專(zhuān)利名稱(chēng)：：粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從粒狀淀粉生產(chǎn)醇類(lèi)(如乙醇)的方法，其包括在低于粒狀淀粉膠凝溫度的溫度下使包含來(lái)自植物材料的粒狀淀粉的漿液暴露于a-淀粉酶，接著用發(fā)酵微生物進(jìn)行發(fā)酵。
背景技術(shù)：
：由于包括對(duì)有限的石油供應(yīng)持續(xù)且增加的依賴(lài)性在內(nèi)的各種原因，以及乙醇產(chǎn)品是可再生能源這一事實(shí)，從農(nóng)作物中生產(chǎn)作為燃料來(lái)源的乙醇的商業(yè)生機(jī)已經(jīng)重新引起世界范圍內(nèi)的興趣。醇類(lèi)發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是乙醇生產(chǎn)方法的一般特征在于濕磨或千磨法。關(guān)于這些方法的綜述，參考Bothast等，2005,Appl.Microbiol.Biotechnol,67:19-25禾flTHEALCOHOLTEXTBOOK,第三版(K.A.Jacques等人著)1999NottinghamUniversityPress,UK?！愣?，濕磨法包括一系列的浸泡(浸漬)步驟以軟化谷物，其中可溶淀粉被去除，接著是回收胚芽、纖維(糠)和麩質(zhì)(蛋白質(zhì))。通過(guò)干燥、化學(xué)和/或酶處理，進(jìn)一步加工剩余的淀粉。然后該淀粉可用于醇類(lèi)產(chǎn)品、高果糖玉米漿或商業(yè)純級(jí)淀粉?！愣裕晒任锬肽シòㄔS多基本步驟，其包括碾碎、蒸煮、液化、糖化、發(fā)酵和固液分離，以生產(chǎn)醇類(lèi)和其它聯(lián)產(chǎn)品。一般地，整谷物，例如玉米谷物，被碾磨成細(xì)顆粒大小，然后在漿槽內(nèi)與液體混合。此漿液在噴射式蒸煮器內(nèi)與液化酶(例如a-淀粉酶)一起受到高溫處理，以將谷物中的淀粉溶解并水解成糊精?；旌衔锉焕鋮s，并進(jìn)一步用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)處理以生產(chǎn)可發(fā)酵葡萄糖。然后含有葡萄糖的醪液(mash)在產(chǎn)生乙醇的微生物的存在下發(fā)酵大約24到120小時(shí)。將醪液中的固體從液相中分離出來(lái)，得到乙醇和有用的聯(lián)產(chǎn)品如酒糟。對(duì)上面的發(fā)酵方法已經(jīng)進(jìn)行了改進(jìn)，是通過(guò)將糖化步驟和發(fā)酵步驟結(jié)合在一個(gè)工藝中實(shí)施的，該工藝被稱(chēng)作同步糖化發(fā)酵或同步糖化、酵母繁殖和發(fā)酵。這些改進(jìn)的發(fā)酵方法相對(duì)于前面所描述的干磨發(fā)酵或甚至濕磨發(fā)酵法具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵诎l(fā)酵罐內(nèi)沒(méi)有發(fā)展出顯著的糖濃度，從而避免了糖對(duì)酵母生長(zhǎng)的抑制。此外，由于缺乏容易利用的葡萄糖，細(xì)菌的生長(zhǎng)得以減少。通過(guò)采用同步糖化發(fā)酵法，可使乙醇產(chǎn)量增加。近來(lái)，已經(jīng)引進(jìn)這樣的發(fā)酵方法，其消除了蒸煮步驟，或者其減少了在高溫下處理谷物的需要。這些有時(shí)被稱(chēng)為無(wú)蒸煮、低溫或溫煮的發(fā)酵方法包括碾磨谷物和將磨碎的谷物與液體結(jié)合形成漿液，其然后在低于粒狀淀粉膠凝溫度的溫度下與一種或多種粒狀淀粉水解酶和任選的酵母混合，以生產(chǎn)乙醇和其它聯(lián)產(chǎn)品(USP4,514,496，WO03/066826;WO04/081193;WO04/106533;WO04/080923和WO05/069840)。盡管上面所述的使用磨碎谷物的漿液與粒狀淀粉水解酶的組合的發(fā)酵方法提供了優(yōu)于以前方法的某些改進(jìn)，但是粒狀淀粉轉(zhuǎn)化工業(yè)還需要另外的發(fā)酵方法改進(jìn)，以產(chǎn)生更高的能量效率和高的終產(chǎn)物產(chǎn)量。本發(fā)明的目標(biāo)是提供將粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成醇類(lèi)(如乙醇)和其它終產(chǎn)物的改進(jìn)方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供從粒狀淀粉生產(chǎn)醇(如乙醇)的方法，其通過(guò)使粒狀淀粉與(X-淀粉酶接觸并且提供內(nèi)源性植物水解酶的合適條件而進(jìn)行，所述植物水解酶使溶解的淀粉水解以產(chǎn)生葡萄糖。該葡萄糖然后可被用作發(fā)酵中的原料以生產(chǎn)醇?！矫?，本發(fā)明涉及從粒狀淀粉底物生產(chǎn)葡萄糖的方法，其包括:a)在低于粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下使包含從植物材料中獲得的粒狀淀粉的漿液與a-淀粉酶接觸以生產(chǎn)寡糖，并且使內(nèi)源性植物糖水解酶水解所述寡糖，和b)產(chǎn)生包含至少10%葡萄糖的醪液。6[11]在該方面的進(jìn)一步實(shí)施方式中，該醪液在1(TC與4(TC之間的溫度下在發(fā)酵微生物和淀粉水解酶的存在下發(fā)酵10小時(shí)至250小時(shí)的一段時(shí)間以生產(chǎn)醇，特別是乙醇。在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)乙醇的方法，其包括a)使包含粒狀淀粉的漿液與能夠溶解粒狀淀粉的(x-淀粉酶接觸，其中所述接觸在3.5至7.0的pH下；在低于所述粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下；以及進(jìn)行5分鐘至24小時(shí)的一段時(shí)間，并得到含有20%以上葡萄糖的醪液底物，以及b)在1(TC與4(TC之間的溫度下，在發(fā)酵微生物和淀粉水解酶的存在下，使所述底物發(fā)酵10小時(shí)至250小時(shí)的一段時(shí)間，以生產(chǎn)乙醇。在上述任一方面的進(jìn)一步實(shí)施方式中，所述方法包括回收乙醇。在所述方面的又進(jìn)一步的實(shí)施方式中，所述方法可以包括未給出的另外步驟，其在所列舉的步驟之前、期間或之后進(jìn)行。圖1是圖解本發(fā)明實(shí)施方式的總體示意圖，其中漿液——其包括含有粒狀淀粉的磨碎谷物并且具有20%至40%的DS——在55"C與70。C之間的溫度和4.0至6.0的pH下與(x-淀粉酶接觸2至24小時(shí)。所得的含有葡萄糖的醪液被轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，并且在25。C至35X:的溫度和3.0至5.0的pH下，在酵母、營(yíng)養(yǎng)物、酸和淀粉水激酶的存在下進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)乙醇。發(fā)明詳述除非本文另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些相似或等價(jià)的任何方法和材料均可以應(yīng)用在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中，但是優(yōu)選的方法和材料被描述?，F(xiàn)在用下面的定義和實(shí)施例，僅通過(guò)參考的方式對(duì)本發(fā)明予以詳細(xì)描述。本文提及的所有專(zhuān)利和出版物，包括在這些專(zhuān)利和出版物中所公開(kāi)的所有序列，通過(guò)引用被明確地并入。7定義-術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵"指的是有機(jī)物通過(guò)微生物的酶促厭氧分解，以產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。盡管發(fā)酵在厭氧條件下發(fā)生，但該術(shù)語(yǔ)不意圖僅限于嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵在氧存在下也發(fā)生。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"淀粉"指的是包括植物的復(fù)雜多糖碳水化合物的任何材料，其包括具有式(C6H^05)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中x可以是任何數(shù)字。術(shù)語(yǔ)"粒狀淀粉"指的是生(未蒸煮的)淀粉，其是在植物材料(如谷物和塊莖)中發(fā)現(xiàn)的天然形式的淀粉。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"干固體含量(drysolidscontent,DS)"指的是基于干重以百分比(％)計(jì)的漿液的總固體。術(shù)語(yǔ)"漿液"指的是含有不溶性固體(例如粒狀淀粉)的含水混合物。術(shù)語(yǔ)"糊精"指的是葡萄糖的短鏈聚合物(如2至10個(gè)單元)。[23]術(shù)語(yǔ)"寡糖"指的是具有以糖苷鍵連接的2-10個(gè)單糖單元的任何化合物。簡(jiǎn)單糖的這些短鏈聚合物包括糊精。術(shù)語(yǔ)"可溶淀粉"指的是從不溶性淀粉(如粒狀淀粉)水解得到的淀粉。術(shù)語(yǔ)"醪液(mash)，，指的是在發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)中使用的液體形式的可發(fā)酵底物的混合物，并且被用于指發(fā)酵的任何階段，從可發(fā)酵底物與一種或多種淀粉水解酶和發(fā)酵生物的初始混合直到發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)完成。[26]術(shù)語(yǔ)"糖化酶"和"淀粉水解酶"指的是任何能將淀粉轉(zhuǎn)化成單糖或寡糖(如己糖或戊糖)的酶。術(shù)語(yǔ)"粒狀淀粉水解(GSH)酶"和"具有粒狀淀粉水解(GSH)活性的酶"指的是具有水解顆粒形式淀粉的能力的酶。術(shù)語(yǔ)"淀粉的水解"指的是借助水分子的加入而切割糖苷鍵。術(shù)語(yǔ)"(x-淀粉酶(例如E.C.類(lèi)3.2丄1)"指的是催化a-l，4-糖苷鍵水解的酶。這些酶也己經(jīng)被描述成那些實(shí)現(xiàn)含有1,4-(x-連接的D-葡萄糖單元的多糖中的1,4-a-D-糖苷鍵的外切型水解或內(nèi)切型水解的酶。術(shù)語(yǔ)"膠凝"意指淀粉分子通過(guò)蒸煮而溶解，形成粘性懸浮液。[31]術(shù)語(yǔ)"膠凝溫度"指的是含淀粉的底物膠凝開(kāi)始的最低溫度。膠凝的確切溫度取決于具體淀粉，而且可根據(jù)諸如植物種類(lèi)及環(huán)境和生長(zhǎng)條件之類(lèi)的因素而變化。因此，本文所討論的膠凝溫度范圍被提供來(lái)包括這種變化。術(shù)語(yǔ)"低于膠凝溫度"指的是低于膠凝溫度的溫度。術(shù)語(yǔ)"葡糖淀粉酶"指的是酶中的淀粉葡萄糖苷酶類(lèi)(例如，E.C.3.2丄3、葡糖淀粉酶、1,4-a-D-葡聚糖葡糖水解酶(1，4-alpha-D-glucanglucohydrolase))。這些是外型作用的酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原性末端釋放葡糖基殘基。所述酶也水解a-l，6和a-1,3鍵，盡管是以比a-1，4鍵慢得多的速度。短語(yǔ)"同步糖化發(fā)酵(simultaneoussaccharificationandfermentation,SSF)"指的是生產(chǎn)終產(chǎn)物的工藝，其中發(fā)酵生物，例如產(chǎn)生乙醇的微生物，和至少一種酶，例如糖化酶，在同一容器中同一個(gè)工藝步驟中被組合。術(shù)語(yǔ)"磨碎(milling)"指的是谷物分解成更小的顆粒。在一些實(shí)施方式中，這個(gè)術(shù)語(yǔ)與碾碎(grinding)可交互使用。[37]術(shù)語(yǔ)"干磨法(drymilling)"指的是干燥的整粒谷物的碾磨，其中谷物的部分，例如胚芽和糠，尚未被有意去除。術(shù)語(yǔ)"液化"指的是淀粉轉(zhuǎn)化中的階段，其中膠凝化淀粉水解而產(chǎn)生低分子量的可溶性糊精。術(shù)語(yǔ)"稀酒糟(thin-stillage)"指的是所形成的發(fā)酵液體部分，其含有溶解的物質(zhì)和懸浮的細(xì)粒，并且其是從發(fā)酵所產(chǎn)生的固體部分分離出來(lái)的。在工業(yè)發(fā)酵工藝中再循環(huán)的稀酒糟常常被稱(chēng)為"回流(back-set)"。術(shù)語(yǔ)"容器"包括但不限于槽、桶、瓶子、燒瓶、袋、生物反應(yīng)器及類(lèi)似物。在一個(gè)實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)是指適合于進(jìn)行本發(fā)明所包括的糖化和/或發(fā)酵工藝的任何貯器。術(shù)語(yǔ)"終產(chǎn)物"指的是從可發(fā)酵底物進(jìn)行酶促轉(zhuǎn)化的任何碳源衍生產(chǎn)物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，終產(chǎn)物是醇，例如乙醇。[42]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵生物"指的是適宜用在發(fā)酵中以直接或間接生產(chǎn)終產(chǎn)物的的任何微生物或細(xì)胞。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"乙醇生產(chǎn)者(ethanolproducer)"或"生產(chǎn)乙醇的微生物"指的是能夠從單糖或寡糖中生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵生物。術(shù)語(yǔ)"衍生的"包括術(shù)語(yǔ)"來(lái)源于"、"得到的"、"可得自"和"分離自"，而且在如本文所使用的一些實(shí)施方式中，是指核苷酸序列所編碼的多肽產(chǎn)生自其中所述核苷酸天然存在或所述核苷酸被插入其中的細(xì)胞。涉及蛋白質(zhì)或多核苷酸的術(shù)語(yǔ)"異源的"指的是并非天然存在于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或多核苷酸。涉及蛋白質(zhì)或多核苷酸的術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源的"指的是在宿主細(xì)胞中天然存在的蛋白質(zhì)或多核苷酸。短語(yǔ)"能夠水解可溶淀粉的內(nèi)源性植物水解酶"指的是這樣的水解酶，其在植物中表達(dá)和產(chǎn)生并且可以通過(guò)內(nèi)源或異源基因的表達(dá)而產(chǎn)生。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)源酶是那些在植物中被天然表達(dá)的酶。[48]短語(yǔ)"外源"酶指的是不在植物或植物細(xì)胞中產(chǎn)生的酶。[49]術(shù)語(yǔ)"酶促轉(zhuǎn)化"一般指的是通過(guò)酶作用改變底物。如本文所使用，該術(shù)語(yǔ)也指通過(guò)酶作用改變可發(fā)酵底物，例如含粒狀淀粉的底物。[50]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"回收"、"分離"、"分開(kāi)"指的是化合物、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸或氨基酸從與其天然相連的至少一個(gè)成分中去除。[51]如本文所使用，"酶單位"是指在特定的測(cè)定條件下每分鐘生產(chǎn)1微摩爾產(chǎn)物的酶量。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)"葡糖淀粉酶活性單位(glucoamylaseactivityunit，GAU)"被定義為在60。C和pH4.2的測(cè)定條件下，每小時(shí)從可溶淀粉底物(4%DS)生產(chǎn)lg葡萄糖所需的酶的量。術(shù)語(yǔ)"產(chǎn)量"指的是采用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的終產(chǎn)物的量。在一些實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)是指終產(chǎn)物的體積，而在其它實(shí)施方式中，該術(shù)語(yǔ)是指終產(chǎn)物的濃度。術(shù)語(yǔ)"DE"或"葡萄糖當(dāng)量"是用于測(cè)量總還原糖濃度的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，基于干重以D-葡萄糖計(jì)算。未水解的粒狀淀粉的DE基本上為0，而D-葡萄糖的DE為100。用于測(cè)定漿液或溶液的DE的教導(dǎo)性方法在Schroorl的方法(Fehling分析滴定法)中進(jìn)行了描述。10[54]如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"包含(comprising)"及其同類(lèi)詞以其包括在內(nèi)的含義加以使用；也就是說(shuō)，等價(jià)于術(shù)語(yǔ)"包括(including)"及其對(duì)應(yīng)的同類(lèi)詞。"一(a)"、"一(an)"和"該(the)，，包括復(fù)數(shù)指代，除非上下文明確地另外規(guī)定。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。本文所提供的標(biāo)題并不是對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞降南薅?，其可以通過(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體上來(lái)理解。具體實(shí)施例方式(A)原材料粒狀淀粉-粒狀淀粉可以獲自植物材料，其包括但不限于小麥、玉米、黑麥、高粱(買(mǎi)羅高粱(milo))、水稻、粟、大麥、黑小麥、木薯(cassava)(木薯(tapioca))、馬鈴薯、甘薯、甜菜、甘蔗、和豆類(lèi)，例如大豆和豌豆。優(yōu)選的植物材料包括玉米、大麥、小麥、水稻、買(mǎi)羅高粱(milo)和其組合。特別優(yōu)選的植物材料從玉米(玉蜀黍(Zeamays))中獲得。植物材料可以包括雜交品種和基因改造品種(如包含異源基因的轉(zhuǎn)基因玉米、大麥或大豆)。植物的任何部分可以用于提供粒狀淀粉，包括但不限于植物部分，例如葉、莖、外殼、莢、塊莖、玉米芯、谷粒和類(lèi)似物。在一些實(shí)施方式中，基本上整個(gè)植物都可以使用，例如，整個(gè)的玉米秸稈都可以使用。在一個(gè)實(shí)施方式中，整粒谷物被用作粒狀淀粉來(lái)源。優(yōu)選的整粒谷物包括玉米、小麥、黑麥、大麥、高粱和其組合。在其它實(shí)施方式中，粒狀淀粉可以從分級(jí)的谷物中獲得，包括纖維、胚乳和/或胚芽部分。植物材料如玉米和小麥的分級(jí)(fractionating)方法在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實(shí)施方式中，從不同來(lái)源中獲得的植物材料可以被混合在一起以獲得在本發(fā)明的方法中使用的粒狀淀粉(如玉米和買(mǎi)羅高粱或者玉米和大麥)。[59]在一些實(shí)施方式中，包含粒狀淀粉的植物材料可以采用諸如磨碎的方法進(jìn)行制備。特別地，碾磨整粒谷物的方法是熟知的，且包括使用錘磨機(jī)和軋制機(jī)。a-淀粉酶-cx-淀粉酶可以是單一酶、雜交酶、或(x-淀粉酶的混合物。在本發(fā)明所包括的一些實(shí)施方式中，a-淀粉酶是具有E.C.編號(hào)E.C.3.2丄-3的微生物酶，尤其是E.C.3.2.1.1。任何合適的(x-淀粉酶可用于本方法。在一些實(shí)施方式中，(x-淀粉酶衍生自細(xì)菌菌株，而在其它實(shí)施方式中，a-淀粉酶衍生自真菌菌株。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，優(yōu)選的a-淀粉酶是細(xì)菌a-淀粉酶。在其它實(shí)施方式中，a-淀粉酶是耐酸a-淀粉酶。合適的a-淀粉酶可以是天然存在的以及重組(雜種和變種)和突變型a-淀粉酶(WO99/19467和WO97/41213)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，a-淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬某種。優(yōu)選的芽孢桿菌屬某種包括枯草芽孢桿菌(S.仰to'fo)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(S.Wearaf/^rwop/w'/wsX遲緩芽孢桿菌/ew"")、地衣芽孢桿菌(凡//C/^"^W7W'S)、凝結(jié)芽孢桿菌(5.ccwgM/a/"W)禾口角率淀-粉、芽孑包木干菌(B.aw_y/o//《Me^3c&/)(USP5,093,257;USP5,763,385;USP5,824,532;USP5，958,739;USP6,008,026:USP6,361,809;USP6,867,031;WO96/23874;WO96/39528和WO05/001064)。特別優(yōu)選的a-淀粉酶衍生自芽孢桿菌屬菌株嗜熱脂肪芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(USP6,187，576;USP6,093,562;USP5,958,739;US2006/0014265和WO99/19467)。[61]大部分優(yōu)選的a-淀粉酶是衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的淀粉酶，包括野生型、雜種和變種a-淀粉酶。參見(jiàn)Suzuki等，(19S9)J.Biol.Chem.264:18933-18938和US2006/0014265,特別是SEQIDNOs:3、4禾口16。還可參考具有AmericanTypeCultureCollection(ATCC)編號(hào)——ATCC39709;ATCC11945;ATCC6598;ATCC6634;ATCC8480;ATCC9945A和NCIB8059——的菌株。除細(xì)菌oc-淀粉酶之外，真菌oc-淀粉酶也被考慮應(yīng)用在本發(fā)明的方法中。合適的真菌cc-淀粉酶衍生自絲狀真菌菌株諸如曲霉屬(A^wgz'〃w)，如米曲霉(A07加e)和黑曲霉(Am'gw)(例如FUNGAMYL禾口CLARASEL)，以及木霉屬(7>/c/70^mw)、根霉屬(7/2/zo/)、-毛^^]^(A/wcor)禾口青霉屬(戶(hù)ew/c/〃z'Mm)。12[63]在本發(fā)明的方法中考慮使用的商業(yè)可得的a-淀粉酶包括SPEZYMEAA;SPEZYMEFRED;SPEZYMEETHYL;GZYMEG997;CLARASEL(GenencorInternationalInc.);禾卩TERMAMYL120隱L、LC、SC和SUPRA(NovozymesBiotech);LIQUOZYMEX和SANSUPER(NovozymesA/S)和ULTRATHIN(/ValleyResearch)。植物酶-植物具有天然存在的淀粉分解酶，如oc-淀粉酶(EC3丄1.1);(3-淀粉酶(EC3丄1.2)、淀粉葡糖苷酶(葡糖淀粉酶)(EC3丄1.3)和淀粉磷酸化酶(EC2.4丄1)。此外，植物可以已經(jīng)被基因工程化以包括編碼淀粉分解酶的異源基因，如淀粉酶、葡糖淀粉酶和其它(WO03/018766和WO05/096804)。內(nèi)源性淀粉分解植物酶，不管是天然存在的還是從導(dǎo)入的多核苷酸表達(dá)的，在暴露于高溫下，如噴射式蒸煮的溫度或者甚至高于粒狀淀粉凝膠溫度的溫度下，都將失活。然而，在本方法中進(jìn)行的溫度下，內(nèi)源性淀粉分解酶被認(rèn)為沒(méi)有失活，并且實(shí)際上有助于粒狀淀粉的水解。盡管不受理論束縛，發(fā)明人認(rèn)為，在接觸步驟中所提供的a-淀粉酶使植物材料的粒狀淀粉結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，允許產(chǎn)生包括糊精在內(nèi)的寡糖。該寡糖在接觸步驟所包括的溫度(如45C至70°C)下被植物淀粉分解酶進(jìn)一步分解。植物淀粉分解酶作用于部分水解的淀粉以產(chǎn)生葡萄糖。盡管外源的葡糖淀粉酶可以被包括在接觸步驟中，但外源葡糖淀粉酶的加入對(duì)于提供葡萄糖來(lái)說(shuō)不是必需的，葡萄糖然后被任選地用作乙醇發(fā)酵的原料。因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的接觸步驟不包括衍生自微生物來(lái)源的葡糖淀粉酶的加入。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，接觸步驟在未加入外源酶的情況下進(jìn)行，尤其是外源葡糖淀粉酶或其它寡糖水解酶。在迸一步的實(shí)施方式中，寡糖僅僅被天然存在的內(nèi)源植物酶水解，具體為植物屬或者可選地具體為植物屬和種。然而，外源葡糖淀粉酶和/或其它酶如肌醇六磷酸酶和蛋白酶的加入可以增加溶解的粒狀淀粉的產(chǎn)量。發(fā)酵生物-[65]發(fā)酵生物的實(shí)例是產(chǎn)乙醇微生物(ethanologenicmicroorganism)或產(chǎn)生乙醇的微生物如產(chǎn)乙醇細(xì)菌，其表達(dá)醇脫氫酶和丙酮酸脫氫酶并且其能從運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymcwo"oswo6fc)中獲得(參見(jiàn)如USP5,000,000;USP5,028,539,USP5,424,202;USP5,514,583禾口USP5,554,520)。在另外的實(shí)施方式中，產(chǎn)乙醇微生物表達(dá)木糖還原酶和木糖醇脫氫酶，即將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖的酶。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，木糖異構(gòu)酶被用于將木糖轉(zhuǎn)化成木酮糖。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用的是能使戊糖和己糖都發(fā)酵成乙醇的微生物。例如，在一些實(shí)施方式中，微生物可以是天然的或非基因工程微生物，或者在其它實(shí)施方式中，微生物可以是重組微生物。例如，在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的發(fā)酵微生物包括來(lái)自自芽孢桿菌屬(B""7/w)、乳酸桿菌屬(丄"ctokc/腸)、大腸桿菌屬(￡.co//)、歐文氏菌屬(五rvWm'a)、泛菌屬(P朋toea)(例如檸檬泛菌(P"'^^))和克雷白氏桿菌屬(《/^*/&)(例如奧克西托克克雷白氏桿菌(Ko砂tocfl))的細(xì)菌菌株(參見(jiàn)，例如USP5,028,539、USP5,424,202禾[]WO95/13362)。[66]在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，產(chǎn)生乙醇的微生物是真菌微生物，如酵母并且尤其是酵母屬(5*accwom_ycM)例如釀酒酵母(》S.cerev^'ae)菌株(USP4,316,956)。多種釀酒酵母是商業(yè)上可得的并且這些包括但不限于FALI(Fleischmann'sYeast),SUPERSTART(Alltech)、FERMIOL(DSMSpecialties),REDSTAR(Lesaffre)和安琪酒精酵母(AngelYeastCompany,China)。輔助酶-盡管在一種實(shí)施方式中，考慮了另外的淀粉水解酶是不需要的并且因此沒(méi)有被包括在接觸步驟中，但是另外的酶可以被包括在本發(fā)明所包含的接觸步驟和發(fā)酵步驟兩者中。在一些實(shí)施方式中，這些酶將作為一種或多種輔助酶包括在接觸步驟中，所述接觸步驟包括使粒狀淀粉漿液與a-淀粉酶和一種或多種輔助酶接觸。在其它實(shí)施方式中，另外的酶將與酵母和其它成分一起被包括在發(fā)酵步驟中。[68]在一些實(shí)施方式中，在與cx-淀粉酶的接觸步驟期間，輔助酶可以包括葡糖淀粉酶、粒狀淀粉水解酶、蛋白酶、肌醇六磷酸酶、纖維素酶、半纖維素酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、角質(zhì)酶(cutinase)、果膠酶(pectinase)、|3-葡聚糖酶、卩-淀粉酶、環(huán)糊精轉(zhuǎn)糖基酶和其組合。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸步驟將包括a-淀粉酶、肌醇六磷酸酶和任選的蛋白酶的組合。在其它實(shí)施方式中，接觸步驟將包括(X-淀粉酶、葡糖淀粉酶和任選的蛋白酶的組合。在還有其它實(shí)施方式中，接觸步驟將包括a-淀粉酶、葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶和任選的蛋白酶的組合。葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2丄3)可以來(lái)自細(xì)菌、植物和真菌來(lái)源的異源或內(nèi)源蛋白質(zhì)表達(dá)。應(yīng)用在本發(fā)明的組合物和方法中的優(yōu)選葡糖淀粉酶是由幾種絲狀真菌和酵母的菌株產(chǎn)生的。特別地，由曲霉屬和木霉屬的菌株分泌的葡糖淀粉酶在商業(yè)上是重要的。合適的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶以及葡糖淀粉酶變種和基因工程突變型葡糖淀粉酶。下面的葡糖淀粉酶是可以應(yīng)用在本發(fā)明所包括的方法中的葡糖淀粉酶的非限制性實(shí)例。黑曲霉(A/^rg/仏"m'gw)Gl和G2葡糖淀粉酶(Boel等，(1984)EMBOJ.3:1097-1102;WO92/00381,WO00/04136禾nUSP6,352,851);泡盛曲霉(A;erg/〃m'mvamw7〕葡糖淀粉酶(WO84/02921);米曲霉(A;erg/〃wsoryzae)葡糖淀粉酶(Hata等，(1991)Agric.Biol.Chem.55:941—949)和J，erg/〃m'5/zf朋廳簡(jiǎn)'葡糖淀粉酶(參見(jiàn)Chen等，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Chen等(1995)Prot.Eng.8:575-582;和Chen等，(1994)BiochemJ.302:275-281)。葡糖淀粉酶也可以獲自踝節(jié)菌屬(r"/w0w_yc")的菌株，例如來(lái)源于埃默森踝節(jié)菌(Iewe,加m7)、r/^ce加mM、、杜邦踝節(jié)菌(7:~o"/0、嗜熱踝節(jié)菌(？AemwpMMs)(WO99/28488;USPNo.RE:532,153;USPNo.4，587,215)的那些；木霉屬的菌株，例如里氏木霉，尤其是與在美國(guó)專(zhuān)利公布2006-0094080中所公開(kāi)的SEQIDNO:4具有至少80%、85%、90%和95%序列同一性的葡糖淀粉酶；根霉屬(i^izopw)的菌株，例如雪白根霉(兄"Zvews)和米根霉(兄WTzcte);毛霉屬(Mwcw)的菌株和腐質(zhì)霉屬(7/wm/co/)的菌株，例如灰色腐質(zhì)霉(Rgr/^a)(參見(jiàn)Boel等，(1984)EMBOJ.3:1097-1102;WO92/00381;WO00/04136;Chen等.，(1996)Prot.Eng.9:499-505;Taylor等，(1978)CarbohydrateRes.61:301-308;US專(zhuān)禾U4,514,496;US專(zhuān)利4，092，434;和Jensen箏(1988)Can.J.Microbiol.34:218-223)。其它可用于本發(fā)明的葡糠淀粉酶包括那些從羅耳阿太菌得到的酶及其變體(WO04/111218)。商業(yè)使用的具有葡糖淀粉酶活性的酶例如從黑曲霉(商品名DISTILLASE、OPTIDEXL-400和GZYMEG9904X，來(lái)自GenencorInternationalInc.)或根霉屬某種(商品名CU.CONC，來(lái)自日本ShinNihonChemicals)產(chǎn)生。還有商業(yè)消化酶，來(lái)自日本AmanoPharmaceuticals,商品名為GLUCZYME(Takahashi等，(1985)J.Biochem.98:663-671)。另外的酶包括根霉屬某種的三種形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2丄3)，即"Glucl"(MW74,000)、"Gluc2"(MW58,600)禾口"Gluc3"(MW61,400)。酶制劑GC480(GenencorInternationalInc.)也在本發(fā)明中得到應(yīng)用。粒狀淀粉水解酶(GSHE)能水解粒狀淀粉，且這些酶已經(jīng)從真菌、細(xì)菌和植物細(xì)胞中回收，例如芽孢桿菌屬某種(B^///^^.)、青霉屬某種(Pew."加謂w.)、腐質(zhì)霉屬某種(/f畫(huà)'co/a取)、木霉屬某種(Zh'c/zo^rm<3sp.)、曲霉屬某種(A^erg/〃zws;x)、毛霉屬某禾中(Mwcw乎)和根霉屬某種(i/2iz印船、平)。在一種實(shí)施方式中，具有GSH活性的一組特定的酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或oc-淀粉酶活性的酶(參見(jiàn)Tosi等，(1993)Can.J.Microbiol.39:846-855)。米根霉GSHE已經(jīng)在Ashikari等，(1986)Agric.Biol.Chem.50:957-964和USP4，863,864中予以描述?；腋|(zhì)霉GSHE己經(jīng)在Allison等，(1992)Curr.Genet.21:225-229、WO05/052148和歐洲專(zhuān)利171218中予以描述。泡盛曲霉河內(nèi)變禾中(J^erg77/z^avvamcWA:mvac/z/)GSHE已經(jīng)在Hayashida等,(1989)Agric.Biol.Chem.53:923-929中予以描述。Js/9erg/〃MA/ra"s"/w'GSHE已經(jīng)在SWbuya等，(1990)Agric.Biol.Chem.54:1905-1914中予以描述。在一種實(shí)施方式中，GSHE可具有葡糖淀粉酶活性且衍生自灰腐質(zhì)霉菌株，特別是灰腐質(zhì)霉嗜熱變種(i^m/co/agn'"avwAew7o/cfea)菌株(參見(jiàn)USP4,618,579)。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的腐質(zhì)霉酶與WO05/0521478的SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至16少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。在另一種實(shí)施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，且衍生自泡盛曲霉菌株，尤其是泡盛曲霉河內(nèi)變種菌株。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的泡盛曲霉河內(nèi)變種酶與WO05/052148的SEQIDNO:6的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。在另一種實(shí)施方式中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，且衍生自根霉屬菌株，例如雪白根霉或米根霉。衍生自Koji菌株雪白根霉的酶以商品名"CUCONC"銷(xiāo)售，或者來(lái)自根霉的酶以商品名GLUZYME銷(xiāo)售。具有葡糖淀粉酶活性的另一有用的GSHE是SPIRIZYMEPlus(NovozymesA/S)，其也包括酸性真菌淀粉酶活性。[77]在另一個(gè)實(shí)施方式，GSHE可具有a-淀粉酶活性，并衍生自曲霉屬的菌株，例如泡盛曲霉、黑曲霉、米曲霉或河內(nèi)白曲霉U.^而c/z/)的菌株，尤其是泡盛曲霉的菌株。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，具有GSH活性的河內(nèi)白曲霉的酶與WO05A18800和WO05/003311的SEQIDNO:3的氨基酸序列具有至少85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%和99%的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，具有GSH活性的酶是雜交酶，例如，一種這樣的雜交酶，其含有a-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域——如黑曲霉a-淀粉酶、米曲霉(x-淀粉酶或河內(nèi)白曲霉(x-淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域，和不同的真菌(x-淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如河內(nèi)白曲霉或灰腐質(zhì)霉的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它的實(shí)施方式中，具有GSH活性的雜交酶可以包括葡萄淀粉酶的催化結(jié)構(gòu)域——如曲霉屬某種"^e^g///^w.)、踝節(jié)菌屬某禾中(ra/ara/^vcess/.)、s/.、木霉屬某禾中(7Hc/zo(ier附a取)或根霉屬某種(//n:zopw5p.)的催化結(jié)構(gòu)域，和不同的葡糖淀粉酶或(x-淀粉酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一些具有GSH活性的雜交酶公開(kāi)在WO05/003311,W005/045018;Shibuya等，(1992)Biosci.Biotech.Biochem56:1674-1675禾卩Cornett等，(2003)ProteinEngineering16:521-520中。合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細(xì)菌的蛋白酶，例如，酸性真菌蛋白酶，例如NSP24以及GC106(GenencorInternationalInc.)。優(yōu)選的真菌蛋白酶衍生自曲霉屬(例如來(lái)自黑曲霉和米曲霉的蛋白酶)、毛霉屬(例如米黑毛霉(Mm/e&/))、木霉屬、根霉屬和念珠菌屬(C^W")的菌株。優(yōu)選的細(xì)菌蛋白酶衍生自芽孢桿菌屬的菌株，如液化淀粉芽孢桿菌。添加到發(fā)酵中的蛋白酶可以增加游離氨基氮的水平和增加酵母的代謝速率并進(jìn)一步提供更高的發(fā)酵效率。[81]可以應(yīng)用在本發(fā)明的方法中的酶包括(3-淀粉酶(E.C.3.2丄2)。這些酶是外切作用的生麥芽糖淀粉酶(exo-actingmaltogenicamylase),其催化直鏈淀粉、支鏈淀粉和相關(guān)的葡萄糖聚合物中1,4-a-糖苷鍵的水解。商業(yè)(3-淀粉酶可從GenencorInternationalInc.得到，而且例子包括SPEZYMEBBA和OPTIMALBBA。纖維素酶(E.C.3.2丄4)，例如內(nèi)切葡聚糖酶，可以應(yīng)用在本發(fā)明的方法中。纖維素酶的例子包括來(lái)自絲狀真菌如木霉屬、腐質(zhì)霉屬、鐮刀菌屬(Fi/Mn'Mm)和曲霉屬的纖維素酶。商業(yè)纖維素酶可以以SPEZYMECP(GenencorInternationalInc.)以及CELLUZYME和ULTRAFLO(NovozymesA/S)獲得。在本發(fā)明的方法中可用的木聚糖酶可以來(lái)自細(xì)菌或真菌來(lái)源，例如曲霉屬、木霉屬、脈孢菌屬(臉mw;ora)和鐮刀菌屬。商業(yè)制劑包括SPEZYMECP禾nLAMINEX(GenencorInternationalInc.)以及ULTRAFLOW(No額y薦A/S)。許多細(xì)菌和真菌肌醇六磷酸酶(E.C.3丄3.8和3丄3.26)是已知的，并且在一些實(shí)施方式中肌醇六磷酸酶的加入在這些方法中特別有用。酵母肌醇六磷酸酶可以衍生自酵母屬(例如釀酒酵母)和許旺酵母屬(ScMww7/o附y(tǒng)c^)(例如西方許旺酵母occzWe"to/k))的菌株(Wodzinski等，Adv.Apple.Microbiol.,42:263-303)。其它真菌肌醇六磷酸酶己經(jīng)在文獻(xiàn)中有所描述，并且參考Wyss等，(1999)Appl.EnvironMicrobiol.65:367-373;Berka等，(1998)Appl.Environ.Microbiol.64:4423-4427;Yamada等，(1986)Agric.Biol.Chem.322:1275-1282;PCT18公布WO98/28408;WO98/28409;WO97/38096和WO9844125;以及美國(guó)專(zhuān)利6,734,004;6,350,602;和5,863,533)。真菌肌醇六磷酸酶已經(jīng)從曲霉屬(例如黑曲霉、泡盛曲霉、土曲霉、米曲霉和煙曲霉(A/MmfgW船))；疏綿狀嗜熱絲孢菌(腐質(zhì)霉屬)(77^mwmyc^^/ww/co/^/a"wg/"oi/sas1)、鐮刀菌屬(爪哇鐮刀菌(Fyavam.c翻)禾口F.vera.腿ocfes)中衍生得到。細(xì)菌肌醇六磷酸酶也可用在本發(fā)明中(GreinerR.等(1993)Arch.Biochem.Biophys.303:107-113;YoonS丄等(1996)EnzymeandMicrobialTechnol.18:449-454;和WO06/043178)。[85]根據(jù)本發(fā)明可被使用的商業(yè)可得的肌醇六磷酸酶包括PHYZYMEXP5000(DaniscoA/S);FINASE(Altech);GC491;FINASE、SPEZYMEHPA(Genencor)、BIO隱FEEDPHYTASE和PHYTASENOVO(Novozymes)以及NATUPHOS(DSM)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定在本發(fā)明所包括的工藝步驟中可以使用的酶的有效量。(B)工藝步驟-要加工的粒狀淀粉(如研磨的谷物)與水溶液混合以得到漿液。水溶液可以從例如水、稀酒糟和/或回流得到。漿液的DS可以在下列范圍5-60%;10-50%;15-45%;15-30%;20-45%;20-30%并且還有25-40%。與a-淀粉酶的接觸步驟可以在3.5至7.0的pH范圍內(nèi)進(jìn)行；還可以在3.5至6.5的pH范圍內(nèi)；優(yōu)選地在4.0至6.0的pH范圍內(nèi)；并且更優(yōu)選地在4.5至5.5的pH范圍內(nèi)。漿液在低于粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下與a-淀粉酶保持接觸。在一些實(shí)施方式中，該溫度被保持在45。C與70。C之間；在其它實(shí)施方式中，該溫度被保持在50。C與7(TC之間;在55。C與7(TC之間;在60°C與70。C之間；在6(TC與65。C之間；在55。C與65。C之間以及在55。C與68。C之間。在進(jìn)一歩的實(shí)施方式中，該溫度為至少45"C、48°C、50°C、53°C、55°C、58°C、60°C、63°C、65。C和68。C。在其它實(shí)施方式中，該溫度不大于65。C、68°C、70°C、73°C、75。C和80。C。[89]按照本文的工藝可用的許多粒狀淀粉的初始淀粉膠凝溫度范圍包括大麥(52。C到59。C)、小麥(58。C到64。C)、黑麥(57。C到7(TC)、19玉米(62。C到72。C)、高直鏈淀粉玉米(67。C到8(TC)、水稻(68。C到77°C)、高粱(68。C到77°C)、馬鈴薯(58。C到68°C)、木薯(59。C到69°C)和甘薯(58。C到72°C)(J丄M.Swinkels，第32—38頁(yè)，在STARCHCONVERSIONTECHNOLOGY^EdsVanBeyn腿等，(1985)MarcelDekkerInc.NewYork禾卩TheAlcoholTextbook3rdED.AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,EdsJacques等,(1999)NottinghamUniversityPress,UK)。[90]在接觸步驟中，漿液可以與a-淀粉酶保持接觸5分鐘至48小時(shí)的期間；并且還可以為5分鐘至24小時(shí)的期間。在一些實(shí)施方式中，該吋間期間為在15分鐘與2小時(shí)之間，15分鐘與6小時(shí)之間，15分鐘與4小時(shí)之間以及還有30分鐘與2小時(shí)之間。在接觸步驟中所用的(x-淀粉酶的有效濃度將根據(jù)所用的具體工藝條件和粒狀淀粉而變化。然而，一般而言，所用的a-淀粉酶的量將在0.001至50AAU/gDS之間、0.01至30AAU/gDS、0.01至10AAU/gDS以及還有0.05至5.0AAU/gDS。在一些實(shí)施方式中，接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中a-淀粉酶的有效劑量將為0.01至15SSU/gDS;還有0.05至10SSU/gDS;還有0.1至10SSU/gDS;以及0.5至5SSU/gDS。在一些實(shí)施方式中，接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中葡糖淀粉酶的有效劑量將在0.01至15GAU/gDS的范圍內(nèi)；還有0.05至10GAU/gDS;還有0.1至10GAU/gDS以及甚至0.5至5GAU/gDS。[94]在一些實(shí)施方式中，將在接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中使用的肌醇六磷酸酶的有效劑量將在0.001至15FTU/gDS的范圍內(nèi)；還有0.005至10FTU/gDS;以及還有0.05至5FTU/gDS。一個(gè)肌醇六磷酸酶單位(FTU)為這樣的酶量，其在37。C和pH5.0下每分鐘從0.0051摩爾/升的肌醇六磷酸鈉中釋放1微摩爾無(wú)機(jī)磷。在一些實(shí)施方式中，將在接觸步驟和/或發(fā)酵步驟中使用的蛋白酶的有效劑量將在0.01至15SAPU/gDS的范圍內(nèi)；還有0.01至10SAPU/gDS;以及還有0.05至5SAPU/gDS。SAPU是指分光光度酸性蛋白酶單位，其中1SAPU為在分析條件下每分鐘從酪蛋白底物中釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶酶活性的量。20[96]在接觸步驟期間，25-卯％的粒狀淀粉被溶解以產(chǎn)生包含糊精的寡糖。在一些實(shí)施方式中，大于20°/。、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和卯％的粒狀淀粉被溶解。在粒狀淀粉與(x-淀粉酶接觸如t:所指出的一段時(shí)間后，獲得可溶淀粉底物(醪液)，其包含大于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%和80%的葡萄糖。[98]在接觸步驟的一些優(yōu)選實(shí)施方式中，具有20-40%DS的含有粒狀玉米淀粉的漿液在55C至70"C之間的溫度下與衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的cx-淀粉酶接觸1至6小時(shí)，得到包含:至少30%葡萄糖的可溶淀粉底物。在接觸步驟的其它優(yōu)選實(shí)施方式中，具有20-40%DS的含有粒狀買(mǎi)羅高粱淀粉的漿液在55C至70C之間的溫度—卩與衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的a-淀粉酶接觸1至6小時(shí)，得到包含至少50%葡萄糖的可溶淀粉底物。在接觸步驟——其導(dǎo)致包含葡萄糖的醪液的產(chǎn)生——之后，該醪液與發(fā)酵微生物(如產(chǎn)生乙醇的微生物)一起經(jīng)歷發(fā)酵。[100]然而，在使包含至少10%葡萄糖的醪液經(jīng)歷發(fā)酵之前，醪液可以進(jìn)一步暴露于包含例如回流和/或玉米浸漬液的水溶液，并且被調(diào)節(jié)至在pH3.0至6.0、pH3.5至5.5或pH4.0至5.5的范圍內(nèi)的pH。在本發(fā)明的該實(shí)施方式中，醪液的。/cDS可以被稀釋。例如，經(jīng)稀釋的醪液的DS可以在5至35%;5至30%;5至25%;5至20%;5至20%;5至15%;以及5至10%，其小于接觸步驟中漿液的y。DS。在一個(gè)非限制性實(shí)例中，如果接觸步驟中漿液的n/。DS為約32%并且醪液進(jìn)一步暴露于稀釋用水溶液——其將DS稀釋在5至10%之間，則待發(fā)酵的醪液的DS將在22%與27%之間。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，如果接觸漿液的DS在30至35%之間，稀釋過(guò)的漿液的DS將為約20至30。/。。[101]在優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含至少10%葡萄糖的醪液然后經(jīng)歷采用如上所述的發(fā)酵微生物的發(fā)酵工藝。這些發(fā)酵工藝在TheAlcoholTextbook3rdED，AReferencefortheBeverage,FuelandIndustrialAlcoholIndustries,EdsJacques等,(1999)NottinghamUniversityPress,UK中被描述。[102]在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該醪液在這樣的溫度范圍內(nèi)一_-15至40°C以及還有25至35°C，在這樣的pH范圍內(nèi)——pH3.0至6.5;還有pH3.0至6.0;pH3.0至5.5,pH3.5至5.0以及還有pH3.5至4.5，在酵母的存在下發(fā)酵12至240小時(shí)的時(shí)間期間，優(yōu)選12至120小時(shí)并且更優(yōu)選24至90小時(shí)，產(chǎn)生醇類(lèi)產(chǎn)物，優(yōu)選乙醇。酵母細(xì)胞一般以每ml發(fā)酵液104至1012活酵母數(shù)的量被供給，并且優(yōu)選107至101()。除了發(fā)酵微生物(如酵母)養(yǎng)料外，發(fā)酵將任選地包括酸和另外的酶。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，接觸步驟在與發(fā)酵步驟分開(kāi)的容器中進(jìn)行。還可以考慮，接觸步驟和發(fā)酵步驟可以在SSF工藝中在同一容器中進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，除了上述原料外，發(fā)酵介質(zhì)將包含補(bǔ)充劑，其包括但不限于維生素(例如生物素、葉酸、煙堿酸、核黃素)、輔因子和大量養(yǎng)料和微量養(yǎng)料以及鹽(如(NH4)2S04;K2HP04;NaCl;MgS04;H3B03;ZnCl2;和CaCl2)。將被包括在發(fā)酵步驟中的另外的酶可以與接觸步驟中使用的酶相同或不同。在一些實(shí)施方式中，酶將包括a-淀粉酶和葡糖淀粉酶，包括粒狀淀粉水解酶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶和a-淀粉酶可以以摻混物的形式出現(xiàn)。特別優(yōu)選的酶摻混物包括STARGEN001(GenencorInternationalInc.),其是來(lái)自河內(nèi)白曲霉(A.kawachi)的a-淀粉酶和來(lái)自黑曲霉的葡糖淀粉酶的摻混物。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，葡糖淀粉酶將衍生自里氏木霉葡糖淀粉酶、羅耳阿太菌葡糖淀粉酶、踝節(jié)菌屬葡糖淀粉酶、曲霉屬葡糖淀粉酶以及從它們衍生出的雜交和變種葡糖淀粉酶。在--些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該酶選自纖維素酶、肌醇六磷酸酶和蛋白酶。醇和其它終產(chǎn)物的回收-本發(fā)酵方法的優(yōu)選終產(chǎn)物為醇產(chǎn)物，優(yōu)選地為乙醇。根據(jù)該方法所生產(chǎn)的終產(chǎn)物可以與發(fā)酵介質(zhì)分離和/或從中純化。分離和純化的方法是已知的，例如使介質(zhì)經(jīng)歷萃取、蒸餾和柱層析。在一些實(shí)施方式中，終產(chǎn)物直接通過(guò)將介質(zhì)送到高壓液相色譜(HPLC)分析進(jìn)行鑒別。[108]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，醪液可以通過(guò)例如離心分成液相和固相而進(jìn)行分離并且回收終產(chǎn)物如醇和固體。醇可以通過(guò)手段諸如蒸餾和分子篩脫水或超濾進(jìn)行回收。在一些實(shí)施方式中，乙醇的收率按體積計(jì)將大于8%、10%、12%、14%、16%和18%。根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的乙醇可以被用作燃料乙醇、飲用乙醇或工業(yè)乙醇。在迸一步的實(shí)施方式中，終產(chǎn)物可以包括發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)品如谷物干酒糟(distillersdriedgrains,DDG)和含可溶物的谷物干酒糟(distiller'sdriedgrainplussolubles,DDGS)，其可被用作動(dòng)物飼料。實(shí)驗(yàn)提供下面的實(shí)施例，以證明和進(jìn)一步闡明本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方式和方面，而且不被解釋為對(duì)其范圍的限制。實(shí)際上，預(yù)期這些教導(dǎo)將在進(jìn)一步優(yōu)化本文所描述的工藝系統(tǒng)中起作用。[112]在本公開(kāi)內(nèi)容和接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)部分，用到了下面的縮寫(xiě)GA(葡糖淀粉酶)；wt%(重量百分比)；°C(攝氏度)；H20(水)；dH20(去離子水)；dIH20(去離子水，Milli-Q過(guò)濾)；g或者gm(克)；嗎(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；^(微升)；ml和mL(毫升)；mm(毫米)；(微米)；M(摩爾濃度)；mM(毫摩爾濃度)；(iM(微摩爾濃度)；U(單位);MW(分子量);sec(秒);min(s)(分鐘)；hr(s)(小時(shí))；DO(溶解氧)；W/V(重量與體積之比)；W/W(重量與重量之比)；V/V(體積與體積之比)；Genencor(GenencorInternational,Inc.,PaloAlto,CA);MT(公噸);和ETOH(乙醇)。下列酶制劑在下面的實(shí)施例中被使用SPEZYMEEthyl(可從Genencor得到)-從地衣芽孢桿菌的基因改造菌株得到的細(xì)菌a-淀粉酶。GC100-在US2006/0014265中公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)用細(xì)菌a-淀粉酶。[115]灰腐質(zhì)霉葡糖淀粉酶(HGA)，其具有如WO2005A)52148的SEQIDNO:3所公開(kāi)的氨基酸序列。23[116]STARGEN001(可從Genencor得到)-黑曲霉葡糖淀粉酶和河內(nèi)白曲霉a-淀粉酶的摻混物。下面的測(cè)定在下面的實(shí)施例中被使用.-a-淀粉酶活性被表示為a-淀粉酶單位(AAU)，并且酶活性通過(guò)淀粉水解的速率來(lái)測(cè)定，淀粉水解的速率體現(xiàn)為碘著色能力下降的速率，其由分光光度法進(jìn)行測(cè)量。一個(gè)AAU的細(xì)菌a-淀粉酶活性為在標(biāo)準(zhǔn)條件F每min水解lOmg淀粉所需的酶量。也將a-淀粉酶活性測(cè)定為可溶淀粉單位(solublestarchunit,SSU)，并且基于在pH4.5和5(TC下，可溶性馬鈴薯淀粉底物(4%DS)被試樣量的酶樣品水解的程度。還原糖含量采用如在Miller,G.L.(1959)Anal.Chem.31:426-428中所述的DNS方法進(jìn)行測(cè)定。一個(gè)酶活性單位(SSU)相當(dāng)于在特定溫育條件下每分鐘所釋放的lmg葡萄糖的還原能力。葡糖淀粉酶活性采用公知的試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定，其基于葡糖淀粉酶催化對(duì)石肖基苯基-a-D畫(huà)卩比喃葡糖苷(p-nitrophenyl誦alpha匿D-glucopyranoside,PNPG)水解生成葡萄糖和對(duì)硝基苯酚的能力。在堿性pH下，該硝基苯酚形成黃顏色，其與葡糖淀粉酶活性成比例，并在400nm處監(jiān)測(cè)，且與以GAU測(cè)定的酶標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較?！獋€(gè)"葡糖淀粉酶活性單位(GlucoamylaseActivityUnit)"(GAU)是在pH4.2和60。C下每小時(shí)從可溶淀粉底物(4%DS)產(chǎn)生1gm還原糖的酶量，還原糖以葡萄糖計(jì)算。白利糖度(Brix)——在給定溫度下總?cè)芙夤腆w含量的量度，通過(guò)采用折射計(jì)測(cè)量加以測(cè)定?？偟矸酆康臏y(cè)定用酶-酶淀粉液化和糖化方法測(cè)定總淀粉含量。在典型的分析中，在100mlKohlraucsh燒瓶?jī)?nèi)放入2g干樣品，并且加入45mlpH7.0的MOPS緩沖液。將該漿液充分?jǐn)嚢?0min。加入1.0ml的SPEZYMEFRED(以1:50稀釋在水中)并加熱至煮沸3-5min。將該燒瓶放在高壓滅菌器內(nèi)，在121。C下保持15min。高壓滅菌處理之后,將該燒瓶放置在95。C的水浴中，加入1ml的以1:50稀釋的SPEZYMEFRED并且溫育45min。調(diào)節(jié)pH到pH4.2，而溫度降到60°C。接著加入20mlpH4.2的乙酸鹽緩沖液。通過(guò)加入1.0ml的以1:100稀釋的OPTIDEXL-400(Genencor)進(jìn)行糖化，且在60。C下繼續(xù)溫育18小時(shí)。通過(guò)在95。C下加熱10min終止此酶反應(yīng)。采用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)HPLC分析，測(cè)定總糖組分。來(lái)自在室溫下不經(jīng)過(guò)酶處理的樣品的水萃取液的可溶淀粉水解產(chǎn)物被從總糖中扣除。[123]溶解固體的百分含量(％)的測(cè)定一7ml樣品被放入小螺絲帽試管中(pH被調(diào)節(jié)至5.0至6.0)并且向管中加入0.007mlSPEZYMEFred。試管被放在沸水浴中10min并且在溫育期間于不同時(shí)間下輕輕混合。10min后取出管并且被放在8(TC水浴中1小時(shí)。管被冷卻并且離心分離。測(cè)定上清夜的白利糖度并且與對(duì)照樣品比較。溶解的固體％=對(duì)照白利糖度x100/樣品白利糖度。樣品的乙醇和碳水化合物測(cè)定采用如下HPLC法進(jìn)行測(cè)量[125]將1.5mlEppendorf離心管裝滿發(fā)酵罐醪液并在冰上冷卻10min;該樣品管在Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)中離心1min;0.5ml上清液樣品被轉(zhuǎn)移到含有0.05mll.lNH2SO4的試管中，并使其靜置5min;向試管中加入5.0ml水，然后通過(guò)0.2|im尼龍針頭式過(guò)濾器(NylonSyringeFilter)將其過(guò)濾到HPLC小瓶?jī)?nèi)；并在HPLC上運(yùn)行。HPLC條件包括乙醇體系柱PhenomenexRezex有機(jī)酸柱(RHM-單糖)#00H0132-KO(相當(dāng)于Bio-Rad87H);柱溫60°C;流動(dòng)相0.01NH2SO4;流速0.6mL/min;檢測(cè)器RI;和注射體積20|aL。碳水化合物體系柱PhenomenexRezex碳水化合物(RCM-單糖)#00H-0130-KO(相當(dāng)于Bio-Rad87H);柱溫70°C;流動(dòng)相納米純DIH20;流速0.8mL/min;檢測(cè)器RI;注射體積10|aL(3%DS材料)。柱基于糖的分子量進(jìn)行分離，糖被標(biāo)為DPI(單糖)；DP2(二糖)；DP3(三糖)；以及DP〉3(聚合度大于3的寡糖)。實(shí)施例1整粒磨碎玉米和分級(jí)玉米的粒狀淀粉的溶解及從中生產(chǎn)乙醇[129]該實(shí)驗(yàn)在三種不同的玉米粒狀淀粉底物上進(jìn)行(A)370g含水量13.3%的整粒磨碎玉米；(B)354.2g含水量9.2%的玉米胚乳；和(C)從含水量11.8%得到的精制玉米淀粉。每種底物被稱(chēng)重并且轉(zhuǎn)移至不銹鋼容器中，與水制成最終1000g的漿液，對(duì)應(yīng)于32。/。DS。[130]漿液的pH用6NH2S04調(diào)節(jié)至pH5.5。加入GC100(4.0AAU/gDS)。將溫度保持在6(TC。在溫育期間，漿液用頂部攪拌器輕輕攪拌。在2、4、6、12和24小時(shí)的時(shí)間間隔后，測(cè)定BRIX(白利糖度)、溶解淀粉％和糖組成(％W/W)，且結(jié)果顯示在表l中。在24小時(shí)，來(lái)自整粒磨碎玉米、胚乳和精制糖的粒狀淀粉在接觸步驟期間分別溶解了79.1%、71.1%和60.0%。在24小時(shí)，水解產(chǎn)物中葡萄糖％對(duì)于整粒磨碎玉米為65.22%，對(duì)于胚乳為49.64%，而對(duì)于精制淀粉僅為5.79%。[131]表1谷物時(shí)間BRIX溶解淀粉％葡萄糖%DP2%DP3%DP>3整玉米211.531.6021.3613.4833.56414.037.5624.3113.6524.48616.341.3325,4213.3619.881218.246.2326.1812.6314.962420.079.165.2222,507.364.92胚乳213.427.1213.858.8850.15416.133.0116.459,3941,15617.536.5618.189.5935.671221.747.4320.989.6521.942422,97U49.6421,339.5219.51精制玉米淀粉214.41,4010.3715.2772.96416.82.3411.6015.2270.84617.85.1412.2715,1367.451219.14.9413.2115.6266.222420,960.05.7914.4017.4262,3926[132]24小時(shí)后，使用來(lái)自整粒磨碎玉米的樣品(32%DS)，在125ml燒瓶中，在400ppm尿素、RedStarRed酵母(Fermentus)、STARGEN001和0.1SAPU/gDS蛋白酶的存在下，在pH4.2,32°C下進(jìn)行酵母發(fā)酵。HPLC數(shù)據(jù)顯示在表2中。表2STARGEN001%V/VETOH%V/VETOH%V/VETOHGAU/g24小時(shí)48小時(shí)72小時(shí)0.110.1111.7413.640.210.3612.1914.620.410.8312.7315.35實(shí)施例2買(mǎi)羅高粱粒狀淀粉的溶解及從中生產(chǎn)乙醇[133]進(jìn)行兩種預(yù)處理(A)稱(chēng)量160g含水量11.6%且總淀粉含量53.3%的整粒磨碎買(mǎi)羅高粱，并轉(zhuǎn)移至含有340g水的不銹鋼容器中。漿液的pH用6N硫酸調(diào)節(jié)至pH5.5。加入SPEZYMEEthyl(1.0AAU/gDS)。溫度被保持在62。C并且32%:DS。(B)HGA以0.1GAUHGA/gDS的當(dāng)量被包括在上文(A)中上述的預(yù)處理中。溶解的固體％和葡萄糖%被示于表3中。表3酶時(shí)間(小時(shí))%DP1(葡萄糖)%DP2%DP3%DP>3溶解的淀粉％SPEZYMEEthyl257.7124.6010.427.27464.4122.509.133.95667.1621,838.162.852486.509.912.950.6354.7SPEZYMEEthyl+HGA284.349.481.474.72487.728.071.183.03688,917.681.032.372493.105.260,591.0569.3來(lái)自上述HGA預(yù)處理的原料(醪液)在125ml燒瓶中在常規(guī)酵母發(fā)酵條件(例如RedStarYeast,pH4.2,32°C，在400ppm尿素、27STARGEN001和0.05SAPU/gDS存在下)下進(jìn)行評(píng)價(jià)。HPLC結(jié)果顯示在表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例3溫度對(duì)從整粒磨碎買(mǎi)羅高粱生產(chǎn)葡萄糖的影響[135]在60。C、65。C和70。C下對(duì)含有GC100(4.0AAU/gDS)、pH5.5、30%DS的整粒磨碎買(mǎi)羅高粱的含水漿液進(jìn)行溫育。溫育6小時(shí)后，取出樣品并離心以分離不溶物。測(cè)量澄清上清液的白利糖度和HPLC組成。測(cè)定溶解的淀粉％和葡萄糖％，并且結(jié)果顯示在表5中。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>隨著在與整粒磨碎買(mǎi)羅高粱的接觸步驟期間溫育溫度從6(TC升高至70C淀粉溶解和葡萄糖含量下降。這表明(x-淀粉酶可能在下失活。大于50%的溶解的淀粉在65匸被水解成葡萄糖，這表明內(nèi)源性植物淀粉水解酶能夠?qū)⒖扇芄烟撬獬善咸烟恰?lái)自上述在65。C的預(yù)處理的原料在基本上如實(shí)施例2中描述的常規(guī)發(fā)酵條件F進(jìn)行評(píng)價(jià)；除了MDS為30。結(jié)果顯示在表6中。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>實(shí)施例4水稻粒狀淀粉的溶解及從中生產(chǎn)乙醇[138]水稻谷物(116g)——其具有淀粉含量81.5%;含水量14%以及穿過(guò)30目篩的顆粒大小——與284g水混合以制備25。/。DS漿液。向該漿液中加入GC100(4.0AAU/gDS)。溫度被保持在65"并且pH被調(diào)節(jié)至pH5.5。在第2、4、6和24小時(shí)測(cè)量白利糖度。測(cè)定可溶淀粉%和葡萄糖％并且結(jié)果顯示在表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>[139]24小時(shí)后，在0.75GAU/gDSSTARGEN001、400ppm尿素和0.4%的安琪酵母(中國(guó)江西)的存在下在pH4.2、32。C下進(jìn)行酵母發(fā)酵。在第24、48和67小時(shí)下取出HPLC樣品(表8)。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>權(quán)利要求1.從粒狀淀粉底物生產(chǎn)葡萄糖的方法，其包括a)在低于所述粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下使包含獲自植物材料的粒狀淀粉的漿液與α-淀粉酶接觸以產(chǎn)生寡糖，并且使內(nèi)源植物淀粉水解酶水解所述寡糖，和b)產(chǎn)生包含至少10％葡萄糖的醪液。其中所述接觸步驟在pH3.5至7.0下進(jìn)行5分鐘至48小時(shí)的一段時(shí)間。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括c)使所述醪液在l(TC與40。C之間的溫度下在發(fā)酵微生物和淀粉水解酶的存在下發(fā)酵10小時(shí)至250小時(shí)的一段時(shí)間，以產(chǎn)生醇。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述cx-淀粉酶衍生自嗜熱脂肪芽孢木下菌(f及Wearof/erwop/w7ws入土也衣芽包桿菌(及//c/2e"^)r附&)或解淀粉芽孢桿菌(5.aw_y/o/—咖c/em0。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述接觸步驟中供給的a-淀粉酶的量在0.01至10.0AAU/gds之間。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述溫度在50。C與7(TC之間。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述醪液包含至少30%葡萄糖。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物材料是玉米、買(mǎi)羅高粱、大麥、小麥、水稻或其組合。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述植物材料是分級(jí)玉米。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述醇是乙醇。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其進(jìn)一步包括回收所述乙醇。11.生產(chǎn)乙醇的方法，其包括a)使包含獲自植物材料的粒狀淀粉的漿液與能夠溶解粒狀淀粉的(x-淀粉酶接觸，其中所述接觸在3.5至7.0的pH下在低于所述粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下進(jìn)行5分鐘至24小時(shí)的一段時(shí)間，b)獲得含有20%以上葡萄糖的底物，和c)在l(TC與4CTC之間的溫度下在發(fā)酵微生物和淀粉水解酶的存在下使所述底物發(fā)酵10小時(shí)至250小時(shí)的一段時(shí)間，以生產(chǎn)乙醇。12.根據(jù)權(quán)利要求ll所述的方法，其進(jìn)一步包括回收所述乙醇。13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述a-淀粉酶是細(xì)菌(x-淀粉酶。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述(x-淀粉酶衍生自嗜熱脂肪芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌。15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述接觸步驟在5(TC與70。C之間的溫度下進(jìn)行。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述溫度在60。C與？0。C之間。17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述接觸步驟在5.0至6,0的pH下進(jìn)行。18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述接觸持續(xù)15分鐘至12小時(shí)的一段時(shí)間。19.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述底物在接觸15分鐘至6小時(shí)之間的時(shí)間后包含30%以上的葡萄糖。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述底物在接觸15分鐘與6小時(shí)之間的時(shí)間后包括40%以上的葡萄糖。21.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括在發(fā)酵步驟前使所述底物澄清。22.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其進(jìn)一步包括將另外的酶加入所述接觸步驟。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述另外的酶選自葡糖淀粉酶、肌醇六磷酸酶、蛋白酶、纖維素酶和/或半纖維素酶。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述另外的酶是肌醇六磷酸酶。25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述另外的酶是蛋白酶。26.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述槳液含有5-60%DS的粒狀淀粉。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述MDS粒狀淀粉在20-40%DS之間。28.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其在所述發(fā)酵步驟前進(jìn)一步包括使所述底物與包含回流的水溶液接觸，以稀釋所述。/。DS。29.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述粒狀淀粉獲自玉米、買(mǎi)羅高粱、大麥、小麥、水稻或其組合。30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中6小時(shí)后葡萄糖％為30%。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中6小時(shí)后葡萄糖％為40%。全文摘要本申請(qǐng)的發(fā)明名稱(chēng)為“粒狀淀粉轉(zhuǎn)化成乙醇的方法”。本發(fā)明涉及從粒狀淀粉底物生產(chǎn)葡萄糖的方法，其包括在低于粒狀淀粉的淀粉膠凝溫度的溫度下使包含從植物材料獲得的粒狀淀粉的漿液與α-淀粉酶接觸，以產(chǎn)生寡糖，并且使所述寡糖水解，以產(chǎn)生包含至少20％葡萄糖的醪液，并且進(jìn)一步包括使所述醪液發(fā)酵以得到乙醇。文檔編號(hào)C12P7/06GK101460629SQ200780020981公開(kāi)日2009年6月17日申請(qǐng)日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者J·K·舍蒂,O·J·蘭特羅,勉李申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司