活性未在植物中發(fā)現(xiàn)，只在細(xì)菌變異鏈球菌(Mukasa等人，普通微生物學(xué)雜志135(1989)，2055-2063)；Tsumori等人，(普通微生物學(xué)雜志131(1985)，3347-3353))和革蘭氏陽(yáng)性菌腸膜明串珠菌的特殊菌株如NRRL B-1355、NRRL B-1498和NRRL B-1501中發(fā)現(xiàn)。這些菌株通常含有不同的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，并且如果使之在含蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)則除交替蔗糖酶外分泌葡聚糖蔗糖酶。這兩種蔗糖酶通常與它們合成的多糖有高結(jié)合親和力(Lopez-Munguia等人，紐約科學(xué)院年報(bào)613(1990)，717-722)，因此，在從含蔗糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的腸膜明串珠菌菌株中純化酶時(shí)，這些多糖必須與蛋白質(zhì)分離(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85；Leathers等人，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志18(1997)，278-283)。
無(wú)外部接納體時(shí)，交替蔗糖酶由蔗糖始催化果糖和高分子交替糖的釋放，交替糖是一種由葡萄糖單元組成的多糖，其主鏈由彼此主要以α-1，3-和α-1，6-糖苷鍵交替連接的葡萄糖單元組成，根據(jù)光散射測(cè)定數(shù)據(jù)，其分子量應(yīng)＞107(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。迄今還沒(méi)有關(guān)于具有末端果糖殘基的交替糖的報(bào)道。然而，不能完全排除交替糖中末端果糖單元的存在。Lopez-Munguia等人(酶與微生物技術(shù)15(1993)77-85)描述了交替糖對(duì)葡聚糖酶降解有抗性。然而，它能被所謂的交替糖酶降解，從而產(chǎn)生不同聚合程度的交替糖的環(huán)形寡聚體(Biely等人，歐洲生物化學(xué)雜志(Eur.J.Biochem.)226(1994)，633-639)。高分子交替糖的超聲處理可使交替糖的分子量降至＜106(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。如果制備超聲處理的交替糖的水溶液，則這些溶液顯示與阿拉伯膠水溶液相當(dāng)?shù)牧髯儗W(xué)性質(zhì)。分子量約為3500的所謂“限制交替糖”能通過(guò)用來(lái)源于球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)(NRRL B-4425)的異麥芽葡聚糖酶酶降解產(chǎn)生(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。
在外部接納體如麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖存在時(shí)，交替蔗糖酶能在該糖類(lèi)接納體處催化α-D-葡聚糖鏈的合成，其中葡萄糖部分主要通過(guò)α-1，6-和α-1，3-糖苷鍵交替連接，和果糖的合成。根據(jù)所使用的接納體，得到的產(chǎn)物具有不同的結(jié)構(gòu)和低于高分子交替糖的分子量和＜15的聚合程度。由于這種聚合程度，這些產(chǎn)物通常也被稱(chēng)為寡聚交替糖(Pelenc等人，Sciences Des Aliments 11(1991)，465-476)。然而，在本發(fā)明的范圍內(nèi)，可在外部接納體存在下制備的這些低分子產(chǎn)物也被稱(chēng)為交替糖。
在利用部分純化的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)制備寡聚交替糖時(shí)，麥芽糖是一種可得到高寡聚交替糖產(chǎn)量的接納體(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。潘糖(聚合程度(d.p.)為3)是通過(guò)形成α-1，6-糖苷鍵而由麥芽糖形成的第一種接納體產(chǎn)物。
與之相反，異麥芽糖是一種效率較低的接納體，它導(dǎo)致較低的寡聚交替糖產(chǎn)量(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。
交替蔗糖酶相對(duì)穩(wěn)定，在50mM乙酸緩沖液，pH5.4中及40℃下半衰期為2天(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。該酶在40℃和pH5.6時(shí)顯示最大活性(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。
在沒(méi)有底物蔗糖時(shí)，交替蔗糖酶催化導(dǎo)致交替糖(部分)重排的歧化反應(yīng)。特別是當(dāng)用含有葡聚糖蔗糖酶污染的部分純化的交替蔗糖酶制劑制備寡聚交替糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)有導(dǎo)致寡聚交替糖完全重排的高歧化率(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。
對(duì)于根據(jù)SDS PAGE測(cè)定的交替蔗糖酶的分子量，能發(fā)現(xiàn)有不同數(shù)值分別為135kDa、145kDa、173kDa和196kDa(Leathers等人，工業(yè)微生物學(xué)與生物技術(shù)雜志18(1997)，278-283；Kim和Robyt，酶與微生物技術(shù)16(1994)，659-664；Zhanley和Smith，應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)(Applied and Environmental Microbiology)61(3)(1995)，1120-1123)。
交替蔗糖酶的酶活性能如Lopez-Munguia等人(紐約科學(xué)院年報(bào)613(1990)，717-722)所述，或如本申請(qǐng)書(shū)的實(shí)施例所述顯示。
一個(gè)活性單位(1u)可定義為在1分鐘內(nèi)導(dǎo)致1μmol果糖釋放的酶量。
本發(fā)明的核酸分子可以是DNA分子，特別是基因組分子。而且，本發(fā)明的核酸分子也可以是RNA分子。本發(fā)明的核酸分子例如能從天然來(lái)源獲得，或可合成或通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生。
本發(fā)明的核酸分子使得可制備能產(chǎn)生高純度和/或足夠量的重組交替蔗糖酶蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞，并遺傳構(gòu)建具有這些酶活性導(dǎo)致在植物中形成交替糖的植物。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“高純度”意思是根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)顯示至少80％、優(yōu)選地至少90％、更優(yōu)選地至少95％的純度。此外，還提供了可用宿主細(xì)胞制備交替糖和/或用于制備重組交替蔗糖酶蛋白質(zhì)的材料與方法。因此，提供本發(fā)明的核酸分子能通過(guò)相對(duì)便宜和耗時(shí)相對(duì)較少的方法制備高純度的交替糖。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子來(lái)源于微生物，優(yōu)選地來(lái)源于細(xì)菌，更優(yōu)選地來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性菌，特別優(yōu)選地來(lái)源于屬于明串珠菌屬的細(xì)菌。來(lái)源于屬于腸膜明串珠菌種的細(xì)菌的核酸分子是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明也涉及可與本發(fā)明的核酸分子特異雜交的寡核苷酸。這些寡核苷酸具有優(yōu)選地至少10個(gè)、特別是至少15個(gè)、特別優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。其特征在于它們可與本發(fā)明的核酸分子特異雜交，即，它們不能或只能一定程度地與編碼其他蛋白質(zhì)特別是其他葡糖基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列雜交。本發(fā)明的寡核苷酸例如能用作擴(kuò)增技術(shù)如PCR反應(yīng)的引物，或作為雜交探針用于分離有關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還涉及載體，特別是質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體和基因技術(shù)中常用的其他載體，它們含有上述本發(fā)明的核酸分子。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的載體能轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞或微生物細(xì)胞。優(yōu)選地，這些載體適于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。特別優(yōu)選地，這些載體允許本發(fā)明的核酸分子-可能與側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū)一起-整合到植物細(xì)胞的基因組中。其實(shí)例是能在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移中使用的二元載體，和已可購(gòu)得的載體。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體中所含的核酸分子與確保可翻譯RNA在原核或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件連接。
本發(fā)明的核酸分子在原核或真核細(xì)胞中例如在大腸桿菌中的表達(dá)是令人感興趣的，因?yàn)樗沟媚芨_地表征這些分子編碼的酶的酶活性。此外，也能在不含干擾酶如葡聚糖蔗糖酶或其他多糖形成酶或多糖降解酶的原核或真核細(xì)胞中表達(dá)這些酶。另外，也能通過(guò)分子生物學(xué)常用方法向核酸分子中插入不同突變(參見(jiàn)例如，Sambrook等人，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，引起可能具有改變的生物學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)的合成。一方面，就此而言，能產(chǎn)生缺失突變體，其中通過(guò)從編碼DNA序列的5’或3’端逐漸缺失而產(chǎn)生核酸分子，該核酸分子引起相應(yīng)縮短的蛋白質(zhì)的合成。例如，在核苷酸序列5’端的這些缺失可使負(fù)責(zé)微生物中分泌酶的氨基酸序列(轉(zhuǎn)運(yùn)肽)得到鑒定。
這使得能制備通過(guò)去掉相應(yīng)序列而不再分泌，但由于添加了其他信號(hào)序列而仍保留于相應(yīng)宿主生物的細(xì)胞內(nèi)，或位于其他區(qū)室如質(zhì)體、線粒體、液泡內(nèi)的酶。
另一方面，也可設(shè)想在例如氨基酸序列的修飾將影響酶活性或酶控制的位點(diǎn)處引入點(diǎn)突變。這樣，例如能產(chǎn)生具有改變的立體和區(qū)域選擇性或改變的Km值的突變體，或不再經(jīng)受細(xì)胞中通常存在的控制機(jī)制、并通過(guò)變構(gòu)控制或共價(jià)修飾得到的突變體。
此外，也能制備具有改變的底物或產(chǎn)物特異性的突變體。而且也能制備具有改變的活性-溫度分布(profile)的突變體。
此外，對(duì)于在植物中的表達(dá)，向本發(fā)明的核酸分子中插入突變使基因表達(dá)率和/或本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)的活性提高。
為在原核細(xì)胞中遺傳工程改造，能通過(guò)DNA序列重組將本發(fā)明的核酸分子或這些分子的部分導(dǎo)入允許誘變或序列修飾的質(zhì)粒中。標(biāo)準(zhǔn)方法(見(jiàn)Sambrook等人，1989，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，USA)可進(jìn)行堿基交換或添加天然或合成序列。通過(guò)向片段上添加連接體或接頭能使DNA片段彼此連接。而且也能使用提供合適的限制位點(diǎn)或除去多余的DNA或限制位點(diǎn)的工程方法。在這些情況中，其中插入、缺失或置換是可能的，能使用體外誘變、“引物修復(fù)”、限制酶切或連接。通常進(jìn)行序列分析、限制酶切分析和其他生物化學(xué)及分子生物學(xué)方法作為分析方法。
此外，本發(fā)明還涉及質(zhì)粒pAlsu-pSK(見(jiàn)圖2和實(shí)施例2)，其于1999年2月4日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)，Braunschweig，保藏號(hào)為DSM 12666，還涉及質(zhì)粒DSM 12666的插入片段中所含的、編碼具有交替蔗糖酶活性的蛋白質(zhì)的核酸分子。此外，本發(fā)明也涉及可與質(zhì)粒DSM 12666的插入片段雜交的核酸分子。本發(fā)明也涉及其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于質(zhì)粒DSM 12666插入片段的核酸分子的核酸分子。此外，本發(fā)明也涉及與質(zhì)粒DSM 12666的插入片段序列有至少40％、優(yōu)選地至少60％、更優(yōu)選地至少80％、再更優(yōu)選地至少90％、最優(yōu)選地至少95％的同源性即序列同一性的核酸分子。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及宿主細(xì)胞，尤其是用上述本發(fā)明的核酸分子或用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的原核或真核細(xì)胞，涉及為這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代、并含有本發(fā)明的核酸分子或載體的細(xì)胞。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，宿主細(xì)胞是微生物細(xì)胞。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“微生物”包括如Schlegel’s“Allgemeine Mikrobiologie”(Georg Thieme Verlag，1985，1-2)所述的細(xì)菌和所有原生生物(例如真菌，特別是酵母、藻類(lèi))。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案涉及藻類(lèi)細(xì)胞和屬于曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、酵母屬(Saccharomyces)或畢赤酵母屬(Pichia)的宿主細(xì)胞(Rodriguez，生物技術(shù)雜志(Journal ofBiotechnology)33(1994)，135-146，Romanos，疫苗(Vaccine)，9卷(1991)，901以及下列等)。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案涉及大腸桿菌細(xì)胞。交替蔗糖酶特別優(yōu)選地由宿主細(xì)胞分泌。為生產(chǎn)重組交替蔗糖酶，這些宿主細(xì)胞的制備能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法進(jìn)行。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞不顯示干擾酶活性，如多糖形成和/或多糖降解酶。
不同表達(dá)系統(tǒng)的綜述例如見(jiàn)“酶學(xué)方法”(Methods inEnzymology)153(1987)，385-516，Bitter等人，(酶學(xué)方法153(1987)，516-544)和Sawers等人，(應(yīng)用微生物學(xué)與生物技術(shù)(Applied Microbiologyand Biotechnology)46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)，500-4)，Hockney(生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends in Biotechnology)12(1994)，456-463)，Griffiths等人，分子生物學(xué)方法(Methods in Molecular Biology)75(1997)，427-440)。酵母表達(dá)系統(tǒng)的綜述例如見(jiàn)Hensing等人，(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人，生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展(Developments inBiological Standardization)83(1994)，13-19)，Gellissen等人，(Antonievan Leuwenhoek 62(1992)，79-93，F(xiàn)leer現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)3(1992)，486-496)，Vedvick現(xiàn)代生物技術(shù)觀點(diǎn)2(1991)，742-745)和Buckholz，生物技術(shù)(Bio/Technology)9(1991)，1067-1072)。
表達(dá)載體在文獻(xiàn)中有廣泛描述。它們通常不僅含有選擇性標(biāo)記基因和確保在所選的宿主中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，而且含有細(xì)菌或病毒啟動(dòng)子，和大多數(shù)情況中的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。在啟動(dòng)子與終止信號(hào)之間至少有一個(gè)限制位點(diǎn)或一個(gè)能插入編碼DNA序列的多接頭。能用天然控制相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列作為啟動(dòng)子序列，只要它在選擇的宿主生物中有活性。然而，該序列也能換為其他啟動(dòng)子序列。能使用導(dǎo)致基因組成型表達(dá)的啟動(dòng)子和可精確控制后連接(postconnected)的基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。文獻(xiàn)中詳述了具有這些性質(zhì)的細(xì)菌和病毒啟動(dòng)子序列。用于在微生物(例如大腸桿菌、釀酒酵母)中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列在文獻(xiàn)中有充分描述。允許后連接基因特別高表達(dá)的啟動(dòng)子包括，例如T7啟動(dòng)子(Studier等人，酶學(xué)方法185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人，于Rodriguez和Chamberlin(編)，《啟動(dòng)子，結(jié)構(gòu)與功能》(Promoters，Structure and Function)；Praeger，New York，(1982)，462-481；DeBoer等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等人，基因42(1986)，97-100)。通常，從微生物生長(zhǎng)周期的對(duì)數(shù)期中期到大約末期時(shí)蛋白質(zhì)含量最高。因此，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子優(yōu)選地用于蛋白質(zhì)的合成。這些啟動(dòng)子通常比組成型啟動(dòng)子導(dǎo)致更高的產(chǎn)量。高度組成型啟動(dòng)子的應(yīng)用引起克隆基因的連續(xù)轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而對(duì)于其他必需細(xì)胞功能通常有能量丟失的結(jié)果，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)減緩(Bernard R.Glick/Jack J.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995).Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，Oxford，p.342)。因此，為了獲得最佳蛋白質(zhì)含量，通常使用兩階段方法。首先，宿主細(xì)胞在最適條件下培養(yǎng)至相對(duì)高的細(xì)胞密度。第二步，根據(jù)所用的啟動(dòng)子類(lèi)型誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。就此而言，tac啟動(dòng)子特別合適，它能用乳糖或IPTG(＝異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)(deBoer等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)80(1983)，21-25)。文獻(xiàn)中也描述了轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
用編碼交替蔗糖酶的DNA對(duì)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化通常能用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如Sambrook等人(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版(1989)ColdSpring Harbor Press，New York；《酵母遺傳學(xué)方法，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Course Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1990)所述。宿主細(xì)胞在滿(mǎn)足所使用的特定宿主細(xì)胞需要(特別是在pH值、溫度、鹽濃度、通風(fēng)、抗生素、維生素、微量元素等方面)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
此外，本發(fā)明涉及由本發(fā)明的核酸分子編碼的蛋白質(zhì)及其生物活性片段，及其制備方法，其中在允許蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，隨后從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，交替蔗糖酶是一種重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中，它是通過(guò)向宿主細(xì)胞中插入編碼該蛋白質(zhì)的DNA序列并在其中表達(dá)而制備的蛋白質(zhì)。然后可從該宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的核酸分子使得能制備可產(chǎn)生高純度和/或足夠量的重組交替蔗糖酶蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明范圍內(nèi)，術(shù)語(yǔ)“高純度”是指，根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)顯示至少80％、優(yōu)選地至少90％、更優(yōu)選地至少95％的純度。無(wú)需以上已提到的費(fèi)時(shí)且高成本的方法(用該方法能從其他成分如葡聚糖蔗糖酶、多糖中純化迄今為止只能從特定明串珠菌菌株中獲得的交替蔗糖酶蛋白質(zhì))，因?yàn)榻惶嬲崽敲改茉诓痪哂腥魏尾焕亩嗵呛铣苫钚缘乃拗骷?xì)胞中產(chǎn)生。此外也可使用宿主細(xì)胞和載體，它們使得能在無(wú)蔗糖時(shí)產(chǎn)生交替蔗糖酶蛋白質(zhì)，從而不再需要另外將交替蔗糖酶蛋白質(zhì)與多糖分離。此外，選擇合適的宿主細(xì)胞和載體可產(chǎn)生足夠量的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)，這用迄今所述的系統(tǒng)還不可能。
宿主細(xì)胞產(chǎn)生的交替蔗糖酶能用常規(guī)純化方法純化，例如沉淀、離子交換層析、親和層析、凝膠過(guò)濾、HPLC反向?qū)游龅取?br> 修飾編碼交替蔗糖酶及在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子可在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生一種多肽，它由于特殊性質(zhì)而易于從培養(yǎng)基中分離。因此，欲表達(dá)的蛋白質(zhì)能表達(dá)為具有其他多肽序列的融合蛋白，其特異結(jié)合性質(zhì)使得能通過(guò)親和層析法分離該融合蛋白(例如，Hopp等人，生物技術(shù)6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，生物技術(shù)趨勢(shì)(Trends Biotechnol.)8(1990)，88-93)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及具有交替蔗糖酶酶活性的蛋白質(zhì)，特別是來(lái)源于微生物，優(yōu)選地革蘭氏陽(yáng)性微生物，特別是明串珠菌屬的微生物，特別優(yōu)選地來(lái)源于腸膜明串珠菌。經(jīng)計(jì)算確定，Seq.ID No.2所示的蛋白質(zhì)的分子量為228.96kDa。本發(fā)明也涉及分子量為229kDa±120kDa、優(yōu)選地229kDa±50kDa、特別優(yōu)選地230kDa±25kDa的交替蔗糖酶。經(jīng)計(jì)算確定，成熟蛋白質(zhì)的分子量為224.77kDa。
本發(fā)明的核酸分子的提供第一次使得能利用遺傳工程制備表達(dá)交替蔗糖酶的植物細(xì)胞，到目前為止這仍是不可能的，因?yàn)榻?jīng)典培養(yǎng)方法不能在植物中表達(dá)細(xì)菌和真菌基因。
因此本發(fā)明也涉及用本發(fā)明的核酸分子或本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，或這些細(xì)胞的后代，編碼具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子在允許可翻譯mRNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件控制下。
例如通過(guò)表達(dá)相應(yīng)的核酸分子引入本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性能在通過(guò)遺傳工程相應(yīng)修飾的植物細(xì)胞中產(chǎn)生交替糖。因此，本發(fā)明的核酸分子在植物細(xì)胞中的表達(dá)是可能的，這能導(dǎo)入在野生型中不存在的另一種相應(yīng)的交替蔗糖酶活性。此外，也能按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法修飾本發(fā)明的核酸分子，以獲得本發(fā)明的交替蔗糖酶，例如它具有改變的溫度依賴(lài)性或底物或產(chǎn)物特異性。這些方法已在上述不同段落中詳細(xì)描述。
可使用多種技術(shù)向植物宿主細(xì)胞中插入DNA。這些技術(shù)包括利用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)作為轉(zhuǎn)化劑用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，原生質(zhì)體融合，注射，DNA的電穿孔，通過(guò)biolistic法插入DNA，及其他可能。
已廣泛研究了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的應(yīng)用，這充分描述于EP120 516；Hoekema，《二元植物載體系統(tǒng)》(The Binary Plant VectorSystem)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第5章；Fraley等人，植物科學(xué)評(píng)述(Crit.Rev.Plant Sci.)4(1993)，1-46，和An等人，EMBO J.4(1985)，277-287。關(guān)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化參見(jiàn)例如Rocha-Sosa等人，(EMBO J.8(1989)，29-33)。
也已描述了利用基于農(nóng)桿菌的載體對(duì)單子葉植物的轉(zhuǎn)化(Chan等人，植物分子生物學(xué)22(1993)，491-506；Hiei等人，植物雜志6(1994)271-282；Deng等人，中國(guó)科學(xué)(Science in China)33(1990)，28-34；Wilmink等人，植物細(xì)胞報(bào)道(Plant Cell Reports)11(1992)，76-80；May等人，生物技術(shù)13(1995)，486-492；Conner和Dormisse，國(guó)際植物科學(xué)雜志(Int.J.Plant Sci.)153(1992)，550-555；Ritchie等人，轉(zhuǎn)基因研究(Transgenic Res.)2(1993)，252-265)。可供選擇的轉(zhuǎn)化單子葉植物的系統(tǒng)包括利用biolistic方法轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，植物生理學(xué)(PlantPhysiol.)104(1994)，37-48；Vasil等人，生物技術(shù)11(1993)，1553-1558；Ritala等人，植物分子生物學(xué)24(1994)317-325；Spencer等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)(Theor.Appl.Genet.)79(1990)，625-631)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分通透性細(xì)胞的電穿孔、經(jīng)玻璃纖維的插入。特別是在文獻(xiàn)中重復(fù)描述了玉米的轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)例如，WO 95/06128，EP 0 513 849，EP 0 465 875，EP29 24 35；Fromm等人，生物技術(shù)8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，植物細(xì)胞2，(1990)，603-618；Koziel等人，生物技術(shù)11(1993)，194-200；Moroc等人，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)80，(1990)，721-726)。
也已敘述了其他類(lèi)谷物的成功轉(zhuǎn)化，例如大麥(Wan和Lemaux，同上；Ritala等人，同上；Krens等人，自然296(1982)，72-74)和小麥(Nehra等人，植物雜志5(1994)，285-297)。在植物細(xì)胞中有活性的任何啟動(dòng)子通常都適用于在植物細(xì)胞中表達(dá)核酸分子。能選擇啟動(dòng)子以使在本發(fā)明的植物中的表達(dá)組成型發(fā)生或僅在特定組織中、在植物發(fā)育的特定時(shí)期或在外部影響所決定的時(shí)間發(fā)生。啟動(dòng)子對(duì)于植物可以是同源的或異源的。
合適的啟動(dòng)子例如是花椰菜花葉病毒的35S RNA啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如US-A-5,352,605)和遍在蛋白啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如US-A-5,614,399)，它們引起組成型表達(dá)，和patatin基因啟動(dòng)子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)，其在馬鈴薯中引起塊莖特異的表達(dá)，或確保只在光合活性組織中表達(dá)的啟動(dòng)子，如ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO，J.8(1989)2445-2451)、Ca/b-啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如US-A-5,656,496、US-A-5,639,952，Bansal等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)89(1992)，3654-3658)和Rubisco SSU啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如US-A-5,034,322；US-A-4,962,028)或來(lái)源于小麥的谷蛋白啟動(dòng)子，其導(dǎo)致胚乳特異的表達(dá)(HMW啟動(dòng)子)(Anderson，理論與應(yīng)用遺傳學(xué)96，(1998)，568-576，Thomas，植物細(xì)胞2(12)，(1990)，1171-1180)、來(lái)源于稻的谷蛋白啟動(dòng)子(Takaiwa，植物分子生物學(xué)30(6)(1996)，1207-1221，Yoshihara，F(xiàn)EBS Lett.383(1996)，213-218，Yoshihara，植物與細(xì)胞生理學(xué)(Plant and Cell Physiology)37(1996)，107-111)、來(lái)源于玉米的shrunken啟動(dòng)子(Maas，EMBO J.8(11)(1990)，3447-3452，Werr，分子普通遺傳學(xué)202(3)(1986)，471-475，Werr，分子普通遺傳學(xué)212(2)，(1988)，342-350)、USP啟動(dòng)子、菜豆蛋白啟動(dòng)子(Sengupta-Gopalan，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)82(1985)，3320-3324，Bustos，植物細(xì)胞1(9)(1989)，839-853)或來(lái)源于玉米的玉米醇溶蛋白基因啟動(dòng)子(Pedersen等人，細(xì)胞29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，植物分子生物學(xué)15(1990)，81-93)。然而，也能使用只在外部因素所決定的時(shí)間激活的啟動(dòng)子(參見(jiàn)例如WO 93/07279)。就此而言，可簡(jiǎn)單誘導(dǎo)的熱休克蛋白啟動(dòng)子可能是特別有意義的。此外，也可使用種子特異的啟動(dòng)子如來(lái)源于蠶豆(Vicia faba)的USP啟動(dòng)子，其可確保在蠶豆及其他植物中的種子特異的表達(dá)(Fiedler等人，植物分子生物學(xué)22(1993)，669-679；Bumlein等人，分子普通遺傳學(xué)225(1991)，459-467)。此外也可使用果實(shí)特異的啟動(dòng)子，如WO 91/01373所述。
此外，也可具有終止序列，其用來(lái)正確地終止轉(zhuǎn)錄并向轉(zhuǎn)錄物添加poly-A尾，這被認(rèn)為具有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄物的作用。這些元件在文獻(xiàn)中有述(參見(jiàn)例如Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)，并能任意替換。
這些細(xì)胞不同于天然存在的植物細(xì)胞，因?yàn)槭聦?shí)是它們含有不在這些細(xì)胞中天然存在的本發(fā)明的核酸分子。此外，本發(fā)明的這些轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞不同于天然存在的植物細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兒蟹€(wěn)定整合于基因組中的至少一個(gè)拷貝的本發(fā)明的核酸分子。
此外，至少由于下列特征之一，本發(fā)明的植物細(xì)胞優(yōu)選地不同于天然存在的植物細(xì)胞如果插入的本發(fā)明的核酸分子對(duì)于植物細(xì)胞是異源的，則發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞含有本發(fā)明的插入核酸分子的轉(zhuǎn)錄物。后者能通過(guò)例如Northern印跡分析檢測(cè)。本發(fā)明的植物細(xì)胞優(yōu)選地含有一種由本發(fā)明的插入核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。這可用例如免疫學(xué)方法特別是Western印跡分析顯示。
按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法能使轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生為整個(gè)植物。
本發(fā)明也涉及可通過(guò)再生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞而獲得的植物。此外，還涉及含有上述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞的植物。
在大多數(shù)植物中，光合作用期間在植物內(nèi)形成的糖形式即主要是蔗糖形式的光同化物被運(yùn)輸?shù)较鄳?yīng)靶器官中。由于蔗糖是交替蔗糖酶聚合反應(yīng)的底物，故所有植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，在交替蔗糖酶表達(dá)方面原則上都能被本發(fā)明的核酸分子改變。
編碼具有交替蔗糖酶活性的蛋白質(zhì)的本發(fā)明核酸分子在植物中的表達(dá)例如能用來(lái)實(shí)現(xiàn)可從植物中獲得的提取物的粘度改變，這種改變是通過(guò)交替糖的合成而實(shí)現(xiàn)的。就此而言，例如番茄是所關(guān)注的。交替蔗糖酶在番茄果實(shí)中的表達(dá)導(dǎo)致交替糖的合成，并導(dǎo)致從這些果實(shí)中獲得的提取物的粘度改變，例如用于番茄泥或番茄醬的生產(chǎn)。
本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)在顯示較高蔗糖含量或貯存蔗糖的植物器官中特別有利。這些器官例如是甜菜根或甘蔗莖。由于這些植物通常不貯存任何可知含量的淀粉，所以能從這些植物中分離由交替蔗糖酶合成的純交替糖。
植物細(xì)胞中發(fā)生蔗糖生物合成的位置是細(xì)胞溶膠。但貯存位置是液泡。在向甜菜或馬鈴薯的貯藏組織轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，或在向種子胚乳轉(zhuǎn)運(yùn)期間，蔗糖必須通過(guò)質(zhì)外體。因此，所有這三種區(qū)室，即細(xì)胞溶膠、液泡、質(zhì)外體可有助于表達(dá)用于合成交替糖的核酸分子。另外，例如由細(xì)菌果糖基轉(zhuǎn)移酶在造粉體中的表達(dá)所示，質(zhì)體也有助于此。同樣需要蔗糖作為底物的該果糖基轉(zhuǎn)移酶能介導(dǎo)“淀粉果聚糖”在造粉體中的形成(Smeekens，植物科學(xué)趨勢(shì)(Trends in Plant Science)，2，8(1997)，286-288)。
對(duì)于產(chǎn)淀粉植物，如馬鈴薯和玉米，其中淀粉生物合成和淀粉貯藏通常在造粉體中發(fā)生，交替蔗糖酶在質(zhì)外體、細(xì)胞溶膠或液泡中的表達(dá)將導(dǎo)致在這些區(qū)室中另外合成寡糖和/或多糖，這能解釋產(chǎn)量的總體提高。
對(duì)于馬鈴薯-造粉體中合成的淀粉能與質(zhì)外體、細(xì)胞溶膠或液泡中合成的交替糖分離，能用極相同的植物回收淀粉和交替糖。
此外，也已知轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和玉米植物，其由于反義構(gòu)建體抑制了ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶而完全抑制了分別在塊莖和谷粒中的淀粉合成。對(duì)于馬鈴薯，可溶性糖，特別是蔗糖和葡萄糖，例如在塊莖中積累(Müller-Rber等人，EMBO J.11(1992)，1229-1238)。用蔗糖作為底物通過(guò)交替蔗糖酶的表達(dá)能在這些植物的細(xì)胞溶膠、液泡或質(zhì)外體中產(chǎn)生交替糖。
因此在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物細(xì)胞特征在于較來(lái)源于野生型植物的相應(yīng)細(xì)胞降低的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性。
編碼AGPase的DNA分子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知，并為例如Müller-Rber等人，(分子普通遺傳學(xué)224(1)(1990)，136-146)所描述。利用編碼AGPase的DNA分子，能通過(guò)重組DNA技術(shù)(例如反義、核酶或共抑制方法)產(chǎn)生顯示降低的AGPase活性的植物。此外，例如來(lái)源于玉米的具有降低的AGPase活性的AGPase突變體(brittle-2和shrunken-2)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
術(shù)語(yǔ)“降低的”是指與相應(yīng)野生型細(xì)胞相比，AGPase活性?xún)?yōu)選地至少降低10％、更優(yōu)選地至少50％、再更優(yōu)選地至少80％。
AGPase活性能按照Müller-Rber等人(分子普通遺傳學(xué)224(1)(1990)，136-146)或按照本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法測(cè)定。
根據(jù)葡萄糖部分被直接從蔗糖轉(zhuǎn)移給存在的糖接納體的事實(shí)區(qū)別交替蔗糖酶催化的反應(yīng)。相反，對(duì)于植物，由蔗糖生物合成線性葡聚糖如下進(jìn)行首先將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，然后均轉(zhuǎn)化為活化的中間體ADP-葡萄糖。用淀粉合酶將葡萄糖部分從ADP葡萄糖轉(zhuǎn)移給已存在的葡聚糖，從而釋放ADP。蔗糖轉(zhuǎn)化為兩個(gè)ADP葡萄糖分子需要幾個(gè)耗能反應(yīng)。因此，交替蔗糖酶催化的反應(yīng)的能量消耗大大低于在植物細(xì)胞中由蔗糖合成多糖的能量消耗，這可導(dǎo)致在含有本發(fā)明的核酸分子的植物中合成的寡糖和/或多糖產(chǎn)量提高。
對(duì)于核酸分子在植物中的表達(dá)，原則上存在如下可能性合成的蛋白質(zhì)可能位于植物細(xì)胞(例如細(xì)胞溶膠、質(zhì)體、液泡、線粒體)或植物(例如質(zhì)外體)的任何區(qū)室中。為實(shí)現(xiàn)在特定區(qū)室的定位，必要時(shí)編碼區(qū)必須與確保在相應(yīng)區(qū)室中定位的DNA序列連接。使用的信號(hào)序列必須均排列于與編碼該酶的DNA序列相同的閱讀框中。
為確保在質(zhì)體中的定位，可設(shè)想使用下列轉(zhuǎn)運(yùn)肽之一菠菜質(zhì)體鐵氧還蛋白NADP＋氧化還原酶(FNR)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，Jansen等人，(現(xiàn)代遺傳學(xué)(Current Genetics)13(1988)，517-522)公開(kāi)。特別是，能使用此處公開(kāi)的cDNA序列中核苷酸-171-165的序列，其包含5′非翻譯區(qū)及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。另一個(gè)實(shí)例是玉米蠟質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，其包含成熟蠟質(zhì)蛋白的前34個(gè)氨基酸殘基(Klsgen等人，分子普通遺傳學(xué)217(1989)，155-161)。也能使用不含成熟蛋白質(zhì)前34個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。此外，也能使用核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(Wolter等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)85(1988)，846-850；Nawrath等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)91(1994)，12760-12764)、NADP malat脫氫酶(Gallardo等人，Planta 197(1995)，324-332)、谷胱甘肽還原酶(Creissen等人，植物雜志8(1995)，167-175)或R1蛋白(Lorberth等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)16，(1998)，473-477)的信號(hào)肽。
為確保在液泡中的定位，可設(shè)想使用下列轉(zhuǎn)運(yùn)肽之一patatin蛋白的N端序列(146個(gè)氨基酸)(Sonnewald等人，植物雜志1(1991)，95-106)或Matsuoka和Neuhaus，實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志(Journal of ExperimentalBotany)50(1999)，165-174；Chrispeels和Raikhel，細(xì)胞68(1992)，613-616；Matsuoka和Nakamura，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)88(1991)，834-838；Bednarek和Raikhel，植物細(xì)胞3(1991)，1195-1206；Nakamura和Matsuoka，植物生理學(xué)101(1993)，1-5所述的信號(hào)序列。
為確保在線粒體中的定位，例如可設(shè)想使用Braun等人(EMBO J.11，(1992)，3219-3227)所述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
為確保在質(zhì)外體中的定位，可設(shè)想使用下列轉(zhuǎn)運(yùn)肽之一蛋白酶抑制劑II基因(Keil等人，核酸研究14(1986)，5641-5650；von Schaewen等人，EMBO J.9(1990)，30-33)、來(lái)源于解淀粉歐文氏菌(Erwiniaamylovora)的果聚糖蔗糖酶基因(Geier和Geider，物理分子植物病理學(xué)(Phys.Mol.Plant Pathol.)42(1993)，387-404)、來(lái)源于茄子(Solanumtuberosum)的patatin基因B33片段一其編碼前33個(gè)氨基酸的信號(hào)序列(Rosahl等人，分子普通遺傳學(xué)(Mol Gen.Genet.)203(1986)，214-220)或Oshima等人(核酸研究18(1990)，181)所述的信號(hào)序列。
Seq.ID No.1所示的核酸序列編碼一種胞外交替蔗糖酶。包含Seq.ID No.2的大約前39個(gè)N端氨基酸殘基的信號(hào)序列確保了分泌。
轉(zhuǎn)基因植物原則上可以是任何植物種的植物，也就是說(shuō)，它們可以是單子葉和雙子葉植物。優(yōu)選地，這些植物是為營(yíng)養(yǎng)或?yàn)榧夹g(shù)目的特別是為工業(yè)目的人工培育的有益植物。它們優(yōu)選地是貯淀粉植物，如谷類(lèi)種(黑麥、大麥、燕麥、小麥、粟、西米等)、稻、豌豆、皺粒豌豆、木薯和馬鈴薯；番茄、蕓苔、大豆、大麻、亞麻、向日葵、豇豆或竹芋，成纖維植物(例如亞麻、大麻、棉花)，貯油植物(例如蕓苔、向日葵、大豆)和貯蛋白質(zhì)植物(例如豆莢科植物、谷類(lèi)、大豆)。本發(fā)明也涉及果樹(shù)和棕櫚。此外，本發(fā)明也涉及飼料植物(例如草料和牧草，如苜蓿、三葉草、黑麥草)和蔬菜類(lèi)植物(如番茄、萵苣、菊苣)和觀賞植物(如郁金香、風(fēng)信子)。優(yōu)選貯糖和/或貯淀粉植物。特別優(yōu)選甘蔗和甜菜和馬鈴薯植物、玉米、稻、小麥和番茄植物。
本發(fā)明的另一主題是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的方法，與未轉(zhuǎn)化的野生型細(xì)胞/未轉(zhuǎn)化的野生型植物相比，它們可合成交替糖。在該方法中，本發(fā)明的核酸分子所編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或活性與不顯示任何交替蔗糖酶表達(dá)和/或活性的相應(yīng)野生型細(xì)胞/野生型植物相比提高。特別是，這種方法包括根據(jù)本發(fā)明的核酸分子在植物細(xì)胞中的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選地與一種確保在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子連接。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括向植物細(xì)胞中導(dǎo)入根據(jù)本發(fā)明的核酸分子并由該細(xì)胞再生植物。
這種表達(dá)的提高例如可通過(guò)Northern印跡分析來(lái)檢測(cè)?；钚缘奶岣呖赏ㄟ^(guò)檢測(cè)來(lái)源于植物細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物的交替蔗糖酶活性來(lái)檢測(cè)。交替蔗糖酶的酶活性例如能如Lopez-Munguia等人(紐約科學(xué)院年報(bào)613，(1990)，717-722)所述或如本申請(qǐng)書(shū)的實(shí)施例所述測(cè)定。
本發(fā)明也涉及本發(fā)明的植物的繁殖材料。術(shù)語(yǔ)“繁殖材料”包括適于無(wú)性或有性產(chǎn)生后代的植物部分。合適的無(wú)性繁殖材料是例如插條、愈傷組織培養(yǎng)物、根莖或塊莖。其他繁殖材料包括例如果實(shí)、種子、秧苗、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物等。優(yōu)選的繁殖材料是塊莖和種子。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的植物的可收獲部分如果實(shí)、種子、塊莖或根狀莖。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及制備交替糖的方法，其包括從本發(fā)明的植物中提取并分離交替糖的步驟。
從本發(fā)明的植物中提取并分離交替糖可用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如沉淀、提取和層析法。
此外本發(fā)明也涉及可從本發(fā)明的植物或從本發(fā)明的繁殖材料獲得的交替糖。
此外本發(fā)明也涉及一種制備交替糖和/或果糖的方法，其中本發(fā)明的宿主細(xì)胞向含蔗糖培養(yǎng)基中分泌交替蔗糖酶，并從該培養(yǎng)基中分離交替糖和/或果糖。
本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用一種重組產(chǎn)生的、由宿主細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌的交替蔗糖酶，從而避免了必須破碎細(xì)胞才能純化蛋白質(zhì)，因?yàn)榉置诘牡鞍踪|(zhì)能從上清液中獲得。培養(yǎng)基的殘余成分能用加工技術(shù)中常用的方法除去，如透析、反向滲透、層析法等。這些方法也適用于濃縮分泌至培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)。微生物分泌蛋白質(zhì)通常由N端信號(hào)肽(信號(hào)序列、前導(dǎo)肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽)介導(dǎo)。具有該信號(hào)序列的蛋白質(zhì)能穿透微生物的細(xì)胞膜。蛋白質(zhì)的分泌能通過(guò)向編碼交替蔗糖酶的相應(yīng)區(qū)域中添加編碼該信號(hào)肽的DNA序列而實(shí)現(xiàn)。
所表達(dá)的交替蔗糖酶的天然信號(hào)肽是優(yōu)選的，來(lái)源于腸膜明串珠菌NRRL B 1355的交替蔗糖酶的信號(hào)肽(見(jiàn)Seq.ID No.2的大約前25-45個(gè)N端氨基酸殘基)是特別優(yōu)選的。
來(lái)源于產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M5A1的α-CGTase的信號(hào)肽(Fiedler等人，分子生物學(xué)雜志256(1996)，279-291)或GenBank保藏號(hào)X86014的序列的核苷酸11529-11618所編碼的信號(hào)肽是最優(yōu)選的。
交替糖和/或果糖的制備既不需要活化的葡萄糖衍生物也不需要輔因子，而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的大多數(shù)多糖合成反應(yīng)中這是必要的。因此，分泌交替蔗糖酶的微生物能在含蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所分泌的交替蔗糖酶引起交替糖和果糖在培養(yǎng)基中的合成。
與來(lái)源于可天然分泌交替蔗糖酶的腸膜明串珠菌的宿主細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明使用的宿主細(xì)胞具有如下優(yōu)點(diǎn)，它們不分泌具有不利的多糖合成副反應(yīng)的蛋白質(zhì)，如葡聚糖蔗糖酶，結(jié)果是在宿主細(xì)胞外，除交替糖之外，不能形成其他的多糖，這些多糖通常只能通過(guò)高成本且耗時(shí)的方法才能與交替糖分離。此外，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案的宿主細(xì)胞沒(méi)有任何不利的多糖降解副活性，否則可導(dǎo)致產(chǎn)生的交替糖產(chǎn)量降低。
本發(fā)明的方法除交替糖之外產(chǎn)生果糖。果糖能用于便宜地分離所謂的“富含果糖糖漿”(HFCS)。制備果糖的常規(guī)方法一方面用于利用轉(zhuǎn)化酶酶促分解蔗糖，或用于將淀粉分解為葡萄糖單元—主要是通過(guò)酸水解完成，及隨后用葡萄糖異構(gòu)酶將葡萄糖酶促轉(zhuǎn)化為果糖。然而，這兩種方法都產(chǎn)生葡萄糖和果糖的混合物。這兩種成分隨后必須通過(guò)層析法彼此分離。
本發(fā)明的方法的兩種反應(yīng)產(chǎn)物的分離，或底物蔗糖的反應(yīng)產(chǎn)物的分離，例如能利用允許果糖透過(guò)而不允許蔗糖和/或交替糖透過(guò)的膜來(lái)實(shí)現(xiàn)。如果準(zhǔn)備用這種膜連續(xù)除去果糖，則發(fā)生更多或更少的蔗糖完全轉(zhuǎn)化。
交替糖與果糖的分離能用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行或能如工作實(shí)施例所述進(jìn)行。
根據(jù)該方法的一個(gè)實(shí)施方案，宿主細(xì)胞來(lái)源于微生物，優(yōu)選地來(lái)源于大腸桿菌。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的方法使用真菌宿主細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞，如釀酒酵母(Aaccharomyces cerevisiae)。在含蔗糖培養(yǎng)基中產(chǎn)生交替糖的酵母細(xì)胞由于交替蔗糖酶的酶活性而不易使用，因?yàn)榻湍阜置谝环N可分解胞外蔗糖的轉(zhuǎn)化酶。酵母通過(guò)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收產(chǎn)生的己糖。然而，已描述了一種酵母株(Riesmeier等人，EMBO J.11(1992)，4705-4713)，其含有一種缺陷的sec2基因，因此不能分泌轉(zhuǎn)化酶。此外，這些酵母細(xì)胞不含能將蔗糖輸入細(xì)胞中的輸送系統(tǒng)。如果利用本發(fā)明的核酸分子修飾這種菌株使其可向培養(yǎng)基中分泌交替蔗糖酶，則將在含蔗糖培養(yǎng)基中合成果糖和交替糖。產(chǎn)生的果糖隨后能被酵母細(xì)胞吸收。
在該方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為固定形式。
通常，宿主細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞內(nèi)含固定于合適的材料中，如藻酸鹽、聚丙烯酰胺、明膠、纖維素或脫乙酰殼多糖。然而，細(xì)胞與載體材料的吸附或共價(jià)結(jié)合也是可能的(Brodelius和Mosbach，酶學(xué)方法，135(1987)，222-230)。細(xì)胞固定的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它允許達(dá)到比液體培養(yǎng)大大提高的細(xì)胞密度。這導(dǎo)致更高的產(chǎn)率。而且，培養(yǎng)的攪拌和通風(fēng)成本降低，保持無(wú)菌的方法的成本也降低。另一重要方面是連續(xù)生產(chǎn)交替糖的可能性，從而避免或者至少大大減少了發(fā)酵過(guò)程中定期發(fā)生的非生產(chǎn)階段。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及一種生產(chǎn)交替糖和/或果糖的方法，其中a)使含蔗糖溶液與本發(fā)明的蛋白質(zhì)在可使蔗糖轉(zhuǎn)化為交替糖和/或果糖的條件下接觸；和b)從該溶液中分離交替糖和/或果糖。
在該實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種利用無(wú)細(xì)胞酶制劑體外制備交替糖和/或果糖的方法。在此情況中，在允許形成交替蔗糖酶蛋白質(zhì)的無(wú)蔗糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)例如可分泌交替蔗糖酶的微生物至穩(wěn)定期。離心培養(yǎng)基除去細(xì)胞后，能從上清液中回收分泌的酶。隨后將該酶加入含蔗糖溶液中以合成交替糖和/或果糖。與上述在含細(xì)胞系統(tǒng)中合成交替糖相比，該方法具有反應(yīng)條件易于控制、反應(yīng)產(chǎn)物基本較純且易于純化的優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)的純化能如上所述進(jìn)行。
本發(fā)明的方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用一種純化的交替蔗糖酶。純化的交替蔗糖酶是指基本上不含合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞的細(xì)胞成分的酶，并且無(wú)具有多糖合成活性(如葡聚糖蔗糖酶)或降解活性的蛋白質(zhì)污染，和/或無(wú)(多糖)接納體污染。術(shù)語(yǔ)“純化的交替蔗糖酶”優(yōu)選地指具有至少70％、優(yōu)選地至少85％、特別優(yōu)選地至少95％純度的交替蔗糖酶。
純化蛋白質(zhì)在制備交替糖和/或果糖中的應(yīng)用具有許多優(yōu)點(diǎn)。與使用部分純化的蛋白質(zhì)提取物的方法相比，本發(fā)明的方法的反應(yīng)培養(yǎng)基不含生產(chǎn)菌株(微生物)的任何殘余，其可用于蛋白質(zhì)的純化或通過(guò)遺傳工程制備。
此外，純化蛋白質(zhì)的應(yīng)用在食品及藥品工業(yè)用途上有利。由于反應(yīng)培養(yǎng)基組成確定且不含任何不需要的成分，所以產(chǎn)品同樣在成分上更加精確確定。因此，通過(guò)遺傳工程生產(chǎn)的這些產(chǎn)品獲得食品和藥品工業(yè)批準(zhǔn)的方法需要相當(dāng)少的證明，特別是因?yàn)檫@些產(chǎn)品不應(yīng)顯示任何痕量的轉(zhuǎn)基因微生物。
此外，與迄今描述的使用部分純化的交替蔗糖酶制劑在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的體外方法相反，使用純化交替蔗糖酶的本發(fā)明的方法具有可制備高純度交替糖而不發(fā)生葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖污染的優(yōu)點(diǎn)，這是因?yàn)楸景l(fā)明的蛋白質(zhì)有高純度。此外，本發(fā)明的方法可高產(chǎn)量地生產(chǎn)交替糖，而沒(méi)有例如由葡聚糖蔗糖酶的不利副反應(yīng)引起的損失，這種副反應(yīng)將使部分底物蔗糖轉(zhuǎn)化為不希望的葡聚糖，葡聚糖與交替糖的分離只能用耗時(shí)且昂貴的方法實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的方法除交替糖之外還產(chǎn)生果糖。果糖能用于便宜地回收所謂的“富含果糖糖漿”(HFCS)。由于使用純化的交替蔗糖酶，本發(fā)明的方法能產(chǎn)生高純度的產(chǎn)物。因此，與由玉米淀粉制備HFCS的常規(guī)方法相比-其包括經(jīng)離子交換除去緩沖鹽的高成本步驟(Crabb和Mitchinson，TIBTECH 15(1997)，349-352)，本發(fā)明的方法不需要昂貴的果糖純化。
本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案使用一種重組產(chǎn)生的交替蔗糖酶。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，具有交替蔗糖酶酶活性的酶固定于一種載體材料上。
交替蔗糖酶的固定具有如下優(yōu)點(diǎn)是合成反應(yīng)催化劑的酶易于從反應(yīng)混合物中回收，并能重新利用數(shù)次。由于酶的純化通常是昂貴且耗時(shí)的，故酶的固定和再利用可大大節(jié)約成本。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)物不含任何殘余蛋白質(zhì)的純度。
有多種載體材料可用于蛋白質(zhì)的固定，與載體材料的偶聯(lián)可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵進(jìn)行(綜述見(jiàn)《酶學(xué)方法》135，136，137)。廣泛應(yīng)用的載體材料包括例如瓊脂糖、藻酸鹽、纖維素、聚丙烯酰胺、硅石或尼龍。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，(固定于載體材料上的)交替蔗糖酶存在于兩層膜之間，其一允許果糖透過(guò)而不允許蔗糖和交替糖透過(guò)，另一個(gè)允許蔗糖而不允許交替糖透過(guò)。底物的供應(yīng)通過(guò)允許蔗糖透過(guò)的膜進(jìn)行。合成的交替糖保留于兩層膜之間的空隙中，釋放的果糖能通過(guò)只允許果糖透過(guò)的膜從反應(yīng)平衡中連續(xù)去除。這種排列可有效分離反應(yīng)產(chǎn)物，從而產(chǎn)生純果糖。
此外，也描述了通過(guò)離子交換層析對(duì)果糖的分離(《淀粉水解產(chǎn)物，世界性的技術(shù)、生產(chǎn)及用途》(Starch Hydrolysis Products，WorldwideTechnology，Production，and Application)，F(xiàn). W.Schenck，R.E.Hebeda編，(1992)，VCH Publishers，Inc.，紐約)。
因此，交替蔗糖酶在制備純果糖中的用途一方面具有能使用相對(duì)便宜的底物蔗糖作為原材料的優(yōu)點(diǎn)，另一方面又能從反應(yīng)混合物中容易地分離果糖而不需其他的酶促轉(zhuǎn)化或?qū)游龇椒ā?br> 此外，本發(fā)明還涉及制備交替糖和/或果糖的方法，其中a)使含蔗糖溶液與本發(fā)明的蛋白質(zhì)和接納體分子在可使蔗糖轉(zhuǎn)化為交替糖和/或果糖的條件下接觸；和b)從該溶液中分離交替糖和/或果糖。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，接納體分子是指交替蔗糖酶能催化其鏈延伸反應(yīng)的分子。在反應(yīng)開(kāi)始時(shí)能加入反應(yīng)混合物中的接納體優(yōu)選地是碳水化合物或碳水化合物衍生物。外部接納體的應(yīng)用導(dǎo)致產(chǎn)生在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中稱(chēng)為交替糖的低分子產(chǎn)物。碳水化合物接納體優(yōu)選地是寡糖或多糖，特別是支鏈多糖，如糊精、糖原或支鏈淀粉，優(yōu)選地是線性多糖，特別優(yōu)選地是選自的麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖的糖類(lèi)。如果在這些接納體處發(fā)生交替糖鏈的延伸，則形成具有比離析物更高的分子量的產(chǎn)物。當(dāng)使用麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖時(shí)，人們獲得比能在無(wú)外來(lái)糖接納體時(shí)制備的交替糖有更低分子量的產(chǎn)物。
制備的寡聚交替糖的分子量大小取決于所使用的蔗糖/接納體比。例如，產(chǎn)物的聚合程度隨蔗糖/異麥芽糖比值的提高而提高。
此外，蔗糖/接納體比值可影響寡聚交替糖產(chǎn)量。例如，寡聚交替糖產(chǎn)量隨蔗糖/異麥芽糖比值的提高而提高。
迄今描述的利用作者聲稱(chēng)已純化的交替蔗糖酶生產(chǎn)寡聚交替糖的方法(Pelenc等人，Sciences Des Aliments 11(1991)，465-476)在糖接納體麥芽糖的存在下只能產(chǎn)生寡聚交替糖和寡葡聚糖的產(chǎn)物混合物。在此情況中，寡葡聚糖的合成可能是由于交替蔗糖酶制劑的葡聚糖蔗糖酶污染。與該方法相比，本發(fā)明的方法具有利用重組產(chǎn)生的不含任何葡聚糖蔗糖酶污染物的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)能生產(chǎn)寡聚交替糖而不同時(shí)形成寡葡聚糖的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的方法能生產(chǎn)寡聚交替糖，而不需要其他高成本的分離寡葡聚糖的純化步驟。
根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，具有交替蔗糖酶酶活性的酶固定于一種載體材料上。
根據(jù)本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，使用重組產(chǎn)生的交替蔗糖酶。
此外，本發(fā)明還涉及含有交替糖的終產(chǎn)品。在該方面，終產(chǎn)品被認(rèn)為是指化妝品，優(yōu)選地食品、飼料，特別優(yōu)選地是藥品。
最后，本發(fā)明涉及一種制備上述產(chǎn)物的方法，其包括本發(fā)明的上述交替糖生產(chǎn)方法之一，和這樣獲得的交替糖的配制，其形式適于相應(yīng)產(chǎn)品的上述用途之一。
公開(kāi)了這些和其他實(shí)施方案，其對(duì)于技術(shù)人員是顯然的，且包括于本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例中。能按本發(fā)明含義使用的關(guān)于上述方法、工具和用途之一的其他文獻(xiàn)能從本領(lǐng)域中獲得，例如利用電子裝置從公開(kāi)圖書(shū)館獲得。該目的尤其能用公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)如“medline”達(dá)到，其可通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)例如從http//www.ncbi.nlm.gov/PrbMed/medline.html網(wǎng)址獲得。其他數(shù)據(jù)庫(kù)和地址為技術(shù)人員所知，并能從互聯(lián)網(wǎng)例如從網(wǎng)址http//www.lycos.com獲得。關(guān)于生物技術(shù)專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的來(lái)源和信息的綜述見(jiàn)Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364。
附圖描述


圖1用克隆AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba的相應(yīng)重疊片段篩查腸膜明串珠菌NRRL B 1355基因組文庫(kù)后克隆的完整序列區(qū)的線性圖譜。
圖2質(zhì)粒圖譜pAlsu-pSK。
圖3HPLC層析譜在麥芽糖存在下寡聚交替糖的制備(實(shí)施例2)。
圖4質(zhì)粒圖譜pAlsu-pET24a圖5SDS PAGE，及隨后蔗糖酶活性的測(cè)定(參見(jiàn)實(shí)施例6)使用下列蛋白質(zhì)提取物1＋2)含有pAlsu-pET24a-3的大腸桿菌BL21(DE3)3＋4)含有pAlsu-pET24a-7的大腸桿菌BL21(DE3)5＋6)含有pAlsu-pET24a-21的大腸桿菌BL21(DE3)7＋8)含有pET24a的大腸桿菌BL21(DE3)1，3，5，7) IPTG誘導(dǎo)之前的培養(yǎng)物2，4，6，8) 培養(yǎng)末期的培養(yǎng)物圖6葡聚糖T10的HPLC層析譜。
圖7葡聚糖酶消化后葡聚糖T10的HPLC層析譜。
圖8
寡聚交替糖的HPLC層析譜。
圖9葡聚糖酶消化后寡聚交替糖的HPLC層析譜。
圖10包含質(zhì)粒pBinAR-N的多接頭的表達(dá)盒的圖譜。
圖11質(zhì)粒圖譜pat-Alsu-Hyg。
圖12質(zhì)粒圖譜fnr-Alsu-Hyg。
實(shí)施例實(shí)施例中使用的載體1.pBinAR-N利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))，我們將35S啟動(dòng)子與OCS-終止子之間的不同多接頭(參見(jiàn)
圖10)導(dǎo)入質(zhì)粒pBinAR中(Hfgen和Willmitzer，植物科學(xué)(Plant Science)66(1990)，221-230)。得到的質(zhì)粒被稱(chēng)為pBinAR-N。
2.pBinAR-Hyg-N通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))我們分離含有35S啟動(dòng)子、多接頭和OCS-終止子的pBinAR-N的EcoRI/HinDIII-片段。然后將該片段連接于質(zhì)粒pBIB-Hyg的相同限制位點(diǎn)(Becker，核酸研究18(1990)，203)。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pBinAR-Hyg-N。
3.pBinAR-pat-Hyg使用寡核苷酸Sp-pat-5′和Sp-pat-3′(SEQ ID Nos.48和SEQ ID No.49)，用質(zhì)粒pgT5(Rosahl等人，分子普通遺傳學(xué)203(1986)，214-220；Sonnewald等人，植物雜志1(1991)，95-106)作為模板，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增了編碼馬鈴薯patatin蛋白前導(dǎo)肽的DNA分子(參見(jiàn)SEQ ID No.50，其不同于Sonnewald等人，植物雜志1(1991)，95-106所用的序列)。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物用限制酶XbaI和SalI酶切，然后連接于事先用限制酶SpeI和SalI線性化的質(zhì)粒pBinAR-Hyg-N中。產(chǎn)生的質(zhì)粒被稱(chēng)為pBinAR-pat-Hyg。
PCR條件緩沖液和聚合酶來(lái)自于Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶號(hào)1644947)DNA 0，2ng10x緩沖液＋MgSO45μldNTPs(每種10 mM) 1μl引物Sp-pat-5′ 120nM引物Sp-pat-3′ 120nMPwo聚合酶1，0單位蒸餾水 加至50μl反應(yīng)條件步驟195℃230分鐘步驟295℃030分鐘步驟364℃030分鐘步驟472℃030分鐘(每次循環(huán)加1秒鐘)步驟572℃500分鐘步驟2-4以循環(huán)方式重復(fù)35次。
4.pBinAR-FNR-Hyg利用寡核苷酸Sp-fnr-5′和Sp-fnr-3(參見(jiàn)SEQ ID No.51和52)，我們使用質(zhì)粒p6SocFNR-15(Jansen等人，現(xiàn)代遺傳學(xué)(Current Genetics)13，(1988)，517-522)作為模板，通過(guò)PCR法擴(kuò)增了編碼菠菜FNR蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)肽的DNA分子。得到的PCR產(chǎn)物用XbaI和SalI酶切，然后克隆到SpeI/SalI-切開(kāi)的pBinAR-Hyg-N中。產(chǎn)生的質(zhì)粒稱(chēng)為pBinAR-fnr-Hyg。
PCR條件緩沖液和聚合酶來(lái)自Gibco BRL(鉑Taq DNA聚合酶高保真號(hào)1304-011)DNA 0，2ng10x緩沖液 5μlMgSO4 2，0μldNTPs(每種10mM) 1μl引物Sp-fnr-5′150nM引物Sp-fnr-3′150nMTaq鉑高保真聚合酶 1，5單位蒸餾水加至50μl反應(yīng)條件步驟1 95℃230分鐘步驟2 95℃030分鐘步驟3 58℃030分鐘步驟4 68℃020分鐘(每循環(huán)加1秒)步驟5 68℃300分鐘步驟2-4以循環(huán)方式重復(fù)35次。實(shí)施例1來(lái)源于腸膜明串珠菌NRRL-B1355的交替蔗糖酶的克隆交替蔗糖酶的分離及測(cè)序腸膜明串珠菌NRRL-B1355菌株在添加有5％蔗糖的1升乳酸菌MRS培養(yǎng)液(Difco)中28℃培養(yǎng)2天。以20,000xg離心培養(yǎng)物30分鐘后，上清液與等體積的10％三氯乙酸混合，并在4℃下攪拌16小時(shí)。然后以10,000xg離心該溶液30分鐘。將這樣獲得的沉淀物溶解于4.5ml40mM Tris-HCl，pH8.8中，隨后用(約0.5ml)2M Tris堿中和。該蛋白質(zhì)溶液交給公司Toplab Gesellschaft für angewandte BiotechnologiembH，Martinsried，德國(guó)，進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)序。在該公司，在SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離該蛋白質(zhì)溶液，凝膠用考馬斯藍(lán)染色，隨后用10％乙酸除去染色。為了蛋白質(zhì)的酶促消化，從凝膠上切下蛋白質(zhì)條帶，加壓通過(guò)篩子破碎(孔30μm×100μm)。然后用半濃縮的溫育緩沖液(12.5mM Tris，0.5mM EDTA pH8.5)洗滌破碎的凝膠2分鐘。隨后離心，除去緩沖液，凝膠在“Speedvac”中干燥1小時(shí)(約5％殘余水份，橡膠樣)。隨后制備內(nèi)切蛋白酶LysC在400μl 12.5mM Tris/HCl，pH8.5(酶∶蛋白質(zhì)＝1∶10)和0.1％月桂基麥芽糖苷(laurylmaltosite)中的溶液。向樣品中加入200μl該溶液，并在加熱塊搖床中37℃溫育過(guò)夜。為了洗脫肽片段，與1％TFA進(jìn)行1小時(shí)溫育兩次，隨后離心，之后用10％甲酸、20％異丙醇、60％乙腈洗脫3小時(shí)。通過(guò)HPLC(Superspher 60 RPselect B柱(Merck，Darmstadt)2mm×125mm；緩沖液A 0.1％三氟乙酸，緩沖液B0.085％TFA乙腈溶液；流速0.2ml/min；梯度5-60％60分鐘；206nm檢測(cè))使獲得的肽片段彼此分離。然后用Procise492自動(dòng)測(cè)序儀(Applied Biosystems，PE)測(cè)序獲得的肽片段；方法為根據(jù)Hunkapiller(Hunkapiller等人，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)91(1983)，399-413)改進(jìn)的分步Edman降解。
鑒定了6種不同的肽序列(參見(jiàn)Seq.ID No.5-9，Seq.ID No.21)，它們被命名為lysC-66、lysC-67、lysC-82、lysC-83、lysC-88和“N-端”。腸膜明串珠菌NRRL B1355的基因組DNA文庫(kù)的制備腸膜明串珠菌NRRL-B1355(購(gòu)自ATCC)在另外含有2％(w/v)葡萄糖和50mM磷酸鈉緩沖液pH7.0的100ml YT培養(yǎng)基(Sambrook等人，同上)中28℃培養(yǎng)36小時(shí)。離心收集細(xì)胞后，根據(jù)Ausubel等人(《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，Greene and John Wiley & Sons(1994)，USA)分離基因組DNA。
100μg腸膜明串珠菌NRRL-B1355基因組DNA用0.001單位限制酶Sau3A部分消化30分鐘，隨后用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提并用乙醇沉淀。在廠商指定條件下(Stratagene，pBK噬菌粒載體使用說(shuō)明書(shū)及T4DNA連接酶連接試劑盒)用T4 DNA連接酶將從腸膜明串珠菌NRRL-B1355獲得的2.5μg部分消化的DNA與1μg BamHI-酶切并去磷酸化的載體pBKCMVBamHI(Stratagene)連接。2μl連接混合液按照使用說(shuō)明書(shū)用Gigapack III Gold(Stratagene)包裝，并在測(cè)定噬菌體含量后貯存。用于分離交替蔗糖酶基因的探針的制備從胰蛋白酶消化純化的交替蔗糖酶蛋白質(zhì)(見(jiàn)上)后獲得的肽序列l(wèi)ysC-66(Seq.ID No.5)、lysC-67(Seq.ID No.6)、lysC-82(Seq.ID No.7)、lysC-83(Seq.ID No.8)和lysC-88(Seq.ID No.9)中，選擇經(jīng)歷反向翻譯后的肽lysC-82和lysC-83用于合成簡(jiǎn)并寡核苷酸(Seq.ID No.10，Seq.ID No.11)。該寡核苷酸用作對(duì)NRRL-B1355基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)的引物。表示為N的寡核苷酸內(nèi)的所有位點(diǎn)在引物合成中均替換為肌苷。
PCR反應(yīng)條件用Taq聚合酶(GibcoBRL公司)緩沖液制備反應(yīng)混合液。
反應(yīng)混合液Taq聚合酶(Gibco)DNA 100 ng(基因組NRRL-B1355)DNTPs 2.5 mM每種核苷酸引物 10 μl溶液含0.2μMol10倍緩沖液5μl氯化鎂2mM聚合酶1單位水 加至 50μl步驟1 95℃ 3’步驟2 95℃ 1’步驟3 58℃ 2’步驟4 72℃ 2’步驟5 72℃ 10’步驟2-4重復(fù)40次。
將該P(yáng)CR反應(yīng)產(chǎn)生的837bp片段(Seq.ID No.12)—其末端用T4DNA聚合酶制成平端—克隆到Smal-酶切的pBlueSkript載體(Stratagene)中。產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為pAlsu-PCR-lysc82/83。插入片段測(cè)序及計(jì)算機(jī)輔助翻譯為相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列后，用Swiss Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比較。比較顯示與已知的糖基轉(zhuǎn)移酶有同源性(P49331，P11001，P68987，P13470，P27470，P29336)。
用細(xì)菌株和廠商指明的營(yíng)養(yǎng)液(Stratagene)將腸膜明串珠菌NRRL-B1355基因組DNA文庫(kù)的約5,000個(gè)噬菌體涂板，37℃溫育12小時(shí)后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。隨后通過(guò)將硝酸纖維素膜浸入1.5m氯化鈉、0.5M苛性鈉溶液中2分鐘而變性噬菌體，并通過(guò)浸入1.5M氯化鈉、0.5MTris-HCl，pH8.0中5分鐘中和濾膜。用0.2M Tris-HCl、2xSSC漂洗濾膜后，噬菌體DNA通過(guò)UV交聯(lián)結(jié)合于膜上(Stratagene公司的Stratalinker，120,000μJ 30秒)。濾膜在預(yù)雜交液中(5xSSC，0.5％ BSA，5xDenhardt，1％SDS，40mM磷酸鈉緩沖液，pH7.2，100mg/l鯡精DNA，25％甲酰胺)42℃溫育6小時(shí)。30ng由質(zhì)粒pAlsu-PCR-lysc82/83分離的插入片段用多引物試劑盒(Boehringer Mannheim)用α-32P dCTP(ICN Biomedicals)放射性標(biāo)記。該放射性探針加入預(yù)雜交混合液中，濾膜在該預(yù)雜交混合液中42℃過(guò)夜。移除雜交混合液后，用洗滌溶液(0.1xSSC，0.5％SDS)在55℃下洗濾膜3次，15分鐘。然后將X光片(Kodak)置于濾膜上18小時(shí)。鑒定、分離產(chǎn)生雜交信號(hào)的噬菌體集落，重懸浮于SM培養(yǎng)基中，然后再次分散涂板使其能作為單個(gè)噬斑識(shí)別。將這些噬菌體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜并在上述條件下進(jìn)一步處理并雜交后，利用放射性基因探針獲得雜交的噬菌體作為單個(gè)分離株。按照使用說(shuō)明書(shū)(Stratagene)體外切割分離的噬菌體后，克隆AS-19B1和AS-19B2能作為質(zhì)粒分離。對(duì)這兩個(gè)克隆(Agowa)(Seq.ID No.13，Seq..ID No.14)完全測(cè)序后，兩序列均顯示1008bp的重疊。Seq.ID No.13與Seq.No.14的連接及隨后所有可能的閱讀框的計(jì)算機(jī)輔助翻譯使得能鑒定從起始密碼子ATG(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的堿基678-680)開(kāi)始的連續(xù)閱讀框。由于在該閱讀框中未發(fā)現(xiàn)終止密碼子，故分離其他克隆以獲得交替蔗糖酶的完整編碼序列。
因此，如上所述，利用用多引物試劑盒(Boehringer Mannheim)放射性標(biāo)記的克隆AS-19B2片段再次檢測(cè)腸膜明串珠菌NRRL-B1355基因組DNA文庫(kù)的約5,000個(gè)噬菌體的雜交。雜交探針用來(lái)源于AS-19B2的HindIII(AS-19B2插入片段中的限制位點(diǎn))/SalI(在多接頭中酶切pBKCMV噬粒載體)-片段制備。該片段含有編碼上述閱讀框的序列3’端的372個(gè)堿基。噬菌體文庫(kù)的篩選、挑選和噬菌體對(duì)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化在上述條件下進(jìn)行。對(duì)這樣分離的克隆AS-28B(見(jiàn)Seq.ID No.15)和AS-29Ba(Seq.ID No.16)進(jìn)行完全序列分析后，能鑒定克隆AS-19B2(Seq.ID No.14)與AS-28B之間960個(gè)相同堿基(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的堿基4863-5823)的重疊和克隆AS-19B2與AS-29Ba(Seq.ID No.16)之間的567個(gè)相同堿基(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的堿基5256-5823)的重疊?？寺S-28B和AS-29Ba有1523個(gè)相同的堿基(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的堿基5256-6779)。計(jì)算機(jī)輔助連接克隆AS-19B1、AS-19-B2和AS-28B后，出現(xiàn)從起始密碼子ATG(完整序列中的堿基678-680)開(kāi)始的連續(xù)閱讀框。該閱讀框也不含終止密碼子。待連接克隆AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba后，能鑒定從密碼子“ATG”(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的堿基678-680)開(kāi)始、終止于“TAA”(對(duì)應(yīng)于Seq.ID No.1的破基6849-6851)的閱讀框，其編碼2057個(gè)氨基酸。除了編碼區(qū)之外，完整分離和鑒定的組成克隆的DNA序列(Seq.ID Nos.13-16)含有5’區(qū)中的677個(gè)堿基和3’區(qū)中的2469個(gè)堿基，其代表不編碼交替蔗糖酶的序列(見(jiàn)
圖1)。實(shí)施例2質(zhì)粒pAlsu-pSK的構(gòu)建，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌和檢測(cè)蛋白質(zhì)提取物的酶活性質(zhì)粒AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba以下列方法連接(見(jiàn)實(shí)施例1)將克隆AS-19B1的Notl-(載體pBK CMV多接頭中的限制位點(diǎn)，Novagen公司)/Clal-片段插入載體pBluescript SK(Stratagene公司)的相同限制位點(diǎn)中(＝前一克隆步驟)。向由第一個(gè)克隆步驟所獲得的克隆中連續(xù)插入來(lái)自AS-19B2的Clal/Xhol片段、來(lái)自AS-28B的Xhol/Mlul片段和AS-28B的Mlul/BsaBl(克隆到載體的平端Apal限制位點(diǎn)中的BsaBl-酶切片段)片段，產(chǎn)生質(zhì)粒pAlsu-pSK(見(jiàn)圖2)。該質(zhì)粒含有來(lái)源于腸膜明串珠菌NRRL-B1355的交替蔗糖酶的完整編碼序列及5’區(qū)中的677bp非編碼序列(啟動(dòng)區(qū))和3’區(qū)中的539bp(Seq.ID No.17)。
然后用質(zhì)粒pAlsu-pSK轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α，F(xiàn)ermentas公司)。該細(xì)菌在50ml“Terrific培養(yǎng)液”(其組成如Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY所述(補(bǔ)充了0.5％葡萄糖))或發(fā)酵培養(yǎng)基中27℃培養(yǎng)兩天，該發(fā)酵培養(yǎng)基具有下列組成KH2PO41.5g/l，(NH4)2SO45.0g/l，NaCl 0.5g/l，檸檬酸鈉1.0g/l，F(xiàn)e2＋SO4x7H2O，0.075g/l，酵母提取物0.5g/l，胰蛋白胨1.0g/l，葡萄糖15.0g/l，MgSO4x7，H2O 0.3g/l，CaCl2x2H2O 0.014g/l，礦物鹽10ml/l，H3BO32.5g/l，CoCl2x6H2O 0.7g/l，CuSO4x5H2O 0.25g/l，MnCl2x4H2O，1.6g/l，ZnSO4x7H2O 0.3g/l，Na2MoO4x2H2O 0.15g/l，維生素B1(硫胺素)0.005g/l。
所有培養(yǎng)物均含有100mg/l氨芐青霉素。然后離心收集細(xì)胞，重懸浮于2ml 50mM磷酸鈉緩沖液pH7.2中，用弗氏壓碎器破碎。隨后，再次離心去除破碎細(xì)胞的固體顆粒，過(guò)濾除菌(Sterivex GV 0.2μm，微孔)后用上清液(下文稱(chēng)為(蛋白質(zhì))提取物)做進(jìn)一步分析。交替糖利用蛋白質(zhì)提取物的體外制備為體外制備交替糖，在2ml 100mM檸檬酸鈉緩沖液pH6.5和20％(w/v)蔗糖中檢測(cè)200μl獲得的每種提取物在100μl 10mM麥芽糖存在與否時(shí)的活性。反應(yīng)混合液在37℃下溫育24小時(shí)。隨后在無(wú)麥芽糖時(shí)用等體積乙醇沉淀后，未發(fā)現(xiàn)沉淀性聚合物。在含有麥芽糖的批次中，HPLC層析(Dionex PA-100柱，工作緩沖液150mM NaOH，洗脫緩沖液150mM NaOH＋3M乙酸鈉緩沖液梯度)顯示寡聚體的形成(見(jiàn)圖3)?；钚阅z將每種20ml蛋白質(zhì)提取物加于6％ SDS-PAA凝膠中，以每個(gè)凝膠20mA的電流強(qiáng)度分離。(加于凝膠之前，提取物不在95℃下溫育)。隨后，按照Miller和Robyt(分析生物化學(xué)156(1986)，357-363)的方法檢測(cè)提取物的蔗糖酶活性。
對(duì)照(葡聚糖蔗糖酶NRRL-B-512F，其制備參見(jiàn)實(shí)施例3)顯示聚合活性。上述含有質(zhì)粒pAlsu-pSK的大腸桿菌細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物不顯示任何聚合物形成活性。實(shí)施例3來(lái)源于腸膜明串珠菌NRRL-B512F的葡聚糖蔗糖酶的克隆及表達(dá)基因組DNA的分離腸膜明串珠菌NRRL-B512F(從ATCC獲得)在另外含有1％蔗糖和50mM磷酸鈉緩沖液pH7.0的YT培養(yǎng)基(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Press，New York)中28℃培養(yǎng)48小時(shí)。離心收集細(xì)胞后，根據(jù)Ausubel等人(《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》，第1卷，Greene and John Wiley & Sons(1994)，USA)分離基因組DNA。葡聚糖蔗糖酶基因的PCR擴(kuò)增和在pET24a中的克隆為了在大腸桿菌中重組表達(dá)葡聚糖蔗糖酶，在PCR擴(kuò)增之后將編碼葡聚糖蔗糖酶的基因克隆到表達(dá)載體pET24a(Novagen)中。為此，在編碼葡聚糖蔗糖酶的序列的5’端引入一個(gè)Eagl限制位點(diǎn)，在3’端引入一個(gè)Xhol限制位點(diǎn)，同時(shí)使用來(lái)源于WO 89/12386的序列的PCR引物(5’b512-15’-ACTgCggCCgCATgCCATTTACAgAAAAAg-3’；Seq.IDNo.3和3’b5125’-ACTgCTCgAgTTATgCTgACACAgCATTTC-3’；Seq.ID No.4)。隨后進(jìn)行向pET24a多接頭的相應(yīng)限制位點(diǎn)中的克隆。得到的質(zhì)粒被命名為UL5-20。
PCR反應(yīng)條件使用Gibco BRL公司的緩沖液和聚合酶。
DNA 100 ng(基因組NRRL-B512F)10倍緩沖液 5 μlMgCl2 4 mM5’引物50 ng3’引物50 ngdNTP1 mM每種核苷酸Pfu聚合酶 0.5 單位水加至50μl步驟195℃ 4分鐘步驟295℃ 1分鐘步驟355℃ 1分鐘步驟472℃ 5分鐘步驟572℃ 10分鐘步驟2-4重復(fù)40次。重組葡聚糖蔗糖酶的制備含有質(zhì)粒UL5-20的BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞在YT培養(yǎng)基(見(jiàn)上)中37℃培養(yǎng)，直到OD600＝0.8。隨后用0.2mM IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞，并在18℃下再培養(yǎng)24小時(shí)。離心收集細(xì)胞并重懸浮于磷酸鈉緩沖液，pH5.2中后，用弗氏壓碎器破碎細(xì)胞。所獲得的溶液經(jīng)離心不含不可溶成分，獲得含葡聚糖蔗糖酶、下文稱(chēng)為提取物的上清液。實(shí)施例4交替蔗糖酶編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增及在pET24a中的克隆用腸膜明串珠菌NRRL-B1355株的基因組DNA作為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)(見(jiàn)以下的反應(yīng)條件)擴(kuò)增交替蔗糖酶的編碼區(qū)。利用引物A1-4(Seq.ID No.18)在5’端引入一個(gè)Nhel限制位點(diǎn)，利用引物A1-5(Seq.ID No.19)在3’端引入一個(gè)Sall限制位點(diǎn)。分離出約6200bp的片段A1-4 5’-GGG CCC GCT AGC ATG AAA CAA CAA GAAACA GTA1-5 5’-CCC GGG GTC GAC CTT TGT CGA ATC CTT CCCPCR反應(yīng)條件(Gibco BRL公司的試劑盒)DNA 1μl10x緩沖液 5μl每種dNTP 10mM 2μl50mM MgSO42μl引物每種 1μl鉑DNA聚合酶 0.2μl蒸餾水37.8μl步驟1 95℃，2分鐘步驟2 95℃，20秒步驟3 47℃，20秒步驟4 68℃，7分鐘(每一循環(huán)延長(zhǎng)3秒)步驟5 68℃，15分鐘在進(jìn)行步驟5之前步驟2-4重復(fù)35次。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法純化獲得的PCR片段，用限制性?xún)?nèi)切核酸酶NheI和SalI處理，連接于同樣用這些酶酶切的載體pET24a(來(lái)自Novagen公司)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。制備質(zhì)粒并限制酶切消化后，篩選出3個(gè)陽(yáng)性克隆。它們分別被命名為pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21(見(jiàn)圖4)。均含有Seq.ID No.20所示的序列作為插入部分。實(shí)施例5重組交替蔗糖酶在搖瓶培養(yǎng)及發(fā)酵罐中在大腸桿菌中的表達(dá)搖瓶培養(yǎng)質(zhì)粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21和pET24a轉(zhuǎn)化Novagen公司的大腸桿菌BL21(DE3)，在3ml YT培養(yǎng)基(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中37℃初始培養(yǎng)3小時(shí)后，以2份重復(fù)在搖瓶中在含有0.2％葡萄糖代替右旋糖作為碳源的50ml Davis基本培養(yǎng)基(DIFCO手冊(cè)，《微生物用脫水培養(yǎng)基和試劑》，第10版，Detroit Michigan，USA(1984))中37℃培養(yǎng)，直到OD600達(dá)到約0.8。離心并重懸浮后，兩份重復(fù)培養(yǎng)液之一在含有1％乳糖作為碳源并含誘導(dǎo)劑的Davis基本培養(yǎng)基(DMA)中27℃再培養(yǎng)16小時(shí)。離心收集各培養(yǎng)液的細(xì)胞，重懸浮于50mM乙酸鈉緩沖液pH5.3中，如實(shí)施例2所述制備蛋白質(zhì)提取物。發(fā)酵罐在下列條件下在2升發(fā)酵罐(Biostad B；B.Braun，Melsungen)中培養(yǎng)克隆pAlsu-pET24a-21轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO41.5g/l，(NH4)2SO45.0g/l，NaCl 0.5g/l，檸檬酸鈉1.0g/l，F(xiàn)e2＋SO4x7H2O 0.075g/l，酵母提取物0.5g/l，胰蛋白胨1.0g/l，葡萄糖15.0g/l，MgSO4x7H2O 0.3g/l，CaCl2x2H2O 0.014g/l，礦物鹽10ml/l，H3BO32.5g/l，CoCl2x6H2O 0.7g/l，CuSO4x5H2O 0.25g/l，MnCl2x4H2O 1.6g/l，ZnSO4x7H2O 0.3g/l，Na2MoO4x2H2O 0.15g/l，維生素B1(硫胺素)0.005g/l。
碳源培養(yǎng)基中含有葡萄糖(1.5％(w/v))，加入70％(w/v)葡萄糖溶液。
用氨和磷酸自動(dòng)控制pH為pH7.0+/-0.1。通過(guò)用攪拌器控制調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pO2為20％濃度。
條件用50ml預(yù)培養(yǎng)物接種1.5升發(fā)酵培養(yǎng)基。
細(xì)胞首先在37℃下培養(yǎng)直到已有的葡萄糖耗光。然后在相同溫度下以9g葡萄糖xl-1xh-1的進(jìn)料速度培養(yǎng)，直到OD600＝40。此時(shí)，將培養(yǎng)液的溫度降低至20℃，添加葡萄糖的量降至2gxl-2xh-1。在培養(yǎng)溫度為20℃時(shí)，用0.2mM IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Sigma))誘導(dǎo)培養(yǎng)。在20℃下再培養(yǎng)18小時(shí)后，離心收集細(xì)胞，重懸浮于50mM磷酸鈉緩沖液pH5.3中，并如實(shí)施例2所述制備提取物。實(shí)施例6重組交替蔗糖酶活性、高碘酸氧化和根據(jù)Schiff染色的SDSPAGE分析由大腸桿菌搖瓶培養(yǎng)物(BL21菌株(DE3))制備分別含有質(zhì)粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21和pET24a(對(duì)照)的蛋白質(zhì)提取物。兩種不同提取物均由用不同提取物轉(zhuǎn)化的細(xì)胞制備，這些提取物之一在IPTG誘導(dǎo)前制備，另一種在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)在IPTG誘導(dǎo)后制備。這些搖瓶培養(yǎng)物的提取物(參見(jiàn)實(shí)施例5)的活性檢測(cè)包括，SDSPAGE分離蛋白質(zhì)，隨后用50mM乙酸鈉緩沖液pH5.3洗滌除去SDS，在50mM乙酸鈉pH5.3、5％(w/v)蔗糖中37℃溫育凝膠16小時(shí)，隨后高碘酸氧化形成的聚合物，并用酸性希夫試劑染色(Miller和Robyt，分析生物化學(xué)156，(1986)，357-363)。
圖5顯示，含有克隆載體pET24a的提取物(在IPTG誘導(dǎo)之前及之后的提取物制劑)均未發(fā)現(xiàn)有蔗糖酶活性。對(duì)于分別用質(zhì)粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21轉(zhuǎn)化的菌株，所有蛋白質(zhì)提取物在誘導(dǎo)期結(jié)束時(shí)均顯示蔗糖酶活性(濃縮于一條帶中)。
在IPTG誘導(dǎo)前，未發(fā)現(xiàn)這些活性帶。
當(dāng)凝膠中形成的聚合物能按照上述方法用酸性希夫試劑染色時(shí)，可以假定其不是由純?chǔ)?1，3-連接的單位組成的，因?yàn)檫@不能引起任何染色。
當(dāng)從除交替蔗糖酶之外至少表達(dá)一種葡聚糖蔗糖酶的腸膜明串珠菌NRRL-B1355株中分別分離載體pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21中所含的基因時(shí)，不能用該染色法準(zhǔn)確確定質(zhì)粒中所含的核酸序列是否編碼一種交替蔗糖酶。葡聚糖和交替糖都能用該方法檢測(cè)，因?yàn)檫@兩種聚合物均含有α-1，6鍵。實(shí)施例7熱處理后重組制備的交替蔗糖酶的酶活性及交替蔗糖酶特異性的檢測(cè)為了證明聚合活性，使用搖瓶培養(yǎng)的提取物(參見(jiàn)實(shí)施例5)。100μl提取物加入2ml反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鈉pH5.3、20％蔗糖)中，并在37℃下溫育24小時(shí)。為了比較，使用95℃處理10分鐘滅活的提取物和含有載體pET24a的大腸桿菌BL21(DE3)的提取物。聚合物形成只在未滅活的批次中發(fā)現(xiàn)，而95℃處理10分鐘的批次和含有pET24a的BL21(DE3)提取物的批次不顯示任何聚合物形成。向所有批次中加入等體積的無(wú)水乙醇后，只有未滅活的批次中沉淀出聚合物。這一發(fā)現(xiàn)清楚地表明了交替蔗糖酶的活性，因?yàn)镹RRL B-1355中存在的葡聚糖蔗糖酶經(jīng)45℃處理30分鐘滅活，而交替蔗糖酶在這些條件下仍有活性(Lopez-Munguia等人，酶與微生物技術(shù)15(1993)，77-85)。分別用偶聯(lián)酶學(xué)檢測(cè)釋放的葡萄糖和果糖及24小時(shí)后反應(yīng)混合液中仍含的蔗糖的酶測(cè)定顯示，果糖只存在于未滅活的提取物中。
為進(jìn)行酶學(xué)檢測(cè)，以不同稀釋度向含有5％蔗糖和50mM乙酸，pH5.5的1ml批次中加入純化的蛋白質(zhì)或粗蛋白質(zhì)提取物，并在37℃下溫育。待5分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘和30分鐘后，從這些批次中每個(gè)取出10μl，通過(guò)立即加熱到95℃終止交替蔗糖酶的酶活性。隨后，在偶聯(lián)光度測(cè)定中分別測(cè)定交替蔗糖酶釋放的果糖和葡萄糖部分和耗用的蔗糖部分。為此，1μl至10μl滅活樣品置于1ml 50mM咪唑緩沖液，pH6.9、2mM MgCl2、1mM ATP、0.4mM NAD和0.5U/ml己糖激酶中。順序加入約1單位葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(來(lái)自于腸膜明串珠菌)，約1單位磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和約5單位蔗糖酶后，測(cè)定340nm處光吸收的改變。隨后根據(jù)Lambert-Beer法則分別計(jì)算釋放的果糖和葡萄糖和耗用的蔗糖的量。
在對(duì)照批次中(95℃處理滅活提取物和含有pET24a的大腸桿菌提取物)，24小時(shí)后在反應(yīng)批次中未發(fā)現(xiàn)有明顯的果糖釋放及蔗糖減少。
這些結(jié)果證實(shí)，質(zhì)粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21分別編碼的蔗糖酶的特異性是葡糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性。排除了果糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性—對(duì)于明串珠菌屬的某些菌株已描述了其存在，因?yàn)榉駝t應(yīng)發(fā)現(xiàn)葡萄糖。實(shí)施例8利用在大腸桿菌中制備的交替蔗糖酶產(chǎn)生交替糖將發(fā)酵含有質(zhì)粒pAlsu-pET24a-3(見(jiàn)實(shí)施例4)的大腸桿菌BL21(DE3)獲得的100ml提取液加入900ml反應(yīng)緩沖液(50mM乙酸鈉pH5.3、20％蔗糖)中，37℃溫育24小時(shí)。向反應(yīng)混合液中加入等量的無(wú)水乙醇使形成的交替糖沉淀。用50％乙醇洗滌沉淀物兩次后冷凍干燥。基于反應(yīng)中使用的蔗糖的量，干燥聚合物的產(chǎn)率為60％。實(shí)施例9葡聚糖酶消化后交替糖和葡聚糖的HPLC分析實(shí)施例7中制備的100mg聚合物和100mg葡聚糖T10(Pharmacia)均溶解于1ml水中。將這些溶液每種40μl加入700μl反應(yīng)緩沖液(50mM磷酸鉀pH5.7、8單位葡聚糖酶，ICN Biomedicals Inc.No.190097)中，37℃溫育16小時(shí)。未用葡聚糖酶處理的50μl聚合物溶液(見(jiàn)圖6)和50μl用葡聚糖酶處理的聚合物溶液(圖7)經(jīng)HPLC(Dionex，PA-100柱，NaOH/NaOH-NaAc梯度)分析。
對(duì)于葡聚糖T10，能清楚地看到聚合物切割為低分子量的不同分子。完整的高分子量葡聚糖被葡聚糖酶轉(zhuǎn)化為較小的單位(主要是異麥芽糖)。相反，對(duì)于交替糖，在葡聚糖酶溫育后只有少量短鏈寡糖。大多數(shù)交替糖不可被葡聚糖酶消化。這一發(fā)現(xiàn)提示，通過(guò)重組交替蔗糖酶制備的產(chǎn)物不是葡聚糖，而是已知幾乎不能被葡聚糖酶酶促消化的交替糖(Lopez-Mungia等人，酶與微生物技術(shù)15，(1993)，77-85)。實(shí)施例10無(wú)葡聚糖酶時(shí)交替糖的體外制備100μl搖瓶培養(yǎng)提取物(參見(jiàn)實(shí)施例5)加入2ml反應(yīng)緩沖液中(50mM乙酸鈉，pH5.3、20％蔗糖)。另外向另一批中加入50單位葡聚糖酶(Biomedicals Inc.No.190097)。相應(yīng)的含有來(lái)源于腸膜明串珠菌NRRL-B512F的葡聚糖蔗糖酶代替酶提取物的兩批作為對(duì)照這兩批之一還混合有葡聚糖酶。
乙醇沉淀后，含葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖酶的反應(yīng)批次不顯示任何聚合物形成。其他所有批次均發(fā)現(xiàn)有聚合物形成。實(shí)施例11寡聚交替糖的體外制備和HPLC分析寡聚交替糖如實(shí)施例2所述在麥芽糖存在下用蛋白質(zhì)提取物制備，隨后經(jīng)HPLC-層析法檢測(cè)(見(jiàn)圖8)(參見(jiàn)實(shí)施例2)。為了比較，在制備寡聚交替糖后將該批次的一部分與50單位葡聚糖酶(Biomedicals Inc.190097)混合，隨后也進(jìn)行通過(guò)HPLC層析的分離(見(jiàn)圖9)。兩種層析譜的比較顯示，不僅屬于寡聚交替糖(α和β-異頭物)的兩個(gè)峰(保留時(shí)間為15.87-16.61分鐘)的高度，而且其他所有峰的高度均未改變，其首要標(biāo)志不用葡聚糖酶即已可見(jiàn)。這一發(fā)現(xiàn)提示，重組制備的交替蔗糖酶使得能制備寡聚交替糖而同時(shí)不產(chǎn)生寡葡聚糖。寡葡聚糖易于被葡聚糖酶消化，如果存在寡葡聚糖，則顯現(xiàn)HPLC層析譜中峰高度降低。實(shí)施例12交替糖的甲基化分析為了進(jìn)一步分析在體外產(chǎn)生的交替糖，進(jìn)行甲基化分析。
全甲基化全甲基化如Ciucanu和Kerek(碳水化合物研究131(1984)，209-218)所述進(jìn)行，使用溶于DMSO的NaOH/MeI，或使用根據(jù)Hakomori(生物化學(xué)雜志55(1964 FEB)，205-208)的改進(jìn)方法，該方法依賴(lài)于在室溫下使用新鮮制備的溶于DMSO的Li-Dimsyl/MeI(Dimsyl＝甲磺酰負(fù)碳離子)。
所有反應(yīng)都在氮環(huán)境下進(jìn)行。利用二氯甲烷抽提過(guò)量的碘甲烷，并在最后洗去鹽分離全甲基化產(chǎn)物。
降解為部分甲基化的乙酸山梨糖醇(甲基化分析)全甲基化的葡聚糖用2N三氟乙酸在120℃下水解1-3小時(shí)。冷卻后，用氮除去酸。然后將產(chǎn)生的葡聚糖與少量甲苯共同蒸餾，之后用溶于1N氨的NaBD4還原，最后用嘧啶/乙酸酐(acetanhydrid)乙酰化(3h，90℃)。用二氯甲烷抽提產(chǎn)物，并用NaHCO3洗滌。通過(guò)氣相層析分析有機(jī)相中的產(chǎn)物。
乙?；a(chǎn)物的分析乙?；a(chǎn)物通過(guò)氣相層析分析，這用Carlo-Erba公司生產(chǎn)的裝備有柱上注射器、25m CPSol8CB和FID-檢測(cè)儀的GC 6000 Vega型層析儀進(jìn)行。用氫作為載體氣體(80kPa)。
峰的鑒定和積分如Sweet等人(碳水化合物研究40(1975)，217)所述進(jìn)行。
結(jié)果下列主要成分經(jīng)氣相層析鑒定。
此外，也發(fā)現(xiàn)了少量(相對(duì)含量為0.2-0.4mol％)的下列成分1，4，5-和1，3，4，5-山梨糖醇和另一種四乙?；煞?1，5，x，y)。假定這些成分是由于不完全甲基化產(chǎn)生的。
對(duì)于上述成分，在通過(guò)改變水解長(zhǎng)度(按小時(shí)數(shù)以粗體表示)而進(jìn)行的不同實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)有下列含量(MA＝甲基化分析1；MA-b＝甲基化分析2)數(shù)值，單位為mol％乙?；恢? MA(1h) MA(2h)MA(3h) MA-b(2h)1，5 10，49 10，569，17 12，711，3，5 31，69 34，7032，95 23，121，4，5 0，70 0，30 0，36 0，331，5，6 47，02 44，1747，23 54，621，3，4，50，27 0，22 0，25 0，311，5，x，y0，19 0，32 0，36 0，241，3，5，69，64 9，73 9，68 8，67實(shí)施例13用于植物的表達(dá)盒的構(gòu)建交替蔗糖酶的液泡和質(zhì)體表達(dá)利用質(zhì)粒Alsu-pET24a作為模板，使用PCR引物Al-5′-1.2和Al-3′-2.2(參見(jiàn)SEQ ID NO 53和54)，我們擴(kuò)增了來(lái)源于腸膜明串珠菌的交替蔗糖酶的編碼區(qū)，然后用限制酶SalI和PstI酶切。之后將得到的片段克隆到SalI和SdaI消化的質(zhì)粒a)pBinAR-pat-Hyg和b)pBinAR-fnr-Hyg中。
得到的質(zhì)粒稱(chēng)為a)pat-Alsu-Hyg(見(jiàn)
圖11)和b)fnr-Alsu-Hyg(見(jiàn)
圖12)。
注意通過(guò)選擇PCR引物從cds中除去細(xì)菌分泌信號(hào)肽。
PCR條件緩沖液和聚合酶來(lái)自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶No.1644947)DNA 0，5ng10x緩沖液＋MgSO45μldNTPs(每種10 mM)2μl引物Sp-AS-5′ 100nM引物Sp-AS-3′ 100nMPwo聚合酶 1，0單位蒸餾水 加至50μl反應(yīng)條件步驟1 95℃230分鐘步驟2 95℃030分鐘步驟3 47℃030分鐘步驟4 68℃700分鐘(每一循環(huán)加3秒)步驟5 68℃1500分鐘步驟2-4以循環(huán)方式重復(fù)35次。實(shí)施例14對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物中交替蔗糖酶表達(dá)的Northern印跡分析由分別含質(zhì)粒pat-Alsu-Hyg和fnr-Alsu-Hyg的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植物的葉或塊莖在MM 200型粉碎機(jī)(Retsch GmbH & Co.KG，42781Haan，德國(guó))中粉碎，30Hz 50秒。根據(jù)Logemann等人(分析生物化學(xué)163(1987)，16-20)提取RNA。將每一樣品50μg RNA加樣于含甲醛的1％瓊脂糖凝膠上。電泳后，用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上(Hybond N，Amersham，UK)。核酸在膜上的固定通過(guò)UV交聯(lián)完成(Stratalinker by Stratagene)。
膜在雜交緩沖液(25％(v/v)甲酰胺、250mM磷酸鈉，pH7.2、250mM氯化鈉、1mM EDTA 7％(w/v)SDS、25％(w/v)聚乙二醇6000、0，25mg/ml剪切的鮭精DNA)中42℃預(yù)雜交6小時(shí)。之后在另外含放射性標(biāo)記探針的雜交緩沖液中42℃雜交過(guò)夜。放射性探針用隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim，1004760)和來(lái)源于質(zhì)粒pAlsu-pSK的大約4kb KpnI/XhoI片段根據(jù)使用說(shuō)明書(shū)制備。用3xSSC在50℃下洗膜一次20分鐘(Sambrook等人，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))，隨后用0.5xSSC洗滌一次20分鐘，之后將膜暴露于X光片過(guò)夜。
權(quán)利要求
1.一種編碼具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白質(zhì)的核酸分子，其選自(a)編碼至少成熟形式的蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)包含Seq.IDNo.2所示的氨基酸序列或質(zhì)粒DSM 12666中所含cDNA編碼的氨基酸序列；(b)包含Seq.ID No.1所示核苷酸序列或質(zhì)粒DSM 12666中所含cDNA的核苷酸序列或相應(yīng)核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)編碼一種蛋白質(zhì)的核酸分子，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與Seq.ID No2所示的氨基酸序列有至少40％的同源性；(d)核酸分子，其一條鏈可與如(a)或(b)所述的任一核酸分子雜交；(e)包含一種核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列編碼由(a)、(b)、(c)或(d)所述的任一種核酸分子編碼的蛋白質(zhì)之生物活性片段；和(f)核酸分子，其核苷酸序列由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并而不同于如(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子的序列。
2.一種可與權(quán)利要求1的核酸分子特異雜交的寡核苷酸或多核苷酸。
3.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1的核酸分子的載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的載體，其中核酸分子以有義方向與確?？煞gRNA在原核或真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和合成的調(diào)節(jié)元件連接。
5.以保藏號(hào)DSM 12666保藏的質(zhì)粒pAlsu-pSK。
6.用權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求3或4的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或這種細(xì)胞的后代。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，它是一種微生物細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞，它是大腸桿菌細(xì)胞。
9.一種制備具有交替蔗糖酶的生物活性的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的方法，其中權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞在允許蛋白質(zhì)合成的條件下培養(yǎng)，從培養(yǎng)的細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離蛋白質(zhì)。
10.由權(quán)利要求1的核酸分子編碼的或按照權(quán)利要求9的方法制備的蛋白質(zhì)或其生物活性片段。
11.一種用權(quán)利要求1的核酸分子或權(quán)利要求3或4的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，或這種細(xì)胞的后代，其中編碼具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白質(zhì)的該核酸分子受允許可翻譯mRNA在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)元件控制。
12.一種含有權(quán)利要求11的植物細(xì)胞的植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的植物，它是一種有用植物。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的植物，它是一種貯糖或貯淀粉植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的植物的繁殖材料，其含有權(quán)利要求11的植物細(xì)胞。
16.一種制備交替糖的方法，其包括從根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的植物中提取并分離交替糖的步驟。
17.可從根據(jù)權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)的植物中，從根據(jù)權(quán)利要求15的繁殖材料中，或通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求16的方法獲得的交替糖。
18.一種制備交替糖和/或果糖的方法，其中(a)權(quán)利要求6-8任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞向含蔗糖培養(yǎng)基中分泌交替蔗糖酶；和(b)從該培養(yǎng)基中分離交替糖和/或果糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中宿主細(xì)胞是固定化的。
20.一種制備交替糖和/或果糖的方法，其中(a)使一種含蔗糖溶液與權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)在可使蔗糖轉(zhuǎn)化為交替糖和/或果糖的條件下接觸；和(b)從該溶液中分離交替糖和/或果糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中蛋白質(zhì)固定于一種載體材料上。
22.一種制備交替糖和/或果糖的方法，其中(a)使含蔗糖溶液與權(quán)利要求10的蛋白質(zhì)和接納體分子在可使蔗糖轉(zhuǎn)化為交替糖和/或果糖的條件下接觸；和(b)從該溶液中分離交替糖和/或果糖。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中接納體分子選自麥芽糖、異麥芽糖、異麥芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的方法，其中蛋白質(zhì)是固定化的。
25.含有如權(quán)利要求17所述或按照權(quán)利要求16和18-24任一項(xiàng)制備的交替糖的化妝品或食品。
26.一種制備化妝品或食品的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求16和18-24任一項(xiàng)的步驟，所得交替糖制劑呈適宜用作化妝品或食品的形式。
全文摘要
提供了編碼交替蔗糖酶的核酸分子。此外也提供了載體、宿主細(xì)胞和用此處所述核酸分子轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和含有它們的植物。此外也描述了制備由于插入編碼交替蔗糖酶的核酸分子而可合成碳水化合物交替糖的轉(zhuǎn)基因植物的方法。此外還提供了制備交替糖和由其衍生的產(chǎn)品的方法。
文檔編號(hào)C12P19/04GK1341148SQ00802662
公開(kāi)日2002年3月20日 申請(qǐng)日期2000年2月7日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月8日
發(fā)明者J·科斯曼, T·韋爾什, M·奎恩茲, K·克努特 申請(qǐng)人:普蘭泰克生物技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)有限公司, 馬普科技促進(jìn)協(xié)會(huì)